KR101621709B1 - 식물 생장을 촉진하는, 수지상 균근 균 및 슈도모나스 코리엔시스 균주 혼합물 및 이의 용도 - Google Patents

식물 생장을 촉진하는, 수지상 균근 균 및 슈도모나스 코리엔시스 균주 혼합물 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR101621709B1
KR101621709B1 KR1020160013245A KR20160013245A KR101621709B1 KR 101621709 B1 KR101621709 B1 KR 101621709B1 KR 1020160013245 A KR1020160013245 A KR 1020160013245A KR 20160013245 A KR20160013245 A KR 20160013245A KR 101621709 B1 KR101621709 B1 KR 101621709B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
strain
mixture
amf
pseudomonas
plant
Prior art date
Application number
KR1020160013245A
Other languages
English (en)
Inventor
사동민
셀바쿠마 고팔
김기윤
멜빈 조 마노하란
Original Assignee
충북대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 충북대학교 산학협력단 filed Critical 충북대학교 산학협력단
Priority to KR1020160013245A priority Critical patent/KR101621709B1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101621709B1 publication Critical patent/KR101621709B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/04—
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12R1/38—
    • C12R1/645—

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 식물 생장을 촉진하는 수지상 균근 균 및 슈도모나스 코리엔시스 균주의 혼합물 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에서는 분리된 수지상 균근 균(AMF)인 클라로이데오글로머스 라멜로섬 S-11 균주와 공생박테리아인 슈도모나스 코리엔시스 S2CB35 균주 혼합물을 식물에 처리한 결과, 클라로이데오글로머스 라멜로섬 S-11 균주 및 슈도모나스 코리엔시스 S2CB35 균주 각각을 처리한 것보다 식물의 생장을 더욱 촉진시키는 것을 확인하였다. 본 발명의 클라로이데오글로머스 라멜로섬 S-11 균주와 슈도모나스 코리엔시스 S2CB35 균주 혼합물을 함유하는 미생물 제제는 식물 생장을 촉진시킬 수 있으므로, 이를 이용하면 식물의 생산량 증대에 이바지할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

식물 생장을 촉진하는, 수지상 균근 균 및 슈도모나스 코리엔시스 균주 혼합물 및 이의 용도{Mixture of arbuscular mycorrhizal fungi and Pseudomonas koreensis strain promoting plant growth and uses thereof}
본 발명은 식물 생장을 촉진하는 수지상 균근 균 및 슈도모나스 코리엔시스 균주 혼합물 및 이의 용도에 관한 것이다.
세포내 박테리아와 진핵성 유기체 사이의 공생 관계는 동물에서 폭넓게 연구되어 왔으며, 식물에서도 그러하다. 그러나, 오직 소수의 보고에서만 수지상체 균근, 외균근 및 뮤코르마이코티나(Mucormycotina) 균류에서의 엔도박테리아의 존재여부를 설명했을 뿐이다. 수지상 균근 균(AMF, Arbuscular Mycorrhizal Fungi)은 조건형 및 절대형 엔도박테리아의 양측 모두에 해당한다. 조건형 엔도박테리아는 인공 배지에서 생장할 수 있는 반면, 절대형 엔도박테리아는 실험실 조건에서는 배양가능하지 않다. 절대형 엔도박테리아의 경우, 유전체 크기는 진화시간이 지나면서 줄어들고, 박테리아의 생애 주기 완료는 숙주에 완전히 좌우된다. 토양 박테리아는 포자 벽 또는 균사 손상을 통해 AMF로 침입하며, AMF와 공생 관계를 발전시켜 나간다.
토양 내에 존재하는 많은 박테리아는 식물 뿌리와 공생 관계를 형성함으로써 식물에 몇가지 혜택을 제공한다. 공생은 숙주 식물에 특화된 구축물 또는 뿌리혹 (nodule)의 형성과 관련된다. 또한, 특히 근권 (rhizosphere)에 존재하는 자유 생활 토양 박테리아 (free living soil bacteria)가 간접적 또는 직접적으로 식물 생장을 촉진하는 것으로 나타났다. 식물 생장 촉진 박테리아 (PGPB)로도 알려진 유익한 자유 생활 박테리아는 화합물의 합성 및 환경으로부터 영양분 흡수의 증가를 촉진함으로써 직접적으로 식물 생장을 촉진하는 반면, 간접적 촉진은 식물의 생물적 및 비생물적 스트레스의 완화와 관련된다. 각 PGPB는 대기 질소 고정, 다양한 식물 호르몬의 생산, 미네랄의 가용화, 사이더포어 (siderophore)의 생산 및 효소의 합성과 같은 식물 생장을 촉진하기 위한 다양한 방법을 갖는다.
AMF 균사 생장, 군집화 및 포자 생산에 대한 PGPB의 유익한 영향이 이미 보고된 바 있다. 균근 균의 생장 및 활성을 강화하는 PGPB는 균근 헬퍼 박테리아(MHB)로 지칭된다. AMF는 자연 환경에서 식물뿐만 아니라, 많은 박테리아와도 상호작용한다. 한편, 많은 토양 및 식물 내생 박테리아가 다양한 환경 조건 하에서 식물 생장을 촉진하는 것으로 연구 및 보고되어 왔다 (Jalil et al. 2009 J Plant Physiol 166:667-674). 일부 연구는 염분 조건 하에서 식물 생장 및 영양분 흡수에 대한 AMF 및 식물 생장 촉진 (PGP) 박테리아의 공동-접종 (co-inoculation) 효율에 대해 보고했다. 대부분의 연구들은 단지 AMF 및 PGP의 단일 접종에 의한 식물 생장에 대해서만 집중한다. 따라서, 본 발명자는 AMF 및 PGP 혼합물(consortium)의 개발은 효과적인 생체-접종원 (bio-inoculant)일 수 있다는 것을 가정한다. 또한, 본 발명자는 옥수수 식물 생장에 대한 AMF 및 PGP의 단일 및 혼합 접종의 효과를 연구하기 위해 본 발명의 목표를 고안하였다.
한편, 한국등록특허 제1563349호에서는 '염 스트레스 조건에서 식물 생장을 촉진하는 수지상 균근 균 및 마실리아 속 RK4 균주 혼합물 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2006-0000730호는 '슈도모나스 플루오레센스 ＭＣ07 및 바실러스메가테리움의 혼합균주를 함유하는 미생물 비료'가 개시되어 있다. 그러나 본 발명에서와 같이, '식물 생장을 촉진하는 수지상 균근 균 및 슈도모나스 코리엔시스 균주 혼합물 및 이의 용도'에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 수지상 균근 균(AMF, Arbuscular Mycorrhizal Fungi)인 클라로이데오글로머스 라멜로섬(Claroideoglomus lamellosum) S-11 균주(KCTC18442P)와 상기 AMF 포자 표면으로부터 슈도모나스 코리엔시스(Pseudomonas koreensis) S2CB35 균주(KCTC18443P)를 분리 동정하였다.
또한, 본 발명에서는 분리된 클라로이데오글로머스 라멜로섬 S-11 균주(KCTC18442P) 및 슈도모나스 코리엔시스 S2CB35 균주(KCTC18443P) 혼합물을 식물에 처리한 결과, 클라로이데오글로머스 라멜로섬 S-11 균주(KCTC18442P) 및 슈도모나스 코리엔시스 S2CB35 균주(KCTC18443P) 각각을 처리한 것보다 식물의 생장을 효과적으로 촉진시키는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 식물 생장을 촉진하는, 수지상 균근 균 및 상기 수지상 균근 균의 포자 표면으로부터 분리한 슈도모나스 코리엔시스(Pseudomonas koreensis) 균주 혼합물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 혼합물 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 식물 생장 촉진용 미생물 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 혼합물 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 식물 생장 촉진용 생물비료를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 혼합물을 배양하는 단계를 포함하는 생물비료를 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 혼합물을 식물 또는 식물의 종자에 침지 또는 관주 처리하는 단계를 포함하는 식물 생장을 촉진시키는 방법을 제공한다.
본 발명에서는 분리된 수지상 균근 균(AMF)인 클라로이데오글로머스 라멜로섬 S-11 균주와 공생박테리아인 슈도모나스 코리엔시스 S2CB35 균주 혼합물을 식물에 처리한 결과, 클라로이데오글로머스 라멜로섬 S-11 균주 및 슈도모나스 코리엔시스 S2CB35 균주 각각을 처리한 것보다 식물의 생장을 더욱 촉진시키는 것을 확인하였다. 본 발명의 클라로이데오글로머스 라멜로섬 S-11 균주와 공생박테리아인 슈도모나스 코리엔시스 S2CB35 균주 혼합물을 함유하는 미생물 제제는 식물 생장을 촉진시킬 수 있으므로, 이를 이용하면 식물의 생산량 증대에 이바지할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 부트스트랩 값이 1000인 AMF(Arbuscular Mycorrhizal Fungi) 분리 균주(A) 및 포자 공생 박테리아(SAB)의 계통수를 나타낸다.
도 2는 AMF 클라로이데오클로머스 라멜로섬 S-11 및 SAB(spore associated bacteria) 슈도모나스 코리엔시스 S2CB35-gfp 혼합체 (consortium) 개발을 나타낸다. (A) 대조구, (B) 혼합체 - AMF 표면 상에 SAB 결합, (C) 내생적 결합 없음. 화살표는 gfp-태깅된 SAB를 나타낸다.
도 3은 식물 생장 및 균근 (mycorrhizal) 발달에 대한 혼합 접종 효과를 나타낸다. (A) 식물 건중량, (B) AMF 포자 수 및 (C) 균근 콜로니화. 다른 문자들은 처리 사이의 유의차를 나타낸다 (P < 0.05).
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 식물 생장을 촉진하는, 수지상 균근 균 및 상기 수지상 균근 균의 포자 표면으로부터 분리한 슈도모나스 코리엔시스(Pseudomonas koreensis) 균주 혼합물을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 균주 혼합물에서, 상기 수지상 균근 균은 클라로이데오글로머스 라멜로섬(Claroideoglomus lamellosum) 균주일 수 있고, 바람직하게는 클라로이데오글로머스 라멜로섬(Claroideoglomus lamellosum) S-11 균주일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 균주 혼합물에서, 상기 슈도모나스 코리엔시스 균주는 슈도모나스 코리엔시스 S2CB35 균주일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 균주 혼합물에서, 상기 수지상 균근 균은 바람직하게는 클라로이데오글로머스 라멜로섬(Claroideoglomus lamellosum) S-11 균주로 기탁번호가 KCTC18442P일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 균주를 한국생명공학연구원에 2016년 1월 21일자로 기탁하였다 (기탁번호: KCTC18442P).
본 발명의 일 구현 예에 따른 균주 혼합물에서, 상기 슈도모나스 코리엔시스(Pseudomonas koreensis) 균주는 바람직하게는 슈도모나스 코리엔시스 S2CB35 균주로 기탁번호가 KCTC18443P일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 균주를 한국생명공학연구원에 2016년 1월 21일자로 기탁하였다 (기탁번호: KCTC18443P).
본 발명의 일 구현 예에 따른 균주 혼합물에서, 상기 식물은 옥수수일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 균주 혼합물 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 식물 생장 촉진용 미생물 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 혼합물 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 식물 생장 촉진용 생물비료를 제공한다.
상기 미생물 제제는 수지상 균근 균 및 상기 수지상 균근 균의 포자 표면으로부터 분리한 슈도모나스 코리엔시스(Pseudomonas koreensis) 균주 혼합물을 유효성분으로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 클라로이데오글로머스 라멜로섬(Claroideoglomus lamellosum) S-11 균주(KCTC18442P) 및 슈도모나스 코리엔시스 S2CB35 균주(KCTC18443P)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 의한 미생물 제제는 액상 비료 형태로 제조될 수 있으며 이에 증량제를 첨가하여 가루분말의 형태로 이용하거나 이를 제형화하여 과립화시킬 수도 있다. 그러나 그 제형에 특별히 한정되지는 않는다. 즉 화학비료 공급이 제한된 친환경 유기농업에서 이를 극복하기 위한 생물비료로 제형화가 가능하다.
본 발명은 클라로이데오글로머스 라멜로섬(Claroideoglomus lamellosum) S-11 균주(KCTC18442P) 및 슈도모나스 코리엔시스 S2CB35 균주(KCTC18443P) 혼합물을 이용하여 작물의 성장을 촉진시키는 생물비료로서의 이용법을 제공한다. 상기 균주를 배양한 배양액을 이용하여 이를 액체 상태로 그대로 관주하거나 작물의 종자에 침지 또는 분무하거나 종자에 코팅하여 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 균주 혼합물을 배양하는 단계를 포함하는 생물비료를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 균주 혼합물의 배양 방법 및 생물비료의 제조 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있으며, 특정 방법에 특별히 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 균주 혼합물을 식물 또는 식물의 종자에 침지 또는 관주 처리하는 단계를 포함하는 식물 생장을 촉진시키는 방법을 제공한다. 상기 식물의 생장을 촉진하는 방법으로는 상기 균주 혼합물을 종자나 식물에 침지하거나 관주, 즉, 분무하여 수행할 수 있다. 침지하는 방법의 경우, 배양액 및 제제를 식물체 주변의 토양에 붓거나 또는 종자를 배양액 및 제제에 담가둘 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
균주 정보
본 발명을 위해 선발된 박테리아 균주는 슈도모나스 코리엔시스(Pseudomonas koreensis) S2CB35이다. 상기 균주가 다양한 식물 생장 촉진 특성을 갖는지 분석되었다 (표 1). 본 발명에 사용된 AMF 균주는 클라로이데오글로머스 라멜로섬(Claroideoglomus lamellosum) S-11이다. 상기 슈도모나스 코리엔시스(Pseudomonas koreensis) S2CB35 및 클라로이데오글로머스 라멜로섬(Claroideoglomus lamellosum) S-11 균주의 분리방법은 하기에 기재하였다. 본 발명에 사용된 균주의 정보는 표 1에 나타냈다.
본 발명에 사용된 박테리아 균주 및 플라스미드
플라스미드/균주 유전형 또는 다른 관련 특헝 참고문헌
대장균 S17-1 Vector for plasmid pFAJ1820 Xi et al. (1999)
대장균 HB101 Helper bacteria containing pRK2013 Xi et al. (1999)
슈도모나스 코리엔시스 S2CB35 Plant growth promoting spore associated bacteria (Genbank number: KM507143) 본 발명
슈도모나스 코리엔시스 S2CB35-gfp Green fluorescent protein (GFP)-tagged mutant representative of Pseudomonas koreensis S2CB35 본 발명
클라로이데오글로머스 라멜로섬 S-11 Propagated arbuscular mycorrhizal fungi (Genbank number: KP677595) 본 발명
pRK2013 Mobilizing plasmid Figurski and Helinski (1979)
pFAJ1820 pUT mini Tn5gusA - pgfp Xi et al. (1999)
참고문헌 : Xi et al. 1999 Journal of Microbiological Methods 35: 79-86, Figurski and Helinski 1979 Proceedings of the National Academy of Sciences 76: 1648-1652
AMF 포자 분리 및 동정
AMF(Arbuscular Mycorrhizal Fungi) 포자는 연안 간척지로부터 수득된 토양을 Daniel and Skipper (1982 American Phytopathological Society, St Paul, Minnesota, pp 244)의 방법에 따라 체 분리법 (wet sieving)과 디캔팅(decanting) 방법을 이용하여 수집하였다. 포자 분리는 PVLG로 고정 후 입체 현미경을 이용하여 분리하고, 'INVAM(International Culture Collection of Arbuscular and Vesicular-Arbuscular Mycorrhizal Fungi)'를 참고하여 판별하였다. AMF 포자의 분류학적 계통 확인은 포자의 표면을 2% 클로라민-T와 100 ppm 스트렙토마이신을 이용하여 30분간 멸균하고, 각 타입의 5개의 포자를 10x PCR 버퍼와 증류수를 1:1로 혼합한 혼합물 10 ㎕가 들어있는 PCR 튜브에 첨가하였다. AMF 포자의 18S rDNA는 nested PCR를 이용하여 증폭하였다. 전체 균근 DNA 염기서열 분석은 GeoA2 (5'-CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3' : 서열번호 1)와 Geo11 (5'-ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3' : 서열번호 2) 프라이머를 이용하였고, 내생균근 (AMF) 염기서열은 AM1 (5'-GTTTCCCGTAAGGCGCCGAA-3' : 서열번호 3)과 NS31 (5'-TTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC-3' : 서열번호 4) 프라이머를 사용하였다 (Sheng et al. 2013 Plant and Soil 369: 599-613). 증폭된 생성물을 형광 염료 터미네이터 방법 (ABI prism 장비 및 BigdyeTM Terminator 순환 서열분석 즉석 반응 키트 V.3.1)을 이용해 서열분석했다. 서열을 정렬시키고, EzTaxon 서버를 이용해 최근접 이웃을 밝혀냈다. CLUSTAL W에 의해 결과의 다중적 정렬 후, MEGA 6를 이용해 계통수를 구축했다 (Tamura et al. 2011 Molecular Biology and Evolution, 28, 2731-2739). 부트스트랩 값을 1000으로 하여 이웃-연결 계통수를 구축했다.
포자 공생 박테리아 ( SAB )의 분리 및 동정
본 발명에서 사용된 포자 공생 박테리아(SAB, spore associated bacteria)는 연안 간척지에서 수득된 토양에서 AMF(Arbuscular Mycorrhizal Fungi) 포자를 분리하여 포자의 표면으로부터 균주를 분리하였다(Cruz et al. 2012 Biology Open, 1, 52-57). 포자 공생 박테리아를 분리하기 위해 2% 클로라민-T와 100 ppm 스트렙토마이신을 이용하여 포자의 표면을 30분 동안 멸균하였다. 분리한 포자는 멸균한 에펜도르프 튜브에 넣고 5초간 볼텍싱하여 채취하였다. 포자는 나이론 네트 필터 (30 μm) 형태의 스핀 컬럼이 들어 있는 4개의 1.5 ml 에펜도르프 튜브에 각각 60개씩 옮겼다. 각 튜브에 2% 클로라민-T와 100 ppm 스트렙토마이신을 첨가하고, 4개의 튜브를 각각 0분, 10분, 20분, 30분으로 처리구를 선정하여 포자를 멸균하였다. 각 시간대별로 멸균한 포자의 표면을 증류수로 6~7번 세척한 후, 0.08% NA(nutrient agar) 배지와 PEYA (5% 폴리펩톤 및 1% 효모 추출물) 배지에서 접종하여 2주 동안 28℃ 조건으로 배양하였다. 2주 후 포자 주변에 생장한 균주 콜로리를 채취하여 정제 및 계대배양하였다.
분리한 균주의 16S 유전체 DNA를 27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3' : 서열번호 5) 및 1492R (5'-GGYTACCTTGTTACGACTT-3' : 서열번호 6) 프라이머를 이용해 증폭했다 (Weisburg et al. 1991 Journal of Bacteriology, 173, 697-703). 증폭된 생성물의 서열을 정렬시키고, EzTaxon 서버를 이용해 최근접 이웃을 밝혀냈다. CLUSTAL W에 의해 결과의 다중적 정렬 후, MEGA 6를 이용해 계통수를 구축했으며, 부트스트랩 값을 1000으로 하여 이웃-연결 계통수를 구축했다.
박테리아 균주의 녹색 형광 단백질 ( GFP )-태깅
GFP-태깅은 대장균 HB101 (pRK2013)를 이용한 삼친교배 (triparental mating) 방법으로 대장균 유전자 Tn5gusAgfpcassette (pFAJ1820)의 슈도모나스 코리엔시스 S2CB35 균주로의 도입에 의해 수행되었다 (Xi et al. 1999 J Microbiol Methods 35: 85-92). 형질전환체는 50 ㎍/ml의 카나마이신이 첨가된 1/2 강도 영양 아가 배지 상에서 선별되었다. 정제된 형질전환체에서 GFP의 존재에 대한 확인은 YL065 (F) 5'-GCGATGTTAATGGGCAAAAA-3' : 서열번호 7) 및 YL066 (R) 5'-TCCATGCCATGTGTAATCCT-3' : 서열번호 8) 프라이머 세트를 사용한 PCR을 통해 수행되었다. PCR 프로그램을 위한 반응은 94℃에서 3분, 35회 반복의 94℃에서 30초, 56℃에서 1분 및 72℃에서 1분에 이어서 72℃에서 10분 동안 수행되었고, 650bp의 PCR 산물 크기에서 gfp 카세트의 삽입이 확인되었다 (Yim et al. 2014 J Plant Physiol 171:1064-1075). PCR 확인 후, gfp 돌연변이체 유도체의 상대적 형광 활성은 15mW, 공냉식 아르곤 이온 (Ar) 레이저 여기 (excitation) 광원 (488 nm)이 장착된 유세포 분석기 (flow cytometer, FACScalibur)를 사용하여 측정되었다 (Gotz et al. 2006 Microbiol Ecol 56:207-218). 한개의 슈도모나스 코리엔시스 S2CB35 콜로니를 선발한 후, gfp 유도체 및 야생형의 콜로니 외형, 세포 형태 및 성장 속도가 비교되었다.
균주 혼합물 개발
균주 혼합물 개발을 위해, 박테리아 균주 슈도모나스 코리엔시스 S2CB35는 세포수 1×108 cfu/ml에 도달할 때까지 배양되었고, 세포는 수집한 후, 0.1 M 인산 버퍼 (pH 6.8)에 다시 현탁되었다. 박테리아 균주는 AMF 및 박테리아가 밀접하게 관련하는지 확인하기 위해 AMF와 함께 배양되었다. 배양 후, 포자는 직접 또는 2% 클로라민 T 및 100 ㎍/ml의 스트렙토마이신으로 30분 동안 표면 살균한 후 마운팅되었다. 현미경 관찰은 Ar 레이저 (gfp: 여기, 488 nm; 방출 필터 BP, 500 내지 530)가 장착된 Leica TCS SP2 공초점 시스템 (Leica Microsystems Heidelberg GmbH)을 사용하여 수행되었다. 이미지 수집 (acquisitions)은 ×20 및 ×40 대물렌즈 (N.A. 약 0.75)를 이용하여 수행되었고, ZEN lite 2012 (blue edition)를 사용하여 처리되었다.
유묘 준비 및 박테리아 처리
옥수수 종자 (Zea mays L.)는 70% 에탄올로 1분 동안 표면 멸균되었고, 6% NaOCl로 5분 동안 처리된 후, 멸균된 증류수로 7회 세척되었다. 균주 혼합물 및 박테리아 처리를 위해, 유묘 트레이에 파종되기 전에 표면-멸균된 종자는 세포수 1×108 cfu/ml의 슈도모나스 코리엔시스 S2CB35를 포함하는 10 ml의 0.1 M 인산 버퍼 (pH 6.8)에 4시간 동안 침지되었다. 대조구 및 AMF 처리를 위해, 종자는 박테리아가 없는 0.1 M 인산 버퍼 (pH 6.8)로 처리되었다.
처리 세부사항
4가지 처리구 (대조구, AMF (C. lamellosum), PGPB (슈도모나스 코리엔시스 S2CB35) 및 혼합물 (consortium, AMF+PGPB)) 및 처리당 4회 반복 실험이 무작위 블록 디자인 (randomized block design)에 배치되었다. 각 포트 (pot)는 2.5 kg의 흙으로 채워졌고, 균근 처리 포트들은 75 g의 AMF 접종원 (AMF 접종원은 약 200개의 포자 및 30개의 root bits를 포함함)이 토양 표면 1 cm 아래에 첨가되어 처리되었다. 대조적으로, 대조구 및 PGPB 처리구는 동일한 영양분 함량을 유지하기 위해 고압 멸균되어 어떤 AMF 번식체 (propagules)도 없는 75 g의 AMF 접종원이 처리되었다. 또한, 모든 처리에서 동일한 박테리아 수를 유지하기 위해, 대조구 및 PGPB 처리구에 고압 멸균되지 않은 75 g의 AMF 접종원으로부터 수득된 AMF 접종원의 토양 추출물 70 ml이 처리되었다. 균주 혼합물 접종을 위해, AMF 및 PGPB가 접종되었다. 동등하게 성장된 7일령 옥수수 유묘는 2.5 kg의 흙을 포함하는 포트로 이식되었고, 이식 후 44일 (days after transplantation, DAT) 동안 유지되었다. 식물은 100 ml의 변형된 Hoagland's 영양액 (Sheng et al. 2011)이 주기적으로 보충되었다. 종자의 세균 첨가처리 (bacterization) 외에도, 1×108 cfu/ml의 PGPB를 포함하는 5 ml의 0.1 M 인산 버퍼 (pH 6.8)가 10 및 30 DAT에 박테리아 및 혼합물 처리 포트에 첨가되었다. 대조구 및 AMF 처리구는 포트에 접종하기 전에 121℃에서 15분 동안 고압 멸균된 것을 제외하고, 동일한 양의 박테리아 배양액이 처리되었다.
식물 및 균근 매개변수 ( mycorrhizal parameters )에 대한 단일 및 혼합물 접 종원의 효과
신초 (shoots)의 건조 중량은 식물을 70℃의 건조기에서 48시간 동안 건조시킨 후에 측정되었다. 식물 내 총 질소 축적은 Kjeldahl 분석기로 측정되었다. 가용 인 (phosphorus)은 바나데이트-몰리브데이트 (vanadate-molybdate) 법으로 측정되었고, Ca, Mg, Na 및 K 농도는 유도결합플라즈마 분광분석기 (inductively coupled plasma optical emission spectrometry, ICP-OES)를 통해 측정되었다. 뿌리 샘플은 부착된 흙을 제거하기 위해 수돗물로 세척되었고, 1 cm 길이의 조각으로 자른 뒤, Phillips 및 Hayman의 선행연구 (1970 Trans Brit Mycol Soc 55, 158-161)에 기술된 0.05% 트리판 블루 (trypan blue)로 염색되었다. 균근 콜로니화 (M%)는 Trouvelot 등의 선행연구 (1986 INRA Press, Paris, pp. 217-221)에 기재된 방법에 따라 계산되었다. AMF 포자는 습식 체거름 (wet sieving) 및 디캔팅 (decanting) 방법 (Gerdemann and Nicolson, 1963, Transactions of the British Mycological Society, 46: 235-244)으로 50 g의 흙으로부터 분리되었다.
통계적 분석
무작위 블록 디자인은 조절된 조건 식물 실험을 위해 사용되었다. 결과 데이터는 분산 분석이 실시되었고, 평균 유의차는 SAS package 9.4를 사용하여 P < 0.05에서 Duncan 다중 범위 테스트로 비교되었다.
실시예 1. AMF 포자와 포자 공생 박테리아 동정결과
분리된 AMF 포자는 18S rDNA 염기서열 분석을 이용해 클라로이데오글로머스 (Claroideoglomus) 속으로부터 밝혀냈다(도 1A). AMF 포자의 표면으로부터 분리한 포장 공생 박테리아(SAB)는 슈도모나스 코리엔시스 (Pseudomonas koreensis)와 가까운 (98.95%) 매칭을 나타냈다(도 1B).
실시예 2. 균주 혼합물 개발의 확인
균주 혼합물 개발에서, AMF 포자 벽과 결합하는 PGP 박테리아의 특징이 관찰되었다 (표 2). 대조구 처리에서는 AMF의 포자 벽에 PGPB의 결합이 관찰되지 않았다(도 2). 반면에 형광이 뚜렷한 박테리아 세포가 PGPB와 함께 배양된 AMF의 포자 벽에서 관찰되었다. 그러나, 표면 멸균 및 파괴된 포자에서는 PGPB의 내생적 콜로니화가 나타나지 않았는데, 이는 PGPB 결합이 AMF 포자 벽의 외부면에만 한정된다는 것을 제시한다.
슈도모나스 코리엔시스 S2CB35의 생화학적 및 식물 생장 촉진 (PGP) 특성
물리적/생화학적 테스트 Positive/Negative
그람 염색 Negative
세포 모양 Rod
카탈라아제 Positive
옥시다아제 Positive
PGP 특성 Quantitative
IAA 생산 With tryptophan - 8.47±0.73 ㎍ ml-1
ACC 디아미나아제 활성 0.78±0.48μmol α-Ketobutyrate (mg protein)-1 h-1
P 가용화 108.54±2.88 g l-1
질소고정 Positive
사이더포어 생산 Positive
PGP 기능 유전자 동정 Positive/Negative
nifH Positive
acdS Positive
nodA Positive
탄소원 이용 Positive/Negative
말레이트 Positive
옥살레이트 Negative
실시예 3. 식물 생장, 프롤린 함량 및 균근 매개변수
균근 (AMF) 및 PGPB의 처리는 대조구에 비해 옥수수 식물의 건조 중량을 향상시켰지만, 단지 균주 혼합물 접종에서만 대조구에 비해 식물 건조 중량의 유의한 증가가 나타났다 (도 3A). 균근 포자 수에 대한 접종의 효과는 도 3B에 제시되었다. AMF 처리에 비해 AMF 및 PGPB 혼합물 접종에서 포자 수가 유의하게 증가했다. 그러나, PGPB 및 대조구 접종에서는 AMF가 접종되지 않은 것과 같이 포자 수의 유의차가 관찰되지 않았다. AMF와 PGPB 혼합물 접종은 AMF 단독 처리에 비해 균근 콜로니화를 유의하게 증가시켰다 (도 3C).
실시예 4. 영양분 축적
미생물 처리는 신초 및 뿌리 모두에서 식물 영양분 축적을 유의하게 증가시켰다 (표 3). 모든 미생물 접종은 신초 및 뿌리 모두에서 총 질소를 유의하게 증가시켰다. 혼합물 접종은 신초 및 뿌리 모두에서 인을 유의하게 증가시켰다. 혼합물 접종에서는 유의하게 높은 칼륨 축적이 신초 및 뿌리 모두에서 관찰되었고, PGPB 단독 접종에서도 뿌리의 칼륨 축적이 유의하게 증가되었다. 칼슘 및 마그네슘의 축적에서는, 혼합물 접종에서 유의하게 높은 축적이 신초 및 뿌리 모두에서 관찰되었다. 반면, 나트륨 축적에서는 미생물 처리구 및 대조구 사이에서 유의차가 관찰되지 않았다.
옥수수 신초 및 뿌리의 영양분 축적에 대한 균주 혼합물(consortium) 접종의 효과
Plant Treatments Total N P K Ca Mg Na
mg / plant
Shoot Control 819.6±64.3c 68.3±6.8c 470.4±46.3b 40.0±4.9b 32.9±1.5b 2.8±0.4a
AMF 1362.9±185.3b 113.1±9.9b 499.4±74.1b 41.1±6.5b 42.6±6.1b 3.5±1.4a
PGPB 1342.7±101.9b 133±16.9b 597.2±137.8ab 42.0±11.9b 36.9±7.1b 2.2±1.4a
Consortium 1921.7±68.9a 180.1±9.1a 817.0±57.6a 96.3±11.2a 69.6±2.2a 6.3±2.5a
Root Control 78.8±2.8c 13.9±0.9b 51.5±5.3b 5.6±0.7c 4.2±0.3c 33.8±3.1b
AMF 250.4±39.6ab 19.2±3.2db 80.3±17.0ab 17.0±1.7b 8.9±0.8b 58.3±14.8a
PGPB 196.1±18.8bc 36.7±0.9a 106.1±18.6a 20.9±2.6ab 11.2±1.2b 73.7±14.8a
Consortium 384.7±80.7a 30.3±3.0a 107.4±17.3a 28.1±4.2a 16.5±1.4a 56.4±9.7a
한국생명공학연구원 KCTC18442P 20160121 한국생명공학연구원 KCTC18443P 20160121
<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Mixture of arbuscular mycorrhizal fungi and Pseudomonas koreensis strain promoting plant growth and uses thereof <130> PN16011 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ccagtagtca tatgcttgtc tc 22 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 accttgttac gacttttact tcc 23 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gtttcccgta aggcgccgaa 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ttggagggca agtctggtgc c 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ggytaccttg ttacgactt 19 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gcgatgttaa tgggcaaaaa 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 tccatgccat gtgtaatcct 20

Claims (6)

  1. 옥수수 식물 생장을 촉진하는, 기탁번호가 KCTC18442P인 클라로이데오글로머스 라멜로섬(Claroideoglomus lamellosum) S-11 균주인 수지상 균근 균 및 상기 수지상 균근 균의 포자 표면으로부터 분리한 기탁번호가 KCTC18443P인 슈도모나스 코리엔시스(Pseudomonas koreensis) S2CB35 균주의 혼합물.
  2. 삭제
  3. 제1항의 균주 혼합물 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 옥수수 식물 생장 촉진용 미생물 제제.
  4. 제1항의 균주 혼합물 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 옥수수 식물 생장 촉진용 생물비료.
  5. 제1항의 균주 혼합물을 배양하는 단계를 포함하는 생물비료를 제조하는 방법.
  6. 제1항의 균주 혼합물을 옥수수 식물 또는 옥수수 식물의 종자에 침지 또는 관주 처리하는 단계를 포함하는 옥수수 식물 생장을 촉진시키는 방법.
KR1020160013245A 2016-02-03 2016-02-03 식물 생장을 촉진하는, 수지상 균근 균 및 슈도모나스 코리엔시스 균주 혼합물 및 이의 용도 KR101621709B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020160013245A KR101621709B1 (ko) 2016-02-03 2016-02-03 식물 생장을 촉진하는, 수지상 균근 균 및 슈도모나스 코리엔시스 균주 혼합물 및 이의 용도

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020160013245A KR101621709B1 (ko) 2016-02-03 2016-02-03 식물 생장을 촉진하는, 수지상 균근 균 및 슈도모나스 코리엔시스 균주 혼합물 및 이의 용도

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR101621709B1 true KR101621709B1 (ko) 2016-05-17

Family

ID=56109695

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020160013245A KR101621709B1 (ko) 2016-02-03 2016-02-03 식물 생장을 촉진하는, 수지상 균근 균 및 슈도모나스 코리엔시스 균주 혼합물 및 이의 용도

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101621709B1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101865810B1 (ko) * 2017-02-23 2018-06-12 충북대학교 산학협력단 기가스포라 마가리타 s-23 균주 및 슈도모나스 코리엔시스 s2cb35 균주 혼합물을 유효성분으로 함유하는 염 스트레스 조건에서 식물 생장을 촉진하는 균주 혼합물 및 이의 용도
CN116171808A (zh) * 2022-11-10 2023-05-30 云南大学 一种利用丛枝菌根真菌和细菌联合修复退化草地的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101563349B1 (ko) 2015-01-20 2015-10-26 충북대학교 산학협력단 염 스트레스 조건에서 식물 생장을 촉진하는 수지상 균근 균 및 마실리아 속 rk4 균주 혼합물 및 이의 용도

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101563349B1 (ko) 2015-01-20 2015-10-26 충북대학교 산학협력단 염 스트레스 조건에서 식물 생장을 촉진하는 수지상 균근 균 및 마실리아 속 rk4 균주 혼합물 및 이의 용도

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101865810B1 (ko) * 2017-02-23 2018-06-12 충북대학교 산학협력단 기가스포라 마가리타 s-23 균주 및 슈도모나스 코리엔시스 s2cb35 균주 혼합물을 유효성분으로 함유하는 염 스트레스 조건에서 식물 생장을 촉진하는 균주 혼합물 및 이의 용도
CN116171808A (zh) * 2022-11-10 2023-05-30 云南大学 一种利用丛枝菌根真菌和细菌联合修复退化草地的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Nihorimbere et al. Beneficial effects of Bacillus subtilis on field-grown tomato in Burundi: Reduction of local Fusarium disease and growth promotion
CN112553122B (zh) 一株解淀粉芽孢杆菌、菌剂及其制备方法和应用
CN109355233B (zh) 一种解淀粉芽孢杆菌及其应用
WO2004050861A1 (fr) Preparation microbienne et procede de prevention et de traitement du fletrissement bacterien, la plante et son utilisation
CN110452832B (zh) 一株耐酸性解淀粉芽孢杆菌Kc-5及其应用
CN114501999A (zh) 生物杀虫剂和生物肥料组合物
KR101563349B1 (ko) 염 스트레스 조건에서 식물 생장을 촉진하는 수지상 균근 균 및 마실리아 속 rk4 균주 혼합물 및 이의 용도
US20060018883A1 (en) Microbial preparation &amp; method for preventing and curing the bacterial wilt the plant and its use
CN115873747A (zh) 一株具有广谱抑菌活性的贝莱斯芽孢杆菌及其应用
KR101621709B1 (ko) 식물 생장을 촉진하는, 수지상 균근 균 및 슈도모나스 코리엔시스 균주 혼합물 및 이의 용도
KR101865810B1 (ko) 기가스포라 마가리타 s-23 균주 및 슈도모나스 코리엔시스 s2cb35 균주 혼합물을 유효성분으로 함유하는 염 스트레스 조건에서 식물 생장을 촉진하는 균주 혼합물 및 이의 용도
US11674118B2 (en) PGPR compositions and methods for improved cultivation of tomato and potato species
CN117165494A (zh) 一种猕猴桃溃疡病生防菌株Wq-1及其应用
Kannan et al. Control of Fusarium wilt disease in cowpea plant (Vigna Unguiculata L.). using secondary metabolites produced in Bradyrhizobium japonicum
Sellal et al. Effect of seeds treatment with Trichoderma harzianum on argan plants growth
KR20180097185A (ko) 클라로이데오글로머스 라멜로섬 s-11 균주 및 슈도모나스 코리엔시스 s2cb35 균주 혼합물을 유효성분으로 함유하는 식물의 염 내성 증가용 조성물
Mukasheva et al. Bacterial endophytes of Trans-Ili Alatau region's plants as promising components of a microbial preparation for agricultural use
CN114250177B (zh) 一株不动杆菌及其在提高植物抗逆性中的应用
CN111471627B (zh) 一株粘质沙雷氏菌bsz及应用
KR101573584B1 (ko) 토양근권세균 츠카무렐라 티로시노솔벤스 균주 yjr102을 포함하는 식물병 방제 및 식물 생장촉진용 조성물
EP2821478B1 (en) Glomus iranicum var. tenuihypharum var. nov. strain and its use as bio-nematicide
Bakhshi et al. Bacillus amyloliquefaciens as a biocontrol agent improves the management of charcoal root rot in melon
KR20090105726A (ko) 고추의 세균성점무늬병과 탄저병을 방제하는 바실러스메가테리움 22-5 균주
KR101621732B1 (ko) 식물 생장을 촉진하는 내염성 패니바실러스 사이렌엑시던스 균주 및 이의 용도
JP2006151898A (ja) ダイズ黒根腐病を生物的に防除するための組成物及び方法

Legal Events

Date Code Title Description
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant