CN1412311A - 利用侵染相关基因的协同作用提高微生物杀虫效果的方法 - Google Patents
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Abstract
一种利用侵染相关基因的协同作用提高微生物杀虫效果的方法，将虫生真菌侵染昆虫时分泌的两类主要水解酶：类枯草杆菌蛋白酶和几丁质酶基因克隆，并将二者分别置于真菌、细菌或植物组成性启动子之下，然后串联于真菌、细菌或植物表达载体上，构建类枯草杆菌蛋白酶和几丁质酶基因的双价表达载体。利用遗传转化技术将双价表达载体分别转入虫生真菌、杀虫细菌或杀虫病毒，获得同时高效表达类枯草杆菌蛋白酶和几丁质酶的重组菌株，使二者在微生物侵染昆虫时协同作用，提高菌株毒力；或者将双价载体转入植物，获得同时表达类枯草杆菌蛋白酶和几丁质酶的转基因植株，使二者在植物中协同作用，提高植株的抗虫能力。
Description
技术领域：本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种利用基因工程提高微生物杀虫效果的方法。
背景技术：自然界中分布有十分丰富的杀虫微生物。在微生物导致的昆虫死亡中，病原真菌占60％以上。因此，研制和开发微生物杀虫剂特别是真菌杀虫剂受到国内外的广泛关注。近年来，真菌杀虫剂产品发展迅速，防治对象包括温室害虫、沙漠蝗虫、水稻叶蝉以及卫生害虫，如蟑螂、白蚁、苍蝇等，市场规模日益扩大，产生了良好的经济和社会效益。
但是真菌杀虫剂存在击倒害虫时间长、不能有效的将害虫控制在作物受损之前等不足。因此，克服和解决这一问题，对于研制新型高效真菌杀虫剂具有重要意义。杀虫真菌击倒昆虫包括孢子附着在昆虫体壁并萌发、侵染结构(如附着胞)的形成、菌丝穿过昆虫体壁、菌丝在虫体内生长并使昆虫致病等主要过程。其中菌丝穿透昆虫体壁是致病的关键过程，该过程不仅决定侵染的成败，而且其速度对杀虫真菌击倒昆虫的时间影响很大。昆虫体壁主要由蛋白质和几丁质组成，蛋白质填充在几丁质骨架结构中形成坚固的昆虫外壳。杀虫真菌通过机械压力和水解酶的降解作用穿透体壁。在这一过程中杀虫真菌分泌蛋白酶、几丁酶和酯酶等多种水解酶，其中蛋白酶和几丁酶起重要作用。
近年来，随着生物技术的发展和对真菌侵染昆虫分子机理研究的深入，利用基因工程进行菌株改造为解决上述问题提供了可能。如美国马里兰大学的St.Leger等人(1996)将真菌侵染昆虫时分泌的一种类枯草杆菌蛋白酶Pr1基因导入绿僵菌(Metarhizium anisopliae)野生菌株中组成性表达，显著提高了菌株毒力，重组菌株击倒害虫的时间缩短了25％，作物损失降低了40％。St.Leger等人还将绿僵菌类枯草杆菌蛋白酶Pr1基因导入昆虫杆状病毒中，也显著提高了病毒毒力。这说明，利用基因工程改造菌株是解决上述问题的有效途径。但是目前人们在杀虫真菌的基因工程方面主要局限在Pr1等基因的研究上，从报道的重组菌株的杀虫效果来看，尚未达到令人满意的水平。其原因之一是，昆虫的体壁除了蛋白质外，几丁质也是主要成份。相对于蛋白酶而言，对几丁酶在侵染过程所起作用的研究较少。从现有的研究结果来看，几丁质酶也是诱导酶，它由在蛋白酶作用后露出的几丁质诱导产生。在金龟子绿僵菌侵染昆虫体壁的初期只有低水平表达，60h后表达量才明显增加，并由菌丝附近向体壁其它部分扩散(St.Leger1996)。在基因克隆方面，目前仅从金龟子绿僵菌克隆了2个几丁酶基因(Bogo1998，Sun1998)，但至今还未有在白僵菌(Beauveria SP.)中克隆几丁酶基因的报道。有关杀虫真菌几丁酶基因的功能和表达特性的研究也很少。
几丁质在昆虫体壁中起骨架结构作用，因此，几丁酶在降解昆虫体壁中的作用也十分重要。而且，St.Leger(1986)的体外试验研究表明，金龟子绿僵菌通过蛋白酶和几丁酶的协同作用水解昆虫体壁。Charnley等(1991)用Dimilin(一种几丁质合成抑制剂)处理昆虫幼虫，使其几丁质合成受损，接种金龟子绿僵菌后发现，杀虫真菌降解昆虫体壁的速度显著提高，体壁几乎完全被分解，并且金龟子绿僵菌的寄主专化性降低，即对多种经Dimilin处理的昆虫体壁的降解效果一样。但是这一方法的关键是用几丁质合成抑制剂使几丁质合成受阻来提高蛋白酶降解昆虫体壁的速度。利用侵染相关基因的协同作用提高微生物降解昆虫体壁的速度从而提高杀虫效果的研究尚未见报道。
发明内容：本发明的目的在于，根据昆虫体壁的结构和昆虫病原真菌的侵染机理，提供一种利用基因工程提高杀虫真菌杀虫效果的方法。该方法的要点是：利用杀虫真菌分解寄主体壁水解酶的协同作用，同时将两种或两种以上的水解酶基因导入杀虫真菌，使其组成性表达并协同作用，促进真菌菌丝穿透昆虫体壁，缩短击倒时间。该方法还可用于提高其它杀虫微生物如细菌、病毒等的杀虫效果和植物的抗虫效果。
本发明的基本思路是将昆虫病原真菌侵染昆虫时起关键作用的类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1和几丁酶基因BbChit-1同时导入杀虫微生物或植物，使其组成性超量表达，提高杀虫微生物的毒力或提高植物的抗虫能力。
本发明依次通过以下步骤实现：
(1)球孢白僵菌(Beauveria bassiana)类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1和几丁质酶基因BbChit-1基因克隆
①球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1的cDNA基因克隆
利用昆虫体壁诱导球孢白僵菌分生孢子萌发后的芽管状物，提取RNA，纯化mRNA，构建cDNA文库，同时，根据对不同来源的类枯草蛋白酶基因的同源性比较结果，按其中2个保守序列设计引物，上游引物BbP-1(forward primer)的序列为：5′＞tgg ggt cta ggt cgc atc tc＜3′；下游引物BbP-2(reverse primer)的序列为：5′＞gcc agg tgc gaa aat gtc aac＜3′，然后利用RT-PCR技术扩增出大小为593bp的类枯草杆菌蛋白酶探针BbP，利用此探针筛选cDNA文库，获得阳性克隆，释放文库，酶切验证，测序验证，获得大小为1557bp的CDEP-1 cDNA基因(polyA除外)；
②球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1的基因克隆
根据CDEP-1 cDNA 5′端和3′端序列设计引物，以球孢白僵菌的基因组DNA为模板扩增CDEP-1的基因组序列，上游引物序列为：5′＞ctt cat cca gca agc aaagtc＜3′，下游引物序列为：5′＞gtt aaa tat aca gat caa tga gtt ttg＜3′；
③球孢白僵菌内切几丁酶Bbchit1的分离纯化及序列测定
在利用几丁质诱导培养球孢白僵菌的基础上，分离纯化出具有内切酶活性的几丁酶Bbchit1，并进行N’端氨基酸测定，序列为：AGTCATKGRPAGKVLQGYWENWD；
④球孢白僵菌内切几丁酶Bbchit1的cDNA的克隆
提取利用几丁质诱导的球孢白僵菌总RNA，根据N’端氨基酸序列设计上游兼并引物，结合下游加接头的Oligo-dT引物，利用3′RACE扩增出编码几丁酶Bbchit1的cDNA序列；
⑤球孢白僵菌内切几丁酶基因Bbchit1的克隆
根据3’RACE得到的cDNA序列，利用YADE技术扩增Bbchit1的全长基因，用于YADE的线性扩增引物序列为：5’＞ccg tgc ttg cga atg tcg＜3’，指数扩增引物序列为：5’＞ggc acc gtc cca gtt ctc＜3’，以DraI酶切球孢白僵菌的基因组DNA为模板，YADE扩增得到了长为1400bp的片段，连接3’RACE和YADE的产物，得到Bbchit1的全长基因序列；
(2)蛋白酶基因CDEP-1和几丁质酶基因BbChit-1双价载体的构建
将类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1和几丁质酶基因Bbchit1分别置于构巢曲霉(Aspergillius nidulans)3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子Pgpd和色氨酸基因的终止子TtrpC之下，然后将二者串联于真菌表达载体，构建成双价基因的真菌表达载体，或将类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1和几丁质酶基因Bbchit1串联于原核表达系统，构建成双价基因的原核表达载体，或将类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1和几丁质酶基因Bbchit1分别置于植物组成性启动子如35sCAMV和Nos终止子之下，然后将二者串联于植物表达载体，构建成双价基因的植物表达载体；
(3)获得同时超量表达蛋白酶CDEP-1和几丁质酶BbChit-1重组微生物或抗虫植物
利用遗传转化技术，将构建的双价载体转入虫生真菌或其它杀虫微生物或植物，筛选获得同时组成性超量表达蛋白酶CDEP-1和几丁质酶BbChit-1的高毒力重组微生物或抗虫植物。
上述步骤(1)-①中获得大小为1557bp的CDEP-1的cDNA，其中含有一个1134bp的开放阅读框(ORF open reading frame)，5′端非编码区长72bp，3′端非编码区长为353bp，1134bp的开放阅读框编码一个377个氨基酸、分子量为38616的蛋白质，其等电点为PI＝8.302。N端18个氨基酸是一个信号肽序列，其中含有一个带正电荷氨基酸(Arg)，8个氨基酸的疏水区域和螺旋转弯的氨基酸(Pro)，信号肽的剪切位点的识别序列(Ala-Pro-Val)。进一步对氨基酸序列分析表明，Asp138、His168和Ser323为枯草杆菌蛋白酶活性区域的关键氨基酸，组成丝氨酸类蛋白酶的电子传递链。
(1)-②中扩增得到的片段长为1760bp，命名为gCDEP-1，在Genebank上的登录号为：AY040532。与CDEP-1序列相比较，gCDEP-1含有3个内含子，每个内含子具有典型的边界序列GT..AG，内含子中含有分枝序列CTAAT和CTGAC。
(1)-④扩增出编码几丁酶Bbchit1的cDNA序列片段长为1120bp，包含编码几丁酶Bbchit1成熟蛋白的序列和3’端非编码序列。
(1)-⑤中得到的Bbchit1全长基因序列，Genbank登录号为：AY145440。Bbchit1含有长为1047bp的开放阅读框架(ORF，open reading frame)，编码348个氨基酸，其中含有几丁酶典型的活性序列95-98(SXGG)和128-135(DGIDXDXE)。对照N-端测序结果，Bbchit1含有长为28个氨基酸的信号肽序列。
上述步骤(3)中虫生真菌是指白僵菌(Beauveria SP.)、绿僵菌(MetarhiziumSP.)、拟青霉(paecilomyces SP.)、轮枝菌(Verticillium SP.)等。其它杀虫微生物包括细菌、病毒等。
该发明的优点是将虫生真菌侵染昆虫时分泌的两类主要水解酶类枯草杆菌蛋白酶和几丁质酶基因克隆，将二者分别置于真菌、细菌或植物组成性启动子之下，然后串联于真菌、细菌或植物表达载体上，构建类枯草杆菌蛋白酶和几丁质酶基因的双价表达载体。利用遗传转化技术将双价表达载体分别转入虫生真菌、杀虫细菌或杀虫病毒，获得同时高效表达类枯草杆菌蛋白酶和几丁质酶的重组菌株，使二者在微生物侵染昆虫时协同作用，提高菌株毒力；或者将双价载体转入植物，获得同时表达类枯草杆菌蛋白酶和几丁质酶的转基因植株，使二者在植物中协同作用，提高植株的抗虫能力。
具体实施方式：
实施例1：
通过诱导培养，提取球孢白僵菌诱导性表达的RNA，根据类枯草杆菌蛋白酶序列同源性比较，设计兼并引物，利用RT-PCR扩增探针，然后从球孢白僵菌诱导性表达的cDNA文库中钩取类枯草杆菌蛋白酶CDEP-1的cDNA基因，根据CDEP-1cDNA的5′端和3′端序列设计引物，以球孢白僵菌的基因组DNA为模板扩增出CDEP-1的基因组序列gCDEP-1；通过诱导培养，分离纯化具有内切活性的球孢白僵菌几丁质酶BbChit-1，测定其N’端氨基酸序列，根据N’端氨基酸序列设计上游兼并引物，利用3’RACE等技术扩增出编码几丁酶Bbchit1的cDNA序列，根据cDNA序列设计引物，利用YADE技术扩增cDNA片段上游序列，包括信号肽序列、3’端非编码序列和部分启动子序列，连接3’RACE和YADE的产物，得到了Bbchit1的全长基因序列Bbchit1；将类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1和几丁质酶基因Bbchit1分别置于构巢曲霉(Aspergillius nidulans)3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子Pgpd和色氨酸基因的终止子TtrpC之下，然后将二者串联于真菌表达载体，构建成双价基因的真菌表达载体；利用遗传转化技术，将构建的双价载体转入虫生真菌白僵菌，筛选获得同时组成性超量蛋白酶CDEP-1和几丁质酶BbChit-1的高毒力重组菌株。
实施例2：
通过诱导培养，提取球孢白僵菌诱导性表达的RNA，根据类枯草杆菌蛋白酶序列同源性比较，设计兼并引物，利用RT-PCR扩增探针，然后从球孢白僵菌诱导性表达的cDNA文库中钩取类枯草杆菌蛋白酶CDEP-1的cDNA基因，根据CDEP-1cDNA的5′端和3′端序列设计引物，以球孢白僵菌的基因组DNA为模板扩增出CDEP-1的基因组序列gCDEP-1；通过诱导培养，分离纯化具有内切活性的球孢白僵菌几丁质酶BbChit-1，测定其N’端氨基酸序列，根据N’端氨基酸序列设计上游兼并引物，利用3’RACE等技术扩增出编码几丁酶Bbchit1的cDNA序列，根据cDNA序列设计引物，利用YADE技术扩增cDNA片段上游序列，包括信号肽序列、3’端非编码序列和部分启动子序列，连接3’RACE和YADE的产物，得到了Bbchit1的全长基因序列Bbchit1；将类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1和几丁质酶基因Bbchit1分别置于构巢曲霉(Aspergillius nidulans)3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子Pgpd和色氨酸基因的终止子TtrpC之下，然后将二者串联于真菌表达载体，构建成双价基因的真菌表达载体；利用遗传转化技术，将构建的双价载体转入虫生真菌绿僵菌，筛选获得同时组成性超量蛋白酶CDEP-1和几丁质酶BbChit-1的高毒力重组菌株。
实施例3：
通过诱导培养，提取球孢白僵菌诱导性表达的RNA，根据类枯草杆菌蛋白酶序列同源性比较，设计兼并引物，利用RT-PCR扩增探针，然后从球孢白僵菌诱导性表达的cDNA文库中钩取类枯草杆菌蛋白酶CDEP-1的cDNA基因，根据CDEP-1cDNA的5′端和3′端序列设计引物，以球孢白僵菌的基因组DNA为模板扩增出CDEP-1的基因组序列gCDEP-1；通过诱导培养，分离纯化具有内切活性的球孢白僵菌几丁质酶BbChit-1，测定其N’端氨基酸序列，根据N’端氨基酸序列设计上游兼并引物，利用3’RACE等技术扩增出编码几丁酶Bbchit1的cDNA序列，根据cDNA序列设计引物，利用YADE技术扩增cDNA片段上游序列，包括信号肽序列、3’端非编码序列和部分启动子序列，连接3’RACE和YADE的产物，得到了Bbchit1的全长基因序列Bbchit1；将类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1和几丁质酶基因Bbchit1分别置于构巢曲霉(Aspergillius nidulans)3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子Pgpd和色氨酸基因的终止子TtrpC之下，然后将二者串联于真菌表达载体，构建成双价基因的真菌表达载体；利用遗传转化技术，将构建的双价载体转入虫生真菌拟青霉，筛选获得同时组成性超量蛋白酶CDEP-1和几丁质酶BbChit-1的高毒力重组菌株。
实施例4：
通过诱导培养，提取球孢白僵菌诱导性表达的RNA，根据类枯草杆菌蛋白酶序列同源性比较，设计兼并引物，利用RT-PCR扩增探针，然后从球孢白僵菌诱导性表达的cDNA文库中钩取类枯草杆菌蛋白酶CDEP-1的cDNA基因，根据CDEP-1cDNA的5′端和3′端序列设计引物，以球孢白僵菌的基因组DNA为模板扩增出CDEP-1的基因组序列gCDEP-1；通过诱导培养，分离纯化具有内切活性的球孢白僵菌几丁质酶BbChit-1，测定其N’端氨基酸序列，根据N’端氨基酸序列设计上游兼并引物，利用3’RACE等技术扩增出编码几丁酶Bbchit1的cDNA序列，根据cDNA序列设计引物，利用YADE技术扩增cDNA片段上游序列，包括信号肽序列、3’端非编码序列和部分启动子序列，连接3’RACE和YADE的产物，得到了Bbchit1的全长基因序列Bbchit1；将类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1和几丁质酶基因Bbchit1分别置于构巢曲霉(Aspergillius nidulans)3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子Pgpd和色氨酸基因的终止子TtrpC之下，然后将二者串联于真菌表达载体，构建成双价基因的真菌表达载体；利用遗传转化技术，将构建的双价载体转入虫生真菌蜡蚧轮枝菌(Verticillium lecanni)，筛选获得同时组成性超量蛋白酶CDEP-1和几丁质酶BbChit-1的高毒力重组菌株。
实施例5：
通过诱导培养，提取球孢白僵菌诱导性表达的RNA，根据类枯草杆菌蛋白酶序列同源性比较，设计兼并引物，利用RT-PCR扩增探针，然后从球孢白僵菌诱导性表达的cDNA文库中钩取类枯草杆菌蛋白酶CDEP-1的cDNA基因，根据CDEP-1cDNA的5′端和3′端序列设计引物，以球孢白僵菌的基因组DNA为模板扩增出CDEP-1的基因组序列gCDEP-1；通过诱导培养，分离纯化具有内切活性的球孢白僵菌几丁质酶BbChit-1，测定其N’端氨基酸序列，根据N’端氨基酸序列设计上游兼并引物，利用3’RACE等技术扩增出编码几丁酶Bbchit1的cDNA序列，根据cDNA序列设计引物，利用YADE技术扩增cDNA片段上游序列，包括信号肽序列、3’端非编码序列和部分启动子序列，连接3’RACE和YADE的产物，得到了Bbchit1的全长基因序列Bbchit1；将类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1和几丁质酶基因Bbchit1串联于原核表达载体，构建成双价基因的原核表达载体；利用遗传转化技术，将构建的双价载体转入苏云金芽孢杆菌，筛选获得同时组成性超量蛋白酶CDEP-1和几丁质酶BbChit-1的高毒力重组菌株。
实施例6：
通过诱导培养，提取球孢白僵菌诱导性表达的RNA，根据类枯草杆菌蛋白酶序列同源性比较，设计兼并引物，利用RT-PCR扩增探针，然后从球孢白僵菌诱导性表达的cDNA文库中钩取类枯草杆菌蛋白酶CDEP-1的cDNA基因，根据CDEP-1cDNA的5′端和3′端序列设计引物，以球孢白僵菌的基因组DNA为模板扩增出CDEP-1的基因组序列gCDEP-1；通过诱导培养，分离纯化具有内切活性的球孢白僵菌几丁质酶BbChit-1，测定其N’端氨基酸序列，根据N’端氨基酸序列设计上游兼并引物，利用3’RACE等技术扩增出编码几丁酶Bbchit1的cDNA序列，根据cDNA序列设计引物，利用YADE技术扩增cDNA片段上游序列，包括信号肽序列、3’端非编码序列和部分启动子序列，连接3’RACE和YADE的产物，得到了Bbchit1的全长基因序列Bbchit1；将类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1和几丁质酶基因Bbchit1分别置于病毒组成性启动子和终止子之下，然后将二者串联于病毒表达载体，构建成双价基因的病毒表达载体；利用遗传转化技术，将构建的双价载体转入核型多角体病毒，筛选获得同时组成性超量蛋白酶CDEP-1和几丁质酶BbChit-1的高毒力重组菌株。
实施例7：
通过诱导培养，提取球孢白僵菌诱导性表达的RNA，根据类枯草杆菌蛋白酶序列同源性比较，设计兼并引物，利用RT-PCR扩增探针，然后从球孢白僵菌诱导性表达的cDNA文库中钩取类枯草杆菌蛋白酶CDEP-1的cDNA基因，根据CDEP-1cDNA的5′端和3′端序列设计引物，以球孢白僵菌的基因组DNA为模板扩增出CDEP-1的基因组序列gCDEP-1；通过诱导培养，分离纯化具有内切活性的球孢白僵菌几丁质酶BbChit-1，测定其N’端氨基酸序列，根据N’端氨基酸序列设计上游兼并引物，利用3’RACE等技术扩增出编码几丁酶Bbchit1的cDNA序列，根据cDNA序列设计引物，利用YADE技术扩增cDNA片段上游序列，包括信号肽序列、3’端非编码序列和部分启动子序列，连接3’RACE和YADE的产物，得到了Bbchit1的全长基因序列Bbchit1；将类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1和几丁质酶基因Bbchit1分别置于植物组成性启动子35SCAMV和NOS终止子之下，然后将二者串联于植物表达载体，构建成双价基因的植物表达载体；利用遗传转化技术，将构建的双价载体转入棉花，筛选获得同时组成性超量蛋白酶CDEP-1和几丁质酶BbChit-1的抗虫棉花。
实施例8：
通过诱导培养，提取球孢白僵菌诱导性表达的RNA，根据类枯草杆菌蛋白酶序列同源性比较，设计兼并引物，利用RT-PCR扩增探针，然后从球孢白僵菌诱导性表达的cDNA文库中钩取类枯草杆菌蛋白酶CDEP-1的cDNA基因，根据CDEP-1cDNA的5′端和3′端序列设计引物，以球孢白僵菌的基因组DNA为模板扩增出CDEP-1的基因组序列gCDEP-1；通过诱导培养，分离纯化具有内切活性的球孢白僵菌几丁质酶BbChit-1，测定其N’端氨基酸序列，根据N’端氨基酸序列设计上游兼并引物，利用3’RACE等技术扩增出编码几丁酶Bbchit1的cDNA序列，根据cDNA序列设计引物，利用YADE技术扩增cDNA片段上游序列，包括信号肽序列、3’端非编码序列和部分启动子序列，连接3’RACE和YADE的产物，得到了Bbchit1的全长基因序列Bbchit1；将类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1和几丁质酶基因Bbchit1分别置于植物组成性启动子35S CAMV和NOS终止子之下，然后将二者串联于植物表达载体，构建成双价基因的植物表达载体；利用遗传转化技术，将构建的双价载体转入水稻，筛选获得同时组成性超量蛋白酶CDEP-1和几丁质酶BbChit-1的抗虫水稻。
实施例9：
通过诱导培养，提取球孢白僵菌诱导性表达的RNA，根据类枯草杆菌蛋白酶序列同源性比较，设计兼并引物，利用RT-PCR扩增探针，然后从球孢白僵菌诱导性表达的cDNA文库中钩取类枯草杆菌蛋白酶CDEP-1的cDNA基因，根据CDEP-1cDNA的5′端和3′端序列设计引物，以球孢白僵菌的基因组DNA为模板扩增出CDEP-1的基因组序列gCDEP-1；通过诱导培养，分离纯化具有内切活性的球孢白僵菌几丁质酶BbChit-1，测定其N’端氨基酸序列，根据N’端氨基酸序列设计上游兼并引物，利用3’RACE等技术扩增出编码几丁酶Bbchit1的cDNA序列，根据cDNA序列设计引物，利用YADE技术扩增cDNA片段上游序列，包括信号肽序列、3’端非编码序列和部分启动子序列，连接3’RACE和YADE的产物，得到了Bbchit1的全长基因序列Bbchit1；将类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1和几丁质酶基因Bbchit1分别置于植物组成性启动子35SCAMV和NOS终止子之下，然后将二者串联于植物表达载体，构建成双价基因的植物表达载体；利用遗传转化技术，将构建的双价载体转入油菜，筛选获得同时组成性超量蛋白酶CDEP-1和几丁质酶BbChit-1的抗虫油菜。
Claims (4)
1、一种利用侵染相关基因的协同作用提高微生物杀虫效果的方法，其特征在于，依次包括下列步骤：
(1)球孢白僵菌(Beauveria bassiana)类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1和几丁质酶基因BbChit-1基因克隆
①球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1的cDNA基因克隆
利用昆虫体壁诱导球孢白僵菌分生孢子萌发后的芽管状物，提取RNA，纯化mRNA，构建cDNA文库，同时，根据对不同来源的类枯草蛋白酶基因的同源性比较结果，按其中2个保守序列设计引物，上游引物BbP-1(forward primer)的序列为：5′＞tgg ggt cta ggt cgc atc tc＜3′；下游引物BbP-2(reverse primer)的序列为：5′＞gcc agg tgc gaa aat gtc aac＜3′，然后利用RT-PCR技术扩增出大小为593bp的类枯草杆菌蛋白酶探针BbP，利用此探针筛选cDNA文库，获得阳性克隆，释放文库，酶切验证，测序验证，获得大小为1557bp的CDEP-1cDNA基因(polyA除外)；
②球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1的基因克隆
根据CDEP-1cDNA 5′端和3′端序列设计引物，以球孢白僵菌的基因组DNA为模板扩增CDEP-1的基因组序列，上游引物序列为：5′＞ctt cat cca gca agc aaagtc＜3′，下游引物序列为：5′＞gtt aaa tat aca gat caa tga gtt ttg＜3′；
③球孢白僵菌内切几丁酶Bbchit1的分离纯化及序列测定
在利用几丁质诱导培养球孢白僵菌的基础上，分离纯化出具有内切酶活性的几丁酶Bbchit1，并进行N’端氨基酸测定，序列为：AGTCATKGRPAGKVLQGYWENWD；
④球孢白僵菌内切几丁酶Bbchit1的cDNA的克隆
提取利用几丁质诱导的球孢白僵菌总RNA，根据N’端氨基酸序列设计上游兼并引物，结合下游加接头的Oligo-dT引物，利用3′RACE扩增出编码几丁酶Bbchit1的cDNA序列；
⑤球孢白僵菌内切几丁酶基因Bbchit1的克隆
根据3’RACE得到的cDNA序列，利用YADE技术扩增Bbchit1的全长基因，用于YADE的线性扩增引物序列为：5’＞ccg tgc ttg cga atg tcg＜3’，指数扩增引物序列为：5’＞ggc acc gtc cca gtt ctc＜3’，以DraI酶切球孢白僵菌的基因组DNA为模板，YADE扩增得到了长为1400bp的片段，连接3’RACE和YADE的产物，得到Bbchit1的全长基因序列；
(2)蛋白酶基因CDEP-1和几丁质酶基因BbChit-1双价载体的构建
将类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1和几丁质酶基因Bbchit1分别置于构巢曲霉(Aspergillius nidulans)3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子Pgpd和色氨酸基因的终止子TtrpC之下，然后将二者串联于真菌表达载体，构建成双价基因的真菌表达载体，或将类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1和几丁质酶基因Bbchit1串联于原核表达系统，构建成双价基因的原核表达载体，或将类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1和几丁质酶基因Bbchit1分别置于植物组成性启动子如35sCAMV和Nos终止子之下，然后将二者串联于植物表达载体，构建成双价基因的植物表达载体；
(3)获得同时超量表达蛋白酶CDEP-1和几丁质酶BbChit-1重组微生物或抗虫植物
利用遗传转化技术，将构建的双价载体转入虫生真菌或其它杀虫微生物或植物，筛选获得同时组成性超量表达蛋白酶CDEP-1和几丁质酶BbChit-1的高毒力重组微生物或抗虫植物。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的微生物是真菌、细菌或病毒。
3、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的真菌是白僵菌、绿僵菌、拟青霉、轮枝菌。
4、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的植物是棉花、水稻、油菜。
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