CN104357475B

CN104357475B - 一株金龟子绿僵菌转基因菌株及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN104357475B
Application number: CN201410542584.5A
Authority: CN
Inventors: 张凡; 廖慧萍; 张洁; 刘新; 祝金宝; 卢敏
Original assignee: Shandong Normal University
Current assignee: Shandong Normal University
Priority date: 2014-10-14
Filing date: 2014-10-14
Publication date: 2017-05-24
Anticipated expiration: 2034-10-14
Also published as: CN104357475A

Abstract

本发明公开了一株金龟子绿僵菌转基因菌株及其制备方法与应用，由金龟子绿僵菌基因与外源类枯草杆菌蛋白酶Pr1a基因融合构建的重组工程菌。该金龟子绿僵菌转基因菌株以金龟子绿僵菌为基础，利用Pgpd作为强的启动子，TTrpC作为终止子，Basta作为筛选标记，利用融合PCR的方法构建类枯草杆菌蛋白酶Pr1al过表达盒，然后制备真菌原生质体，利用CaCl₂‑PEG法进行基因工程改造，将过表达盒随机插入金龟子绿僵菌基因组中，进行过表达。本发明的金龟子绿僵菌转基因菌株对德国小蠊灭杀效果好，毒力较强，能够在短时间内实现对德国小蠊种群有效控制。

Description

一株金龟子绿僵菌转基因菌株及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一株金龟子绿僵菌转基因菌株及其制备方法与应用，具体的涉及一种含有外源类枯草杆菌蛋白酶基因，经基因重组得到的金龟子绿僵菌及其制备方法与应用。

背景技术

德国小蠊，俗称蟑螂，是常见的世界性卫生害虫之一，能够携带多种细菌、病毒及寄生虫卵，导致疾病的传播，其分泌物或死亡虫体还能导致严重的机体过敏。自传入国内以来，因其对栖息场所的适应性强、繁殖快，易对化学杀虫剂产生耐药性，对我国的侵害程度日趋严重。

目前，对德国小蠊的防治仍以化学防治为主，但高毒、高残留的化学杀虫剂的长期大量使用引起了一系列的环境和食品安全问题，因此减少化学杀虫剂的使用势在必行，以生物防治为主的害虫防治策略逐渐受到广泛的重视。生物防治具有对人畜的安全性高，无公害，无残留，有利于保持生态平衡和环保等优点，而被认为是对付高抗害虫的最有前途的技术手段。

金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)，属于半知菌亚门绿僵菌属，是一种昆虫内寄生菌物。它对寄主的侵染过程包括粘附、孢子萌发、穿透虫体、体内发育和致死，这一过程是附着胞、表皮降解酶和破坏菌素等物质的生理生化作用的综合结果，该菌通过体壁接触感染导致害虫死亡，在侵染昆虫体壁过程中分泌一系列的胞外水解酶如蛋白酶，几丁质酶等，降解昆虫体壁引起昆虫致病并死亡，其中研究最多的是胞外蛋白酶系。金龟子绿僵菌产生的胞外蛋白酶在入侵寄主体壁的过程中起重要作用，其产生水平和活性高低是决定金龟子绿僵菌侵染能力的重要因素。

类枯草杆菌蛋白酶(subtilisin-like protease A，Prla)是胞外蛋白酶的一类，在降解昆虫体壁，并激活昆虫自毒免疫体系，引起害虫致病作用中起主要作用，已被证明是重要的致病因子。已有研究证实，组成性表达在穿透昆虫体壁过程中起重要作用的Pr1a类蛋白酶基因Pr1a显著提高了金龟子绿僵菌对烟草天蛾的毒力。

自1973年Mishra和Tatum首次报道肌醇缺陷型粗糙链孢霉的DNA转化以来，丝状真菌遗传转化研究发展非常迅速，目前已有100多种丝状真菌实现了转化。转化方法包括CaCl₂-PEG转化法，基因枪法，电激转化法及农杆菌介导转化法(ATMT)等。其中，CaCl₂-PEG转化法以原生质体作为受体细胞，具有群体数量大、容易获得纯合性的转化子等优点，近年来在病原真菌的遗传转化中得到广泛应用。Bogo等通过PEG转化法，将带有苯菌灵抗性的质粒pBT6导入金龟子绿僵菌，转化率为0.8～6.9个转化子/μg DNA。Inglis等同样利用PEG介导转化法将pBT6质粒导入玫烟色拟青霉和淡紫拟青霉中。Sandhu等采用PEG介导法，成功的进行了白僵菌的遗传转化，线性和圆形的质粒Psv50的转化率分别为4和6个转化子/μgDNA。

在德国小蠊生物防治的过程中，以昆虫病原真菌-绿僵菌ESC-1为主要成分的灭蟑盒(Biopath毒饵)较为成功，在实际应用中也取得了一定的效果，但昆虫病原真菌杀虫剂灭杀效果通常较慢，毒力较弱，难以短时间内实现对德国小蠊种群的有效控制。

发明内容

本发明的目的是提供一种对德国小蠊灭杀效果好，毒力较强，能够在短时间内实现对德国小蠊种群有效控制的金龟子绿僵菌转基因菌株。该金龟子绿僵菌转基因菌株以金龟子绿僵菌为基础，利用Pgpd作为强启动子，TTrpC作为终止子，Basta作为筛选标记，利用融合PCR的方法构建类枯草杆菌蛋白酶Pr1a过表达盒，然后制备真菌原生质体，利用CaCl₂-PEG介导法进行基因工程改造，将过表达盒随机插入金龟子绿僵菌基因组中，进行过表达，进一步增强其对德国小蠊的灭杀效果。

本发明的另一目的是提供该金龟子绿僵菌转基因菌株在防治德国小蠊中的应用。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

一株金龟子绿僵菌转基因菌株，由金龟子绿僵菌基因与外源类枯草杆菌蛋白酶Pr1a基因融合构建的重组工程菌。

具体的，上述金龟子绿僵菌转基因菌株的构建方法如下：

(1)根据GenBank上登录号为EU526905的类枯草蛋白酶Pr1a基因的序列，设计PCR引物，引物序列如下：

5'-aacatatgcatctgtctgctcttct-3'，如序列表中SEQ.ID.NO 1所示；

5'-ggcctaggttaggcaccgttgtaggcaa-3'，如序列表中SEQ.ID.NO 2所示。

根据上述引物序列，以金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)菌株基因组DNA为模板，扩增出Pr1a基因片段，片段长度为1378bp，序列片段如序列表中SEQ.ID.NO 3所示：

(2)利用Pgpd作为强的启动子，TTrpC作为终止子，Basta作为筛选标记，利用融合PCR的方法构建过表达盒。

(3)采用二级培养法收集金龟子绿僵菌菌丝体，制备金龟子绿僵菌湿菌丝原生质体；

(4)将步骤(2)制备的过表达盒采用CaCl₂-PEG介导法导入到步骤(3)制备的金龟子绿僵菌原生质体中，将过表达盒随机插入金龟子绿僵菌基因组中，进行过表达；

(5)筛选分离basta抗性能够稳定遗传的金龟子绿僵菌重组菌株。

步骤(2)中，用于扩增Pgpd启动子的引物序列为：

M1号引物：CGGAGAATATGGAGCTTCATCG，如序列表中SEQ.ID.NO 4所示；

M2号引物：AGAAGAGCAGACAGATGCATGGGAAAAGAAAGAGAAAAGA，如序列表中SEQ.ID.NO5所示；

用于扩增TTrpC终止子的引物序列为：

M5号引物：ACAACGGCAACGGTGCCTAAGATCCACTTAACGTTACTGA，如序列表中SEQ.ID.NO8所示；

M6号引物：CAGTTCTTCTCGGCGTTAACCCAGGGGCTGGTGACGG，如序列表中SEQ.ID.NO 9所示；

步骤(3)中，金龟子绿僵菌原生质体的制备方法为：以0.7mol/L的NaCI溶液作为渗透压稳定剂，20mL原生质体Buffer，30℃酶解处理5小时。

本发明的金龟子绿僵菌重组菌株可以采用固体发酵法获取大量孢子用作防治德国小蠊的生防材料。

采用固体发酵优化培养基进行发酵，固体发酵优化培养基配方：以大米为发酵物料，按质量比为1：0.3加入质量百分数为0.02％CuSO4、1％硝酸钠、1％微量元素混合液；

培养条件为：发酵温度为26-28℃，初始pH值为5.5-6.5，发酵前期保持高湿，后期降湿，发酵周期12-15天，得率平均达到16亿孢子/克。

本发明的有益效果：

(1)本发明的金龟子绿僵菌转基因菌株，通过过表达类枯草杆菌蛋白酶，提高了对德国小蠊的杀虫毒力，改善了其生物安全性，具有良好的生产应用前景。

(2)本发明制备的金龟子绿僵菌转基因菌株，在有丝分裂的过程中basta抗性能够稳定遗传，转化体系高效、稳定、可靠。

(3)制备方法简单，重现性强。

附图说明

图1为过表达盒结构示意图；

图2为过表达盒各片段电泳图；从左到右依次是marker，Pgpd，pr1a,TTrpc,Pgpd+pr1a+TTrpc，Basta。

具体实施方式

结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实施例1

一株金龟子绿僵菌转基因菌株的制备方法：

首先，根据GenBank上登录号为EU526905的类枯草蛋白酶Pr1a基因的序列，设计PCR引物，引物序列如下：

5'-aacatatgcatctgtctgctcttct-3'，如序列表中SEQ.ID.NO 1所示；

5'-ggcctaggttaggcaccgttgtaggcaa-3'，如序列表中SEQ.ID.NO 2所示。

其次，利用Pgpd作为强的启动子，TTrpC作为终止子，Basta作为筛选标记，利用融合PCR的方法构建过表达盒，构建的过表达盒的结构示意图如图1所示。过表达盒中各片段的电泳图如图2所示。

过表达盒构建的具体方法为：利用融合PCR的原理，设计引物，在引物中添加接头，具体引物如下：

M1号引物：CGGAGAATATGGAGCTTCATCG，如序列表中SEQ.ID.NO 4所示；

M3号引物：ATGCATCTGTCTGCTCTTCT，如序列表中SEQ.ID.NO 6所示；

M4号引物：TTAGGCACCGTTGCCGTTGT，如序列表中SEQ.ID.NO 7所示；

M7号引物：AACGCCGAGAAGAACTG，如序列表中SEQ.ID.NO 10所示；

M8号引物：ACAAGTGTACCTGTGCATTCTGGG，如序列表中SEQ.ID.NO 11所示；

M9号引物：GGCAGTAAGCGAAGGAGAAT，如序列表中SEQ.ID.NO 12所示；

M10号引物：GTATTGGGTGTTACGGAGCA，如序列表中SEQ.ID.NO 13所示。

通过M1和M2号引物，M5和M6号引物，M7和M8号引物分别扩增出Pgpd启动子，TTrpC终止子和basta抗性基因(抗草胺膦)，提取金龟子绿僵菌(中国普通微生物菌种保藏管理中心保存，菌种编号3，3676，在中国科学院微生物研究所可以购买得到)的染色体，利用M3和M4号引物扩增出pr1a片段。

利用KOD Fx酶将扩增出的Pgpd，pr1a，TTrpC这三个片段按摩尔比1：3：1的比例加入到PCR的反应体系中融合。

PCR反应体系为：

反应条件为：

反应之后将PCR反应产物稀释10倍后当模板，然后利用M1和M6号引物扩增出这三个片段的全长。全长序列如序列表中SEQ.ID.NO 14所示。

切胶回收后将其命名为m，与basta片段按摩尔比1:1的比例加入到PCR反应体系中进行融合

反应体系为：

反应条件为：

反应之后将PCR反应产物稀释10倍后当模板，用M9和M10号引物扩增出整个过表达盒的全长。全长序列如序列表中SEQ.ID.NO 15所示：

各基因片段通过PCR连接的基本原理为：M1和M2号引物PCR得到Pgpd启动子,M3和M4号引物扩增出pr1a片段,M5和M6号引物PCR得到TrpC终止子。因为引物M2的5’端AGAAGAGCAGACAGATGCAT与pr1a片段的5’端序列ATGCATCTGTCTGCTCTTCT互补,M5的5’端ACAACGGCAACGGTGCCTAA与M4互补配对，即与pr1a片段的3’端互补配对，所以依据本领域常规技术即以M1和M2号引物PCR得到的Pgpd启动子，通过片段ATGCATCTGTCTGCTCTTCT与M3和M4号引物扩增出pr1a搭桥后的片段，又通过片段ACAACGGCAACGGTGCCTAA与以M5和M6为引物PCR得到的TrpC终止子片段互补搭桥形成模板,最后可通过M1和M6扩增得到Pgpd启动子和pr1a片段以及TrpC终止子相连的片段m。M6的5’端与basta表达框架(M7和M8号引物扩增)存在互补序列，同理可通过PCR将片段m和basta表达框架连接。

采用二级培养法收集金龟子绿僵菌(中国普通微生物菌种保藏管理中心保存，菌种编号3，3676，在中国科学院微生物研究所可以购买得到)的菌丝体，在以0.7mol/L的NaCl溶液作为渗透压稳定剂，20mL原生质体Buffer，30℃处理5小时的酶解条件下，可形成金龟子绿僵菌湿菌丝原生质体，原生质体悬液在显微镜下(40×10)利用血球计数板计数，稀释至原生质体浓度为500sp/mL，取200μL与再生培养基的上层培养基混合均匀，再倾倒于已铺好的底层再生培养基上，取原生质体悬液200μL涂布平皿，重复三次，将原生质体用无菌水做低渗处理，涂皿作为对照，于27℃培养，3d后检查生长情况，根据再生率公式：

再生率＝(再生菌落数一对照处理再生菌落数)/镜检原生质体/mL×0.2×100％，计算原生质体的再生率，结果为15％。

再生培养基由底层再生培养基和上层培养基组成，底层再生培养基配方(1000ml)：3g酵母浸出物，3g酪氨酸水解物，20g蔗糖，20g琼脂糖，38.9g NaCl；上层培养基配方：琼脂粉7g，其余成分同底层培养基。

将构建好的过表达盒采用CaCl₂-PEG介导法导入到金龟子绿僵菌原生质体中，将过表达盒随机插入金龟子绿僵菌基因组中，进行过表达，以不加过表达盒DNA和不加原生质体为对照。28℃培养箱培养4d，在选择性再生培养基(选择性再生培养基由底层培养基和上层培养基组成，底层培养基配方(1000ml)：3g酵母浸出物，3g酪氨酸水解物，20g蔗糖，20g琼脂糖，38.9g NaCl，终浓度为4000U/mL的basta；上层培养基配方：琼脂粉7g，其余成分同底层培养基。)上生长的菌落即为转化子。在对照没有生长的前提下，统计转化平板上的抗性菌落数，计算转化率；

转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积/涂板菌液体积；

转化率(转化子数/每μg质粒DNA)＝转化子总数/质粒DNA加入量(μg)，

结合3次转化结果，转化率可达到22±4个转化子/μg DNA。将转化子接种到含4000U/mL basta的PDAY培养基(产孢培养基)上，培养2d，再进行划线，采用单孢分离法将纯化的转化子接种到含有4000U/mL basta的PDAY平板上继续培养。

PDAY培养基配方(1000ml)：马铃薯洗净去皮，取200克切成小块，加水1000毫升，煮沸半小时后，在滤液中加入20克琼脂，煮沸溶解后加蔗糖20克，5g酵母浸出物。

转化绿僵菌3d后，在含4000U/mL basta的选择性培养基上筛选，发现转化时不加表达盒DNA的对照处理无菌落出现，加入表达盒DNA的处理出现了抗G418的绿僵菌再生菌落。挑取所出现的菌落，转接至含4000U/mL basta的PDAY选择性培养基上培养，发现全部生长。结合几次转化结果，该试验方案转化子的出现频率约22±4个转化子/μg DNA。随机挑选转化子，与对照同时接种于含4000U/mL basta的PDAY培养皿中，每皿接种对照和转化子。培养1周，发现对照没有长出菌落，转化子长出菌落，这说明得到的不是流产型转化子。

对得到的193株转化子在非选择压力培养基(PDAY培养基)上培养,再制成孢子悬液,分别在不含basta和含basta的PDAY培养基上培养3d，分别计数长出的菌落数，计算转化子的稳定率，转化子稳定率＝选择性培养基上的菌落数/产孢培养基上的菌落数×100％。

结果在193株转化子中有170株在含有basta的选择性培养基上菌落数为零，为得到的转化子总数的88.0％，这些转化子的稳定率为0％，编号为TP4、TP19和TP20转化子的稳定率分别达到60.1％、10.6％和3.8％，表明这3个转化子在有丝分裂过程中含有basta抗性基因的后代在减少，其余的TP1等20株转化子稳定率均为100％，表明这些转化子在有丝分裂过程中basta抗性能够稳定遗传。

挑取绿僵菌的20个稳定转化子，分别转接至产孢培养基平皿上，27℃培养7d，挑孢子转接至另一产孢培养基平皿上，连续转接10次后，转至含4000U/mL basta的选择性培养基上培养。继代培养转化子,发现在无basta选择压力的条件下，转化子依然保持basta的抗性，证明了插入标记的稳定性,从而表明该转化体系具有高效、稳定、可靠和简便的特点。

实施例2

prla蛋白酶活力的测定：

参照St.Leger等人的方法(1987)，利用专一性短肽底物SUC-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA(Sigma)进行Prl蛋白酶活性测定，以出发菌株金龟子绿僵菌为对照，以本实施例1制备的表达prla蛋白酶的重组菌株Tp1为样品，分别测定其在蝉蜕诱导培养基和非诱导培养基(LB培养基)50h小时的prla蛋白酶活性。

蝉蜕培养基配方(g/L)：蝉蜕粉2.0g，KH₂PO₄0.2g，MgSO₄0.2g，琼脂粉2g，pH8.0；

LB培养基(g/L)：蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，1.5g琼脂粉，pH7.2。

酶活力测定结果表明：非诱导条件下，出发菌株未检测到蛋白酶活性，重组菌株比酶活力约18U/mg；在诱导培养条件下，两菌株均检测到较高的prla蛋白酶活性，分别为16U/mg和22U/mg，重组菌株相对于出发菌株，酶活力约提高37.5％。表明重组菌株成功实现类枯草杆菌蛋白酶prla的组成型表达。

实施例3

菌株的毒力测定：

将实施例1制备的金龟子绿僵菌重组菌株Tp1分散在市售棉籽油中，配成最终孢子浓度为1×10⁸个/mL的油悬浮剂，以金龟子绿僵菌出发菌株作对照。从培养缸中选取羽化2～d天体重一致的雄性蟑螂成虫作为试虫，用微量移液枪取1μL油悬浮剂接种蟑螂前胸背板下，放入培养缸中，调节温度26～28℃，相对湿度50～60％，光照周期16hL/8hD。设置棉籽油空白对照。每次处理50头虫，重复三次。每天更换新鲜鼠粮，每天定时观察并记载各处理的死虫数，以镊子轻触虫体，足和虫翅不动为死亡。

根据以下公式计算蟑螂的死亡率和校正死亡率：

死亡率(％)＝(处理前虫数-处理后虫数)÷处理前虫数×100％

校正死亡率(％)＝(处理死亡率-对照死亡率)÷(100-对照死亡率)×100％

结果见表1。

表1 点滴毒力测定12天结果

实施例4

用于防治德国小蠊的生防材料：

制备方法为：将本发明实施例1制备的金龟子绿僵菌重组菌株，采用固体发酵法获取大量孢子用作防治德国小蠊的菌剂。

培养条件为：发酵温度为28℃，初始pH值为6.0，发酵前期保持高湿，后期降湿，发酵周期13天，得率平均达到16亿孢子/克。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims

1.一株金龟子绿僵菌转基因菌株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为3, 3676的金龟子绿僵菌的染色体，利用M3和M4号引物扩增出pr1a片段；所述M3和M4号引物如序列表中SEQ.ID.NO6和SEQ.ID.NO 7所示；

(2)利用Pgpd作为强的启动子，TTrpC作为终止子，Basta作为筛选标记，利用融合PCR的方法构建过表达盒；

(5)筛选分离basta抗性能够稳定遗传的金龟子绿僵菌重组菌株；

步骤(2)中，用于扩增Pgpd启动子的引物序列为：

M1号引物：CGGAGAATATGGAGCTTCATCG，如序列表中SEQ.ID.NO 4所示；

M2号引物：AGAAGAGCAGACAGATGCATGGGAAAAGAAAGAGAAAAGA，如序列表中SEQ.ID.NO 5所示；

用于扩增TTrpC终止子的引物序列为：

M5号引物：ACAACGGCAACGGTGCCTAAGATCCACTTAACGTTACTGA，如序列表中SEQ.ID.NO 8所示；

通过M1和M2号引物，M5和M6号引物，M7和M8号引物分别扩增出Pgpd启动子、TTrpC终止子和basta抗性基因；

所述M7和M8号引物如序列表中SEQ.ID.NO 10和SEQ.ID.NO 11所示；

2.如权利要求1所述的金龟子绿僵菌转基因菌株的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，构建的过表达盒的全长序列如序列表中SEQ.ID.NO 15所示。

3.如权利要求1所述的金龟子绿僵菌转基因菌株的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，金龟子绿僵菌原生质体的制备方法为：以0.7mol/L的NaCl溶液作为渗透压稳定剂，20mL原生质体Buffer，30℃酶解处理5小时。

4.权利要求1至3任一项所述的方法制备的金龟子绿僵菌转基因菌株。

5.权利要求4所述的金龟子绿僵菌转基因菌株在制备防治德国小蠊的生物防治材料中的应用。

6.一种用于德国小蠊生物防治的菌剂，其特征在于，由权利要求4所述的金龟子绿僵菌转基因菌株经固体发酵法制得；

发酵培养条件为：发酵温度为26-28℃，初始pH值为5.5-6.5，发酵周期12-15天；

固体发酵优化培养基配方：以大米为发酵物料，按质量比为1：0.3加入质量百分数为0.02％CuSO₄、1％硝酸钠、1％微量元素混合液。