CN101886046B - 昆虫病原真菌转酸性海藻糖酶基因菌株及制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

昆虫病原真菌转基因菌株，其含有同源或异源酸性海藻糖酶组成性外源基因；其是通过构建酸性海藻糖酶基因全长cDNA组成性表达载体，然后建立液生分生孢子转化体系，再进行选择性地筛选制得的；本发明昆虫病原真菌转基因菌株在制备真菌农药中的应用。本发明昆虫病原真菌转基因菌株表达海藻糖酶的效率高；本发明制备方法易操作、重复再现性好；本发明昆虫病原真菌转基因菌株应用于真菌农药中，该真菌农药作用于昆虫体内时，通过转基因菌株的超量表达酸性海藻糖酶基因，使昆虫寄主体内酸性海藻糖酶活性被提高，加速了海藻糖利用，促进了病原真菌在寄主昆虫体内生长，从而有效地提高了真菌农药如绿僵菌、白僵菌等真菌农药的杀虫活性。

Description

昆虫病原真菌转酸性海藻糖酶基因菌株及制备方法和用途

技术领域

本发明涉及转基因菌株及其制备方法和用途，尤其涉及昆虫病原真菌转基因菌株及其制备方法和用途。

背景技术

害虫防治是农业生产的重要组成部分。化学农药在防治有害生物和保障农业增产方面起了积极作用。但化学农药大量长期使用引起了一系列的环境和食品安全问题。由于微生物生物防治具有安全和可持续控制的优点，一直受到人们的广泛关注。其中，昆虫病原真菌是昆虫病原微生物中最大的一个类群，自然死亡昆虫的60％由其引起，是自然界控制昆虫种群数量的重要因素之一。昆虫病原真菌主要通过体壁侵染昆虫，在害虫持续控制及维护物种多样性方面具有特殊优势。目前真菌杀虫剂已作为化学农药的替代产品或补充制剂防治多种有害昆虫。然而，与其他微生物农药一样，真菌农药存在杀虫较慢、防效不稳定等缺点，这极大限制了其广泛应用。提高昆虫病原真菌杀虫速度对扩大其应用范围、减少化学农药使用、保护生态环境具有重要意义。

提高昆虫病原真菌杀虫剂杀虫速度措施主要有：(1)通过制剂研究为真菌提供适宜的微环境，促进真菌快速生长与侵染；(2)通过菌株筛选获得高杀虫活性的菌株；(3)通过菌株改良获得高杀虫活性的菌株。杀虫真菌制剂研究成果对促进杀虫真菌产业化与应用起到推动作用，特别是杀虫真菌油悬浮剂的出现，显著降低杀虫真菌环境湿度依耐性，使得杀虫真菌应用范围从森林等荫蔽区域扩大到干旱、高温区域。但是，由于昆虫病原真菌侵染昆虫是两者相互作用的过程，即便在适宜的环境条件下，真菌侵染昆虫直至昆虫死亡，仍需要较长的时间。通过菌株筛选已获得针对多种不同昆虫的一系列具有高杀虫活性的昆虫病原真菌菌株，其中国内外登记注册的真菌农药已有100多种，由于自然菌株是经过长期与寄主昆虫相互作用进化形成，与寄主昆虫在自然界中达到平衡，所以从大量菌株筛选具有高杀虫活性的昆虫病原真菌菌株费时、费事。目前，在昆虫病原真菌致病机制研究的基础上利用基因工程手段改良菌株成为提高昆虫病原真菌杀虫活性的重要途径。

昆虫病原真菌侵染寄主昆虫主要有3个过程：①分生孢子附着在寄主表皮；②穿透昆虫表皮入侵到昆虫体内；③在昆虫体内利用昆虫营养生长繁殖并分泌毒素直至昆虫得病死亡。迄今为止，对昆虫病原真菌致病机制的研究成果主要集中在真菌穿透寄主表皮过程中产生的一些水解酶类，并分离鉴定多个与致病相关的基因，如蛋白酶Prl、几丁质酶等。St Leger(1996)通过转基因技术成功的将Prl基因转入绿僵菌(Metarhizium)，获得高毒力的绿僵菌工程菌株。该工程菌株在烟草天蛾的血淋巴中组成性超表达后激活酚氧化酶系统，引起幼虫黑化，导致昆虫死亡时间缩短25％，取食量下降40％。2005年Fang等人成功将昆虫病原真菌毒力因子-几丁质水解酶Bbchitl基因构建在gpd组成性启动子下游转入白僵菌基因组中，获得超表达工程菌株。工程菌株对蚜虫的毒力明显增强：与野生菌株相比，工程菌株对蚜虫的致死剂量降低50％，致死时间缩短50％。Fang等人(2007)将家蚕的BmChBD融合到Bbchitl中获得的杂交几丁水解酶，这个杂交几丁水解酶(Bbchitl-BmChBD)的基因与组成性启动子gpd(三磷酸甘油醛脱氢酶)连接后被成功转化到白僵菌中，提高真菌的表皮穿透能力，与野生菌株相比，工程菌株使昆虫死亡时间缩短23％。

然而，由于研究难度较大，目前对病原真菌进入昆虫血腔后到寄主死亡前的时期(侵入后)研究较少，而这一时期又恰是病原真菌与寄主之间生死斗争的关键时期，占了真菌侵染致病过程中绝大部分时间，缩短病原真菌昆虫体内侵染时间能有效提高昆虫病原真菌杀虫活性。Wang and St.Leger(2007)通过基因工程的方法将一种昆虫特异性神经毒素(来源于黄肥尾蝎)基因AajIT转入绿僵菌，使其侵染寄主昆虫后在昆虫血淋巴中特异表达；当死亡率相同时，该工程菌株防治烟草天蛾的剂量比野生型菌株降低22倍，缩短防治埃及伊蚊时间40％以上；该工程菌株防治咖啡豆蛀虫的剂量较野生型菌株降低15.7倍(Pava-Ripoll等，2008)。Thomas and Read(2007)认为：由于社会心理和政治的因素，该方法被广泛应用还需一个较长时间。采用安全、易被人们接受的基因工程菌缩短病原真菌昆虫体内侵染时间成为研究热点。

我们通过研究发现，在昆虫中海藻糖作为血液内的一种主要糖分以提供昆虫活动，昆虫体内海藻糖浓度影响昆虫的活动与行为，而昆虫病原真菌能分泌一种海藻糖降解酶利用昆虫体内的海藻糖供其生长，则海藻糖降解酶是一种昆虫病原真菌可能的致病因子。我们进一步研究发现该海藻糖降解酶为一种酸性酶，昆虫病原真菌侵染昆虫后，昆虫体内酸性海藻糖活性上升，而昆虫体内海藻糖浓度相应下降，这进一步表明昆虫病原真菌酸性海藻糖降解酶(ATM)是一种可能的致病因子，通过基因工程的手段，构建真菌ATM超表达载体，转化绿僵菌、白僵菌，获得ATM超量表达的工程菌，将是一种易被人们接受的提高昆虫病原真菌杀虫活性的新方法。

发明内容

本发明的目的在于提供昆虫病原真菌转基因菌株，本发明转基因菌株能超量表达同源或异源酸性海藻糖酶。

本发明的另一目的在于提供上述昆虫病原真菌转基因菌株的制备方法，本发明方法再现性好。

本发明的又一目的在于提供上述昆虫病原真菌转基因菌株的用途。

本发明的目的是这样实现的：

昆虫病原真菌转基因菌株，其特征在于：所述转基因菌株含有同源或异源酸性海藻糖酶组成性外源基因。

为了进一步提高转基因菌株酸性海藻糖酶表达的水平，上述酸性海藻糖酶组成性外源基因为pBarEx-ATM或pBGFP-ATM。

上述病原真菌为白僵菌或绿僵菌，还可以是拟青霉或轮枝菌等昆虫病原真菌。

上述昆虫病原真菌转基因菌株，是通过构建酸性海藻糖酶基因全长cDNA组成性表达载体，然后建立液生分生孢子转化体系，再进行选择性地筛选得到的。

上述构建酸性海藻糖酶基因全长cDNA组成性表达载体中的酸性海藻糖酶基因来自含有酸性海藻糖酶基因的丝状真菌或酵母菌；所述丝状真菌可以是绿僵菌或白僵菌或拟青霉或轮枝菌或曲霉或小孢子菌等含有酸性海藻糖酶基因的真菌，所述酵母菌可以是毕赤酵母或酿酒酵母或假丝酵母等含有酸性海藻糖酶基因的酵母菌，优选为绿僵菌CQMa102。

具体地说，上述昆虫病原真菌转基因菌株：

是通过聚合酶链式反应(PCR)扩增绿僵菌CQMa102酸性海藻糖酶基因全长cDNA核酸序列，并将其克隆到以除草剂抗性基因(Bar基因)为筛选标记的真菌表达载体pBarEx或以苯莱特(Benomyl)抗性基因(β-微管蛋白基因，β-Tubulin)为筛选标记的真菌表达载体pBGFP，使ATM基因处于来自构巢曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶(gpdA)基因的启动子或磷酸丙糖异构酶(tpiA)基因的启动子与色氨酸合成酶(trpC)基因的终止子控制之下，得到海藻糖酶基因组成性表达载体pBarEx-ATM或pBGFP-ATM；建立利用基因枪法转化绿僵菌或白僵菌液生分生孢子的体系，将pBarEx-ATM或pBGFP-ATM整合到绿僵菌、白僵菌基因组、拟青霉或轮枝菌中；最后经过抗性筛选和聚合酶链式(PCR)反应法筛选得到。

上述昆虫病原真菌转基因菌株的制备方法：

1、构建酸性海藻糖酶(ATM)基因组成性表达载体

首先根据pBGFP构建丝状真菌表达载体pBarEx：设计引物1(5’-attagacgtcgcaggtcgacagaagaatgac-3’，下划线为Aat II酶切位点)与引物2(5’-gtcggccgggcgtcgttctgggctcatggtagatccactagagcggccgc-3’)从构巢曲霉基因组DNA中扩增色氨酸合成酶启动子(PtryC)序列；设计引物3(5’-gcggccgctctagtggatctaccatgagcccagaacgacgcccggccgac-3’，与引物2反向互补系列；其中atg为Bar基因起始密码子)与引物4(5’-cgcggatccagcttttattagatctcggtgac-3’，下划线为BamHI酶切位点)从pCAMBIA 3300中扩增Bar基因序列；以引物1与引物4，采用融合PCR扩增PtryC控制下的Bar Cassette；将pBGFP与Bar Cassette分别采用AatII与BamHI双酶切后，用T4连接酶连接构建成丝状真菌表达载体pBarEx；

其次，根据绿僵菌CQMa102酸性海藻糖酶基因全长cDNA核酸序列(GenBank登录号：EF190950)设计的引物5(5’-ccatcgatatgcgcgcgactcccatg-3’，下划线为ClaI酶切位点)与引物6(5’-tcccccgggctaaaacgctctaccctt-3’，下划线为SmaI酶切位点)，以绿僵菌CQMa102cDNA为模板，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增出两端分别带有ClaI与SmaI酶切位点的3303bp的ATM基因全长cDNA序列，并将其克隆到丝状真菌表达载体pBarEx或pBGFP的ClaI和SmaI位点之间，使ATM基因处于来自构巢曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶(gpdA)基因的启动子与色氨酸(trpC)基因的终止子控制之下，得到海藻糖酶基因组成性表达载体pBarEx-ATM或pBGFP-ATM；pBarEx-ATM或pBGFP-ATM表达载体用CaCl₂法转入大肠杆菌中并进行扩增，载体大量提取的产物经SpeI线性化后去磷酸，再经酚-氯仿抽提得到上述线性化组成性表达载体；

2、建立利用基因枪法转化昆虫病原真菌液生分生孢子的体系

将1ml浓度为10⁷个/ml的绿僵菌CQMa102或白僵菌CQBb022成熟分生孢子水悬浮液接种于装有100ml 1/4强度萨氏液体培养基(1/4SDA)(10g/l葡萄糖，2.5g/l蛋白胨，5.0g/l酵母浸膏，初始pH 6.5)的250ml三角瓶中，28℃，250rpm振荡培养3天，四层灭菌纱布过滤后6000g离心5分钟沉淀液生分生孢子，用无菌水重悬清洗2次，最后20％无菌甘油重悬使孢子浓度达10⁸个/ml，分装后-80℃保存；

3、转化与筛选

转化时取出50μl上述液生分生孢子悬浮液与灭菌平皿中央，使其直径达到1cm，然后放入75％乙醇消毒的基因枪室内用于转化；按照Bio-Rad系统提供的方法进行金粉的处理和线性载体pBarEx-ATM或pBGFP-ATM的包埋，并利用该系统进行微粒子轰击；轰击后在超净台上取出孢子液，用5ml无菌水稀释，取100ul涂布于除草剂草丁膦(Phosphinothricin，PPT)或苯莱特(Benomyl)筛选培养基平板上，28℃培养；绿僵菌采用80ug/ml PPT或5ug/ml苯莱特的查氏平板筛选，白僵菌筛选采用10ug/ml PPT或5ug/ml苯莱特的查氏平板筛选，10天后挑取正常生长单菌落，在相应筛选培养基与1/4SDA平板上交替传代5次后提取DNA，利用特异引物对(5’-gactgcccgc attgagaag-3’与5’-agatggaggagttggtgttg-3’)，经PCR验证转基因菌株Bar基因，或利用特异引物对(5’-gcttactcctccttgacaccac-3’与5’-agccgagtatggtaaccaaggg-3’)，验证转基因菌株β-Tubulin基因，得到稳定转基因菌株。

上述昆虫病原真菌转基因菌株在制备真菌农药中的应用。

有益效果

本发明昆虫病原真菌转基因菌株表达海藻糖酶的效率高；本发明制备方法易操作、重复再现性好；本发明昆虫病原真菌转基因菌株应用于真菌农药中，该真菌农药作用于昆虫体内时，通过转基因菌株的超量表达酸性海藻糖酶基因，使昆虫寄主体内酸性海藻糖酶活性被提高，加速了海藻糖利用，促进了病原真菌在寄主昆虫体内生长，从而有效地提高了真菌农药如绿僵菌、白僵菌等真菌农药的杀虫活性。

附图说明

图1：酸性海藻糖酶(ATM)基因表达载体结构示意图

(A)pBarEx-ATM

(B)pBGFP-ATM

图2：绿僵菌、白僵菌ATM转基因菌株与空载体转化子PCR验证电泳图

(A)pBarEx-ATM载体转化

(M)Marker

(1)MaOE017

(2)MaVT

(3)MaWT(CQMa102)

(4)BbOE113

(5)BbVT

(6)BbWT(CQBb022)

(B)pBGFP-ATM载体转化

(M)Marker

(1)MaOE112

(2)MaWT(CQMa102)

(3)BbOE093

(4)BbWT(CQBb022)

图3：转基因菌株酸性海藻糖酶(ATM)基因的表达量

A：绿僵菌酸性海藻糖酶基因的表达量；B：白僵菌酸性海藻糖酶基因的表达量

图4：绿僵菌ATM转基因菌株、空载体转化子与出发菌株对蝗虫的生物活性比较

图5：白僵菌ATM转基因菌株、空载体转化子与出发菌株对蝗虫的生物活性比较

图6：绿僵菌ATM转基因菌株、空载体转化子与出发菌株侵染寄主昆虫后，蝗虫血淋巴中酸性海藻糖酶活性

图7：绿僵菌ATM转基因菌株、空载体转化子与出发菌株侵染寄主昆虫后，蝗虫血淋巴中酸性海藻糖酶同功酶分析

(1)MaWT

(2)MaVT

(3)MaOE017

(4)空白对照(棉籽油接种蝗虫)

图8：绿僵菌ATM转基因菌株、空载体转化子与出发菌株侵染寄主昆虫后，蝗虫血淋巴中海藻糖含量

图9：绿僵菌ATM转基因菌株、空载体转化子与出发菌株侵染寄主蝗虫后，在蝗虫血淋巴中的生长量

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。

实施例1

一种昆虫病原真菌转基因菌株的制备方法：

1、构建酸性海藻糖酶基因组成性表达载体：

首先，根据pBGFP(Cao YQ，Peng GX，He ZB，Wang ZK，Yin YP，Xia YX.Transformation of Metarhizium anisopliae with benomyl resistance and green fluorescentprotein genes provides a tag for genetically engineered strains.Biotechnology Letters，2007，29：907-911)构建丝状真菌表达载体pBarEx：设计引物1(5’-attagacgtcgcaggtcgacagaagaatgac-3’，下划线为Aat II酶切位点)与引物2(5’-gtcggccgggcgtcgttctgggctcatggtagatccactagagcggccgc-3’)从构巢曲霉基因组DNA中扩增色氨酸合成酶启动子(pTryC)序列；设计引物3(5’-gcggccgctctagtggatctaccatgagcccagaacgacgcccggccgac-3’，与引物2反向互补系列；其中atg为Bar基因起始密码子)与引物4(5’-cgcggatccagcttttattagatctcggtgac-3’，下划线为BamHI酶切位点)从pCAMBIA 3300(购自CAMBIA公司)中扩增Bar基因序列；以引物1和引物4，采用融合PCR扩增pTryC控制下的Bar Cassette；将pBGFP与Bar Cassette分别采用AatII与BamHI双酶切后，用T4连接酶连接构建成丝状真菌表达载体pBarEx。

其次，根据绿僵菌CQMa102(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，CGMCC菌株号0877，在中国科学院微生物研究所可以购买到)酸性海藻糖酶基因全长cDNA核酸序列(GenBank登录号：EF190950)设计的引物1(5’-CCATCGATATGCGCGCGACTCCCATG-3’，下划线为ClaI酶切位点)与引物2(5’-TCCCCCGGGCTAAAACGCTCTACCCTT-3’，下划线为SmaI酶切位点)，以绿僵菌CQMa102cDNA为模板，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增出两端分别带有ClaI与SmaI酶切位点的3303bp的ATM基因全长cDNA序列，并将其分别克隆到丝状真菌表达载体pBarEx或pBGFP的ClaI和SmaI位点之间，使ATM基因处于来自构巢曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶(gpdA)基因的启动子与色氨酸(trpC)基因的终止子控制之下，分别得到海藻糖酶基因组成性表达载体pBarEx-ATM(见附图1A)或pBGFP-ATM(见附图1B)，pBarEx-ATM或pBGFP-ATM载体用CaCl₂法分别转入大肠杆菌中并进行扩增，载体大量提取的产物经Spe I线性化后去磷酸，再经酚-氯仿抽提得到浓度为500-1000 ug/ml的上述线性化组成性表达载体，OD260/280在1.80-1.85之间。以pBarEx空白载体为对照。

2、建立昆虫病原真菌液生分生孢子转化体系：

将100μl的绿僵菌CQMa102或白僵菌CQBb022分生孢子水悬浮液(浓度为10⁷个/m1)分别接种于装有100ml 1/4强度萨氏液体培养基(1/4SDA)(10g/l葡萄糖，2.5g/l蛋白胨，5.0g/l酵母浸膏，初始pH 6.5)的250ml三角瓶中，28℃，250rpm振荡培养3-4天，四层灭菌纱布过滤后6000g离心5分钟沉淀液生分生孢子，用无菌水重悬清洗2次，最后20％无菌甘油重悬使孢子浓度达10⁸个/ml，50μl/管分装后-80℃保存。

3、转化与筛选

转化时取50μl分生孢子悬液于灭菌60mm平皿中央，使其直径达1cm，然后放于70％乙醇灭菌基因枪室内。按照Biolistic PDS-1000/he Particle Delvery System(Bio-Rad)系统提供的方法进行金粉的处理和线性载体pBarEx-ATM或pBGFP-ATM的包埋，并利用该系统，以1350psi气压，27.5英寸汞(Hg)真空度进行微粒子轰击。以pBarEx空白载体为对照。轰击后取出样品，在超净台上取出孢子液，用5ml无菌水稀释，取100ul涂布于除草剂草丁膦(phosphinothricin，PPT)或苯莱特(Benomyl)筛选培养基平板上26℃-28℃培养10天左右。

绿僵菌与白僵菌筛选培养基分别为含有浓度为80ug/ml、10ug/ml PPT或含有浓度为5ug/ml苯莱特(Benomyl)的查氏培养基(2g/l NaNO₃，1g/l K₂HPO₄，KCl 0.5g/l，0.5g/lMgSO₄，0.01g/l FeSO₄，30g/l蔗糖，15-20g/l琼脂，pH自然)。10天后挑取正常生长单菌落，在相应筛选培养基与1/4SDA平板上交替传代4次，选取菌落仍然能够正常生长的稳定转基因菌株。同时采用PCR方法，以引物对(5’-gactgcccgc attgagaag-3’与5’-agatggagga gttggtgttg-3’)验证转基因菌株Bar基因或以引物对(5’-gcttactcctccttgacaccac-3’与5’-agccgagtatggtaaccaaggg-3’)验证转基因菌株Tubulin基因。

转化筛选后分别得到含有Bar基因的ATM绿僵菌转基因菌株与空载体绿僵菌转化子(MaOE017，MaVT)与ATM白僵菌转基因菌株与空载体白僵菌转化子(BbOE113，BbVT)(见附图2A)，和含有抗苯莱特基因的ATM绿僵菌转基因菌株(MaOE112)与ATM白僵菌转基因菌株(BbOE093)(见附图2B)。

为了验证本发明提供的方法可以提高昆虫病原真菌孢子的杀虫活性及其机制，发明人作了如下实验：

1、利用定量PCR检测转基因菌株中酸性海藻糖酶(ATM)基因的表达量

将绿僵菌的超表达转基因菌株(MaOE017)、空载体转化子(MaVT)、出发菌株CQMa102(MaWT)与白僵菌超表达转基因菌株BbOE113、空载体转化子(BbVT)、出发菌株CQBb022(BbWT)的分生孢子分别接种在1/4 SDA平板上，28℃恒温培养12-15天；用接种铲轻刮下孢子粉，悬浮在灭菌的0.01％Tween 80(w/v)溶液中混匀，四层擦镜纸过滤后用血球计数板计数，配制1×10⁸个/ml的孢子悬液；按1％(v/v)的接种量接种于海藻糖为唯一碳源的基本盐液体培养基(ICM)中(1.0g/l KH2PO4，0.5g/l MgSO4，1.0g/l KCl，2g/l硫酸铵，10g/l海藻糖，10g/l MES，初始pH 6.0)中，28℃，250rpm振荡培养，每天取3ml培养液，4℃12000g离心收集菌丝。按Promega总RNA提取试剂盒说明书提取菌株总RNA，按Promega反转录酶说明书以随机引物反转录成第一链cDNA，以此为模板，用引物7(5’-tccttgatgg ctattccgc-3’)和引物8(5’-gcgccgacccattttgtgattc-3’)进行定量PCR检测ATM基因的表达，以3-磷酸甘油醛脱氢酶(gpdA)基因为参照，见附图3。

从附图3A可以看出，在海藻糖酶诱导培养基ICM中培养2-4天，绿僵菌ATM超表达转基因菌株(MaOE017)的ATM基因表达水平都显著高于出发菌株CQMa102(MaWT)(p＜0.01)，为出发菌株(MaWT)的1.7-2.3倍，而绿僵菌空载体转化子(MaVT)与出发菌株(MaWT)ATM基因表达水平无显著差异(p＞0.05)。与此相似，从附图3B可以看出，在海藻糖酶诱导培养基ICM中培养2-4天，白僵菌ATM超表达转基因菌株(BbOE093)的ATM基因表达水平上都显著高于与出发菌株(BbWT)(p＜0.01)，而白僵菌空载体转化子(BbVT)与出发菌株Bb022(BbWT)的ATM基因表达水平无显著差异(p＞0.05)。这说明转ATM基因的绿僵菌与白僵菌菌株中都能超量表达ATM基因，而空载体序列不影响ATM基因的表达。

2、绿僵菌转基因菌株杀虫活性

本实验以绿僵菌CQMa102菌株的寄主昆虫东亚飞蝗为实验材料，测定绿僵菌转基因菌株杀虫活性。

将活化的CQMa102与其转基因菌株孢子用灭菌水配成浓度为1×10⁵个孢子/ml的孢子悬浮液，均匀涂在直径为9cm的1/4SDAY平板上(100μl/皿)，26℃培养15d，完全产孢。将孢子刮下后放在干燥器中干燥后用棉籽油涡旋分散，静置10-15min，吸取中层孢子油悬浮液，采用新鲜煤油(透明)稀释测定浓度，根据浓度将配好的孢子油悬浮液用棉籽油梯度稀释至1.6×10⁵，8×10⁵，4×10⁶，2×10⁷，1×10⁸和5×10⁸个孢子/ml备用。

选取羽化后3-4天的东亚飞蝗健康雄虫，用微量移液枪吸取5μl的绿僵菌孢子油悬浮液，在蝗虫前胸背板下点滴接种后放入生测笼中，调节温度26-28℃，相对湿度40-70％，每天更换新鲜麦苗或人工饲料，并观察、记载各处理的死虫数。以棉籽油接种为空白对照(control)。根据蝗虫每天死亡累计虫数采用DPS软件统计LT₅₀、LT₉₀，结果见附图4与表1。

从附图4与表1可以看出，绿僵菌空载体转化子(MaVT)与出发菌株(MaWT)接种蝗虫后存活率无明显差异，但接种5天后显著高于绿僵菌ATM转基因菌株(MaOE017)(p＜0.01)；接种后7天，MaOE017处理组蝗虫存活率小于10％，而MaVT与MaWT处理组存活率都约为60％。另外，MaWT LT₅₀较MaOE017处理组推迟1.2天(18.8％)，而LC₅₀为MaOE017处理组的约15倍(附表1)。这些说明：ATM超表达绿僵菌转基因菌株较出发菌株对寄主昆虫蝗虫的生物活性明显提高。

附表1绿僵菌ATM转基因菌株、空载体转化子与出发菌株对蝗虫室内防治效果比较

菌株	MaWT	MaVT	MaOE017
				LC50(conidia/ml)	(6.6±1.6)×106	(7.7±1.8)×106	(4.3±1.1)×105
LT50(days)*	6.4±0.5	6.2±0.9	5.2±0.3

3、白僵菌转基因菌株杀虫活性

本实验以白僵菌CQBb022菌株的寄主昆虫玉米螟为实验材料，测定白僵菌转基因菌株杀虫活性。

按上面方法配制浓度为至1.6×10⁵，8×10⁵，4×10⁶，2×10⁷，1×10⁸和5×10⁸个孢子/ml的白僵菌CQBb022孢子油悬浮液。选取3龄玉米螟幼虫，放入垫有滤纸的直径为9cm培养皿中，置于喷雾塔(BURKARD)载物台中央固定，调节气压为10psi，用50μl不同处理处理白僵菌孢子油悬浮液喷雾后将培养皿转入生测室，调节温度25-28℃，放入玉米叶。接种后，每12小时观察一次观察并记载各处理的死虫数。根据死亡后身体是否变硬判断为玉米螟是否为白僵菌侵染致死。以棉籽油接种为空白对照(control)。根据玉米螟每天死亡累计虫数采用DPS软件统计LT₅₀、LT₉₀。结果见附图5与表2。

从附图5与表2可以看出，白僵菌空载体转化子(BbVT)与出发菌株CQBb022(BbWT)接种蝗虫后存活率无明显差异(p＞0.05)，但在接种4天后显著高于白僵菌ATM转基因菌株BbOE113(p＜0.01)，接种后7天，当BbOE113玉米螟存活率小于5％，而BbWT与BbVT处理组存活率分别为47.9％与56.3％。BbWT对照组LT₅₀较Bb0E093处理组推迟约0.9天，而LC₅₀为BbOE093处理组的约13倍。这些说明：白僵菌ATM超表达转基因菌株较出发菌株对寄主昆虫玉米螟的生物活性明显提高。

附表2白僵菌ATM转基因菌株、空载体转化子与出发菌株对蝗虫室内防治效果比较

菌株	BbWT	BbVT	BbOE113
				LC50(conidia/ml)	(3.6±1.2)×107	(3.5±0.6)×108	(2.7±0.5)×106
LT50(days)*	6.7±0.4	6.5±0.6	5.5±0.3

4、感病蝗虫体内酸性海藻糖酶活性、海藻糖含量与绿僵菌生长量

将绿僵菌CQMa102出发菌株、ATM转基因菌株MaOE017与空白转化子MaVT孢子用大豆色拉油悬浮，配成2×10⁷个孢子/ml的油悬浮液，接种蝗虫后3、4、5、6天每处理取出10只蝗虫，停食2小时，将蝗虫放置于冰上10分钟，然后蝗虫后腿内侧关节膜采血。蝗虫血淋巴采集后加入10％体积的无菌冰冷抗凝血缓冲液(AC buffer：0.017M乙二胺四乙酸(EDTA)，0.041M柠檬酸，pH4.8)，6000rpm离心6分钟，分别收集上清与沉淀。以棉籽油接种后的蝗虫血淋巴为空白对照(Control)。

酸性海藻糖酶活性测定：取10ul上清置于1.5ml离心管中，加入20ul海藻糖底物溶液[含有50mM海藻糖的Mcllvaine缓冲液(22ml 0.1M柠檬酸+28ml 0.2M Na₂HPO₄；pH5.6)]，在30℃条件下反应30min；100℃水浴10分钟后冰浴5分钟，4℃下14000g离心5分钟之后取10ul上清置于96孔酶标板中，加入200ul葡萄糖检测试剂(北京中生)[含0.5mM 4-氨基安替吡啉，20mM羟基苯璜酸(p-hydroxybenzene sulphonate)，15,000U/l葡萄糖氧化酶和10,000U/l过氧化物酶]在27℃下显色40min，使用Model 550酶标仪(Bio-rad)，于在490nm下测光吸收值。根据葡萄糖标准品做标准曲线，计算酸性海藻糖酶活性(见附图6)。

酸性海藻糖酶同功酶分析：取50ul上清液用4℃ddH₂O稀释50倍后装入超滤管，4℃下8,000g离心脱盐浓缩，重复3次。脱盐浓缩液后采用宽pH范围两性电解质(pH 3-10)进行在水平板聚丙烯酰胺等电聚焦电泳(PAGE-IEF)。阴极电泳液与阳极电泳液分别为2mM NaOH与2mMH₃PO₄。电泳结束后，采用覆盖胶法对凝胶中酸性海藻糖酶进行活性显色：将10ml含有10g/l海藻糖的0.1M柠檬酸缓冲液(pH5.0)、50ul 1000U/ml葡萄糖氧化酶、50ul 2500U/ml过氧化物酶、2ml 25mg/mL 3-氨基-9-乙基-咔唑(溶解在丙酮中)与12ml 20g/l琼脂水溶液(60℃)混合后，均匀倾倒在凝胶表面，然后将凝胶放置在37℃下进行保温直到出现红棕色染色条带。用7％的乙酸对凝胶进行固定(见附图7)。

酸性海藻糖浓度测定：蝗虫的血淋巴上清液先用Mcllvaine缓冲液稀释3倍，然后于100℃加热10分钟，4℃下14000g离心5分钟；取20ul上清液加入2ul海藻糖酶(2.5U/ml，sigma)，混匀后于37℃保温16小时。设置空白对照反应，只加2ul海藻糖酶储藏液(50％甘油、1％Tritonx-100和25mM磷酸钾，PH 6.5)。16小时反应后，于100℃加热10分钟终止反应，接着将样品放在冰上冷却5分钟，然后将冷却后的样品10000rpm离心5分钟。取10ul上清液加入200ul葡萄糖测定试剂(北京中生)，26℃反应40分钟，使用Model550酶标仪(BioRad)，于490nm的处测定光吸收值，计算蝗虫血淋巴海藻糖含量(见附图8)。

蝗虫体内绿僵菌DNA浓度测定：利用离心后的沉淀提取DNA，以昆虫病原真菌特异引物9(5’-TGGCATCTTCTGAGTGGTG-3’)和引物10(5’-CCCGTTGCGAGTGAGTTA-3’)进行定量PCR，以绿僵菌DNA建立的标准曲线计算出蝗虫体内绿僵菌DNA浓度(见附图9)。

从附图6可以看出，感病蝗虫体内海藻糖降解酶活性随着侵染时间的延长从的0.15-0.3U/ml(接种后3天)逐渐升高到(0.4-0.6U/ml)(接种后6天)，都显著高于健康蝗虫体内0.08U/ml的水平(p＜0.01)；另外，绿僵菌ATM转基因菌株(MaOE017)处理组蝗虫体内海藻糖降解酶活性显著高于绿僵菌空载体转化子(MaVT)与出发菌株(MaWT)(p＜0.01)。由于感病蝗虫体内较空白对照(Control)多了一个新的等电点为4.7的海藻糖降解酶活性条带，该条带与绿僵菌体外分泌的酸性海藻糖降解酶等电点一致(Zhao H，et al.，2007)，并且蝗虫感病后其自身的海藻糖降解酶活性受到抑制(附图7)，说明感病蝗虫体内海藻糖降解酶活性由蝗虫体内绿僵菌分泌的酸性海藻糖酶量决定。附图7也表明：绿僵菌ATM超表达转基因菌株(MaOE017)处理组蝗虫体内海藻糖降解酶活性明显高于绿僵菌空载体转化子(MaVT)与出发菌株(MaWT)。相应的，从附图8可以看出，绿僵菌ATM超表达转基因菌株(MaOE017)处理组蝗虫体内海藻糖浓度显著低于空载体转化子(MaVT)与出发菌株(MaWT)，生物量显著高于绿僵菌空载体转化子(MaVT)与出发菌株(MaWT)处理组。这些说明：ATM超表达绿僵菌转基因菌株在寄主昆虫体内通过超量表达ATM基因，提高寄主昆虫体内血淋巴中ATM的活性，增强绿僵菌利用寄主昆虫体内血淋巴中海藻糖的能力，促进绿僵菌在昆虫体内生长，从而提高菌株的杀虫活性。

实施例2

昆虫病原真菌转基因工程菌株MaOE017孢子粉真菌农药的制备：

将1ml浓度为10⁷个/ml的绿僵菌转基因工程菌株MaOE017成熟分生孢子水悬浮液接种于装有100ml 1/4强度萨氏液体培养基(1/4SDA)(10g/l葡萄糖，2.5g/l蛋白胨，5.0g/l酵母浸膏，初始pH 6.5)的250ml三角瓶中，28℃，150rpm振荡培养3天，准备液体菌种；将大米在室温(25℃)用自来浸泡4小时候后装入蘑菇袋中，121℃灭菌30分钟后冷却至25℃；按重量比为1∶10的比例接种转基因工程菌株MaOE017液体菌种，混合均匀，28℃下培养15天后用干燥器中用变色硅胶干燥，用80目筛网收集绿僵菌转基因菌株MaOE017干孢子粉真菌农药，4℃密封保存。

实施例3

昆虫病原真菌转基因工程菌株MaOE017油悬浮剂真菌农药的配制：

将800g的菜籽油和200g含绿僵菌转基因菌株MaOE017干孢子粉放在搅拌机中(1000-1500转/分钟)混合20分钟均匀，用80目滤网过滤后配置成20％的绿僵菌油悬浮剂真菌农药，用油稀释3-5倍后采用超低容量技术喷雾。

实施例4

昆虫病原真菌转基因菌株MaOE017可湿性粉剂真菌农药的配制：

将200g含500亿孢子/克绿僵菌转基因菌株MaOE017干孢子粉、740g硅藻土、30g脂肪醇聚氧乙烯醚、20g烷基酚聚氧乙烯醚、10g司班放在搅拌机中(1000-1500转/分钟)混合20分钟均匀，用80目滤网过筛后配制成100亿孢子/克可湿性粉剂真菌农药，使用时用水稀释500-2000倍后采用喷雾。

Claims (3)

1.一种昆虫病原真菌转基因菌株，其特征在于：

所述转基因菌株是通过PCR聚合酶链式反应扩增绿僵菌CQMa102酸性海藻糖酶基因全长cDNA核酸序列，并将其克隆到以除草剂抗性基因——Bar基因为筛选标记的真菌表达载体pBarEx或以Benomyl抗性基因——β-微管蛋白基因为筛选标记的真菌表达载体pBGFP，使ATM基因处于来自构巢曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶gpdA基因的启动子或磷酸丙糖异构酶tpiA 基因的启动子与色氨酸合成酶trpC基因的终止子控制之下，得到海藻糖酶基因组成型表达载体pBarEx-ATM或pBGFP-ATM；再建立利用基因枪法转化绿僵菌液生分生孢子的体系，将pBarEx-ATM或pBGFP-ATM整合到绿僵菌基因组中；最后经过抗性筛选和聚合酶链式反应法筛选得到的；所述pBarEx是根据pBGFP构建的：设计引物1与引物2，从构巢曲霉基因组DNA中扩增色氨酸合成酶启动子PtryC序列；设计引物3与引物4，从pCAMBIA 3300中扩增Bar基因序列；以引物1与引物4，采用融合PCR扩增PtryC控制下的Bar盒；将pBGFP与Bar盒分别采用AatII与BamHI双酶切后，用T4连接酶连接构建成丝状真菌表达载体pBarEx；所述引物1为5’-attagacgtcgcaggtcgacagaagaatgac-3’，下划线为Aat II酶切位点；所述引物2为5’-gtcggccgggcgtcgttctgggctcatggtagatccactagagcggccgc-3’；所述引物3为5’-gcggccgctctagtggatctaccatgagcccagaacgacgcccggccgac-3’，与引物2反向互补序列，其中atg为Bar基因起始密码子；所述引物4为5’-cgcggatccagcttttattagatctcggtgac-3’，下划线为BamHI酶切位点。

2.如权利要求1所述的昆虫病原真菌转基因菌株的制备方法，其特征在于：

a. 构建酸性海藻糖酶基因组成型表达载体

首先根据pBGFP构建丝状真菌表达载体pBarEx：设计引物1与引物2，从构巢曲霉基因组DNA中扩增色氨酸合成酶启动子PtryC序列；设计引物3与引物4，从pCAMBIA 3300中扩增Bar基因序列；以引物1与引物4，采用融合PCR扩增PtryC控制下的Bar盒；将pBGFP与Bar盒分别采用AatII与BamHI双酶切后，用T4连接酶连接构建成丝状真菌表达载体pBarEx；所述引物1为5’-attagacgtcgcaggtcgacagaagaatgac-3’，下划线为Aat II酶切位点；所述引物2为5’-gtcggccgggcgtcgttctgggctcatggtagatccactagagcggccgc-3’；所述引物3为5’-gcggccgctctagtggatctaccatgagcccagaacgacgcccggccgac-3’，与引物2反向互补序列，其中atg为Bar基因起始密码子；所述引物4为5’-cgcggatccagcttttattagatctcggtgac-3’，下划线为BamHI酶切位点；

其次，根据绿僵菌CQMa102酸性海藻糖酶基因全长cDNA核酸序列设计的引物5与引物6，以绿僵菌CQMa102 cDNA为模板，通过聚合酶链式反应扩增出两端分别带有ClaI与SmaI酶切位点的3303bp的ATM基因全长cDNA序列，并将其克隆到丝状真菌表达载体pBarEx或pBGFP的ClaI和SmaI位点之间，使ATM基因处于来自构巢曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶gpdA基因的启动子与色氨酸trpC基因的终止子控制之下，得到海藻糖酶基因组成型表达载体pBarEx-ATM或pBGFP-ATM；pBarEx-ATM或pBGFP-ATM表达载体用CaCl₂法转入大肠杆菌中并进行扩增，载体大量提取的产物经SpeI线性化后去磷酸，再经酚-氯仿抽提得到所述线性化组成型表达载体；所述引物5为5’-ccatcgatatgcgcgcgactcccatg-3’，下划线为ClaI酶切位点；所述引物6为5’- tcccccgggctaaaacgctctaccctt -3’，下划线为SmaI 酶切位点；

b. 建立利用基因枪法转化昆虫病原真菌液生分生孢子的体系

将1ml浓度为10⁷个/ml的绿僵菌CQMa102成熟分生孢子水悬浮液接种于装有100ml 1/4 强度萨氏液体培养基的250ml三角瓶中，28℃，250rpm振荡培养3天，四层灭菌纱布过滤后6000g离心5分钟沉淀液生分生孢子，用无菌水重悬清洗2次，最后20%无菌甘油重悬使孢子浓度达10⁸个/ml，分装后-80℃保存；所述萨氏液体培养基为10g/l葡萄糖，2.5g/l蛋白胨，5.0g/l酵母浸膏，初始pH 6.5；

c.转化与筛选

转化时取出50μl所述液生分生孢子悬浮液于灭菌平皿中央，使其直径达到1cm，然后放入75%乙醇消毒的基因枪室内用于转化；按照Bio-Rad系统提供的方法进行金粉的处理和线性载体pBarEx-ATM或pBGFP-ATM的包埋，并利用该系统进行微粒子轰击；轰击后在超净台上取出孢子液，用5ml 无菌水稀释，取100μl涂布于除草剂草丁膦或苯莱特筛选培养基平板上，28℃培养；绿僵菌采用80μg/ml PPT或5μg/ml苯莱特的查氏平板筛选，10天后挑取正常生长单菌落，在相应筛选培养基与1/4SDA平板上交替传代5次后提取DNA，利用5’- gactgcccgc attgagaag -3’与5’-agatggagga gttggtgttg-3’的特异引物对，经PCR验证转基因菌株Bar基因，或利用5’-gcttactcctccttgacaccac-3’与5’-agccgagtatggtaaccaaggg-3’的特异引物对，验证转基因菌株β-Tubulin基因，得到稳定转基因菌株。

3.如权利要求1所述的昆虫病原真菌转基因菌株在制备真菌农药中的应用。

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