CN105002208A - 用于在植物中控制昆虫侵袭的组合物和方法 - Google Patents

用于在植物中控制昆虫侵袭的组合物和方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于在植物中控制昆虫侵袭的组合物和方法。本发明涉及对有害生物侵袭的控制，这是通过抑制无脊椎有害生物中的一种或多种生物功能来实现的。本发明公开了用于控制有害生物侵袭的方法和组合物，这是通过将一种或多种不同的重组双链RNA分子喂饲给有害生物，通过对基因表达的遏制获得有害生物侵袭的减少来实现的。本发明还涉及制造表达双链RNA分子的转基因植物的方法，以及用于保护植物抵挡有害生物侵袭的转基因杀虫剂的特定组合。

Description

用于在植物中控制昆虫侵袭的组合物和方法
本申请是国际申请日为2005年4月8日的国际申请PCT/US2005/011816进入中国、申请号为200580019203.4的题为“用于在植物中控制昆虫侵袭的组合物和方法”的发明专利申请的分案申请。
对相关申请的交叉引用
本发明要求如下美国临时申请：提交于2004年4月9日的60/560,842、提交于2004年4月27日的60/565,632、提交于2004年6月11日的60/579,062、提交于2004年8月20日的60/603,421、提交于2004年10月11日的60/617,281以及提交于2005年4月7日的60/________，它们每份都通过引用整体并入本文。
技术领域
一般而言，本发明涉及在植物中以及在动物中和在动物上对有害生物侵袭进行的遗传控制。更具体地，本发明涉及用于修饰特定有害生物细胞或组织中编码序列内源表达的方法。更具体地，本发明利用重组DNA技术，对有害生物细胞中目标编码序列的表达加以转录后遏制或抑制，这是通过向有害生物喂饲一种或多种从目标编码序列的一部分或全部转录而来的双链或小干扰核糖核酸(RNA)分子来实现的，由此对侵袭加以控制。因此，本发明涉及通过双链RNA(dsRNA)或小干扰RNA(siRNA)对编码序列表达的序列特异性抑制，以获得对有害生物的理想水平的控制。
本发明还提供了新颖的、经过分离和高度纯化的核酸分子，其包括但不限于用于转录本发明dsRNA或siRNA分子的、非天然存在的核苷酸序列和重组DNA构建体，当被引入有害生物时，其能遏制或抑制有害生物中内源编码序列或目标编码序列的表达。本发明还提供了下述转基因植物，(a)所述植物含有下述核苷酸序列，所述核苷酸序列编码经过分离的和高度纯化的核酸分子以及非天然存在的重组DNA构建体，用于转录用于控制对植物有害的生物侵袭的dsRNA或siRNA分子，以及(b)展示出对昆虫侵袭的抗性和/或提高的耐受性。本发明还描述了：含有本发明的dsRNA核苷酸序列的组合物，其用于在植物上或动物上或动物的环境中局部应用，以使有害生物侵袭消除或减少。
背景技术
人类生存的环境充满了有害生物侵袭。有害生物包括：昆虫、蜘蛛、甲壳类动物、真菌、细菌、病毒、线虫、扁形虫、蛔虫、蛲虫、十二指肠虫、绦虫、锥体虫、血吸虫、马蝇、跳蚤、扁虱、螨、虱等，它们是人类环境中普遍存在的，已应用了多种手段企图控制这些有害生物的侵袭。用于控制微小有害生物(例如细菌、真菌和病毒)侵袭的组合物已被提供为抗生素组合物、抗病毒组合物以及抗真菌组合物形式。用于控制较大有害生物(例如，线虫、扁形虫、蛔虫、蛲虫、犬心虫、绦虫、锥体虫、血吸虫等)侵袭的组合物典型地已作为化学组合物的形式存在，它们可被应用到已知会出现有害生物侵袭的物质表面，或者以药丸、粉末、药片、软膏或胶囊等形式被受侵袭的动物摄取。本发明涉及提供：较之本领域已知的组合物，用于控制有害生物侵袭的改进方法。
商业作物通常是昆虫攻击的目标。在过去数十年中，关于开发用于控制植物中昆虫侵袭的更为有效的方法和组合物，已有了一些实质性的进展。化学杀虫剂对于根除有害生物侵袭非常有效。但是，使用化学杀虫剂有多种缺点。化学杀虫剂是非选择性的。人们意欲应用化学杀虫剂来控制对多种作物和其它植物来说有害的无脊椎有害生物。但是，因为缺乏选择性，化学杀虫剂对于非目标动物也会施加其作用，并且，在化学杀虫剂应用过的一段时间，通常会使田野贫瘠。化学杀虫剂持续存在于环境中，通常很慢被代谢，如果完全不被代谢的话。它们会积累于食物链中，特别是高等食肉动物的食物链中。这些化学杀虫剂的积累导致对这些试剂抗性的发展以及导致进化梯高端的物种，所述杀虫剂作为诱变剂和/或致癌剂发生作用，通常导致不可逆的有害遗传修饰。因此人们强烈需要对环境友善的方法用于控制或根除植物中或植物上的昆虫侵袭，即，选择性的、环境惰性的、非持续保留的以及生物可降解的，并且能很好地是用于有害生物抗性管理体系的方法。
包括Bacillus thuringiensis(B.t.)细菌的组合物是可通过商业途径获得的，其作为对环境安全并且可接受的杀昆虫剂已使用了在超过三十年。Bt细菌的杀昆虫作用是这些细菌专有产生的蛋白质的结果，所述蛋白质不会持续存在于环境中，并且，对于受影响的目标物种具有高度的选择性，仅通过被目标有害生物摄取来施加其作用，它们已显示出了对环境和其它非目标生物(包括人类)的无害性。含有编码杀昆虫B.t.蛋白的一种或多种基因的转基因植物还可在本领域内获得，它们明显有效于控制有害昆虫的侵袭。使用表达Bt杀昆虫蛋白的重组植物的实质性结果是，在使用此类转基因作物的地区，应用到环境以控制作物田间有害生物侵袭的化学杀虫剂的量明显减少。化学杀虫剂应用的减少使得土壤更为清洁，并且使得从土壤流向周围溪流、江河、池塘和湖泊的水也更为清洁。除这些环境好处之外，转基因抗昆虫作物生长的作物田间，有利昆虫的数量有显著增加，这是因为化学杀虫剂的使用减少的缘故。
本领域中已报道了反义方法和组合物，它们被相信能通过单链RNA分子(理论上，能在体内与高度互补的正义链RNA分子杂交)的合成施加其作用。反义技术难于在很多系统中使用，这有三个主要原因。首先，转化细胞中表达的反义序列不稳定。第二，转化细胞中表达的反义序列的不稳定性随之对将该序列运送到远离转基因细胞的宿主、细胞类型或生物系统造成困难。第三，随着不稳定性和反义序列的运送遇到的困难对于如下企图来说也制造了困难，所述企图是：在编码该反义序列的重组细胞内部提供能有效调节目标正义核苷酸序列表达水平的剂量。
用于在细胞、组织或生物内调节基因表达水平的技术鲜有改进，特别地，缺少用于通过使用重组DNA技术来延迟、遏制或减少特定基因表达的发展的技术。此外，作为这些手段的不可预见性的结果，没有用于在真核或原核生物中调节特定基因表达水平的、商业途径可获得的手段。
以前已展示了在多种有害生物中对特定基因进行双链RNA介导的抑制。已在果蝇Drosophila melanogaster中对dsRNA介导的用于遗传控制的手段加以了检测(Tabara et al.，1998，Science 282：430-431)。Tabara et.al.描述了一种方法，用于运送涉及产生转基因昆虫(其表达双链RNA分子)的dsRNA或将dsRNA溶液注射到昆虫体内或在胚胎发育之前注射到卵囊内。研究人员之前已经展示，通过将含有双链或小干扰RNA分子的溶液喂饲给线虫或将线虫浸于该溶液中，以及通过注射dsRNA分子，可在线虫中获得双链RNA介导的基因遏制。Rajagopal et al.描述了如下失败的企图：通过喂饲含特异于目标基因的dsRNA的溶液，或通过将幼虫浸于该溶液中，来遏制有害昆虫Spodoptera litura幼虫的内源基因，但是，在用微量注射器(microapplicator)将dsRNA注射到第五态幼虫的血淋巴之后，Rajagopal et al.却成功地获得了遏制(J.Biol.Chem.，2002，277：46849-46851)。类似地，Mesa et al.(Us 2003/0150017)预见性地描述了用于使用运送到幼虫的dsRNA抑制鳞翅类幼虫Helicoverpa armigera的优选基因座，所述运送通过摄取了被转化为产生dsRNA的植物来实现。人们相信，在大多数无脊椎有害生物物种的膳食中提供dsRNA分子或将含有dsRNA的组合物注射到无脊椎有害生物体内是不切实际的。向无脊椎有害生物提供dsRNA分子的膳食方法是不切实际的，因为RNA分子，甚至是稳定的双链RNA分子，在温和碱性或酸性环境(例如，在大多数无脊椎有害生物消化道中所发现的)中也是高度不稳定的，容易被环境中的核酸酶所降解。因此，人们需要在特定无脊椎有害生物内通过遏制、延迟或者减少基因表达来调节基因表达的改进方法，所述方法为了控制有害生物侵袭的目的或者用于引入新的表型性状。
发明内容
本发明，在一种实施方式中，包含抑制无脊椎有害生物中目标基因表达的方法。特别地，本发明包含对无脊椎有害生物(特别地，Western玉米根虫(WCR，Diabrotica virgifera virgifera LeConte))中一种或多种目标基因的表达加以调节或抑制的方法，所述方法能导致进食、生长、发育、繁殖以及传播停止，最终导致昆虫死亡。所述方法包括：将经稳定的双链RNA(dsRNA)或其修饰形式(例如，小干扰RNA(siRNA)序列)的部分或全部引入到无脊椎有害昆虫体内细胞或细胞外环境(例如，中肠)中，在无脊椎有害昆虫体内，dsRNA或siRNA进入到细胞中，对至少一种或多种目标基因的表达加以抑制，并且，其中，对一种或多种目标基因表达的抑制在无脊椎有害生物上施加了有害的作用。特别考虑的是，本发明的方法和组合物将有用于：通过在有害生物膳食中提供一种或多种包含dsRNA分子的组合物，在任何有害生物宿主、有害生物共生体或有害生物喜好的环境中限制或消除无脊椎有害生物的侵袭，只要有害生物消化系统pH在大约4.5至大约9.5的范围内，大约5至大约9，大约6至大约7以及大约pH 7.0。
本发明公开了示例性的序列表，其中含有来自Western玉米根虫(WCR，Diabrotica virgifera)的核苷酸和氨基酸序列，如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：143以及SEQ ID NO：169至SEQ ID NO：174所示，还含有来自其它鞘翅类昆虫，包括Colorado薯虫(CPB，Leptinotarsadecemlineata)和赤拟谷盗(RFB，Tribolium castaneum)；来自鳞翅类昆虫，包括欧洲玉米钻心虫(ECB，Ostrinia nubilalis)、小地老虎(BCW，Agrotis ipsilon)、玉米夜蛾(CEW，Helicoverpa zea)、秋天行军虫(FAW，Spodoptera frugiperda)、棉铃象鼻虫(BWV，Anthonomusgrandis)、蚕(Bombyx mori)以及Manduca sexta，以及来自双翅类昆虫，包括Drosophila melanogaster、Anopheles gambiae以及Aedesaegypti的的序列，如SEQ ID NO：144至SEQ ID NO：159所示。序列表以CD-ROM光盘的形式随本申请的纸质复印件被包括。
提交的、对应于序列表的计算机可读形式含有针对如下序列的序列表信息：玉米根虫Unigene序列、EST序列、玉米根虫特异性探针序列、引物序列、扩增子序列以及编码双链RNA序列的序列以及v-ATPase和来自上述其它昆虫的核糖体L19直向同源体(SEQ ID NO：144至SEQ ID NO：159)。
本发明提供了一种方法，用于遏制无脊椎有害生物(例如玉米根虫或相关物种)中的基因表达，所述方法包括如下步骤：在有害生物的膳食中提供基因遏制量的至少一种dsRNA分子，所述dsRNA分子是由序列表中SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：143以及SEQ ID NO：169至SEQ ID NO：174所示的核苷酸序列转录来的，其至少一段片断与有害生物细胞中形成的mRNA序列互补，并且观察有害生物的死亡或进食被抑制、阻碍或停止。
在本发明的另一方面，所述方法包括如下步骤：向有害生物喂饲一种(或多种)经过稳定的dsRNA分子或其修饰形式，例如siRNA分子，其核酸序列与选自由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：143以及SEQID NO：169至SEQ ID NO：174构成的组的核苷酸序列转录来的RNA分子至少大约80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或大约100％相同。
因此，在本发明的另一方面，提供了序列表示出的SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：143以及SEQ ID NO：169至SEQ ID NO：174所示的一组经过分离和纯化的核苷酸序列。本文公开的SEQ ID NO：1至SEQID NO：143所示的核苷酸序列是从由WCR昆虫幼虫制备的互补DNA(cDNA)文库分离并实质上纯化出的。本文公开的序列表中SEQ IDNO：169至SEQ ID NO：174所示的核苷酸序列分离并高度纯化自有害的Southern玉米根虫的基因组DNA，或该有害昆虫的mRNA库，由此类mRNA库获得的、或基于本文公开的核苷酸序列或本领域中已知作为T7噬菌体RNA聚合酶启动子序列从头合成的cDNA核苷酸序列。本发明提供了经过稳定的dsRNA或siRNA分子，或一种或多种miRNA的表达，用于抑制无脊椎有害生物，例如WCR昆虫中目标基因的表达。经过稳定的dsRNA、miRNA或siRNA分子可以包含相对至少一种启动子以正义或反义方向排列的至少两种编码序列，其中，包含正义链和反义链的核苷酸序列被至少大约五至大约一千个核苷酸的间隔(spacer)序列所连接或联结，其中，正义链和反义链长度不同，并且其中，两种编码序列中的每一种与序列表中SEQ ID NO：1至SEQID NO：143之一或SEQ ID NO：169至SEQ ID NO：174之一所示的核苷酸序列分享至少90％，至少95％，至少98％或者甚至100％的序列相同性。
本发明还提供了非天然存在的(NNO)核苷酸序列，其可被用于靶向无脊椎有害生物中的基因，用于双链RNA介导的遏制，以获得想要的对目标基因的抑制。SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：143或SEQ IDNO：169至SEQ ID NO：174所示的核苷酸序列的任何一种可被用于构建此类NNO核苷酸序列。
本发明还提供了编码本发明所包含的dsRNA分子的重组dNA构建体，用于引入宿主细胞。重组DNA构建体包含被宿主细胞转录为RNA的核苷酸序列。转录的RNA形成至少一种dsRNA分子，使得dsRNA分子的一条链被与选自由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：143和SEQ ID NO：169至SEQ ID NO：174所构成的组的核苷酸序列至少大约80％至大约100％相同的核苷酸序列的一部分所编码。重组DNA构建体能在宿主细胞中产生dsRNA分子，能抑制内源基因或目标基因或其衍生物或其互补序列在宿主细胞中，或无脊椎有害生物摄取经转化的宿主细胞之后在有害生物细胞中的表达。本发明的核苷酸序列处于在宿主细胞中可被操作的启动子序列控制之下，并且被表达以产生在宿主细胞中形成dsRNA分子的核糖核酸序列。在宿主细胞或无脊椎有害生物中对dsRNA分子进行进一步加工，形成siRNA分子。
本发明还提供了用于植物转化的重组DNA序列，其被构建为含有能转化为单链RNA分子的至少一种非天然存在的核苷酸序列。当在无脊椎有害生物的膳食中提供的情况下，单链RNA分子在体内通过分子间杂交形成双链RNA分子，抑制无脊椎有害生物细胞中至少一种目标基因的表达。非天然存在的核苷酸序列与至少一种启动子序列可操作地连接，所述启动子序列在转基因植物细胞中发挥作用，将可操作地连接的非天然存在的核苷酸序列转录为一种或多种核糖核酸序列。RNA序列自身装配为双链RNA分子，被提供于在转基因植物上进食的无脊椎有害生物的膳食中。有害生物的膳食中的dsRNA分子的供应，获得了对有害生物中一种或多种目标基因表达的想要的抑制。
本发明还提供了下述重组宿主细胞，所述宿主细胞在其基因组中具有至少一种重组DNA序列，所述DNA序列能在宿主细胞中被转录，以产生至少一种dsRNA分子，当被无脊椎有害生物消化时，所述dsRNA分子发挥作用，以抑制有害生物中目标基因的表达。dsRNA分子是由下述核苷酸序列的一部分所编码的，所述核苷酸序列展示出与序列表中SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：143或SEQ ID：169至SEQ ID NO：174所示的核苷酸序列的至少大约80至大约100％的相同性。用于构建靶向WCR基因以进行抑制的dsRNA试剂的示例性核苷酸序列示于序列表中SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：143和SEQ ID：169至SEQ IDNO：174。
本发明还提供了用于植物转化的重组DNA构建体，所述构建体由至少两种不同的非天然存在的序列构成，当作为RNA序列在体内表达以及在无脊椎有害生物的膳食中提供时，所述序列能抑制无脊椎有害生物细胞中至少两种不同目标基因的表达。第一种非天然存在的序列被转化为RNA，其形成至少一种第一种dsRNA分子。第一种dsRNA分子的一部分被第一种非天然存在的序列的一部分所编码，其展示出与序列表中SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：143或SEQ ID：169至SEQID NO：174所示的核苷酸序列、第一种目标基因的核苷酸序列、其衍生物、或其互补序列的至少大约80至大约100％的相同性。第二种非天然存在的序列被转化为RNA，其形成第二种dsRNA分子。第二种dsRNA分子的一部分被第二种非天然存在的序列的一部分所编码，其展示出与选自序列表中SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：143或SEQ ID：169至SEQ ID NO：174所示的核苷酸序列、以及第二种目标基因的核苷酸序列、其衍生物、或其互补序列的至少大约80至大约100％的相同性。两种非天然存在的序列被可操作地放置于至少一种启动子序列的控制之下。启动子序列发挥功能，以在转基因植物细胞中表达第一种和第二种dsRNA分子。在于转基因植物上进食的无脊椎有害生物的膳食中，提供有害生物抑制浓度的dsRNA分子，有害生物对植物细胞的摄取能获得对有害生物中目标基因表达的想要的抑制。
本发明还提供了经过转化的植物细胞，其在其基因组中具有上文提到的用于植物转化的重组DNA序列中的至少一种。经过转化的植物细胞产生转基因植物，转基因植物制造后代植物、种子以及植物产品，它们每一种都包含重组DNA。
本发明的方法和组合物可应用于任何单子叶和双子叶植物，这取决于想要的无脊椎有害生物控制，或者，其可通过药学上可接受的制剂应用到无脊椎动物上，以使无脊椎有害生物侵袭发生一定水平的降低。特别地，植物包括但不限于：紫花苜蓿、莳萝(aneth)、苹果、杏、朝鲜蓟、芝麻菜、芦笋、鳄梨、香蕉、大麦、豆、甜菜(beet)、黑莓、蓝莓、椰菜、抱子甘蓝、卷心菜、芥菜、香瓜、胡萝卜、木薯、花椰菜、芹菜、樱桃、芫荽、柑橘、克莱门氏小柑橘、咖啡、玉米、棉花、黄瓜、花旗松、茄子、苦苣、宽叶莴苣、桉树、茴香、无花果、葫芦、葡萄、柚子、哈密瓜、豆薯、奇异果、莴苣、韭菜、柠檬、酸橙、火炬松、芒果、瓜、蘑菇、坚果、燕麦、黄秋葵、洋葱、桔、装饰用植物、木瓜、欧芹、豌豆、桃、花生、梨、胡椒、柿、松树、菠萝、大蕉、李、石榴、白杨、马铃薯、南瓜(pumpkin)、温柏、辐射松、菊苣、萝卜、覆盆子、水稻、裸麦、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜(squash)、草莓、甜菜(sugarbeet)、甘蔗、向日葵、红薯、苏合香、蜜柑、茶、烟草、番茄、草皮、蔓生植物、西瓜、小麦、薯蓣以及小胡瓜植物。
本发明还提供了一种有害生物控制试剂，其中包含从本发明的核苷酸序列转录来的dsRNA分子。所述核苷酸序列与序列表中SEQ IDNO：1至SEQ ID NO：143或SEQ ID：169至SEQ ID NO：174所示的核苷酸序列分享大约80至大约100％的相同性。在一种形式中，有害生物控制试剂包含dsRNA分子。在另一种形式中，有害生物控制试剂包含siRNA分子。在又一种形式中，有害生物控制试剂包含编码下述mRNA分子的重组DNA序列，所述mRNA分子能形成用于引入植物和微生物的dsRNA或siRNA分子。在还一种形式中，有害生物控制试剂是微生物，其含有编码下述mRNA分子的重组DNA序列，所述mRNA分子能形成dsRNA或siRNA分子。有害生物控制试剂优选是昆虫或线虫类有害生物控制试剂。
人们需要有害生物控制试剂发挥作用，以减少或消除玉米根虫的侵袭，但是也考虑到，本文示出的方法和组合物能被用来获得来自其它有害生物的相关序列，以及利用这些衍生物以控制其它(多种)有害生物的侵袭。还考虑到，昆虫有害生物可以选自玉米根虫所属的相同属、相同科或目。此外，本发明的发明人还考虑到，可使用本发明，将其应用于控制来自昆虫王国和来自线虫、真菌病原体、病毒、细菌以及任何其它对植物有害的无脊椎生物的任何物种。
本发明还提供了用于控制无脊椎有害生物侵袭的方法和组合物的组合。一种手段提供了用于保护植物抵挡昆虫侵袭的、本文所述的dsRNA方法和组合物，以及一种或多种杀昆虫剂，所述杀昆虫剂展示出与dsRNA方法和组合物所展示出的性质不同的性质。例如，当在昆虫有害生物的膳食中提供Bt蛋白时，就展现出了与本发明的方法和组合物的作用模式戏剧性不同的用于控制昆虫有害生物的作用模式。配制为局部应用的组合物，或使用转基因方法获得的将dsRNA方法和组合物与Bt方法和组合物组合起来的组合物，能产生协同效应，这是控制昆虫侵袭的领域中以前未知的。产生一种或多种dsRNA或siRNA分子(能抑制目标有害生物中一些必要生物功能的)的转基因植物与对目标有害生物来说有毒的一种或多种B.t.杀昆虫蛋白一起提供了令人吃惊的协同效应。一种协同效应是(多种)dsRNA或(多种)Bt蛋白所需的表达水平降低。当组合到一起时，每种有害生物控制剂都仅需要更低的有效剂量。人们相信，Bt杀昆虫蛋白制造出了进入孔，dsRNA或siRNA分子通过所述的进入孔能更为有效地渗透进远离昆虫肠道的空间，或者更为有效地渗透进Bt蛋白所制造的伤口附近的细胞，由此仅需要更少量的Bt或dsRNA就能获得想要的杀昆虫结果，或者想要的对目标有害生物目标生物功能的抑制或遏制。
本发明的发明人在本文中描述了多项发明，其中包括用于控制无脊椎有害生物侵袭的方法，所述方法是通过向无脊椎有害生物的膳食中提供下述试剂来进行的，所述试剂包含在被有害生物摄取时发挥作用的核糖核酸，或者由所述核糖核酸构成，以抑制有害生物细胞内目标核苷酸序列的表达。在膳食中提供的核糖核酸由是目标核苷酸序列的或与目标核苷酸序列互补的核糖核苷酸序列构成。核糖核苷酸序列是由下述连续的DNA序列转录来的，所述DNA序列有至少大约19至大约5000个核苷酸长，其选自由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：143、SEQ ID：169至SEQ ID NO：174及其互补序列所构成的组。所述方法提供了对下述核苷酸序列的构建，所述核苷酸序列可用于表达RNA分子，所述RNA分子在提供给有害生物的膳食中被有害生物所摄取。膳食可以是人工膳食，对其进行过配制以达到在此类膳食上保持有害生物的特定营养要求，所述膳食可以补充有有害生物控制量的、已从单独的表达系统中纯化出的RNA，对膳食的补充用于下述目的：确定RNA组合物的有害生物控制量，或确定——在有害生物摄取被补充的膳食时，能与有害生物中的一种或多种目标序列特异性地结合和部分杂交的、一种或多种构建的特定RNA是否有用于获得一些基因遏制活性。膳食还可以是用DNA序列转化过的重组细胞，所述DNA是针对试剂、RNA或基因遏制剂的表达构建的。有害生物摄取一种或多种此类经过转化的细胞时，能观察到想要的基因型或表型结果，这表明，该试剂具有抑制有害生物细胞内目标核苷酸序列表达的功能。
无脊椎有害生物优选是昆虫、蜘蛛、线虫、扁形动物、囊蠕虫、真菌有害生物或者基因遏制技术可适用的其它任何无脊椎有害生物。更优选地，无脊椎有害生物是在动物或植物侵袭方面特别被怀疑的无脊椎有害生物。更特别地，无脊椎有害生物是偏好侵袭作物植株、装饰物和/或草地的昆虫或线虫或真菌有害生物。
选用来表达本发明的基因遏制剂的DNA序列优选为大约19至大约5000个核苷酸长，其至少部分与一种或多种特定目标有害生物物种DNA中存在的目标序列的正义或反义链在序列上高度相同。短语“至少部分”意欲表示下述概念：选用来表达基因遏制剂的DNA序列可由从一种或多种目标有害生物获得的单条序列构建而来，其可被用于表达下述RNA，所述RNA能在对一种或多种目标有害生物中单个基因或基因家族的遏制重发挥作用；或者可从多种DNA序列来构建作为嵌合体的DNA序列。所述多种DNA序列可以每一条都从单种有害生物内的一种或多种核苷酸序列获得，或者可以从多种不同有害生物的一种或多种核苷酸序列获得。特别地，选出的序列应当能展示出与来自有害生物物种DNA的核苷酸序列的大约80至大约100％的核苷酸序列相同性。有害生物物种的DNA可通过下述方法来鉴定：从有害生物物种中分离出DNA，或者通过对有害生物物种中的RNA加以鉴定，反向地将RNA序列转变为DNA。示例出来自玉米根虫有害生物物种的DNA的序列是本文中示出的、序列表中的SEQ ID NO：1至SEQ IDNO：143、SEQ ID：169至SEQ ID NO：174及其互补序列。
选用来表达基因遏制性RNA分子的DNA序列可被包括于多核苷酸组合物中，所述组合物在植物细胞中使用。特别地，DNA序列可被包括进用于转化植物细胞基因组的载体，并且可被包括进表达盒，所述表达盒含有至少一种植物功能性启动子，所述启动子与选用的DNA序列和其它任何表达控制元件(想用来获得合适的细胞内时间或植物空间水平的表达)可操作地相连。将多核苷酸组合物引入到植物细胞的基因组中提供了转化细胞，如果合适的选择手段已与多核苷酸组合物被一起包括，那么其可被选择，并再生为转基因重组植物。转基因植物、事件，可被提供于一种或多种有害生物的膳食中，以获得对有害生物侵袭的控制。转基因植物可以产生后代植物、植物细胞以及种子，它们每一种都含有多核苷酸组合物。
本发明提供了一种保护植物抵挡昆虫侵袭的方法，所述方法通过向昆虫有害生物提供下述植物细胞中的一种或多种来实现的，所述细胞每种都表达基因遏制性的RNA分子，所述RNA分子来自下述DNA序列，所述DNA序列选自由本文举例的序列所构成的组。对含有基因遏制性RNA、有害生物或昆虫控制剂的植物细胞的摄取，导致了对有害生物或昆虫中一种或多种生物学功能的抑制。
本发明提供了一种组合物，其中含有两种或多种不同的杀虫剂，其中每种都对同样的有害生物或昆虫物种有毒。如本文所述，这些杀虫剂中的一种可以是有用于在有害生物的一种或多种细胞中遏制必要生物功能的RNA分子。第二种杀虫剂可随第一种一起被包括。第二种杀虫剂可以是不同于第一种的第二种基因遏制性RNA，或者第二种杀虫剂可以选自如下物质构成的组：马铃薯块茎储藏蛋白patatin、Bacillus thuringiensis杀昆虫蛋白、Xenorhabdus杀昆虫蛋白、Photorhabdus杀昆虫蛋白、Bacillus laterosporous杀昆虫蛋白、Bacillussphearicus杀昆虫蛋白以及木质素。Bacillus thuringiensis杀昆虫蛋白可以是大量杀昆虫蛋白中的任何种类，所述蛋白包括但不限于：Cry1、Cry3、TIC851、CryET70、Cry22、双元杀昆虫蛋白CryET33和CryET34、双元杀昆虫蛋白CryET80和CryET76、双元杀昆虫蛋白TIC100和TIC101、双元杀昆虫蛋白PS149B1、VIP杀昆虫蛋白、TIC900或相关蛋白、TIC901、TIC1201、TIC407、TIC417以及前述杀昆虫蛋白的任何种类的杀昆虫嵌合体。
针对遏制被靶向、或针对有害生物细胞中的功能或作为有害生物的生理或代谢方面的功能(针对遏制被靶向的基因的表达所能产生的)被靶向的基因可编码必要的蛋白，所述蛋白的预期功能选自由如下功能所构成的组：肌肉形成，保幼激素的形成，保幼激素的调控，离子调控和转运，消化性酶的合成，细胞膜势的保持，氨基酸生物合成，氨基酸降解，精子形成，信息素的合成，信息素传感，天线蛋白(antennae)的形成，翅膀形成，腿的形成、发育和分化，卵的形成、幼虫成熟、消化性酶的形成、血淋巴的合成、血淋巴的保持、神经传递、细胞分裂、能量代谢、呼吸和凋亡。优选地，选用来构建遏制构建体的DNA序列是从序列表中示出的、用于遏制玉米根虫基因的核苷酸序列获得的。我们想到，用于控制无脊椎有害生物侵袭的方法将包括：在无脊椎有害生物的膳食中提供试剂，例如，从第一种DNA序列表达的第一种核糖核苷酸序列，其在被有害生物摄取时发挥功能，以抑制所述有害生物内的生物功能，还想到，第一种DNA序列展示出与从所述有害生物获得的编码序列大约85至大约100％的核苷酸序列相同性。第一种核糖核苷酸序列可与第二种核糖核苷酸序列杂交，所述第二种核糖核苷酸序列与第一种核糖核苷酸序列互补或实质上互补，第二种核糖核苷酸序列是第二种DNA序列所表达的，第二种DNA序列对应于从无脊椎有害生物获得的编码序列，其选自本文在序列表中示出的序列或其互补体。优选地，第一种和第二种DNA序列包含与序列表中示出的序列中的一种或多种相同的连续序列，所述连续序列有大约14至大约25或更多连续核苷酸。
当含有有害生物基因遏制量的杀昆虫剂(例如，由本文序列表中示出的一种或多种序列的表达产生的一种或多种RNA分子)的膳食被提供给下述无脊椎有害生物时，本发明发挥最优功能，所述有害生物展示出大约4.5至大约9.5、大约5.0至大约9.0、大约5.5至大约8.5、大约6.0至大约8.0、大约6.5至大约7.0、或大约7.0的消化系统pH。可选地，本文所述的方法、核酸、核糖核酸、核糖核苷酸序列、组合物、植物、植物细胞、后代植物、种子、昆虫控制剂、有害生物控制剂、表达盒中的任何种类，在针对包含上述消化道pH的一种或多种有害生物的膳食中提供时具有功能。
本发明的膳食可以是任何足够的有害生物膳食，其包括但不限于，人工膳食或配方、植物细胞、多种植物细胞、植物组织、植物的根、植物种子以及从植物种子生长来的植物，其中，所述膳食包含有害生物抑制量的、由下述DNA分子编码的RNA分子，所述DNA分子是或实质上是一种或多种选自序列表中所示的核苷酸序列，或选自从特定无脊椎有害生物物种获得的核苷酸序列的连续至少大约19至大约5000个核苷酸，或者与其互补或实质上互补。
农业上和商业上重要的产品和/或组合物(包括但不限于，动物饲料、农产品和玉米产品以及副产品，玉米产品以及副产品是被用作为用于人类消耗的食物，或者用于意欲用于人类消耗的组合物和农产品的，其包括但不限于，玉米粉、玉米面、玉米糖浆、玉米油、玉米淀粉、爆米花、玉米饼、含有玉米和玉米副产品的谷物等)意欲落入本发明的范围，如果这些产品和组合物含有可探测量的、本文示出的、作为诊断含有此类苷酸序列的任何转基因事件的核苷酸序列的话。这些产品是有用的，至少因为它们可能从作物获得，并且能生产，在含有更少杀虫剂和有机膦的大田中繁殖，这是它们包括进本发明的核苷酸用于控制无脊椎有害生物在植物中的侵袭的结果。此类农产品和农产品制品是从由转基因植物生产的种子来生产的，其中，所述转基因植物表达下述RNA，所述RNA来自本发明的一种或多种连续核苷酸，或一种或多种无脊椎有害生物的核苷酸及其互补体。此类农产品和农产品制品还可有用于控制此类农产品和农产品制品的无脊椎有害生物，例如，控制面粉象鼻虫，因为在农产品或农产品制品中存在有能遏制有害生物基因的RNA，所述RNA是本发明所示的基因序列所表达的。
本发明还提供了计算机可读的介质，在其上记录有序列表中示出的SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：143或SEQ ID NO：169至SEQ IDNO：174示出的核苷酸序列或其互补体中的一种或多种，用于大量基于计算机的应用，包括但不限于，DNA相同性和相似性搜索、蛋白质相同性和相似性搜索、转录情况特征分析、基因组之间的比较以及人工杂交分析。
具体实施方式
下文是对本发明的详细描述，其被提供来协助本领域技术人员实践本发明。本领域普通技术人员可不离开本发明宗旨或范围的情况下在本文所述的实施方式中做出改良和变化。
在本文中发明人发现，与本领域的教导相反，将含有双链RNA分子(由在无脊椎物种的一种或多种被表达的核苷酸序列中发现的序列构成)的组合物喂饲给从中获得所述核苷酸序列的无脊椎物种，导致了对无脊椎物种中一种或多种生物功能的抑制。特别地，发明人发现，将由玉米根虫RNA序列构成的双链RNA分子分别喂饲给玉米根虫，导致了摄取此类组合物的玉米根虫的死亡，或者发育和分化受到抑制。
发明人对从每种无脊椎有害生物物种获得的数千种cDNA序列的核苷酸序列加以了鉴定。由cDNA序列所编码的氨基酸序列被推断出来，并且与所有已知的氨基酸序列比对。cDNA序列中的很多被预计为编码下述蛋白，所述蛋白具有一些与它们相关的注释信息。与特定核苷酸序列以及其所编码的蛋白序列相关的注释信息基于：通过本文所述的cDNA序列的翻译推断出的氨基酸序列与本领域公众可获得的数据库中已知的氨基酸序列之间的同源性和相似性。针对所有已知的氨基酸序列，对本文所示的推断出的氨基酸序列进行了BLAST，基于比对结果，对每种推断出的氨基酸序列指派了可能的功能。编码本领域已知的对生存来说很重要的蛋白或蛋白部分(例如，涉及多种代谢或催化生化途径、细胞分裂、繁殖、能量代谢、消化、神经功能等的氨基酸序列)的cDNA序列被选用来制备在无脊椎有害生物的膳食中提供的双链RNA分子。如本文所述，目标有害生物摄取含有一种或多种dsRNA(其至少一段片断对应于目标有害生物细胞中产生的RNA的至少一段高度相同的片断)的组合物，导致目标有害生物的死亡、发育迟缓或其它抑制情况。这些结果表明，从无脊椎有害生物获得的核苷酸序列，DNA或RNA可被用于构建重组有害生物宿主或是有害生物侵袭目标的共生体。有害生物宿主或共生体可被转化为含有从无脊椎有害生物获得的核苷酸序列中的一种或多种。转化进有害生物宿主或共生体的核苷酸序列编码一种或多种RNA，所述RNA在被转化的宿主或共生体内的细胞或生物流体中形成dsRNA，由此使得：如果/当有害生物在转基因宿主或共生体上进食，dsRNA是可获得于有害生物的膳食中的，这将导致对有害生物细胞中一种或多种基因表达的遏制，最终导致有害生物的死亡、发育迟缓或其它抑制情况。
一般而言，本发明涉及对宿主生物中无脊椎有害生物侵袭的遗传控制。更具体地，本发明包括将有害生物控制剂运送至无脊椎有害生物的方法。此类有害生物控制剂直接或间接导致有害生物保持其自身、生长或者侵袭目标宿主或共生体的能力受损。本发明提供了在有害生物膳食中利用经稳定的dsRNA的方法，这作为遏制有害生物中目标基因的手段，由此获得对有害生物靶向的宿主或共生体中或周围的有害生物侵袭的想要的控制。使用重组的经过稳定的dsRNA或siRNA分子，可以制造转基因植物。
为完成前述内容，本发明提供了一种方法，用于抑制无脊椎有害生物(特别地，Western玉米根虫(WCR)或其它鞘翅类昆虫物种)中目标基因的表达，导致进食、生长、发育、繁殖、传播的停止，最终可能导致有害生物的死亡。所述方法包括：将经过稳定的双链RNA(dsRNA)核苷酸分子或其经过修饰的形式(例如小干扰RNA(siRNA)分子)部分或全部地引入到有害生物作为食物来源依赖的营养组合物中，并且使得该营养组合物对于有害生物进食来说是可获得的。对含有双链或siRNA分子的组合物的摄取，导致有害生物细胞对所述分子的吸收，从而抑制有害生物细胞中至少一种目标基因的表达。对目标基因的抑制对有害生物造成了有害的影响。dsRNA分子或siRNA由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：143和SEQ ID NO：169至SEQ ID NO：174中任何序列所示出的核苷酸序列构成，其抑制导致对于有害生物的生长和发育或者其它生物功能来说很重要的蛋白或核苷酸作用物被减少或除去。选用的核苷酸序列展示出与序列表中SEQ IDNO：1至SEQ ID NO：143和SEQ ID NO：169至SEQ ID NO：174所示的核苷酸序列或其互补序列之一的大约80％至至少大约100％的序列相同性。此类抑制是特异性的，因为来自目标基因一部分的核苷酸序列选自抑制性dsRNA或siRNA转录来的序列选出的。所述方法有效于抑制至少一种目标基因的表达，可被用于抑制有害生物中很多其它类型的目标基因。
本发明还提供了不同形式的有害生物控制剂，用于获得想要的有害生物侵袭的减少。在一种形式中，有害生物控制剂包含dsRNA分子。在另一种形式中，有害生物控制剂包含siRNA分子。在又一种形式中，有害生物控制剂包含重组DNA构建体，所述构建体可用于稳定转化为生物和植物，使得经转化的微生物或植物能编码dsRNA或siRNA分子。在另一种形式中，有害生物控制剂是微生物，其中含有编码dsRNA或siRNA分子的重组DNA构建体。
从cDNA文库和/或基因组文库信息提供经过分离和纯化的核苷酸序列对。核苷酸序列对是从任何优选的无脊椎有害生物获得的，其被用作为热扩增引物，以产生本发明的dsRNA或siRNA分子。
本发明提供了重组DNA构建体，用于获得对有害生物靶向的特定宿主或共生体的稳定转化。经过转化的、有害生物靶向的宿主或共生体表达具有有效杀虫水平的、来自重组DNA构建体的优选dsRNA或siRNA分子，并且在有害生物的膳食中提供所述分子。
作为经过转化的、有害生物目标生物的宿主或共生体的例子，本发明还提供了经过转化的植物细胞以及经过转化的植物和它们的后代。经过转化的植物细胞和经过转化的植物表达本发明的一种或多种dsRNA或siRNA序列，所述序列来自序列表中示出的SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：143和SEQ ID NO：169至SEQ ID NO：174中示出的一种或多种DNA序列或其互补序列。
本文中使用的词汇“基因遏制”在同时使用时，被用来指：用于降低产生的蛋白水平的任何公知方法，蛋白产生是基因转录成mRNA以及随后mRNA翻译的结果。基因遏制还用来指来自基因或编码序列的蛋白表达的降低，包括转录后基因遏制和转录遏制。转录后基因遏制是从遏制靶向的基因或编码序列转录来的mRNA的全部或一部分与用于遏制的对应双链RNA之间的同源性介导的，其指在细胞中可获得的用于与核糖体结合的mRNA的量实质上的或可测量到的降低。经过转录的RNA可以是正义方向的，发挥所谓的共遏制作用，或者可以是反义方向的，发挥所谓反义遏制作用，或者以两种方向产生dsRNA，发挥所谓的RNA干扰作用(RNAi)。转录遏制是细胞中dsRNA的存在所介导的，所述dsRNA是基因遏制剂，其展示出与启动子DNA序列或其互补序列的高度序列相同性，发挥被称为启动子反遏制。基因遏制可以针对与性状相关的天然植物基因发挥作用，例如，给植物提供具有降低水平的、由天然基因编码的蛋白，或者具有增加或降低水平的受影响的代谢物。基因遏制还可针对下述对植物有害的生物中的目标基因发挥作用，所述有害生物能摄取或接触含有基因遏制剂的植物材料，所述基因遏制剂被特别设计为能抑制或遏制有害生物细胞中一种或多种同源序列或互补序列的表达。
美国专利号5,107,065、5,759,829、5,283,184和5,231,020中公开：反义或正义定向的RNA进行转录后基因遏制，以调控植物细胞中的基因表达。dsRNA用于遏制植物中基因的用途被公开于WO 99/53050、WO 99/49029、美国专利申请公开号2003/0175965和2003/0061626、美国专利申请号10/465,800和美国专利号6,506,559以及6,326,193中。
在植物中进行转录后基因遏制的优选方法使用正义定向和反义定向的、经过稳定的转录来的RNA，例如，作为发卡和茎环结构。用于进行转录后基因遏制的优选DNA构建体是下述这样的，其中，第一段片断编码展示出反义定向的RNA，其展示出与待遏制的目标基因片断之间的高度相同性，所述第一段片断与第二段片断相连，第二段片断编码展示出与第一段片断具有高度互补性的RNA。此类构建体被预计会形成茎环结构(这是通过第一段片断与第二段片断杂交形成的)和来自连接两者段片断的核苷酸序列的环结构(见WO94/01550、WO98/05770、US 2002/0048814和US 2003/0018993)。
本文中使用的术语“核酸”指从5’至3’末端阅读的脱氧核糖核酸或核糖核酸碱基的单或双链聚合物。可选地，“核酸”还可含有非天然存在的或被改变的碱基，其允许通过聚合酶的正确阅读，不会降低该核酸编码的多肽的表达。术语“核苷酸序列”或“核酸序列”指作为单独的单链存在或存在于二体中的核酸的正义和反义链。术语“核糖核酸”(RNA)包括RNAi(抑制性RNA)、dsRNA(双链RNA)、siRNA(小干扰RNA)、mRNA(信使RNA)、miRNA(微小RNA)、tRNA(转运RNA、被或未被相应的酰化氨基酸加上电荷的)以及cRNA(互补RNA)，术语“脱氧核糖核酸”(DNA)包括cDNA和基因组DNA以及DNA-RNA杂交体。词汇“核酸片断”、“核酸序列片断”或更常见的“片断”将被本领域技术人员理解为：其包括基因组序列、核糖体RNA序列、转运RNA序列、信使RNA序列、操纵子序列和更小的工程改造过的核苷酸序列，所述序列表达或可被改造为表达蛋白质、多肽或肽。
本文中使用的术语“有害生物”指昆虫、蜘蛛、甲壳类动物、真菌、细菌、病毒、线虫、扁形虫、蛔虫、蛲虫、十二指肠虫、绦虫、锥体虫、血吸虫、马蝇、跳蚤、扁虱、螨、虱等，它们是自然界普遍存在的，可以摄取或接触一种或多种由有害生物宿主或共生体(被转化为能表达双链基因遏制剂的，或涂布有所述遏制剂)产生的细胞、组织或流体，或者可以摄取含有基因遏制剂的植物材料。本文中使用的“有害生物抗性”是转基因植物、转基因动物、转基因宿主或转基因共生体的特征，使得所述植物、动物、宿主或共生体对于有害生物的攻击具有抗性，所述攻击典型地能对所述植物、动物、宿主或共生体造成损害或损失。此类有害生物抗性可能产生自天然突变，或者更为典型地，产生自赋予有害生物抗性的重组DNA的加入。为使转基因植物具有昆虫抗性，重组DNA可以例如，编码昆虫致死性或昆虫抑制性蛋白，例如来自B.thuringiensis细菌的delta内毒素(例如，在棉花和玉米的商业可获得品种中使用的)，或者可被转录为RNA分子，在重组植物的组织或流体中形成dsRNA分子。dsRNA分子部分包含：与偏好在重组植物上进食的有害昆虫中DNA序列编码的相应RNA片断相同的RNA片断。目标有害昆虫中基因的表达受dsRNA遏制，对目标有害昆虫中基因表达的遏制导致植物具有昆虫抗性。Fire et al.(美国专利号6,506,599)一般性地描述了对有害生物侵袭的抑制，仅针对在线虫种Caenorhabditis elegans中具有抑制基因功能作用的若干中核苷酸序列提供了细节。类似地，Plaetinck et al.(US 2003/0061626)描述了dsRNA用于在多种线虫有害生物种抑制基因功能的用途。Mesaet al.(US 2003/0150017)描述了：使用dsRNA序列去转化宿主细胞，以表达与特定病原体中目标序列高度相同的相应dsRNA序列，并且特别描述了：构建重组植物，其表达这些dsRNA序列(用于被多种对植物有害的生物摄取)，协助对有害生物基因组中基因的负调，并且提高植物对有害生物侵袭的抗性。
本发明提供了使用经过稳定的dsRNA对目标有害生物中一种或多种目标基因的基因表达加以抑制的方法。本发明特别有用于调节真核基因表达，特别是调节昆虫中存在的基因的表达，所述昆虫展示出大约4.5至大约9.5、更优选地大约5.0至大约8.0、进一步更优选地大约6.5至大约7.5的消化系统pH。具有这些范围之外的pH水平的消化系统得对植物有害的生物不是下述方法的优选候选者，所述方法双链RNA介导的、用于基因遏制的方法，其中使用需要摄取优选dsRNA分子的运送方法。调节作用适用于在有害生物中表达的多种基因，例如，负责细胞内代谢或细胞内转化的内源基因，包括住家基因、转录因子和编码细胞内代谢涉及到的多肽的其它基因。
本文中使用的术语“表达”指，从本发明公开的核酸获得的正义或反义RNA的转录和稳定积累。表达还可以表示mRNA向多肽或蛋白质的翻译。本文中使用的术语“正义”RNA指对应于下述序列或片断的RNA转录本，当被目标有害生物产生时，所述序列或片断以能通过目标有害生物细胞翻译成蛋白质的mRNA的形式存在。本文中使用的术语“反义RNA”指与目标有害生物细胞中正常产生的mRNA的全部或一部分互补的RNA。反义RNA的互补可以是针对特定基因转录本的任何部分的，即，5’非编码序列、3’非翻译序列、内含子或编码序列。本文中使用的术语“RNA转录本”指，对DNA序列进行的由RNA聚合酶催化的转录得到的产物。当RNA转录本是DNA序列的完美互补拷贝时，其被称为一级转录本，或者其可以是对一级转录本进行转录后加工获得的RNA，其被称为成熟RNA。
本文中使用的短语“对基因表达的抑制”或“抑制昆虫细胞中目标基因的表达”指，目标基因的蛋白和/或mRNA产物水平不存在(或可观察到的降低)。特异性指：抑制目标基因而对细胞其它基因无作用并且对产生dsRNA分子的细胞内任何基因没有影响的能力。对有害昆虫中目标基因的基因表达的抑制可能导致有害昆虫中的新表型性状。
在不限制本发明范围的情况下，本发明在一个方面提供了一种方法，用于：使用经过稳定的dsRNA策略来控制目标有害生物的侵袭。所述方法涉及：制造经过稳定的dsRNA分子，作为一种昆虫控制剂，诱导有害昆虫中的基因沉默。本发明的昆虫控制剂能直接或间接地诱导昆虫中目标基因的转录后基因沉默事件。对目标基因表达的负调能预防或至少延迟昆虫的生长、发育、繁殖和向宿主的传播。本文中使用的短语“制造经过稳定的dsRNA分子”指：使用本领域中易于获得的重组DNA技术(例如，见Sambrook，et al，In：Molecular Cloning，ALaboratory Manual，2nd Edition，Cold Spring Harbor Press，ColdSpring Harbor，New York，1989)，来构建转录经过稳定的dsRNA的DNA核苷酸序列的方法。本发明的详细构建方法公开于本说明书下文中。本文中使用的术语“沉默”指，对目标核苷酸序列表达的有效“负调”，以及因此该序列在昆虫细胞中产生作用的能力消失。
本发明的一部分提供了一种转运系统，用于将昆虫控制剂转运到昆虫中，这是通过将它们暴露给含有本发明昆虫控制剂的膳食来实现的。根据实施方式之一，经过稳定的dsRNA或siRNA分子可被包括进昆虫膳食，或者可被放置到昆虫消耗的膳食的顶部。
本发明的一部分还提供了用于将昆虫控制剂转运到昆虫中，这是通过：将它们暴露给含有本发明昆虫控制剂的微生物或宿主，例如，植物，通过摄取微生物或宿主细胞或细胞内容物来实现的。根据另一种实施方式中，本发明涉及：制造转基因植物细胞或植物，其中含有能转录本发明的经过稳定的dsRNA分子的重组DNA构建体。本文中使用的短语“制造转基因植物细胞或植物”指下述方法，包括使用本领域中易于获得的重组DNA技术(例如，见Sambrook，et al.)，构建能转录本发明的经过稳定的dsRNA分子的植物转化载体，转化植物细胞或植物，以及产生含有经过转录的、经过稳定的dsRNA分子的转基因植物细胞或转基因植物。特别地，本发明的方法可以包含植物细胞中的重组构建体，其能产生与昆虫基因组内核苷酸序列编码的RNA序列高度同源的dsRNA转录本。昆虫基因组内核苷酸序列编码对于昆虫的存活和传播来说很重要的基因的情况下，对其的负调节将导致昆虫生存以及感染宿主细胞的能力降低。因此，此类负调节导致了对昆虫的保持存活性和传播性的有害影响，因为其防止或降低了昆虫依靠来自宿主细胞的营养物进食、生活的能力。利用上述的昆虫存活性和传播性的降低，在植物细胞中促进了对昆虫感染的抗性和/或提高的耐受性。昆虫中的基因可在成熟(成年)、未成熟(幼虫)或卵的阶段被靶向。
在又一种实施方式中，微生物的非病原性的削弱菌株可被用作为昆虫控制剂的载体，在这种情况下，携带此类试剂的微生物也被称为昆虫控制剂。可对微生物加以工程改造，使其表达目标基因的核苷酸序列，以产生下述RNA分子，所述RNA分子包含与昆虫细胞内典型发现的RNA序列互补或同源的RNA序列。将昆虫暴露给所述微生物，使得微生物被摄取，以及由RNA分子或片段或其衍生物直接或间接介导的对目标基因表达的负调。
或者，本发明提供了：将昆虫暴露给本发明的昆虫控制剂，所述控制剂被包括于喷雾混合器中，应用到宿主，例如，宿主植物的表面。在一种示例性的实施方式中，昆虫对昆虫控制剂的摄取，将昆虫控制剂运送到昆虫消化道，随后运送到昆虫体内的细胞中。在另一种实施方式中，昆虫控制剂通过其它方式(例如注射或其它物理方法)对昆虫的感染也能允许昆虫控制剂的运送。在又一种实施方式中，RNA分子自身被封装进合成的基质，例如聚合物，并被应用到宿主，例如植物的表面。昆虫对宿主细胞的摄取允许昆虫控制剂被运送到昆虫，导致对宿主中目标基因的负调。
还可想到，本发明的组合物可被包括进植物物种的种子，其可以作为被包括进植物细胞基因组的重组基因的表达产物，或者被包括进在种植前应用到种子上的涂层或种子处理中。含有重组基因的植物细胞在本文中被看作转基因事件。
我们相信，当与提供下述保护的转基因事件组合时，杀虫种子处理可以提供显著的优点，所述保护用于抵挡无脊椎有害生物的侵袭，所述事件在针对目标有害生物的优选有效性范围内。此外，我们相信，本领域技术人员公知，存在有下述情况，其中，具有在优选的有效性范围内的此类转基因事件是有利的。
本发明还包括具有超过一种转基因事件的种子和植物。此类组合被称为“堆叠的”转基因事件。所述堆叠的转基因事件可以是针对同样的目标有害生物的事件，或者它们可以针对不同的目标有害生物。在一种优选的实施方式中，具有表达Cry 3蛋白或其杀昆虫变异体的能力的种子还具有表达至少一种其它杀昆虫剂的能力，其包括但不限于与Cry 3蛋白不同的蛋白和/或下述RNA分子，所述RNA分子的序列来自在目标有害生物中表达的RNA的序列，当其在种子或从种子长出的植物细胞中表达时形成双链RNA结构，其中，目标有害生物对植物的一种或多种细胞的摄取导致了对目标有害生物细胞中RNA表达的抑制。
在另一种优选的方法中，具有表达下述dsRNA能力的种子还具有提供除草剂耐受性的转基因事件，所述dsRNA的序列来自目标有害生物。优选地，提供除草剂耐受性的转基因事件是提供对草甘膦，N-(膦羧甲基)甘氨酸(包括此类除草剂的异丙胺盐形式)的抗性的事件。
在本发明的方法中，用杀虫剂去处理包含转基因事件的种子。我们相信，转基因种子(展示出针对目标有害生物的生物活性，这是杀昆虫量的、转基因种子或从该种子生长来的植物细胞中杀昆虫dsRNA的生产的结果)与用某些化学或蛋白杀虫剂对种子进行的处理结合，能向具有此类处理的种子提供意想不到的协同优点，包括：针对目标有害生物对得到的转基因植物的损害提供保护的、意想不到的出众效果。特别地，我们相信，用大约100gm至大约400gm的某些杀虫剂(对每100kg种子而言)，对能表达某些会形成dsRNA分子(其序列是从玉米根虫中表达的一种或多种序列获得的)的构建体的转基因种子进行处理，提供了抵挡玉米根虫的意想不到的出众保护。此外，我们相信，此类组合还有用于针对黑地老虎的损害来保护紧急状态的玉米植物。本发明的种子还被相信具有降低杀虫剂使用成本的性质，因为较之没有使用发明的组合物和方法的情况，为获得需要量的保护，可以使用更少的杀虫剂。此外，因为使用了更少的杀虫剂，并且因为其是在种植之前应用的，没有单独的田野应用，我们相信，本发明的方法因此对于操作者和环境来说都更为安全，并且潜在地较之传统方法更为便宜。
当一些作用被提到为“协同”的时候，这表示包括：转基因事件和杀虫剂的组合对于杀虫活性(或效率)的组合协同作用。但是，这并不表示将此类协同作用限制为杀虫活性，它们还应当包括下述意想不到的优点，例如，增加的活性范围、有利的活性曲线(相关于损害减少的类型和数量)、杀虫剂和应用成本的降低、杀虫剂环境分布减少、杀虫剂向生产操作以及种植玉米种子的人员的暴露减少，以及本领域技术人员已知的其它优点。
可用于本发明与本发明的方法和组合物组合的杀虫剂和杀昆虫剂(包括作为种子处理和涂布)以及使用此类组合物的方法可在例如美国专利号6,551,962中找到，其全文通过引用并入本文。
已经发现，本发明有用于保护种子和植物抵挡宽广范围的农业有害生物，包括昆虫、螨、真菌、酵母、霉菌、细菌、线虫、杂草和塑料以及腐生植物。
优选地，本文所述的种子处理和涂布与本发明的转基因种子一起使用，特别地，除了向转基因种子应用从序列表所示的SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：143和SEQ ID NO：169至SEQ ID NO：174所示的序列或其序列获得的dsRNA分子之外，还向转基因种子应用杀虫剂。虽然我们相信，种子处理可向处于任何生理状态的转基因种子应用，但是优选地，种子处于足够持久稳定的(durable)状态，不会在处理工艺期间招致损害。典型地，种子是已从田间收获到的、从转基因植物上除下的、以及与任何其它非种子植物材料分离的。优选地，种子还将是在生物学上稳定到下述程度的，使得处理不会导致对种子的生物学损害。在一种实施方式中，例如，处理可应用到下述玉米种子上，所述种子已被收获、清洁并被干燥至水份含量按重量计小于大约15％。在另一种实施方式中，种子可以是下述种子：其已被干燥，再涂(prime)上了水和/或另外的材料，然后再用杀虫剂处理前或处理期间再进行干燥。在刚刚描述的限制中，我们相信，可在收获种子和播种种子之间的任何事件，将处理应用到种子上。本文所用的术语“未被播种的种子”用于包括：处于种子收获和在地面播种种子(为了植物发芽和生长的目的)之间的任何时期。
当提到未被播种的种子被杀虫剂“处理”的时候，此类处理不用于包括下述操作：其中，杀虫剂被应用到土壤，而非应用到种子。例如，在与种子被播种的同时，在土地带(band)、“T”带或犁沟中应用此类处理，不被认为是本发明所包括的。
杀虫剂或杀虫剂的组合可以“纯粹地(neat)”应用，即，没有任何稀释或存在其它组分。但是，典型地，杀虫剂以杀虫剂配方的形式应用到种子上。该配方可以含有一种或多种想要的其它组分，其包括但不限于，液体稀释剂，用作为杀虫剂基质的粘合剂，用于在胁迫条件下保护种子的填料以及用于提高涂层弹性、黏着力和/或延展性的增塑剂。此外，对于含有极少或不含填料的的油性杀虫剂配方而言，可能需要向配方中加入干燥剂，例如，碳酸钙、高岭土或斑脱土、珍珠岩、硅藻土或任何其它吸附材料。这些组分在种子处理中的用途是本领域已知的。例如，见，美国专利号5,876,739。本领域技术人员可以容易地选择想要的组分，用于杀虫剂配方，这取决于将被处理的种子类型和选出的特定杀虫剂。此外，可以使用容易获得的、已知杀虫剂的商业配方，如下文实施例中所示。
本发明的杀虫剂可以作为种子涂层的组分应用到种子上。通过加入本发明杀虫剂组合的实施方式之一进行改良之后，可以使用本领域已知的种子涂布方法和组合物。为其应用的这类涂布方法和设备被公开于，例如，美国专利号5,918,413、5,891,246、5,554,445、5,389,399，5,107,787、5,080,925、4,759,945和4,465,017中。种子涂层组合物被公开于，例如美国专利号5,939,356、5,882,713、5,876,739、5,849,320、5,834,447、5,791,084、5,661,103、5,622,003、5,580,544、5,328,942、5,300,127、4,735,015、4,634,587、4,383,391、4,372,080、4,339,456、4,272,417和4,245,432等中。
在涂层中使用的杀虫剂是本文所述的那些杀虫剂。在对种子的处理中使用的杀虫剂的量将取决于种子类型和活性成分的类型而变化，但是所述处理将包含，将种子与具有杀虫作用的量的杀虫剂组合相接触。当昆虫是目标有害生物时，所述的量将是具有杀昆虫作用的杀昆虫剂的量。本文中使用的具有杀昆虫作用的量表示，杀昆虫剂的量将能杀死处于生长的幼虫或蛹阶段的有害生物，或者将持续减少或延迟有害昆虫产生的损害的量。
通常，处理中向种子应用的杀虫剂的量在下述范围内变动：对每100kg种子重量而言，大约100gm至大约2000gm的杀虫剂活性成分。优选地，杀虫剂的量在下述范围内：对每100kg种子而言大约50gm至大约1000gm的活性成分；更优选地，在下述范围内：对每100kg种子而言大约100gm至大约600gm的活性成分；进一步更优选地，在下述范围内：对每100kg种子而言大约200gm至大约500gm的活性成分。或者，已经发现，对于每100kg种子而言超过大约60gm的杀虫剂活性成分的杀虫剂的量是优选的，更优选地，超过大约80gm(每100kg种子)。
用于处理中的杀虫剂不必须要抑制种子发芽，但是应当能在目标昆虫生命周期中能导致对种子或植物伤害的时期，有效于保护种子和/或植物。通常，播种后，涂层将有效大约0至120天。
本发明的杀虫剂可以以涂层的形式应用到种子上。涂层的使用在伴随高杀虫剂负荷(可被需要用来典型地处理耐火有害生物，例如，玉米根虫)的时候特别有效，同时预防由于增加的杀虫剂负荷造成的不可接受的对植物的毒性。
用本文公开的杀虫剂组合物形成的涂层优选能通过扩散或经过基质移动，将杀虫剂慢速释放到周围媒介中。
除涂层之外，还可用下述成分中的一种或多种来处理种子：其它杀虫剂，包括杀真菌剂和除草剂；除草剂安全剂；肥料和/或生物控制剂。这些成分可作为单独的层加入，或者可以在杀虫剂涂层中加入。
可以使用传统的涂布技术和机械，将杀虫剂配方应用到种子上，例如，流床技术，辊磨方法，滚筒静电(rotostatic)种子处理机和鼓式涂布机。其它方法，例如带嘴的床也可以使用。在被涂布之前种子可被预分级(presized)。涂布之后，典型地，可对种子进行干燥，将其转移至分级机中进行分级。此类方法是本领域已知的。
本文中使用的“昆虫控制剂”或“基因遏制剂”指特定的RNA分子，其由通过第三段RNA片断相连的第一段RNA片断和第二段RNA片断构成。第一段和第二段RNA片断处于RNA分子的长度之内，它们互相之间呈高度反向重复，通过第三段RNA片断连接到一起。第一段和第二段RNA片断之间的互补性导致两段片断在体内或体外杂交形成双链分子的能力，即，形成茎，其中第一段和第二段片断中每段的一端通过第三段片断相连，形成环，使得整个结构形成茎环结构，或者甚至更为紧密地杂交结构可以形成茎环打结(knotted)结构。第二段和第二段片断无差别地、并非分别地对应于目标RNA的正义和反义序列，所述RNA是目标有害昆虫的目标基因转录来的，所述基因能被dsRNA分子的摄取所遏制。昆虫控制剂还可以是高度纯化(或分离)的核酸分子，更特别地，来自基因组DNA(gDNA)或cDNA文库的核酸分子或其核酸片段分子。或者，所述片段可以包含更小的寡核苷酸，其具有大约15至大约250个核苷酸残基，更优选地，大约15至大约30个核苷酸残基。“昆虫控制剂”还可以指DNA构建体，所述构建体包含经过分离和纯化的核酸分子或其核酸片段分子，所述分子来自gDNA或cDNA文库。“昆虫控制剂”还可以指包含这种DNA构建体的微生物，所述DNA构建体包含来自gDNA或cDNA文库的、经过分离和纯化的核酸分子或其核酸片段分子。本文中使用的短语“制造昆虫控制剂”指下述方法，其中使用本领域中易于获得的重组DNA技术(例如，见Sambrook，et al.)，来制备能转录经过稳定的dsRNA或siRNA分子的重组DNA构建体，以构建能转录经过稳定的dsRNA或siRNA分子的载体，和/或转化或制造含有转录得到的、经过稳定的dsRNA或siRNA分子的细胞或微生物。本发明的方法提供了对dsRNA转录本的生产，其核苷酸序列与目标RNA序列高度同源，所述目标RNA序列是目标有害昆虫基因组内的目标核苷酸序列所编码的。
本文中使用的术语“基因组”在用于昆虫或宿主细胞的时候，不仅包含核内发现的染色体DNA，其还包含在细胞的亚细胞组分中发现的细胞器DNA。因此，本发明的DNA被引入到植物细胞中的过程可以通过染色体整合或者通过细胞器定位来进行。术语“基因组”应用到细菌的时候包括细菌宿主细胞中的染色体和质粒。因此，本发明的DNA被引入到细菌宿主细胞中的过程可以通过染色体整合或者通过质粒器定位来进行。
对目标基因表达的抑制可被定量，这是通过测量内源目标RNA或目标RNA翻译所产生的蛋白来进行的，抑制的后果可以通过对细胞或生物外在性质的检查来验证。用于对RNA和蛋白定量的方法是本领域技术人员公知的。赋予对氨苄青霉素、博来霉素、氯霉素、庆大霉素、潮霉素、卡纳霉素、洁霉素、甲氨蝶呤、草丁膦、嘌呤霉素、奇霉素、利福平和四环素等的抗性的多种选择标记是可获得的。
在某些优选的实施方式中，基因表达被抑制了至少10％，优选地，至少33％，更优选地，至少50％，进一步更优选地，至少80％。在本发明的特别优选的实施方式中，昆虫细胞内的基因表达被抑制了至少80％，更优选地，至少90％，更优选地，至少95％，或者至少99％，使得显著的抑制发生。显著的抑制被用来指足够的抑制，其导致可被探测到的表型(例如，幼虫生长停止、麻痹或死亡等)或被抑制的目标基因所对应的RNA和/或蛋白质的可被探测到的减少。虽然在本发明的某些实施方式中，抑制在昆虫的实质上所有的细胞中发生，但是在其它优选的实施方式中，抑制仅在表达该基因的细胞亚组中发生。例如，如果将被抑制的基因在昆虫营养消化道的细胞中发挥重要作用，对这些细胞内基因的抑制就足以对昆虫施加有害的作用。
本发明的优点可以包括但不限于下述：易于将dsRNA引入昆虫细胞，可使用低浓度的dsRNA或siRNA，dsRNA或siRNA的稳定性以及抑制的有效性。使用低浓度的、经过稳定的dsRNA的能力避免了反义干扰的很多缺点。本发明并不被限制为体外使用，或被限制为特殊的序列组合物，特定的目标基因组，目标基因核苷酸序列的特定部分，或特定的转基因体或特定的运送方法，这是与本领域已知的可获得的方法中的一些相悖的，例如，反义和共遏制。此外，遗传操纵在并非经典遗传模型的生物中也是可行的。
在对本发明的实践中，下述要点是重要的：从重组构建体转录来的核苷酸序列的存在对其中它们能根据本发明表达的植物细胞无害，并且对动物食物链特别是人类也无害。因为植物的产品可能对于人类摄取来说是可获得的，对目标核苷酸序列表达的负调只发生于昆虫中。
因此，为了选择性地在希望被控制的昆虫物种中获得对目标基因的抑制，优选地，目标基因与植物或脊椎动物中相应基因的序列相同性应当为低度的。优选地，序列相同性程度小于大约80％。更优选地，序列相同性程度小于大约70％。最优选地，序列相同性程度小于大约60％。
根据本发明的一种实施方式，提供了一种核苷酸序列，其体外表达能导致下述经过稳定的RNA序列的转录，所述RNA序列与昆虫中目标基因的RNA分子高度同源，所述RNA分子包含昆虫基因组中核苷酸序列所编码的RNA序列。因此，在昆虫摄取经过稳定的RNA序列(包含于膳食中或喷洒于植物表面上)后，实现对目标昆虫细胞中目标基因对应的核苷酸序列的负调。昆虫中被负调的核苷酸序列导致对昆虫的保持、存活、增殖、繁殖及传播有害的作用。因此，本发明的核苷酸序列可用于调节或控制某范围内的昆虫的侵袭。
根据本发明的另一种实施方式，提供了一种核苷酸序列，其在微生物细胞中的表达导致下述RNA序列的转录，所述RNA序列与昆虫中目标基因的RNA分子高度同源，所述RNA分子包含昆虫基因组中核苷酸序列编码的RNA序列。因此，昆虫摄取微生物细胞中含有的经过稳定的RNA序列之后，将导致昆虫细胞中目标基因的核苷酸序列被负调。昆虫中被负调的核苷酸序列导致对昆虫的保持、存活、增殖、繁殖及传播有害的作用。因此，本发明的核苷酸序列可用于调节或控制某范围内的昆虫的侵袭。
根据本发明的另一种实施方式，提供了一种核苷酸序列，其在植物细胞中的表达导致下述RNA序列的转录，所述RNA序列与昆虫中目标基因的RNA分子高度同源，所述RNA分子包含昆虫基因组中核苷酸序列编码的RNA序列。因此，昆虫摄取植物细胞中含有的经过稳定的RNA序列之后，将导致昆虫细胞中目标基因的核苷酸序列被负调。昆虫中被负调的核苷酸序列导致对昆虫的保持、存活、增殖、繁殖及传播有害的作用。因此，本发明的核苷酸序列可用于调节或控制某范围内的昆虫的侵袭。
本文中使用的术语“高度同源”或者“高度同源性”，在提到和酸序列时，表示在严谨条件下与序列表中所示的SEQ ID NO：1至SEQID NO：143中的任何序列或SEQ ID NO：169至SEQ ID NO：174中的任何序列所示的编码序列或其互补序列能杂交的核苷酸序列。在严谨条件下与序列表中所示的SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：143中的任何序列或SEQ ID NO：169至SEQ ID NO：174中的任何序列或其互补序列能杂交的序列，是允许两条序列间发生反平行比对的序列，然后两条序列能在严谨条件下以相反链上的对应碱基形成氢键，以形成二体分子，其在严谨条件下是足够稳定的，使用本领域公知方法能探测到。优选地，此类高度同源的序列与序列表中所示的SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：143中的任何序列或SEQ ID NO：169至SEQ ID NO：174中的任何序列所示的对照核苷酸序列或其互补序列具有大约65％至大约70％的序列相同性，或者更优选地，大约80％至大约85％的序列相同性，或者最优选地，大约90％至大约95％的序列相同性，至大约99％的序列相同性。
本文中使用的术语“序列相同性”、“序列相似形”或“同源性”被用于描述两条或多条核苷酸序列之间的关系。两条序列之间“序列相同性”的百分比是通过下述方法来测定的：在比较窗上比较两条被最优化对齐的序列，其中，较之对照序列(不包含添加或缺失)，比较窗中序列的一部分可以包含添加或缺失(即，缺口)，用于最优化对齐两条序列。通过下述方法来计算百分比：测定两条序列中存在相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数量，以产生匹配位置的数量，用匹配位置的数量去除比较窗中的位置总数，将结果乘以100以产生序列相同性的百分比。与对照序列比较时每个位置都相同的序列被认为与对照序列相同，反之亦然。如果第一条核苷酸序列展示出与第二条或对照序列的完全互补性，以5’至3’方向来观察时，第一条核苷酸序列被认为是以3’至5’方向来观察的第二条或对照核苷酸序列的互补序列或与其互补。在本文中，以5’至3’方向阅读的一条序列中的每个核苷酸与以3’至5’方向阅读的其它序列的每个核苷酸都互补的时候，我们说核酸序列分子展示出“完全互补性”。与对照核苷酸序列互补的核苷酸序列将展示出与对照核苷酸序列的反向互补序列相同的序列。这些术语和描述在本领域中有很好的详细说明，是本领域普通技术人员易于理解的。
本文中使用的“比较窗”指，至少6个连续位置的概念片断，通常大约50至大约100，更常见地，大约100至大约150个连续位置，其中，两条序列被最优化对齐之后，将一条序列与具有同样数量连续位置的对照序列相比。较之对照序列(不包含添加或缺失)，比较窗可以包含大约20％或更少的添加或缺失(即，缺口)，用于最优化对齐两条序列。本领域技术人员将参考Wisconsin Genetics SoftwarePackage Release 7.0，Genetics Computer Group，575 Science DriveMadison，Wis.，USA)中用于序列比对的详细方法或参考Ausubel et al.(1998)中关于序列分析的详细讨论。
本发明的目标基因从昆虫细胞获得，或者其是外源基因，例如，来自病毒、真菌、昆虫或线虫等的外源遗传序列。“获得”指序列是来自昆虫细胞基因组的目标基因的天然存在的核苷酸序列的全部或部分；如果基因是结构基因的话，特别地，被加上帽子的、剪接的一级聚腺苷化的mRNA的天然存在的核苷酸序列的一部分，所述mRNA是细胞中发现的天然存在的DNA序列表达的；或者并非结构基因的RNA的全部或部分序列，其包括但不限于tRNA、催化RNA、核糖体RNA、微小RNA等。如果获得的序列是基于天然RNA的核苷酸序列制造的，展示出与天然序列的大约80％至大约100％的序列相同性，并且能在严谨杂交条件下与天然序列杂交，那么序列就是从这些天然存在的RNA序列获得的。在一种实施方式中，目标基因包含序列表中所示的SEQ IDNO：1至SEQ ID NO：143中的任何序列或SEQ ID NO：169至SEQ IDNO：174中的任何序列所示的核苷酸序列或其互补序列。取决于特定的目标基因和dsRNA分子的运送剂量，该方法可以使得目标基因的功能全部或部分损失，或者介于两者之间的任何想要的遏制水平。
本发明还提供了人工DNA序列，其能在细胞或微生物中表达，并且，其能抑制昆虫细胞、组织或器官中目标基因的表达，其中，人工DNA序列至少包含编码一种或多种不同核苷酸序列的dsDNA分子，其中，不同核苷酸序列中的每一种都包含间隔序列所连接的正义核苷酸序列和反义核苷酸序列，所述间隔序列编码本发明的dsRNA分子。间隔序列构成了正义核苷酸序列和反义核苷酸序列的部分，其将形成于正义和反义序列之间的dsRNA分子内。正义核苷酸序列和反义核苷酸序列与目标基因的核苷酸序列或其衍生物或其互补序列高度相同。dsDNA分子被可操作地放置于启动子序列的控制下，所述启动子序列在宿主的细胞、组织或器官中发挥作用，表达dsDNA，产生dsRNA分子。在一种实施方式中，人工DNA序列可从序列表中所示的SEQ IDNO：1至SEQ ID NO：143或SEQ ID NO：169至SEQ ID NO：174中所示的核苷酸序列获得。
本发明还提供了人工DNA序列，用于在植物细胞中表达，并且，随着DNA表达为RNA以及被目标有害生物摄取，能获得对有害昆虫细胞、组织或器官中目标基因的表达的遏制。dsRNA至少包含一种或多种结构基因序列，其中，每种结构基因序列都包含间隔序列所连接的正义核苷酸序列和反义核苷酸序列，所述间隔序在互补和反义序列中形成环。正义核苷酸序列和反义核苷酸序列与目标基因的核苷酸序列或其衍生物或其互补序列高度相同。一种或多种结构基因序列被可操作地放置于一种或多种启动子序列的控制下，其中至少一种在原核或真核生物，特别是昆虫的的细胞、组织或器官中是可操作的。在一种实施方式中，人工DNA序列包含序列表中所示的大约SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：143或大约SEQ ID NO：169至SEQ ID NO：174的序列。
本文中使用的术语，用于转录本发明的dsRNA或siRNA或其片段的“非天然存在的基因”、“非天然存在的编码序列”、“人工序列”或“合成编码序列”指，以涉及任何种类的遗传分离和操纵的手段制备的那些，所述手段能制备出转录本发明的dsRNA或siRNA或其片段的编码序列。这包括将编码序列从其天然存在的状态分离，对编码序列进行操纵，这是通过(1)核苷酸插入、缺失或取代，(2)片断插入、缺失或取代，(3)化学合成，例如脱氧核苷亚磷酰胺化学法等、位点特异性突变、对编码序列的截短或者任何其它操纵或分离方法。
根据本发明的这方面，用于WCR控制的非天然存在的基因序列或其片段可被克隆到在转基因植物细胞中可操作的两种组织特异性启动子之间，例如两种根特异性启动子，所述基因序列或其片段可在此处表达，在转基因植物细胞中产生mRNA，从而形成dsRNA分子。植物组织中含有的dsRNA分子被昆虫摄取，从而获得对目标基因表达的期待抑制。
本发明还提供了一种方法，用于获得包含下述核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列能生产本发明的dsRNA或siRNA。在一种优选的实施方式中，本发明的用于获得核酸的方法包括：(a)用杂交探针去探测cDNA或gDNA文库，所述探针包含来自目标昆虫的核苷酸序列或其同源物的全部或部分；(b)鉴定出能与杂交探针杂交的DNA克隆；(c)分离出步骤(b)中鉴定的DNA克隆；以及(d)对包含在步骤(c)中分离得克隆的cDNA或gDNA片段加以测序，其中，被测序的核酸分子能转录RNA核苷酸序列或其同源物的全部或绝大部分。
在另一种优选的实施方式中，本发明的用于获得核酸片段(其中包含用于生产本发明dsRNA或siRNA的绝大部分的核苷酸序列)的方法包括如下步骤：(a)合成第一条和第二条寡核苷酸引物，它们与来自目标昆虫的核苷酸序列之一的部分对应；以及(b)使用步骤(a)的第一条和第二条寡核苷酸引物，扩增克隆载体中存在的cDNA或gDNA插入，其中，扩增得到的核酸分子能转录本发明dsRNA或siRNA的绝大部分的绝大部分。
在对本发明的实践中，目标基因可从玉米根虫(CRW)，例如WCR或SCR获得，或者从能导致作物植物被损害以及随后的减产的任何昆虫物种获得。本发明认为，若干种标准可被用于选择优选的目标基因。所述基因是这样的基因：其蛋白产物具有快速的流通速率，使得dsRNA抑制可导致蛋白水平的快速降低。在某些实施方式中，选用表达水平少量下跌即可导致对昆虫的有害作用的基因是有利的。如果想靶向广谱昆虫物种，那么要选择在这些物种间高度保守的基因。相反，为了带来特异性，在本发明的某些实施方式中，选择含有在各种昆虫物种间或在昆虫与其它生物间保守程度低的区域的基因。在某些实施方式中，选择没有其它生物的已知同源物的基因是人们想要的。
本文中使用的术语“从......获得”指，可从特定的特别来源或物种获得的特别的核苷酸序列，虽然无须直接来自该特别来源或物种。
在一种实施方式中，选用在昆虫消化道中表达的基因。靶向在消化道中表达的基因避免了在昆虫内部散布dsRNA的需要。用于本发明的目标基因可以包括，例如，与编码质膜质子V-ATPase蛋白组分的已知消化道表达基因的核苷酸序列高度同源的那些(Dow et al.，1997，J.Exp.Biol.，200：237-245；Dow，Bioenerg.Biomemb.，1999，31：75-83)。该蛋白复合体是上皮细胞例子转运的唯一能量提供者，用于中肠内腔的碱化。V-ATPase还在马氏(Malpighian)管中表达，所述马氏管是昆虫后肠的长出体(outgrowth)，其以与哺乳动物肾器官类似的方式，在流体平衡以及对外源化合物的解毒中发挥作用。
在另一种实施方式中，选用昆虫生长、发育和繁殖中涉及的很重要的基因。示例性的基因包括但不限于，CHD3基因和β-微管蛋白基因。Drosophila melanogaster中的CHD3基因编码具有ATP依赖型DNA螺旋酶活性的蛋白，其涉及核中的染色质装配/解装配。类似的序列还发现于多种生物中，例如Arabidopsis thaliana、Caenorhabditis elegans和Saccharomyces cerevisiae。beta-微管蛋白基因家族编码与微观相关的蛋白，所述蛋白是细胞骨架的构成部分。相关序列也发现于多种生物中，例如Caenorhabditis elegans和Manduca Sexta。
用于本发明的其它目标基因可以包括，例如，在存活、生长、发育、繁殖和传播中扮演重要角色的那些。这些目标基因可以是下述之一：住家基因、转录因子和昆虫特异性基因或Drosophila中致死性敲除突变。在本发明中使用的目标基因还可以是来自其它生物的那些，例如，来自线虫(例如C.elegans)的。此外，用于本发明的核苷酸序列还可来自下述的植物、病毒、细菌或真菌基因，所述基因的功能已被建立于文献中，其核苷酸序列与昆虫基因组中目标基因分享高度的相似性。根据本发明的一种方法，为了WCR控制，目标序列可以基本从目标WCR昆虫获得。编码与已知蛋白同源的D.v.virgifera蛋白或其片段的、来自WCR cDNA文库的一些示例性目标序列可从序列表中找到。
来自D.virgifera的编码已知蛋白同源物的核酸分子是已知的(Andersen et al.，US Patent Application Serial No.10/205,189)。
虽然Andersen et al.所述的序列主要参考WCR，在本发明的实践中，优选使用具有下述序列的DNA片断，所述序列与需要被控制的目标有害生物中基因或编码序列对应的序列具有至少大约80％相同性，或者至少大约90％相同性，或者至少95％相同性，或者至少98％相同性，或者至少大约100％相同性。与目标序列的相同性小于大约80％的序列较为没用。抑制特异于有害生物的一种或多种基因，所述基因的序列对应dsRNA。无关基因的表达不受影响。这种特异性允许对有害生物物种加以选择性靶向，从而对暴露给本发明组合物的其它生物没有影响。
用于本发明的DNA片断长度为至少大约19至大约23个核苷酸，或者大约23至大约100个核苷酸，但是要小于大约2000个核苷酸。
本发明不限于本文所述的特定基因，其还包括下述任何基因，对所述基因的抑制能向有害昆虫施加有害作用。
对于是通过本发明加以控制的潜在目标的昆虫中的很多而言，关于大多数基因的序列和从对特定基因的突变得到的表型的信息可能是有限的。因此，本发明人提出，从有害昆虫选出合适的基因用于本发明的过程，可以通过使用可从对模式生物(例如Drosophila)，一些其它昆虫物种，或者甚至线虫物种、真菌物种、植物物种(这些物种中的相应基因已被分析)中相应基因的研究获得的信息来进行。在一些情况下，将可能通过使用来自，例如Drosophila、另外的昆虫、线虫、真菌或植物(其中所述基因已从中克隆)的序列或基因名，筛选数据库，例如GenBank来获得目标昆虫相应基因的序列。一旦获得了序列，可以使用PCR来扩增合适地选出的昆虫中的基因片断，用于本发明。
为了获得来自昆虫物种中相应基因的DNA片断，基于在WCR或基因已从中克隆的其它昆虫中发现的序列来设计PCR引物。引物被设计为：能扩增足够长度的DNA片断，用于本发明。DNA(基因组DNA或cDNA)制备自昆虫物种，用PCR引物来扩增DNA片断。扩增条件被选用为：即使在引物不能精确匹配目标序列的情况下，扩增也能得以进行。或者，可以使用WCR基因或其它已知的昆虫基因作为探针，从制备自有害昆虫物种的gDNA或cDNA文库，克隆出基因(或其一部分)。用于实施PCR和从文库中克隆的技术是已知的。基于以前从WCR或其它昆虫物种中克隆出的基因序列，从目标有害昆虫中奋力DNA片断的方法的进一步细节，在实施例中有所提供。本领域普通技术人员将认识到，多种不同的技术可用于从有害昆虫物种中分离出与以前从其它物种种分离的基因相对应的基因片断。
基于进食方式分类，可能导致植物被损害的昆虫通常属于三大类，这三类分别是属于Coleoptem、Lepidoptera、Diptera、Orthoptem、Heteroptera、Ctenophalides、Arachnidiae和Hymenoptera目的咀嚼式、吸吮式和钻孔式昆虫。咀嚼式昆虫吃植物的组织，例如根、叶、花、芽和嫩枝，导致大的损害。来自这一大昆虫种类的例子包括甲虫及其幼虫。WCR和SCR属于咀嚼式昆虫。它们的幼虫在植物的根上进食，特别地，玉米植物的根上，其成虫主要进食叶片。来自WCR或SCR或来自上述目中任何一种物种的基因可被作为目标用于开展本发明。
已经发现，本发明可用于保护种子和植物抵挡广泛的农业有害生物，包括昆虫、螨、真菌、酵母、霉菌、细菌、线虫、杂草和寄生以及腐生植物等。
当昆虫是本发明的目标有害生物时，此类有害生物包括但不限于，来自Lepidoptera目的，例如，
Acleris spp.、Adoxophyes spp.、Aegeria spp.、Agrotis spp.、Alabamaargillaceae、Amylois spp.、Anticarsia gemmatalis、Archips spp、Argyrotaenia spp.、Autographa spp.、Busseola fiisca、Cadra cautella、Carposina nipponensis、Chilo spp.、Choristoneura spp.、Clysiaambiguella、Cnaphalocrocis spp.、Cnephasia spp.、Cochylis spp.、Coleophora spp.、Crocidolomia binotalis、Cryptophlebia leucotreta、Cydiaspp.、Diatraea spp.、Diparopsis castanea、Earias spp.、Ephestia spp.、Eucosma spp.、Eupoecilia ambiguella、Euproctis spp.、Euxoa spp.、Grapholita spp.、Hedya nubiferana、Heliothis spp.、Hellula undalis、Hyplumtria cunea、Keiferia lycopersicella、Leucoptera scitella、Lithocollethis spp.、Lobesia botrana、Lymantria spp.、Lyonetia spp.、Malacosoma spp.、Mamestra brassicae、Manduca sexta、Operophteraspp.、Ostrinia Nubilalis、Pammene spp.、Pandemis spp.、Panolisflammea、Pectinophora gossypiella、Phthorimaea operculella、Pierisrapae、Pieris spp.、Plutella xylostella、Prays spp.、Scirpophaga spp.、Sesamia spp.、Sparganothis spp.、Spodoptera spp.、Synanthedon spp.、Thaumetopoea spp.、Tortrix spp.、Trichoplusia ni和Yponomeuta spp.；
来自Coleoptera目的，例如，
Agriotes spp.、Anthonomus spp.、Atomaria linearis、Chaetocnematibialis、Cosmopolites spp.、Curculio spp.、Dermestes spp.、Diabroticaspp.、Epilachna spp.、Eremnus spp.、Leptinotarsa decemlineata、Lissorhoptrus spp.、Melolontha spp.、Orycaephilus spp.、Otiorhynchusspp.、Phlyctinus spp.、Popillia spp.、Psylliodes spp.、Rhizopertha spp.、Scarabeidae、Sitophilus spp.、Sitotroga spp.、Tenebrio spp.、Tribolium spp.和Trogoderma spp.；
来自Orthoptera目的，例如，
Blatta spp.、Blattella spp.、Gryllotalpa spp.、Leucophaea maderae、Locusta spp.、Periplaneta ssp.和Schistocerca spp.；
来自Isoptera目的，例如，
Reticulitemes ssp；
来自Psocoptera目的，例如，
Liposcelis spp.；
来自Anoplura目的，例如，
Haematopinus spp.、Linognathus spp.、Pediculus spp.、Pemphigus spp.和Phylloxera spp.；
来自Mallophaga目的，例如，
Damalinea spp.和Trichodectes spp.；
来自Thysanoptera目的，例如，
Franklinella spp.、Hercinothrips spp.、Taeniothrips spp.、Thripspalmi、Thrips tabaci和Scirtothrips aurantii；
来自Heteroptera目的，例如，
Cimex spp.、Distantiella theobroma、Dysdercus spp.、Euchistus spp.、Eurygaster spp.、Leptocorisa spp.、Nezara spp.、Piesma spp.、Rhodniusspp.、Sahlbergella singularis、Scotinophara spp.、Triatoma spp.、Miridae家族spp.(例如Lygus hesperus和Lygus lineoloris)、Lygaeidae家族spp.(例如Blissus leucopterus)和Pentatomidae家族spp.；
来自Homoptera目的，例如
Aleurothrixus floccosus、Aleyrodes brassicae、Aonidiella spp.、Aphididae、Aphis spp.、Aspidiotus spp.、Bemisia tabaci、Ceroplaster spp.、Chrysomphalus aonidium、Chrysomphalus dictyospermi、Coccushesperidum、Empoasca spp.、Eriosoma larigerum、Erythroneura spp.、Gascardia spp.、Laodelphax spp.、Lacanium corrii、Lepidosaphes spp.、Macrosiphus spp.、Myzus spp.、Nehotettix spp.、Nilaparvata spp.、Paratoriaspp.、Pemphigus spp.、Planococcus spp.、Pseudaulacaspis spp.、Pseudococcus spp.、Psylla ssp.、Pulvinaria aethiopica、Quadraspidiotusspp.、Rhopalosiphum spp.、Saissetia spp.、Scaphoideus spp.、Schizaphisspp.、Sitobion spp.、Trialeurodes vaporariorum、Trioza erytreae和Unaspiscitri；
来自Hymenoptera目的，例如，
Acromynnex、Atta spp.、Cephus spp.、Diprion spp.、Diprionidae、Gilpinia polytoma、Hoplocampa spp.、Lasius sppp.、Monomoriumpharaonis、Neodiprion spp、Solenopsis spp.和Vespa ssp.；
来自Diptera目的，例如，
Aedes spp.、Antherigona soccata、Bibio hortulanus、Calliphoraerythrocephala、Ceratitis spp.、Chrysomyia spp.、Culex spp.、Cuterebraspp.、Dacus spp.、Drosophila melanogaster、Fannia spp.、Gastrophilusspp.、Glossina spp.、Hypoderma spp.、Hyppobosca spp.、Liriomysa spp.、Lucilia spp.、Melanagromyza spp.、Musca ssp.、Oestrus spp.、Orseoliaspp.、Oscinella frit、Pegomyia hyoscyami、Phorbia spp.、Rhagoletispomonella、Sciara spp.、Stomoxys spp.、Tabanus spp.、Tannia spp.和Tipula spp.；
来自Siphonaptera目的，例如，
Ceratophyllus spp.和Xenopsylla cheopis，以及
来自Thysanura目的，例如，
Lepisma saccharina。
已经发现，当有害昆虫是Diabrotica spp.，特别地，当有害生物是Diabrotica virgifera virgifera(Western玉米根虫，WCR)、Diabroticabarberi(Northern玉米根虫，NCR)、Diabrotica virgifera zeae(墨西哥玉米根虫，MCR)、Diabrotica balteata(巴西玉米根虫，BZR)或巴西玉米根虫复合体(BCR，由Diabrotica viridula和Diabrotica specfosa组成)或Diabrotica undecimpunctata howardii(Southern玉米根虫，SCR)的时候，本发明特别有用。
本发明还特别有效于控制能刺穿植物细胞和组织并从中吮吸流体的昆虫物种，其包括但不限于，臭蝽(Pentatomidae家族的物种)和Miridae家族中的盲蝽(plant bug)，例如西部盲蝽(western tarnishedplant bug，Lygus hesperus物种)、盲蝽(tarnished plant bug，Lyguslineolaris物种)和白豆盲蝽(pale legume bug，Lygus elisus)。
对本文公开的方法的改进，出人意料地特别有用于控制鳞翅目的作物有害生物。
本发明提供了经过稳定的dsRNA或siRNA分子，用于控制昆虫侵袭。dsRNA或siRNA分子包含双链的经聚合核糖核苷酸，其可以包括对磷酸酯糖主链或核苷的修饰。RNA结构中的修饰可被加上尾巴，以允许特异性遗传抑制。
在一种实施方式中，可通过酶方法对dsRNA分子进行修饰，可以产生siRNA分子。siRNA可针对一些昆虫中的一些目标基因有效介导负调作用。这种酶方法可通过在真核RNAi途径中利用昆虫、脊椎动物、真菌或植物细胞中存在的RNAse III酶或DICER酶来完成(Elbashir et al.，2002，Methods，26(2)：199-213；Hamilton andBaulcombe，1999，Science 286：950-952)。该方法还可利用通过重组DNA技术引入到目标昆虫细胞中的重组DICER或RNAse III来进行，这是本领域技术人员易于知道的。天然存在于昆虫中的或通过重组DNA技术制造的DICER酶和RNAse III能将较大的dsRNA链切割为较小的寡核苷酸。DICER酶能特异性地将dsRNA分子切割为siRNA片断，其中，每个siRNA片断为大约19-25个核苷酸长，而RNAse III酶通常将dsRNA分子切割为12-15个碱基对的siRNA。通过上述任何酶产生的siRNA分子具有2至3个核苷酸的3’悬挂和5’磷酸和3’羟基末端。通过RNAse III酶产生的siRNA与在真核RNAi途径中通过Dicer制造的相同，因此，然后可被靶向，并在松散之后被内在的细胞内RNA降解机制降解，分离为单链RNA，以及与目标基因转录的RNA序列杂交。这种方法是的可对昆虫中目标基因核苷酸序列编码的RNA序列进行有效降解或除去。结果就是昆虫中被特别靶向的核苷酸序列的沉默。对酶方法的细节描述可在Hannon(2002，Nature，418：244-251)中找到。
利用本发明的经稳定dsRNA技术来抑制目标基因是序列特异性的，因为，与RNA二体区域对应的核苷酸序列针对遗传抑制被靶向。含有与目标基因的一部分相同的核苷酸序列的RNA被优选用于抑制。相对目标序列具有插入、缺失和单点突变的RNA序列也被发现有抑制作用。在本发明的性能方面，优选地，抑制性dsRNA和目标基因的一部分共享至少大约80％的序列相同性，或者高于大约90％的序列相同性，或者高于大约95％的序列相同性，或者高于大约99％的序列相同性，或者甚至大约100％的序列相同性。或者，RNA的二体区域可被功能性地定义为：能与目标基因转录本的一部分杂交的核苷酸序列。展示出更高的同源性的小于全长的序列可等价于(compensate)较长却仅有较少同源性的序列。相同核苷酸序列的长度可以为至少大约25、50、100、200、300、400、500或者至少大约1000个碱基。通常，应当使用超过20-1100个核苷酸的序列，虽然超过大约200-300个核苷酸的序列是优选的，超过大约500-1000个核苷酸的序列是尤其优选的，这取决于目标基因的大小。本发明具有如下优点：其能忍受序列变异体，所述变异体可能是由于遗传突变、菌株多形性或进化分歧造成的。相对于目标基因的一级转录产物或经过完全加工的mRNA，引入的核酸分子可能不需要绝对同源，可能不需要全长。因此，本领域技术人员需要认识到，如本文所公开的，RNA和目标基因之间的100％序列相同性对于实践本发明来说并非必须。
dsRNA分子可以通过体内或体外合成。dsRNA可以由单条自身互补的RNA链形成，或者可以由两条互补的RNA链形成。细胞的内源RNA聚合酶可以介导体内转录，或者克隆的RNA聚合物可被用于体内或体外转录。可以通过下述方法来靶向抑制：在器官、组织或细胞类型中的特异性转录；环境条件的刺激(例如，感染、胁迫、温度、化学诱导剂)；和/或在发育阶段或年龄进行的工程性转录。RNA链可以是或不是聚腺苷化的；RNA链可以能或不能被细胞的翻译装置翻译为多肽。
本发明的RNA、dsRNA、siRNA或miRNA由本领域技术人员通过化学方法或酶方法来生产，这是通过人工或自动的反应或在另一生物体内来进行的。还可通过部分或完全的有机合成来制造RNA；可通过体外酶合成或有机合成引入任何经过修饰的核糖核苷酸。可以通过细胞内RNA聚合酶或噬菌体RNA聚合酶(例如，T3、T7、SP6)来合成RNA。表达构建体的使用和制造是本领域已知的(见，例如，WO97/32016、美国专利号5,593,874、5,698,425、5,712,135、5,789,214和5,804,693)。如果通过化学合成或通过体外酶合成，可在引入细胞之前对RNA进行纯化。例如，可以通过用溶剂或树脂提取、沉淀、电泳、色谱或其组合，从混合物中纯化出RNA。或者，可以在不纯化或仅进行最小限度的纯化的情况下来使用RNA，以避免由于样品加工导致的损失。RNA可被干燥以贮藏，或者溶解于水溶液中。溶液可以含有缓冲剂和盐，以促进二体链的稳定和/或退火。
为在体内从转基因体或表达构建体进行转录，可使用调控区域(例如，启动子、增强子、沉默子和聚腺苷化)来转录一条(或多条)RNA链。因此，在一种实施方式中，用于制造RNA分子的核苷酸序列可与在微生物、真菌或植物宿主细胞中具有功能的一条或多条启动子序列可操作地相连。理想地，核苷酸序列被放置于内源启动子的控制之下，所述内源启动子通常处于宿主基因组中。处于可操作地连接的启动子序列控制下的本发明核苷酸序列，侧翼还可以有额外的序列，所述额外的序列能有利地影响其转录和/或得到的转录本的稳定性。此类序列通常位于可操作地连接的启动子的上游，和/或表达构建体3’端的下游，可以同时存在于启动子上游和表达构建体3’端的下游，虽然仅仅是此类上有序列也是被包括的。
在另一种实施方式中，本发明的核苷酸序列可以包含被“间隔序列”分离开的反向重复。间隔序列可以是包含下述任何核苷酸序列的区域，如果需要的话，所述核苷酸序列能促进每段重复之间二级结构形成。在本发明的一种实施方式中，间隔序列是用于mRNA的正义或反义编码序列的一部分。或者，间隔序列可以包含能与核酸分子共价连接的核苷酸或其同源物的任何组合。间隔序列可包含长度为至少大约10-100个核苷酸的核苷酸序列，或者长度为至少大约100-200个核苷酸，长度为至少大约200-400个核苷酸，或者长度为至少大约400-500个核苷酸。
就本发明的目的而言，dsRNA或siRNA分子可以从CRW获得，这是通过对从玉米根虫gDNA或cDNA文库获得的目标CRW基因序列或其部分进行聚合酶链式(PCR)扩增来实现的。可以用本领域普通技术人员已知的方法来准备WCR幼虫，可以提取DNA/RNA。可将不同大小的幼虫，从第1龄至完全长成的CRW用于本发明的目的，进行DNA/RNA提取。基因组DNA或cDNA文库可被用于PCR扩增，以生产dsRNA或siRNA。
然后可使用本领域中容易获得的方法，对目标基因进行PCR扩增和测序。本领域技术人员可对PCR条件加以改动，以确保最优的PCR产物形成。经过验证的PCR产物可被用作为模板，用于体内转录，以产生具有被包括进来的最小限度启动子的正义和反义RNA。
本发明的翻名人提出，从昆虫王国中的任何昆虫物种鉴定和纯化出的核酸序列可用于本发明，以控制WCR和其它目标昆虫。在本发明的一个方面，可从来自鞘翅类物种的物种来获得核酸。特别地，可从属于Diabrotica属(鞘翅目，叶甲科)的叶甲虫来获得核酸，更特别地，可从virgifera组来获得本发明的核酸。最特别地，本发明的核酸可从Diabrotica virgifera virgifera LeConte获得，其通常被称为WCR。经过分离的核酸可用于，例如鉴定目标基因，以及构建下述重组载体，所述载体能生产本发明的经过稳定的dsRNA或siRNA，用于保护植物抵挡WCR昆虫侵袭。
因此，在一种实施方式中，本发明包含来自WCR或Lygus的经过分离和纯化的核苷酸序列，其可被用作为昆虫控制剂。经过分离和纯化的核苷酸序列包含序列表中列出的SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：143或SEQ ID NO：169至SEQ ID NO：174所示的序列。
来自WCR或其它昆虫的、可用于本发明的核酸还可包含经过分离和高度纯化的Unigenes和EST核酸分子或其核酸片段分子。EST核酸分子可以编码多肽的显著区域，或者事实上，多肽的大部分。或者，所述片段可以包含更小的寡核苷酸，所述寡核苷酸具有大约15至大约250个核苷酸残基，更优选地，大约15至大约30个核苷酸残基。或者，用于本发明的核酸分子可以来自WCR、lygus或任何其它无脊椎有害生物物种的cDNA文库。
本文中使用的短语“高度纯化的核酸”、“人工序列”、“经过分离和高度纯化的核酸”或者“经过分离和高度纯化的核苷酸序列”指下述核酸，其不再伴随有其天然状态伴随的物质中的一些，或者其结构与天然存在的核酸中的任何都不同。高度纯化的核酸的例子包括：(1)DNA，其具有天然存在的基因组DNA分子的部分序列，但其侧翼没有在该DNA分子天然存在的生物基因组中的该分子部分侧翼存在的两条编码序列；(2)被包括进载体或原核或真核生物基因组DNA中的核酸，包括进去的手段是使得得到的分子与任何天然存在的载体或基因组DNA都不同的；(3)单独分子，例如cDNA、基因组片段、通过聚合酶链式反应(PCR)产生的片段或限制性片段；(4)重组DNA；以及(5)合成DNA。高度纯化的核酸还可由一条或多条cDNA、基因组DNA或合成DNA组成。
来自WCR、Lygus或其它无脊椎有害生物物种的核酸分子和其片段可被用于获得来自其它物种的其它核酸分子，用于本发明中，以产生想要的dsRNA和siRNA分子。此类核酸分子包括下述核酸分子，所述核酸分子编码蛋白质的完全编码序列，以及此类分子的启动子和侧翼序列。此外，此类核酸分子包含：编码基因家族成员的核酸分子。使用上述核酸分子或其片段去筛选从D.v.virgifera或从Lygus hesperus获得的cDNA或gDNA文库，可以容易得获得此类分子。用于制成此类文库的方法是本领域公知的。
来自WCR或Lygus的核酸分子和其片段可被用于获得其它核酸分子，例如核酸同源物，用于本发明中，以产生想要的dsRNA和siRNA分子。此类同源物包括：整个或部分地编码其它物种、植物或其它生物的蛋白质同源物的核酸分子。使用上述核酸分子或其片段去筛选EST、cDNA或gDNA文库，可以容易地获得此类分子。用于制成此类文库的方法是本领域公知的。此类同源物分子的核苷酸序列可以与本文公开的序列表中所示的SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：143或SEQ IDNO：169至SEQ ID NO：174中的一种或多种序列中发现的核苷酸序列或其互补序列有所不同，因为对于稳定杂交来说并不需要完全互补。这些核酸分子还包括，虽然能与核酸分子特异性杂交但可能缺乏完全互补性的分子。在一种特殊的实施方式中，用于3’或5’RACE的方法可用于获得此类序列(Frohman，M.A.et at，Proc.Natl.Acad.ScL(U.S.A.)85：8998-9002(1988)；Ohara，O.et at，Proc.Natl.Acad.ScL(U.S.A.)86：5613-5611(1989))。通常，上述核酸分子或片段中的任何种类都可被用于产生下述dsRNA或siRNA，所述RNA适用于本发明的膳食、喷雾混合物或重组DNA构建体。
本文中使用的短语“编码序列”、“结构核苷酸序列”或“结构核酸分子”指，放置于合适的调控序列控制下时，能被翻译为多肽的核苷酸序列，通常这是通过mRNA进行的。编码序列的边界是由5’末端的翻译起始密码子和3’末端的翻译终止密码子来确定的。编码序列可以包括但不限于，基因组DNA、cDNA、EST和重组核苷酸序列。
术语“重组DNA”或“重组核苷酸序列”指，含有遗传工程修饰的DNA，所述修饰是通过诱变、限制性酶等的操纵来进行的。
上述核酸分子或核酸分子的片段或来自WCR的其它核酸分子能在某些条件下特异性地与其它核酸分子杂交。本文中，如果两条分子能形成反平行的双链核酸结构，就说两条核酸分子能互相特异性杂交。如果两条核酸分子展示出完全互补性，我们就说一条核酸分子是另一条核酸分子的互补序列。如果在至少传统的“低严谨度”条件下，两条分子能以足够的稳定性互相杂交，允许它们保持为互相退火的状态，我们就说这两条分子是“最小限度互补的”。类似地，如果在至少传统的“高严谨度”条件下，两条分子能以足够的稳定性互相杂交，允许它们保持为互相退火的状态，我们就说这两条分子是互补的。传统的严谨条件在Sambrook，et al.和Haymes，et al.In：Nucleic AcidHybridization，A Practical Approach，IRL Press，Washington，DC(1985).中有所描述。
因此，与完全互补有背离是允许的，只要这种背离不会使分子形成双链结构的能力完全消失即可。因此，为使核酸分子或核酸分子的片段被用作为引物或探针，仅需要序列足够互补，能在所用的特定溶剂和盐浓度下形成稳定的双链结构即可。
能促进DNA杂交的合适的严谨条件是，例如，在大约45℃进行于6.0x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，接着在50℃用2.0x SSC去洗，这是本领域技术人员已知的，或者可在Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中找到。例如，清洗步骤中的盐浓度可选自：低严谨度下50℃、大约2.0x SSC，至高严谨度下50℃、大约0.2x SSc。此外，清洗步骤中的温度可从低严谨度下的室温(大约22℃)增加至高严谨度下的大约65℃。温度和盐可都改变，或者，温度或者盐浓度可以保持恒定，其它变量改变。
用于本发明的核酸可以与来自WCR的一种或多种核酸分子或其互补序列在中等严谨条件下特异性杂交，例如，在大约2.0x SSC和大约65℃。用于本发明的核酸将包括：在高严谨度条件下，能与序列表示出的SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：143或SEQ ID NO：169至SEQID NO：174中公开的核酸分子或其互补序列中的一种或多种特异性杂交的那些核酸分子。优选地，用于本发明的核酸分子将展示出与序列表示出的SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：143或SEQ ID NO：169至SEQ ID NO：174中示出的、或者如本文所公开的一种或多种核酸分子具有至少大约80％，或者至少大约90％，或者至少大约95％，或者至少大约98％，或者甚至大约100％的序列相同性；或者，用于本发明的核酸序列将展示出与从有害昆虫的基因组DNA分离出的、如序列表示出的SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：143或SEQ ID NO：169至SEQ IDNO：174中示出的一种或多种核酸分子具有至少大约80％，或者至少大约90％，或者至少大约95％，或者至少大约98％，或者甚至大约100％的序列相同性。
来自WCR的核酸的全部或绝大部分可用于分离编码来自同一物种或其它物种的Diabrotica蛋白同源物或其片段的cDNA、gDNA和核酸。关于从cDNA和gDNA文库分离和鉴定本发明的核酸的技术的详细描述，公开于实施例中。
本发明的核酸还可以是通过本领域已知的方法完全或部分被合成的，尤其是当需要提供植物偏好的序列时。因此本发明核酸的全部或部分可以是使用选用的宿主偏好的密码子来合成的。物种偏好的密码子可以通过，例如，从在特定宿主物种中表达的蛋白中使用最频繁的密码子来确定。对核苷酸序列的其它修饰可以导致突变体具有轻微改变的活性。
本发明一部分提供了一种运送系统，用于向昆虫运送昆虫控制剂。本发明的经过稳定的dsRNA或siRNA分子可被直接引入昆虫的细胞，或者引入到细胞外的腔、空隙空间、淋巴系统、消化系统，引入到昆虫的循环系统，这是通过口服摄取或本领域技术人员可以利用的其它手段来进行的。用于通过口服引入的方法包括：将RNA与昆虫的食物直接混合物，以及下述工程方法，其中，被用作为食物的物种经过了工程改造，得以表达dsRNA或siRNA，然后将其喂饲给待影响的昆虫。在一种实施方式中，例如，dsRNA或siRNA可通过微生物表达，并且可将微生物应用到植物表面或通过物理手段，例如注射引入根、茎。在又一种实施方式中，可对植物进行遗传工程改造，使其表达足以杀死已知会感染植物的昆虫的量的dsRNA或siRNA。
特别地，在WCR中实践本发明时，可将经过稳定的dsRNA或siRNA引入到昆虫体内的中肠，获得理想的对目标基因的抑制。如上文所述，dsRNA或siRNA分子可被包括进膳食或覆盖于膳食上，可被昆虫摄取。在任何情况下，本发明的dsRNA都被提供于目标有害生物的膳食中。本发明的目标有害生物将展示出大约4.5至大约9.5、或大约5至大约8.5、或大约6至大约8、或大约6.5至大约7.7、或大约7.0的消化道pH。目标有害生物的消化道在本文中被定义为有害生物中的下述位置，在该位置，有害生物所摄取的食物被暴露于能有利吸收本发明的dsRNA分子的环境，而不会遭遇极端到使得dsRNA双链之间的氢键分裂从而形成单链分子的pH。
此外，就控制植物中昆虫侵袭的目的而言，通过喷雾应用将昆虫控制用的dsRNA运送到植物表面提供了另一种保护植物的手段。在这种情况下，被工程改造以产生和积累dsRNA的细菌可被发酵，发酵产品被配方为可与常见农业应用兼容的喷雾产品。所述配方可以包括：高效叶片覆盖所需的合适的胶粘物和润湿剂，以及用于保护dsRNA免受UV损害的UV保护剂。此类添加剂是生物杀昆虫剂工业中常用的，也是本领域技术人员公知的。同样地，用于土壤应用的配方可以包括下述颗粒配方，其用作为土壤有害昆虫(例如，玉米根虫)幼虫的饵。
还可预见到，可用与常规农业实践一致的方式来配方通过化学或酶合成生产的dsRNA，将其用作为喷雾产品，以控制昆虫侵袭。所述配方可以包括：高效叶片覆盖所需的合适的胶粘物和润湿剂，以及用于保护dsRNA免受UV损害的UV保护剂。此类添加剂是生物杀昆虫剂工业中常用的，也是本领域技术人员公知的。此类应用可与其它喷雾杀昆虫剂(是或不是基于生物的)应用组合，以在抵挡昆虫进食损害的方面提高对植物的保护。
本发明的发明人提出，生产杀昆虫蛋白的细菌菌株可被用于生产用于昆虫控制目的的dsRNA。这些菌株展示出提高的昆虫控制性质。多种不同的细菌宿主可被用于生产昆虫控制dsRNA。示例性的细菌可以包括E.coli、B.thuringiensis、Pseudomonas sp.、Photorhabdus sp.、Xenorhabdus sp.、Serratia entomophila和相关的Serratia sp.、B.sphaericus、B.cereus、B.laterosponis、B.popilliae、Clostridiumbifermentans和其它Clostridium物种，或其它形成孢子的革兰氏阳性细菌。
本发明还涉及用于在微生物中表达的重组DNA构建体。可使用本领域已知的方法，将从中可以转录出目标RNA的外源核酸引入微生物宿主细胞，例如，细菌细胞或真菌细胞。
本发明的核苷酸序列可被引入到广范围的原核和真核宿主中，产生经过稳定的dsRNA或siRNA分子。术语“微生物”包括原核和真核微生物物种，例如细菌和真菌。真菌包括酵母和有丝真菌等。阐述性的原核生物，既有革兰氏阴性也有革兰氏阳性的，包括Enterobacteriaceae，例如Escherichia、Erwinia、Shigella、Salmonella和Proteus；Bacillaceae；Rhizobiceae，例如Rhizobium；Spirillaceae，例如光细菌、Zymomonas、Serratia、Aeromonas、Vibrio、Desulfovibrio、Spirillum；Lactobacillaceae；Pseudomonadaceae，例如Pseudomonas和Acetobacter；Azotobacteraceae，Actinomycetales和Nitrobacteraceae。真核生物包括真菌，例如Phycomycetes和Ascomycetes，其包括酵母，例如，Saccharomyces和Schizosaccharomyces；以及Basidiomycetes酵母，例如，Rhodotorula、Aureobasidium、Sporobolomyces等。
就针对昆虫保护植物的目的而言，已知栖息于多种不同重要作物的叶面(植物叶子的表面)和/或根围(植物根部周围的土壤)的大量微生物也可以是用于对本文公开的重组构建体进行操纵、繁殖传播、贮藏、运送和/或诱变的理想宿主细胞。这些微生物包括细菌，藻类和真菌。具有特别兴趣的是微生物，例如，细菌，例如下述的属：Bacillus(包括下述种和亚种：B.thuringiensis kurstaki HD-I、B.thuringiensiskurstaki HD-73、B.thuringiensis sotto、B.thuringiensis berliner、B.thuringiensis thuringiensis、B.thuringiensis tolworthi、B.thuringiensisdendrolimus、B.thuringiensis alesti、B.thuringiensis galleriae、B.thuringiensis aizawai、B.thuringiensis subtoxicus、B.thuringiensisentomocidus、B.thuringiensis tenebrionis和B.thuringiensis sandiego)；Pseudomonas，Erwinia，Serratia，Klebsiella，Zanthomonas，Streptomyces，Rhizobium，Rhodopseudomonas，Methylophilius，Agrobacterium，Acetobacter，Lactobacillus，Arthrobacter，Azotobacter，Leuconostoc和Alcaligenes；真菌，特别是酵母，例如，下述的属：Saccharomyces，Cryptococcus，Kluyveromyces，Sporobolomyces，Rhodotorula和Aureobasidium。具有特别兴趣的是此类植物周围的细菌物种，例如Pseudomonas syringae，Pseudomonas fluorescens，Serratiamarcescens，Acetobacter xylinum，Agrobacterium tumefaciens，Rhodobacter sphaeroides，Xanthomonas campestris，Rhizobium melioti，Alcaligenes eutrophus和Azotobacter vinlandii；以及植物周围的酵母物种，例如，Rhodotorula rubra，R.glutinis，R.marina，R.aurantiaca，Cryptococcus albidus，C.diffluens，C.laurentii，Saccharomyces rosei，S.pretoriensis，S.cerevisiae，Sporobolomyces roseus，S.odorus，Kluyveromyces veronae和Aureobasidium pollulans。
细菌重组DNA载体可以是线性的或封闭的环状质粒。载体系统可以是单一载体或质粒，或两种或多种载体或质粒，它们一起含有将被引入到细菌宿主基因组中的总DNA。此外，细菌载体可以是表达载体。序列表中示出的SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：143或SEQ ID NO：169至SEQ ID NO：174或其片段示出的核酸分子可以，例如，适合插入到载体中，所述载体处于合适启动子的控制之下，所述启动子在一种或多种微生物宿主中发挥作用，以驱动所连接的编码序列或其它DNA序列的表达。为此目的，很多载体都是可获得的，对合适载体的选择将主要取决于带插入到载体中的核酸的大小以及将用载体转化的特定宿主细胞。每种载体都含有多种组分，这取决于其功能(扩增DNA或表达DNA)以及与其兼容的特定宿主细胞。用于细菌转化的载体组分通常包括但不限于下述组分中的一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种选择标记基因以及允许外源DNA表达的诱导型启动子。
表达和克隆载体通常含有选择基因，其也被称为选择标记。该基因编码在选择性培养基上生长的经转化宿主细胞存活或生长所必需的蛋白。典型的选择基因编码下述蛋白，所述蛋白能：(a)赋予对抗生素或其它毒素，例如，氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素的抗性，(b)补足营养缺陷，或(c)提供无法从复合培养基中获得的关键营养物，例如，对Bacilli而言，编码D-丙氨酸消旋酶的基因。这些被异源蛋白或其片段成功转化的细胞能产生赋予对药物抗性的蛋白，由此能在选择处理中存活。
用于生产mRNA的表达载体还可含有下述诱导型启动子，所述启动子能被宿主细菌生物识别，并与下述核酸可操作地连接，所述核酸例如，编码D.v.virgifera mRNA或其能引起兴趣的片段的核酸。适合用于细菌宿主的诱导型启动子包括β-内酰胺酶启动子，E.coli λ噬菌体PL和PR启动子，以及E.coli半乳糖启动子、阿拉伯糖启动子、碱性磷酸酶启动子、色氨酸(trp)启动子以及乳糖操纵子启动子及其变体和杂交启动子，例如，tac启动子。但是，其它已知的细菌诱导型启动子也是合适的。
在提到调控序列和结构核苷酸序列时，术语“可操作地连接”指，调控序列导致相连的结构核苷酸序列的表达被调控。“调控序列”或“控制元件”指位于结构核苷酸序列上游(5’非编码序列)、中间或下游(3’非翻译序列)的核苷酸序列，其能影响到相关结构核苷酸序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译的时机和水平或数量。调控序列可以包括启动子、翻译引导序列、内含子、增强子、茎环结构、遏制子结合序列以及聚腺苷化识别序列等。
或者，表达载体可随整合载体被整合进细菌基因组。典型地整合载体含有与允许载体整合的细菌染色体同源的至少一种序列。整合看起来是载体DNA和细菌染色体中同源DNA之间的重组导致的。例如，用来自多种Bacillus菌株的DNA构建的整合载体能整合进Bacillus染色体(EP 0,127,328)。整合载体还可包含细菌噬菌体或转座子序列。自杀型载体也是本领域已知的。
对含有一种或多种上面列出的元件的合适载体的构建利用标准的重组DNA技术来进行。对经过分离的质粒或DNA片段加以切割，加上尾巴，并重新连接为产生所需质粒想要的形式。可获得的细菌表达载体的例子包括但不限于，多功能E.coli克隆和表达载体，例如，Bluescript(Stratagene，La Jolla，CA)，其中，例如，D.v.virgifera蛋白或其片段能被连接进载体，所述连接是以符合用于β-半乳糖苷酶氨基末端Met和随后七个残基的读码框的方式进行的，由此产生杂交蛋白；pIN载体(Van Heeke and Schuster，1989，J.Biol.Chem.264：5503-5509)等。
典型地，酵母重组构建体包括下述组分中的一种或多种：启动子序列、融合伴侣序列、引导序列、翻译终止序列、选择标记。这些元件可以组合进表达盒，表达盒可被保持于复制子中，例如染色体外元件(例如，质粒)，其能稳定保持于宿主(例如酵母或细菌)中。复制子可以具有两套复制系统，由此允许其被保持于，例如，酵母中用于表达，原核生物宿主中用于克隆和扩增。此类酵母-细菌穿梭载体的例子包括YEp24(Botstein et al.，1979，Gene，8：17-24)、pCl/1(Brakeet al.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci USA，81：4642-4646)和YRpl7(Stinchcomb et al.，1982，J.MoI.Biol.，158：157)。此外，复制子可以是高或低拷贝数的质粒。高拷贝数质粒将通常具有大约5至大约200范围内的拷贝数，典型地，大约10至大约150。含有高拷贝数质粒的宿主将优选具有至少大约10，更优选至少大约20个拷贝。
有用的酵母启动序列可从编码代谢途径中酶的基因获得。此类基因的例子包括醇脱氢酶(ADH)(EP 0 284044)、烯醇酶、葡糖激酶、葡糖-6-磷酸异构酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP or GAPDH)、己糖激酶、磷酸果糖激酶、3-磷酸甘油酸酯变位酶和丙酮酸激酶(PyK)(EP0 3215447)。编码酸性磷酸酶的酵母PHO5基因也提供了有用的启动子序列(Myanohara et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80：1，1983)。此外，天然不存在的合成启动子也可作为酵母启动子发挥作用。此类杂交启动子的例子包括与GAP转录激活区域相连的ADH调控序列(美国专利号4,876,197和4,880,734)。杂交启动子的其它例子包括，由ADH2、GAL4、GAL10或PHO5基因调控序列组合上糖分解酶基因(例如GAP或PyK)的转录激活区域组成的启动子(EP 0 164556)。此外，酵母启动子可以包括：具有与酵母RNA聚合酶结合并起始转录的能力的、非酵母来源的天然存在的启动子。
转录终止序列和其它能被酵母识别的终止序列(例如，编码糖分解酶的那些)的例子，是本领域技术人员已知的。
或者，表达构建体可随整合载体被整合进酵母基因组。典型地，整合载体含有与允许载体整合的酵母染色体同源的至少一种序列，并且优选含有侧翼于表构建体的两种同源序列。整合看起来是载体和酵母染色体中同源DNA之间的重组导致的(Orr-Weaver et al.，1983，Methods in Enzymol.，101：228-245)。整合载体可以针对酵母中的特定基因座，这是通过选择合适的同源序列包括进载体来实现的。见上文所述的Orr-Weaver et al.。一种或多种表达构建体可以整合，可能地，影响产生的重组蛋白的水平(Rine et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80：6750)。载体中包括的染色体序列可以作为单一片断存在于载体中，这会导致整个载体的整合，或者其可以作为两条片断存在，所述两条片断与染色体中相邻片断同源，侧翼于载体中的表达构建体，其会导致仅仅是表达构建体的稳定整合。
本发明还提出，将本发明的核苷酸序列转化进植物，使得一种或多种dsRNA分子能以有害生物抑制水平表达。使用本领域可获得的方法，可以容易地制备转化载体。转化载体包含一种或多种下述核苷酸序列，所述序列能被转录为RNA分子，以及与昆虫基因组编码的一种或多种核苷酸序列高度同源和/或互补，使得：昆虫摄取从一种或多种核苷酸序列分子转录来的RNA时，会对昆虫基因组中各个核苷酸序列中的至少一种的表达加以负调。
转化载体还可表示dsDNA构建体，除此之外，其还可被当作重组分子、昆虫控制剂、遗传分子或嵌合(chimeric)遗传构建体。本发明的嵌合遗传构建体可包含，例如，编码一种或多种反义转录本、一种或多种正义转录本、上述每种的一种或多种的核苷酸序列，其中，来自其的转录本的全部或部分与下述RNA分子的全部或部分同源，所述RNA分子包含昆虫基因组中核苷酸序列编码的RNA序列。
在一种实施方式中，植物转化载体是经过分离和纯化的DNA分子，其中包含与本发明的一种或多种核苷酸序列可操作地相连的启动字。核苷酸序列选自由序列表中所示的SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：143或SEQ ID NO：169至SEQ ID NO：174所构成的组。核苷酸序列包括下述片断，其编码目标有害生物RNA转录本中存在的RNA的全部或部分，还包含目标有害生物RNA全部或部分的反向重复。包含表达载体的DNA分子还可含有功能性内含子序列(其定位于编码序列的上游或者甚至在编码序列之中)，所述分子还可以含有五撇(5’)非翻译引导序列(即，UTR或5’-UTR)，其定位于启动子和翻译起始位点之间。
植物转化载体可以含有来自多于一种基因的序列，由此允许多于一种的dsRNA产生，用于抑制目标有害生物细胞中两种或多种基因的表达。本领域技术人员容易理解，具有对应于不同基因中存在的序列的序列的DNA片断可组合成单一的复合DNA片断，用于在转基因植物中表达。或者，可对已含有至少一种DNA片断的本发明质粒加以修饰，这是通过将额外DNA片断顺序插入到增强子和启动子和终止子序列之间来进行的。在设计用来抑制多种基因的本发明昆虫控制剂中，待抑制基因可从同一昆虫物种中获得，以增强昆虫控制剂的效率。在某些实施方式中，基因可从不同的昆虫获得，以拓宽试剂的有效昆虫范围。当针对遏制或针对表达和遏制的组合靶向多种基因时，可以按照Fillatti，专利申请号US 2004-0029283所阐述和公开的，来制造多顺反子DNA元件。
当用本发明的核苷酸序列去转化植物的情况下，选用展示出如下能力下述启动子，所述启动子能在该特定的植物物种中驱动编码序列的表达。在不同植物物种中具有功能的启动子是本领域公知的。可用于在植物中表达多肽的启动子的例子是，Odell et al.(1985，Nature313：810-812)所述的诱导型、病毒、合成或组成型启动子，和/或被从时间上调控、空间上调控以及时空调控的启动子。优选的启动子包括增强的CaMV35S启动子以及FMV35S启动子。就本发明的目的而言，例如，对在根部进食的物种的最优控制而言，优选在植物根部中获得这些基因的最高水平表达。大量的根部增强启动子已被鉴定出来，它们是本领域已知的(Lu et al.，2000，J.Plant Phys.，156(2)：277-283；美国专利号5,837,848和6,489,542)。典型地，本发明的重组DNA载体或构建体将包含选择标记，其能在植物细胞上赋予选择表型。选择标记还可用于选出含有编码本发明多肽或蛋白的外源核酸的植物或植物细胞。标记可以编码杀生物剂抗性、抗生物抗性(例如，卡纳霉素、G418博来霉素、潮霉素等)或除草剂抗性(例如，草甘膦等)。选择标记的例子包括但不限于，编码卡纳霉素抗性的neo基因，可针对使用卡纳霉素、G418等进行选择；编码双丙氨膦抗性的bar基因；突变体EPSP合酶基因，其编码草甘膦抗性；腈水解酶基因，其赋予对溴苯腈的抗性；突变体乙酰乳酸合酶基因(ALS)，其赋予对咪唑啉酮或磺脲的抗性；以及抗甲氨喋呤的DHFR基因。
本发明的重组载体或构建体还可包括筛选标记。筛选标记可被用于监视表达。示例性的筛选标记包括，β-葡糖苷酸酶或uidA基因(GUS)，其编码已知有多种发色底物的酶(Jefferson，1987，Plant Mol.Biol，Rep.5：387-405；Jefferson et al，1987，EMBO J.6：3901-3907)；R-基因座基因，其编码能对植物组织中花青素色素(红色)的产生进行调控的产物(Dellaporta et al，1988，Stadler Symposium 11：263-282)；β-内酰胺酶基因(Sutcliffe et al.，1978，Proc.Natl.Acad.Sci 75：3737-3741)，该基因编码已知有多种发色底物(例如，PADAC，发色头孢菌素)的酶；萤光素酶基因(Ow et al.，1986，Science 254：856-859)；xylE基因(Zukowsky et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci 50：1101-1105)，其编码儿茶酚加双氧酶，所述酶能转化发色的儿茶酚；α-淀粉酶基因(Ikatu et al.，1990，Bio/Technol.8：241-242)；酪氨酸酶基因(Katz et al.，1983，J.Gen.Microbiol.129：2703-2714)，其编码能将酪氨酸氧化为DOPA以及多巴醌的酶，多巴醌随后聚合(condense)为黑色素；α-半乳糖苷酶，其能催化发色的α-半乳糖底物。
通常，优选在植物基因组中非特异性位置引入功能性重组DNA。在特殊情况下，可通过定点整合插入重组DNA构建体。存在有已知能使植入体具有功能的多种定点重组系统，其包括美国专利4,959,317公开的cre-lox和美国专利5,527,695公开的FLP-FRT。
实践中，在任何单一转化实验中，DNA仅被引入到小百分比的目标细胞中。编码选择标记的基因被用于提供用来鉴定被稳定转化的这些细胞的高效系统，所述转化是通过接收转基因DNA构建体并将其整合进它们的基因组来实现的。优选的标记基因提供赋予对选择性试剂(例如，抗生素或除草剂)的抗性的选择标记。本发明的植物可具有对其的抗性的任何除草剂都是用于选择标记的有用试剂。将可能被转化的细胞暴露给选择性试剂。在存活细胞的种群中，将是下述细胞，其中，通常，抗性赋予基因被整合，并已足够允许细胞存活的水平表达。可对细胞进行进一步试验，以验证外源DNA的稳定整合。通常使用的选择性标记基因包括赋予对抗生素抗性的那些，例如对卡纳霉素(nptII)、潮霉素B(aph IV)和庆大霉素(aac3和aacC4)，或者对除草剂抗性/耐受性的那些，例如对草铵膦(bar或pat)、草甘膦(EPSPS)和AMPA(phnO)。此类选择标记的例子被描述于美国专利5,550318、5,633,435、5,780,708和6,118,047中。提供对转化体进行可视鉴定的筛选标记也可使用，例如，表达有色或荧光蛋白(例如，萤光素酶或绿色荧光蛋白(GFP))的基因或者表达beta-葡糖苷酸酶的基因或uidA基因(GUS)，已知其有多种发色底物。
优选的植物转化载体包括来自Agrobacterium tumrfaciens的Ti质粒(例如，美国专利号4,536,475、4,693,977、4,886,937、5,501,967和EP 0 122 791)。Agrobacterium rhizogens质粒(或“Ri”)也可使用，它们是本领域已知的。其它优选的植物转化载体包括Herrera-Estrella(1983，Nature 303：209-213)、Bevan(1983，Nature 304：184-187)、Klee(1985，Bio/Technol.3：637-642和EP 0 120516所公开的那些。
用于通过向植物基因组中引入重组DNA构建体来转化植物的方法和组合物包括大量本领域已知方法中的任何方法。用于构建经过转化的植物的一种方法是微注射轰击法，如美国专利5,015,580、5,550,318、5,538,880、6,153,812、6,160,208、6,288,312和6,399,861所述。用于构建经转化植物的另一种方法是Agrobacterium介导的转化，如美国专利5,159,135、5,824,877、5,591,616和6,384,301所述。或者，可以使用其它非Agrobacterium物种，例如，Rhizobium和展示出下述能力的其它原核细胞，它们能感染植物细胞，将异源核苷酸序列引入受感染的植物细胞的基因组。
可通过本领域技术人员公知的多种传统转化技术，将本发明的DNA构建体引入目标植物。就Agrobacterium介导的转化的目的而言，合适的植物转化载体包括从Agrobacterium tumrfaciens的Ti质粒获得的载体。除Agrobacterium介导的植物转化载体之外，其它方法也可被用于将本发明的DNA构建体插入到植物细胞中。此类方法可以包括但不限于，例如，使用脂质体，电穿孔，增加游离DNA的吸收，通过微注射轰击进行游离DNA的运送以及使用病毒或花粉来进行转化。
可通过永久或临时手段，将本发明的经过分离的核酸中的任何核酸，组合其它遗传元件，例如启动子、内含子、增强子和非翻译引导序列等引入到植物细胞中。可制造编码鞘翅类物种RNA，或来自钻孔式和吸吮式昆虫物种的RNA，或者优选地D.v.virgifera RNA或LygusHesperus RNA的任何核酸分子，并通过允许在植物细胞中产生dsRNA分子的手段将其引入植物细胞，在目标有害昆虫的膳食中提供杀昆虫量的一种或多种特定dsRNA。
术语“转基因植物细胞”或“转基因植物”指，含有外源核酸的植物细胞或植物，所述外源核酸可从WCR获得，或从不同昆虫物种或任何其它非昆虫物种获得。转基因植物还用来包含此类转基因任何世代的后代(子孙(decedent)、后裔等)，或者所有此类转基因植物的任何世代的种子，其中，包含编码本发明的RNA、sRNA、dsRNA、siRNA或其片段的DNA序列的所述后代或种子也是本发明的重要方面。
典型地，使用Agrobacterium转化方法形成的转基因植物含有插入到一条染色体中的单一简单重组DNA序列，其被称为转基因事件。此类转基因植物可被称为：关于插入的外源序列，杂合的。对于转基因体来说纯合的转基因植物可以通过下述方法获得：将含有单一外源基因序列的独立分离(independent segregant)转基因植物，例如，F0植物，与其自身进行有性交配(自交)，以产生F1种子。产生的F1种子中的四分之一将是对于转基因体来说杂合的。使F1种子发芽，就产生了可被杂合性检验的植物，典型地，使用SNP试验或热扩增试验来进行，所述试验允许杂合体和纯合体之间的区别(即，接合性试验)。将杂合植物与其自身或另一种杂合植物杂交，仅产生杂合后代。
除了用重组DNA构建体对植物进行直接转化之外，可通过将具有重组DNA构建体的第一种植物与缺乏该构建体的第二种植物杂交来制备转基因植物。例如，用于基因遏制的重组DNA可被引入到第一种植物品系中，所述品系可受转化的影响，产生可与第二种植物品系杂交的转基因植物，以将用于基因遏制的重组DNA渗入到第二种植物品系中。
可通过实践本发明来制造的转基因植物，包括但不限于，紫花苜蓿、莳萝、苹果、杏、朝鲜蓟、芝麻菜、芦笋、鳄梨、香蕉、大麦、豆、甜菜(beet)、黑莓、蓝莓、椰菜、抱子甘蓝、卷心菜、芥菜、香瓜、胡萝卜、木薯、花椰菜、芹菜、樱桃、芫荽、柑橘、克莱门氏小柑橘、咖啡、玉米、棉花、黄瓜、花旗松、茄子、苦苣、宽叶莴苣、桉树、茴香、无花果、葫芦、葡萄、柚子、哈密瓜、豆薯、奇异果、莴苣、韭菜、柠檬、酸橙、火炬松、芒果、瓜、蘑菇、坚果、燕麦、黄秋葵、洋葱、桔、装饰用植物、木瓜、欧芹、豌豆、桃、花生、梨、胡椒、柿、松树、菠萝、大蕉、李、石榴、白杨、马铃薯、南瓜(pumpkin)、温柏、辐射松、菊苣、萝卜、覆盆子、水稻、裸麦、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜(squash)、草莓、甜菜(sugarbeet)、甘蔗、向日葵、红薯、苏合香、蜜柑、茶、烟草、番茄、草皮、蔓生植物、西瓜、小麦、薯蓣以及小胡瓜植物。
在实践中，本发明可与植物中的其它昆虫控制性状组合，以获得想要的用于增加对昆虫侵袭的控制的性状。将利用不同作用模式的昆虫控制及组合，可以提供针对昆虫进行保护的转基因植物，其较之使用单一昆虫控制性状的植物具有出众的持久稳定性，因为在田间发展出抗性的概率降低。
过去数十年中，已对B.thuringiensis晶体蛋白的杀昆虫机制进行了广泛的研究。已经显示，仅在摄取蛋白之后，蛋白晶体蛋白才会对昆虫的幼虫形式有毒。在鳞翅类幼虫中，昆虫中肠中的碱性pH和蛋白水解酶会溶解蛋白，由此使得对昆虫有毒的组分释放。这些毒性组分破坏中肠细胞，导致昆虫停止进食，并且最终，致使昆虫死亡。就此原因而言，已经证实了B.thuringiensis毒素自身在处理多种有害昆虫的过程中是有效的，并且是对环境安全的杀昆虫剂。鞘翅类和半翅类昆虫，以及很可能地，双翅类、草盲蝽和其它钻孔式和吸吮式昆虫展示出了微酸的肠道pH，所以有效于抵挡鳞翅类幼虫的Bt毒素对上述有害生物不起作用。这些昆虫微酸的肠道pH也被相信是对本发明的组合物更为友善的，在不欲限制到特定理论的情况下，看起来，鳞翅类幼虫肠道的碱性pH是之前企图展示dsRNA效果的企图失败的原因(Fire et al.美国专利号6,506,559；Mesa et al.专利公开号US2003/0150017；Rajagopal et al.，2002，J.Biol.Chem.277：46849-46851；Tabara et al.，1998，Science 282：430-431)。因此我们相信，本文公开的dsRNA方法应当优先用于控制鞘翅类、双翅类、半翅类、草盲蝽、钻孔式和吸吮式昆虫的植物和组合物中。本文示出的方法和组合物特别有用于针对遏制来靶向下述昆虫中的基因，所述昆虫展示出大约4.5至大约9.5、大约5.0至大约9.0、大约5.5至大约8.5、大约6.0至大约8.0、大约6.5至大约7.7、或大约6.8至大约7.6、或大约7.0的肠道pH。但是，展示出大约7.5至大约11.5，或大约8.0至大约11.0，或大约9.0至大约10.0的肠道pH的昆虫和其它有害生物物种，例如鳞翅类昆虫幼虫，也落入本发明的范围内。当在幼虫膳食中与一种或多种Bt蛋白一起提供特异于抑制鳞翅类幼虫基因的dsRNA时，这尤其正确，当以阈值或高于阈值的水平提供时，Bt蛋白会按照常规途径对该鳞翅类幼虫产生毒性。对于同种昆虫物种具有毒性的一种或多种Bt毒素的存在，将有效降低肠道pH，提供针对双链RNA分子的稳定环境，以施加它们对有害昆虫目标基因的遏制作用。
将一种或多种本发明的产生dsRNA分子的经过稳定的dsRNA构建体在目标有害昆虫的膳食中与一种或多种杀昆虫蛋白组合，使得dsRNA与杀昆虫蛋白对同样的有害昆虫有毒性将是有用的。杀昆虫蛋白可以从B.thuringiensis获得，也可以从本领域已知的能产生杀昆虫蛋白的其它生物获得，例如，昆虫病原线虫的细菌共生体(例如，Photorhabdus sp.、Xenorhabdus sp.)、Serratia entomophila和相关的Serratia sp.、B.sphaericus、B.cereus、B.laterosporus、B.popilliae、Clostridium bifermentans和能展示出杀昆虫性质的其它形成孢子的革兰氏阳性细菌。类似地，还提出，产生本发明的dsRNA分子的两种或多种不同的经过稳定的dsRNA构建体可以一起提供于单种植物中，以确保昆虫控制表型的持久稳定性。这些dsRNA分子能靶向同样的基因用于沉默，或者，靶向不同的基因用于沉默。两种或多种不同dsRNA可在同样的植物中组合，每种dsRNA对不同的有害昆虫具有毒性，没有哪种dsRNA对同样的昆虫物种有毒性。
可以预见到，某些经过稳定的dsRNA构建体与一种或多种昆虫控制蛋白基因的组合将产生协同作用，能增强转基因植物的昆虫控制表型。利用人工膳食或整个植物组织进行的昆虫生物试验可用于确定使用dsRNA和昆虫控制蛋白时关于幼虫死亡或生长抑制的剂量应答。本领域技术人员可在生物试验中对dsRNA分子和昆虫蛋白的混合物加以检验，以鉴定出活性组合，所述组合是针对昆虫保护植物中的应用(deployment)有协同性的并且是人们想要的(Tabashnik，1992)。已经报道了不同的昆虫控制蛋白之间杀死有害昆虫的协同性(综述参见Schnepf et al.，1998)。可以预见到，在某些dsRNA之间和某些dsRNA和某些昆虫控制蛋白之间存在有协同性。
可以预见到，dsRNA的组合将揭示针对某些有害昆虫的意想不到的毒性。Rajagopol et al(2002，J Biol Chem.277：46849-46851)报道，将dsRNA喂饲给鳞翅类有害生物S.litura的幼虫，对于让编码中肠氨基肽酶的基因沉默来说是没有作用的。值得一提的是，典型鳞翅类中肠的碱性pH环境对于dsRNA来说是友善的环境，因为RNA二体在碱性pH下的变性将被期望能导致迅速的降解。插入到中肠上皮膜中的B.thuringiensis毒素蛋白形成的孔，导致了中肠pH的中和(综述见Gill，1995，Mem.Inst.Osaldo Cruz，Rio de Janeiro，90：69-74)。因此，仅能在鳞翅类中肠上皮膜中形成暂时的离子通道而不会导致死亡的B.thuringiensis毒素足以将中肠pH降低至更有利于通过中肠上皮细胞吸收dsRNA的水平。作为例子，已知Cry1Ac蛋白针对甜菜行军虫，Spodoptera exigua不是有效的毒素(Chambers et al，1991，J.Bacteriol.173：3966-3976)。但是，Cry1Ac蛋白导致的中肠pH的暂时降低将有用于稳定共摄取的dsRNA，使它们有用于沉默S.exigua的目标基因，由此提供意想不到的控制这种有害昆虫的手段。采用能扰乱鳞翅类昆虫中肠细胞离子调控的任何蛋白，无论其是否能杀昆虫，都可以观察到该效果，这对鞘翅类、双翅类、半翅类、草盲蝽和其它钻孔式和吸吮式有害昆虫等也是有用的。
来自B.thuringiensis的一些杀昆虫蛋白，例如Cyt蛋白，可以导致敏感昆虫幼虫中肠上皮膜的暂时开口，这是由于结构性孔的形成或者由于蛋白的普遍性类去垢剂活性造成的(Butko，2003，Appl.Environ.Microbiol.69：2415-2422)。此类开口甚至能在对导致死亡来说次优化的蛋白浓度下协助dsRNA分子穿过中肠上皮细胞。可以预见到，能导致昆虫上皮膜中暂时开口的任何蛋白，无论是否能杀昆虫，都能协助dsRNA分子进入昆虫细胞，促进细胞沉默。
序列表中所示的SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：143或SEQ IDNO：169至SEQ ID NO：174中提供的核苷酸序列或其片段或其互补序列，可被“提供”于多种培养基中，以协助使用。此类培养基还可提供其亚组，该亚组的形式允许本领域技术人员对序列进行检查。
含有一种或多种本发明序列的农产品制品，以及从含有一种或多种本发明核苷酸序列的重组植物或种子制造的农产品制品作为本发明的实施方式被特别包括。含有一种或多种本发明序列的农产品制品包括但不限于，肉、油、碾碎的或整个的谷粒或植物种子，或者包含任何肉、油、下述碾碎的或整个的谷粒的任何食物产品，所述谷粒是含有一种或多种本发明的序列的重组植物或种子的。在本文包括的一种或多种农产品或农产品制品中对本发明的一种或多种序列的探测用事实证明，农产品或农产品制品由转基因植物构成，所述转基因植物被设计为能表达本发明的一种或多种核苷酸序列，用于通过使用dsRNA介导的基因遏制方法来控制昆虫侵袭的目的。
在本实施方式的一种应用中，本发明的核苷酸序列可被记录到计算机可读介质上。本文中使用的“计算机可读介质”指：切实存在的、可通过计算机直接阅读和访问的表达介质。此类介质包括但不限于：磁性存储介质，例如软盘，硬盘，存储介质和磁带；光学存储介质，例如CD-ROM；电子存储介质，例如RAM和ROM；光学字符识别格式的计算机文档，以及上述种类的杂交体，例如，磁性/光学存储介质。本领域技术人员可以容易地认识到，目前任何已知的计算机可读介质可被用于制造下述产品，所述产品包含记录于计算机可读介质上的本发明的核苷酸序列。
本文中使用的“记录”指，用于在计算机可读介质上存贮信息的方法。本领域技术人员可以容易地采用任何目前已知的方法来在计算机可读介质上记录信息，以产生包含本发明核苷酸序列信息的介质。对于本领域技术人员来说，多种不同的数据存储结构是可获得的，用于制造在其上记录本发明核苷酸序列的计算机可读介质。对数据存储介质的选择通常将基于选用来访问被存储信息的手段。此外，多种不同的数据处理器程序和格式可用于将本发明核苷酸序列存储到计算机可读介质上。序列信息可展示于字处理文本文档中，以可通过商业途径获得的软件，例如WordPerfect和Microsoft Word对其进行格式化，或者其可展示为ASCII文本文档的形式，存储于数据库应用中，例如DB2、Sybase、Oracle等。本领域技术人员可以容易得采用任何数量的数据处理器结构化格式(例如，文本文档或数据库)，以获得在其上记录有本发明核苷酸序列信息的计算机可读介质。
允许本领域技术人员访问计算机可读介质中提供的序列信息的计算机软件是公众可获得的。在Sybase系统上执行BLAST(Altschul et al.，J.Mol.Biol.215：403-410(1990))和BLAZE(Brutlag，et al，Comp.Chem.17：203-207(1993))搜索算法的软件可被用于鉴定序列中的开放阅读框(ORF)，例如，本文提供的、含有与来自其它生物的ORF或蛋白质的同源性的Unigene和EST。此类ORF是本发明序列中编码蛋白质的片段，可用于生产商业上重要的蛋白质，例如，用于氨基酸合成、代谢、转录、翻译、RNA加工、核酸和蛋白降解、蛋白质修饰和DNA复制、限制、修饰、重组和修复的酶。
本发明还提供了含有本文所述的序列信息的系统，特别地，基于计算机的系统。此类系统被设计为：能鉴定出本发明的核酸分子中的商业上重要的片段。本文中使用的“基于计算机的系统”指用于分析本发明核苷酸信息的硬件设备、软件设备和数据存储设备。本发明的基于计算机的系统的最小限度硬件设备包含中央处理器单元(CPU)、输入设备、输出设备和数据存储设备。本领域技术人员可以容易地指导，目前可获得的基于计算机的系统中任何一种都适合用于本发明。
目标序列的最优选长度为大约10至大约100个氨基酸，或大约23至大约300个核苷酸残基。
本文中使用的“目标结构基元(motif)”或“目标基元”指，合理选出的任何序列或序列组合，其中，基于目标基元折叠时形成的三维构型来选择一种或多种序列。本领域已知多种目标基元。蛋白质目标基元包括但不限于，酶活性位点和信号序列。核酸目标基元包括但不限于，启动子序列、顺式作用元件、发卡结构以及诱导型表达元件(蛋白结合序列)。
实施例
发明人在本文中鉴定了用于控制无脊椎有害生物侵袭的方法，这是通过在有害生物膳食中提供双链核糖核酸分子来进行的。令人吃惊地，发明人已经揭示，在被有害生物摄取时，双链核糖核酸分子会发挥作用，抑制有害生物的生物功能，导致下述特征中的一种或多种：有害生物进食减少，有害生物存活率降低，有害生物死亡，有害生物的分化和发育被抑制，有害生物的有性繁殖能力的降低或消失，肌肉形成，保幼激素的形成，保幼激素的调控，离子调控和转运，细胞膜势的保持，氨基酸生物合成，氨基酸降解，精子形成，信息素的合成，信息素传感，天线蛋白的形成，翅膀形成，腿的形成、发育和分化，卵的形成、幼虫成熟、消化性酶的形成、血淋巴的合成、血淋巴的保持、神经传递、细胞分裂、能量代谢、呼吸和凋亡，以及真核细胞细胞骨架结构的任何组分，例如，激动蛋白和微管蛋白。这些特性中任何一种或任何组合可以导致对有害生物侵袭的有效抑制，在对植物有害的生物的情况下，对植物侵袭的抑制。例如，当用作为以局部方式提供给植物的、含有足以抑制有害生物的量的一种或多种双链核糖核酸分子的膳食组合物时，用作为种子处理，作为植物周围的土壤应用，或者通过植物从植物细胞内存在的重组DNA分子来生产时，对植物有害的生物侵袭会出人意料地戏剧性地降低。当应用于单种有害生物时，本文示出的实施例用于阐述本发明。但是，本领域技术人员将认识到，实施例中的方法、配方和想法不作限制之用，其可用于可以消耗下述食物来源的所有无脊椎有害生物物种，以遏制与有害生物相关或在其内部发挥作用的一些重要特征，所述食物来源是可被配方为含有足够量的有害生物抑制剂的，其由至少一种或多种双链RNA分子构成。
实施例1
本实施例描述了对下述核苷酸序列的鉴定，所述核苷酸序列以双链RNA分子的形式提供于玉米根虫膳食中时，有用于控制玉米根虫。
从整个幼虫以及从切开的中肠切段来构建玉米根虫cDNA文库(LIB 149，LIB 150，LD33027，LIB3373)，获得核苷酸序列信息(见，Andersen et al.，提交于2002年7月24日的美国专利申请序列号10/205,189，其整体通过引用被特别并入本文)。此外，从处于不同发育阶段以及每个发育阶段中不同时间的整个幼虫，来构建cDNA文库，以最大化来自Diabrotica物种的不同EST序列的数量。分别由从第一龄(1克)和第三龄(2.9克)的Western玉米根虫幼虫获得的mRNA库构建出文库LIB5444和LIB5462。通过插入到液氮中，将得到的昆虫迅速冷冻。在保持于-20℃的研钵和碾槌中对磨碎昆虫，温度保持是通过在干冰上冷藏和/或向研钵中加入液氮直到组织被磨碎为细粉来实现的。使用试剂(Invitrogen)，按照厂商说明书，提取RNA。使用Dynabeads Oligo dT(Dynal Inc.，NY)，按照厂商说明书，从总RNA制剂中分离出Poly A+RNA。使用SuperScriptTM Plasmid System(Invitrogen)从Poly A+RNA来构建cDNA文库。使用色谱对cDNA进行尺寸分离。第四级和第五级片断被收集，并被连接进pSPORT1载体(Life Technologies Ind.，Gaithersburg MD)的Sal1和Not1限制性内切酶识别位点之间，通过电穿孔转化进E. coli DH10B电感受态细胞。第一龄幼虫文库产生了大约420,000个菌落形成单元。第三龄幼虫文库产生了大约2.78 x 106个菌落形成单元。从平板上洗下来自LIB149、LIB150的菌落，通过简单震荡均匀混合，再倒进Tris-EDTA缓冲液。洗下来的物质中的一半被装入10％的甘油，分装进冷冻小管，贮存于-70℃。另一半被用于用Quiagen微量纯化柱或其等价品来产生质粒DNA。将经过纯化的质粒DNA分装进微离心管，贮存于-20℃。
在高粘度培养基中个别扩增来自Diabrotica virgifera cDNA文库LIB5444和LIB5462的菌落。37℃下，500ml LB培养基(含有0.3％SeaPrep琼脂糖和50mg/l羧苄青霉素)中单独放置的搅拌平板中，混合来自LIB5444的大约200,000个菌落形成单元和来自LIB5462的600,000个菌落形成单元，然后在水/冰浴中迅速冷却1小时，使得细菌菌落均匀悬浮。然后在30℃对经过接种的文库培养42小时。温育之后，在搅拌平板上对细胞进行5分钟的混合。然后将培养基转移到两个250ml的离心瓶中。在10,000 x g处理10分钟，沉淀细菌细胞。从瓶中移出培养基，将细胞重新悬浮于总共20ml的LB培养基中，其中含有50mg/l的羧苄青霉素。加入二甲亚砜至10％，以将细胞保持为冷冻状态。对两种文库进行扩增，至每毫升108个菌落形成单元的最终效价。组合Diabrotica virgifera cDNA文库LIB5444和LIB5462的样品，在经过灭菌蒸馏和去离子的水中，将其调节为每微升大约1.25微克的DNA浓度，分装进25个冷冻小管，每个冷冻小管含有大约8.75微克的DNA。申请人/发明人于2004年6月10日将这些样品保藏到位于10801University Boulevard，Manassas，Virginia USA ZIP 20110-2209的American Type Culture Colleciton(ATCC)，其被称为LIB5444/62。ATCC向申请人提供了保藏收据，其指定ATCC保藏号为PTA-6072。
基本按照上文所述的用于产生玉米根虫cDNA文库的方法，制备玉米根虫高分子量cDNA文库，即LIB5496和LIB5498。分别从由第一龄(1克)和第三龄(1克)Western玉米根虫幼虫获得的mRNA库来构建文库LIB5496和LIB5498。简言之，在液氮中迅速冷冻昆虫，通过在研钵和碾槌中进行碾磨，将冷冻的昆虫变为细粉。使用试剂(Invitrogen)，按照厂商说明书，提取RNA。使用Dynabeads OligodT(Dynal Inc.，NY)，按照厂商说明书，从总RNA制剂中分离出PolyA+RNA。使用SuperScriptTMPlasmid System(Invitrogen)从20微克的Poly A+RNA来构建高分子量cDNA文库。在TAE中的1％琼脂糖凝胶上，对cDNA进行尺寸分离。收集1Kb至10Kb范围内的cDNA，将其连接进pSPORT1载体的Sal1和Not1限制性位点之间，通过电穿孔转化进E.coli DH10B电感受态细胞。LIB5496产生了大约3.5x106个菌落形成单元。LIB5498产生了大约1.0x106个菌落形成单元。在高粘度培养基中个别扩增来自玉米根虫高分子量cDNA文库LIB5496和LIB5498的菌落。37℃下，500ml LB培养基(含有0.3％SeaPrep琼脂糖和50mg/l羧苄青霉素)中单独放置的搅拌平板中，混合来自LIB5496和LIB5498的大约600,000个菌落形成单元，然后在水/冰浴中迅速冷却1小时，使得细菌菌落均匀悬浮。然后在30℃对经过接种的文库培养42小时。温育之后，在搅拌平板上对细胞进行5分钟的混合。然后将培养基转移到两个250ml的离心瓶中。在10,000x g处理10分钟，沉淀细菌细胞。从瓶中移出培养基，将细胞重新悬浮于总共20ml的LB培养基中，其中含有50mg/l的羧苄青霉素。加入二甲亚砜至10％，以将细胞保持为冷冻状态。对两种文库进行扩增，至每毫升108个菌落形成单元的最终效价。从玉米根虫物种特异性质粒文库获得插入的cDNA序列信息。
Andersen et al.玉米根虫文库以及来自LIB5444和LIB5462文库的额外序列最初产生来大约18,415条单独的EST序列，其由大约1.0x107个核苷酸残基构成。EST序列的平均长度为大约586个核苷酸残基。这些EST序列被用于生物信息学算法，得到了重叠群(contig)序列的装配，这在本文中被称为UNIGENE序列，不能通过重叠相同性与其它EST序列装配的个体EST序列在本文中被称为单态(singleton)。然后对LIB5444和LIB5462文库进行更为深度的测序，得到额外的个体EST序列。将从文库，即LIB149、LIB150、LIB3027、LIB3373、LIB5444、LIB5462、LIB5496和LIB5503获得的EST序列展示于序列表中，从SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：143以及SEQ ID NO：169至SEQ ID NO：174。
如果可能的话，将从CRW cDNA文库分离得到的EST序列装配为UNIGENE组，这些装配的Unigene序列被展示于序列表中。UNIGENE是定位基因的簇，其形成自单个EST序列载序列相同性区域内的重叠，以形成更大的序列。对序列表中示出的每条核苷酸序列加以分析，鉴定出开放阅读框的存在。将从开放阅读框推断出的氨基酸序列信息与可从公共数据库获得的已知氨基酸序列信息比较，以推断出氨基酸序列与这些已知氨基酸序列相同性或相似性的程度。如果有的话，用与公共数据库中已知氨基酸序列相关的生物功能，给从cDNA文库核苷酸序列信息推断出的氨基酸序列加上下述注释。注释提供了暗示性的蛋白质(可能从给出特定cDNA序列的特定基因表达的)功能信息，但是这并非决定性的结果。基于暗示性的注释信息，某些cDNA序列被鉴定为：编码可能涉及玉米根虫细胞中一些生物学功能的蛋白，所述功能对生命来说是很重要的，或者对确保细胞的健康和存活来说是必要的，或者可能涉及细胞完整、细胞保持、繁殖能力等。
从可能编码蛋白的该cDNA序列亚组分离出若干条cDNA序列，对它们的抑制可能导致CRW或其它无脊椎生物物种细胞的发病或死亡。然后将这些序列用于构建双链RNA分子，包括进CRW膳食。
基于CRW cDNA文库中报道的cDNA序列来设计热扩增引物对。引物对或者被构建为一对核苷酸序列，引物对的每个成员都展示出与正义或反义序列的完全互补性。构建一些引物对序列，使得该对中的每个成员展示出在其5’端含有T7噬菌体RNA聚合酶启动子的序列，如例如SEQ ID NO：5中核苷酸位点1至核苷酸位点23所示。优选地，使用基因组DNA作为模板，用缺少T7启动子的第一种引物对进行高保真第一次扩增，产生第一扩增子。优选地，cDNA或mRNA序列被用作为模板，用于合成本发明中使用的dsRNA分子，因为本领域中真核生物基因组序列被认为含有成熟RNA分子中不存在的序列。然后将从高保真第一次扩增反应产生的第一扩增子样品在第二次热扩增反应中用作为模板，用含有T7启动子序列的第二对引物对来生产第二扩增子，其中，在第二扩增子的每条链的5’末端处含有或其中嵌有T7启动子。以两个方向获得第二扩增子的完整核苷酸序列，将其与针对cDNA报道的核苷酸序列进行比较，如果存在的话，指出两条序列之间的差异。通常，使用基因组DNA作为模板制备的序列与用于获得显著水平遏制的作为dsRNA分子的进一步使用并不一致，因为有在mRNA或cDNA序列中不存在的基因组序列的变异。
典型地，体外转录反应含有大约1至大约2微克的线性化DNA模板，来自10X浓缩液的T7聚合酶反应缓冲液，核糖核苷酸ATP、CTP、GTP和UTP(其中浓度为每种50至100mM)以及1个单位的T7 RNA聚合酶。按照厂商说明书，在大约37℃温育一段时间(数分钟至数小时)进行RNA聚合酶反应，这取决于所用的RNA聚合酶。通常，反应进行大约2至大约6小时，用于转录最长长达大约400个核苷酸的模板序列，以及进行长达20小时，用于转录长度大于大约400个核苷酸的模板序列。将反应加热至65℃，15分钟，以终止RNA转录。在乙醇中沉淀RNA转录产物，洗，空气干燥，将其重新悬浮于不含RNAse的水中，至浓度为每毫升大约1微克。利用反向T7启动子策略(如上文所概述的)的大部分转录本在体内转录反应中产生了双链RNA，但是，通过将经过纯化的RNA加热至65℃，然后缓慢冷却至室温以确保正义和反义RNA片断的正确退火才获得了高产量的双链RNA。然后用DNAse I和RNAse在37℃对双链RNA产物进行一小时的温育，以去除混合物中存在的任何DNA或单链RNA。按照厂商说明书(AMBION MEGASCRIPT RNAi KIT)，在柱子上纯化双链RNA产物，将其重新悬浮于10mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)或不含RNAse的水中，至每微升0.1至1.0微克的浓度。
将双链RNA样品直接加入到含有上文指出的昆虫膳食的每个孔中，或者在加入到昆虫膳食之前对其进行修饰。对双链RNA的修饰按照厂商提供的针对RNAse III(AMBION CORPORATION，Austin，Texas)或DICER(STRATAGENE，La Jolla，California)的说明书来进行。RNAse III对双链RNA的消化产生了二十一和二十二个核苷酸的二体，其含有5’磷酸化末端和具有2-3个碱基悬挂的3’羟基末端，类似于大约21-26个碱基对的二体短干扰RNA(siRNA)片段，这是Hamilton et.al.(Science，1999，286：950-952)和Elbashir et.al.(Genes&Development，2001，15：188-200)鉴定的、真核途径中的dicer酶制造的。对这种收集到的短干扰RNA二体进行进一步纯化，用聚丙烯酰胺凝胶电泳对样品进行分析，以测定二体形成的完整性和效率。然后在250纳米的波长下通过分光光度法来测定样品的纯度和数量，未使用的样品贮存于-20℃，用于进一步使用。
siRNA或全长双链RNA(dsRNA)的样品被用于进行用选定数量的目标有害生物进行的生物试验。根据下述流程，将dsRNA或siRNA的不同剂量作为重叠应用到玉米根虫人工膳食上。从CropCharacteristics，Inc.，Farmington，Minnesota获得Diabrotica virgiferavirgifera(WCR)的卵。在土壤中，于24℃，60％的相对湿度，完全黑暗下，对非休眠期的WCR卵进行大约13天的培养。在第13天，将含有WCR卵的土壤放置到#30和#60目之间的筛中，使用高压花园水管洗去土壤。通过在LYSOL中泡三分钟对卵的表面进行杀虫(disinfest)，用灭菌水洗三次，用10％的福尔马林溶液洗一次，再用灭菌水洗额外的三次。将用这种方法处理的卵悬浮到灭菌咖啡过滤器中，在27℃，60％的相对湿度，完全黑暗下，孵化过夜。
基本按照Pleau et al.(Entomologia Experimentalis et Applicata，2002，105：1-11)所述来制造昆虫膳食，其中做出了如下改动。将9.4克的SERVA琼脂悬浮进540毫升经过纯化的水中，搅拌直至琼脂完全分散。将水/琼脂混合加热至沸，以完全溶解琼脂，然后倾倒进WARING掺合机。将掺合机保持为低速，此时将62.7克BIO-SERV DIET混合物(F9757)、3.75克冻干的玉米根部、1.25毫升绿色食用颜料以及0.6毫升福尔马林加入到热的琼脂混合物中。然后通过加入10％的氢氧化钾贮液将混合物pH调节为9.0。在磁性搅拌热平板上，用使用灭菌NALGENE涂布的磁性搅棒，以高速对大约600毫升体积的液体膳食继续加以混合，将其保持为大约48℃至大约60℃，并将其分散为FALCOM 96孔圆底微滴定板每个孔中的200微升小份。在灭菌的生物抽风橱(biohood)中令平板中的膳食凝固及空气干燥。
使用连发型微量移液器，取三十(30)微升体积的试验样品，其中含有不同数量的控制试剂或者双链RNA，将其覆盖到每个孔中的昆虫膳食表面。在应用试验样品之后，昆虫膳食被允许在灭菌的生物抽风橱中保持长达一个半小时(one half hour)，以使试剂扩散进膳食，以及允许膳食表面干燥。用画刷向每个孔中放入一只WCR新生幼虫。然后用MYLAR密封平板，用昆虫针来通风。针对每种剂量，对12-72只昆虫幼虫进行试验，数量取决于试验设计。在27℃，60％的相对湿度和完全黑暗下对生物试验平板进行12-14天的培养。在12-14天的时间点，对每种剂量下存活幼虫的数量加以记录。使用合适的微量天平，针对每只存活的幼虫，测定幼虫质量。使用统计软件(SASInstitue，1995)来分析数据，用Dunnet’s检验来进行完全阶乘ANOVA，以较之未处理对照来寻找处理的效果(P＜0.05)。进行Tukey-Kramer事后(post hoc)检验，来比较所有的处理对(P＜0.05)。
下述核苷酸序列最初作为在玉米根虫中肠cDNA文库中鉴定出的cDNA序列被获得(Andersen et al.，同上)，将其用于构建双链RNA分子，用于检验通过在有害生物膳食中喂饲双链RNA分子对有害生物生物功能的抑制效果。
Chd3同源序列
在多种真核生物中鉴定出来的CHD基因，其对应的蛋白被认为作为染色质重构因子发挥作用。术语CHD来自CHD蛋白中发现的三种序列同源性结构域：chromo(染色体组织修饰者)结构域、SNF2-相关螺旋霉/ATPase结构域以及DNA结合结构域，每种都被相信能赋予不同的染色质相关活性。基于另一种序列同源性结构域(PHD锌指结构域，典型地，与染色体相关活性相关)的是否存在，CHD蛋白被分为两类。CHD3相关蛋白具有PHD锌指结构域，但是CHD1相关蛋白则不。实验观察暗示了CHD3蛋白在遏制转录中的作用，其在一些物种中已被显示为含有组蛋白作为亚基的复合体的成分。组蛋白的去乙酰化与转录失活相关，所以CHD3蛋白已被暗示为：利用作为组氨酸去乙酰酶复合体的成分的性质，能作为转录遏制剂发挥作用(Ogas et al.，1999，PNAS 96：13839-13844)。因此，对CHD3蛋白合成的遏制可以作为有用的目标，针对用双链RNA介导的对无脊椎有害生物的抑制。
SEQ ID NO：4对应CRW中肠cDNA核苷酸序列，其氨基酸序列翻译被注释为：与Drosophila melanogaster CHD3氨基酸序列(GenBank编号AF007780)同源。SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：40609分别对应于：正向和反向的基因组扩增引物(即引物对)，所述引物用于产生来自CRW基因组DNA、来自CRW mRNA库或来自从此类库产生的cDNA的扩增子。此类扩增子的序列对应于编码D.melanogasterCHD3氨基酸序列同源体的CRW基因的一部分。SEQ ID NO：5在其5’端含有T7聚合酶启动子序列(核苷酸1-23)，所述启动子序列与SEQ ID NO：5中24-45位核苷酸示出的CRW基因组引物序列(强制性地指定为正向引物序列)相连，其对应于SEQ ID NO：4示出的第31至第52位核苷酸。SEQ ID NO：6在其5’端含有T7聚合酶启动子序列，如1-23位核苷酸所示。T7启动子序列在其3’端与强制性指定的反向基因组引物序列相连，其对应于SEQ ID NO：6中示出的24-44位核苷酸，所述序列的反向互补序列示于SEQ ID NO：4中第298-319位核苷酸。在用CRW基因组DNA作为模板的扩增反应中，使用由SEQID NO：5和SEQ ID NO：6组成的引物对，产生包含SEQ ID NO：7中所示的核苷酸序列的335个碱基对的扩增子，其对应于CRW基因组中编码下述蛋白的部分，所述蛋白展示出与Drosophila melanogasterCHD3氨基酸序列大约66％的相同性。SEQ ID NO：7中示出的第1-23位的核苷酸和第314-335位的核苷酸反向互补序列对应于扩增子任意末端的T7启动子序列。SEQ ID NO：7中第24位核苷酸至第313位核苷酸示出的扩增得到的基因组核苷酸实质上对应于SEQ ID NO：4中第31位核苷酸至第319位核苷酸示出的被报道的cDNA核苷酸序列，只是除了以下区别：SEQ ID NO：4中第63、87、117、177、198、213、219-220、246、249和261位的核苷酸被报道为分别是T、T、G、G、G、T、T、T、C、C和A，而与SEQ ID NO：7进行比对时的相应位置是在第56、80、110、170、191、206、212-213、239、242和254位核苷酸含有C、C、A、A、A、C、A、C、G、A和G。这种区别对应于以前报道的cDNA序列和从基因组DNA模板产生的扩增子序列之间核苷酸序列组合物中大约4％的区别，这与以前报道的cDNA序列可能小于99％的精确性一致(前述Andersen et al.)。
将展示出对应SEQ ID NO：7的序列的扩增子克隆进能在E coli中复制的质粒载体，回收足够量的质粒DNA，以允许从克隆片段任意末端的嵌入收敛(convergent)T7启动子进行体外的T7 RNA聚合酶转录。产生双链RNA，进行生物试验；一条RNA片断由SEQ ID NO：7中大约第24位核苷酸至少至大约第313位核苷酸所示的序列构成(不同之处在于，在SEQ ID NO：7中显示为胸腺嘧啶的每个位置存在尿嘧啶残基)，其它RNA片断是SEQ ID NO：7中大约第313位核苷酸至少至大约第24位核苷酸所示的核苷酸序列的实质反向互补序列，其中，尿嘧啶适当地取代胸腺嘧啶。用DICER或RNAse III去处理双链RNA(dsRNA)的样品，以产生足够量的小干扰RNA(siRNA)。将含有每百万siRNA或dsRNA 0.15部分的样品用于前文所述的CRW膳食生物试验，幼虫被允许进食13天。较之对照，进食含有dsRNA的膳食的CRW幼虫展示出了显而易见的生长抑制和死亡率，所述dsRNA对应于SEQ ID NO：4中示出的序列的全部或部分。
在生物试验中，平行于CHD3序列，对从CRW获得的其它核苷酸序列也进行了检验，包括被注释为可能编码下述蛋白的CRW等价物的核苷酸序列，所述蛋白例如，beta-微管蛋白、40kDa V-ATPase亚基蛋白、延伸因子蛋白EF1α和EF1α48D、26S蛋白体亚基p28蛋白、保幼激素环氧化物水解酶蛋白、依赖膨胀的氯通道蛋白、葡糖-6-磷酸1-脱氢酶蛋白、肌动蛋白42A蛋白、ADP-核糖基化因子1蛋白、转录因子IIB、几丁质酶蛋白和泛素结合(conjugating)酶。
Beta-微管蛋白同源序列
微管蛋白是所有真核细胞中多种细胞内结构的重要结构性组分，主要用于形成微管。对细胞中微管形成的抑制会导致灾难性的效果，包括，对有丝分裂纺锤形成的干扰，对细胞分裂的妨碍等。因此，对微管蛋白形成的遏制可以是双链RNA介导的抑制的有用目标。
对从CRW获得的beta-微管蛋白相关序列进行了鉴定，以用于本发明。SEQ ID NO：18对应于CRW中肠cDNA核苷酸序列，其氨基酸序列翻译被注释为：与Manduca sexta beta-1-微管蛋白氨基酸序列部分同源，以及与Drosophila melanogaster beta-1-微管蛋白氨基酸序列(GenBank编号分别为AF030547和M20419)部分同源。SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20分别对应于正向和反向的基因组扩增引物(即引物对)，所述引物用于从CRW基因组DNA，从CRW mRNA库或从由此类库产生的cDNA来制造扩增子。此类扩增子的序列对应于编码beta-微管蛋白的CRW基因的全部或部分。SEQ ID NO：19和SEQ IDNO：20每个都含有23个核苷酸的T7启动子序列，分别在第1-23位核苷酸。SEQ ID NO：19中示出的第24-44位核苷酸对应于SEQ IDNO：18示出的第96-116位核苷酸。SEQ ID NO：20中示出的第24-44位核苷酸对应于SEQ ID：18中428-448位核苷酸示出的序列的反向互补序列。在用CRW基因组DNA作为模板的扩增反应中，使用由SEQID NO：19和SEQ ID NO：20组成的引物对，产生了包含SEQ ID NO：21中示出的核苷酸序列的339个碱基对的扩增子，其实质上对应于编码下述的CRW基因组的一部分，所述蛋白展示出了与Drosophilamelanogaster和Manduca sexta中存在的beta-微管蛋白同源物的高度相同性。SEQ ID NO：21中示出的核苷酸序列实质上对应于SEQ ID NO：18中96-448位核苷酸示出的核苷酸序列。在基因组扩增子序列和cDNA序列中的相应序列之间没有观察到序列差异。
将展示出对应于SEQ ID NO：21的序列的扩增子克隆进质粒载体，回收足够量的质粒DNA，以允许从克隆片段任意末端的嵌入收敛T7启动子进行体外的T7 RNA聚合酶转录。产生双链RNA，将样品进行生物试验；一条RNA片断，正义链，由SEQ ID NO：21中大约第24位核苷酸至少至大约第376位核苷酸所示的序列构成(不同之处在于，在SEQ ID NO：21中显示为胸腺嘧啶的每个位置存在尿嘧啶残基)，反向互补RNA片断，或反义链是SEQ ID NO：21中大约第376位核苷酸至少至大约第24位核苷酸所示的核苷酸序列的实质反向互补序列，其中，尿嘧啶适当地取代胸腺嘧啶。用DICER或RNAse III去处理双链RNA(dsRNA)的样品，以产生足够量的小干扰RNA(siRNA)。将含有每百万siRNA或dsRNA 0.15部分的样品用于前文所述的CRW膳食生物试验，幼虫被允许进食13天。较之对照，进食含有dsRNA的膳食的CRW幼虫展示出了显而易见的生长抑制和死亡率，所述dsRNA对应于SEQ ID NO：18中示出的序列的全部或部分。
40kDa V-ATPase同源序列
真核生物系统中亚细胞器官内的能量代谢是非常重要的功能。液泡ATP合酶参与在液泡内保持足够水平的ATP。因此，液泡ATP合酶可以是双链RNA介导的抑制的目标。
从CRW获得编码下述蛋白的核苷酸序列，所述蛋白展示出与40kDa V-ATPase的相似性。SEQ ID NO：32的氨基酸序列翻译展示出与Manduca sexta 40-kDa V-ATPase亚基氨基酸序列(GenBank编号X98825)的同源性。SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34分别对应于正向和反向的基因组扩增引物(即引物对)，所述引物用于从CRW基因组DNA，从CRW mRNA库或从由此类库产生的cDNA来制造扩增子。此类扩增子的序列应当对应于编码40kDa V-ATPase的CRW基因的全部或部分。但是，使用CRW基因组DNA作为模板获得的扩增子的核苷酸序列与SEQ ID NO：32示出的被报道的cDNA序列并不一致。
SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34代表热扩增的引物。每条引物都含有23个核苷酸的T7启动子序列，分别在第1-23位核苷酸。SEQ IDNO：33中示出的第24-40位核苷酸对应于SEQ ID NO：32示出的第95-111位核苷酸。SEQ ID NO：34中示出的第24-43位核苷酸对应于SEQ ID：32中362-381位核苷酸示出的序列的反向互补序列。在用CRW基因组DNA作为模板的扩增反应中，使用由SEQ ID NO：33和SEQ IDNO：34组成的引物对，产生了包含SEQ ID NO：35中示出的核苷酸序列的291个碱基对的扩增子。基于Martinez/Needleman-Wunsch DNA比对，SEQ ID NO：35中第24位核苷酸至第268位核苷酸仅展示出了与SEQ ID NO：32所示的核苷酸序列的大约50％的同源性。使用选用的热扩增引物对获得的扩增子序列与SEQ ID NO：32中示出的被报道的序列并不一致。优选地，使用CRW mRNA库或从此类库获得的cDNA来制造扩增子。
制造下述扩增子，所述扩增子展示出对应于SEQ ID NO：32中大约第95位核苷酸至大约第381位核苷酸的序列，将其克隆进质粒载体，回收足够量的质粒DNA，以允许从克隆片段任意末端的嵌入收敛T7启动子进行体外的T7 RNA聚合酶转录。产生双链RNA，将样品进行生物试验；一条RNA片断，正义链，由SEQ ID NO：32中大约第85位核苷酸至少至大约第381位核苷酸所示的序列构成(不同之处在于，在SEQ ID NO：32中显示为胸腺嘧啶的每个位置存在尿嘧啶残基)，反向互补RNA片断，或反义链是SEQ ID NO：32中大约第381位核苷酸至少至大约第95位核苷酸所示的核苷酸序列的实质反向互补序列，其中，尿嘧啶适当地取代胸腺嘧啶。用DICER或RNAse III去处理双链RNA(dsRNA)的样品，以产生足够量的小干扰RNA(siRNA)。将含有每百万siRNA或dsRNA 0.15部分的样品用于前文所述的CRW膳食生物试验，幼虫被允许进食13天。较之对照，进食含有dsRNA的膳食的CRW幼虫展示出了显而易见的生长抑制和死亡率，所述dsRNA对应于SEQ ID NO：32中示出的序列的全部或部分。
EF1α同源序列
转录延伸和转录因子对于代谢来说很重要，它们可以是用于双链RNA介导的抑制的有利目标。
鉴定出了至少两条CRW cDNA序列用于本发明，它们被与曾为能编码延伸因子1alpha(EF1α)的同源物。
如SEQ ID NO：36中所示的单态CRW cDNA序列的氨基酸翻译展示出了与Drosophila melanogaster EF-1-alpha氨基酸序列(GenBank编号X06870)的同源性。还从CRW cDNA中肠文库中鉴定出了被预测为编码EF1α同源蛋白的其它序列。比对这些序列，产生UNIGENE序列，如SEQ ID NO：40所示，其被预测为能编码在本文中被称为48D的EF1α蛋白同源物。该单态中包含的序列的若干条被预测为能编码下述氨基酸序列，所述氨基酸序列展示出与多种EF1α同源蛋白序列的同源性，其包括但不限于，Bombyx mori EF1α(GenBank编号D13338)、Alternia物种EF1α(GenBank编号X03704)、Spragueialeo EF1α(GenBank编号U85680)、Apis mellifera EF1α(GenBank编号AF015267)、Anisakis simplex EF1α(GenBank编号AJ250539)、Papaipema物种EF1α(GenBank编号AF151628)、Ephedrus persicaeEF1α(GenBank编号Z83663)、Papilio garamas EF1α(GenBank编号AF044833)、Alysia lucicola EF1α(GenBank编号Z83667)、Braco物种EF1α(GenBank编号Z83669)、Histeromerus mystacinusEF1α(GenBank编号Z83666)和Caenorhabditis elegans EF1α(GenBank编号U41534)。
被预测为编码EF1α同源物的一部分的一条CRW cDNA序列在本文中被称为B2序列，其被展示于SEQ ID NO：36中。SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38分别对应于正向和反向的基因组扩增引物(即引物对，参照SEQ ID NO：36示出的相应的或反向互补序列)，所述引物用于从CRW基因组DNA，从CRW mRNA库或从由此类库产生的cDNA来制造扩增子。此类扩增子的序列对应于编码EF1α同源蛋白的CRW基因的全部或部分。但是，当用CRW基因组DNA作为模板时获得的扩增子的核苷酸序列与SEQ ID NO：36中示出的报道的cDNA序列并不一致。
SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38代表用于热扩增引物的序列。它们每个都含有23个核苷酸的T7启动子序列，分别在第1-23位核苷酸。SEQ ID NO：37中示出的第24-44位核苷酸对应于SEQ ID NO：36示出的第8-29位核苷酸。SEQ ID NO：38中示出的第24-42位核苷酸对应于SEQ ID：36中310-328位核苷酸示出的序列的反向互补序列。在用CRW基因组DNA作为模板的扩增反应中，使用由SEQ IDNO：37和SEQ ID NO：38组成的引物对，产生了包含SEQ ID NO：39中示出的核苷酸序列的933个碱基对的扩增子。SEQ ID NO：39所示的核苷酸序列与SEQ ID NO：36中示出的第8位核苷酸至第328位核苷酸并不一致。优选地，用CRW mRNA库或从此类库获得的cDNA，例如，SEQ ID NO：36来制造扩增子。
使用CRW mRNA库，或从此类库制备的cDNA，来制造下述扩增子，所述扩增子展示出对应于SEQ ID NO：36中大约第8位核苷酸至大约第328位核苷酸的序列，将其克隆进质粒载体。回收足够量的质粒DNA，以允许从克隆片段任意末端的嵌入收敛T7启动子进行体外的T7 RNA聚合酶转录。产生双链RNA，将样品进行生物试验；一条RNA片断，正义链，由SEQ ID NO：36中大约第8位核苷酸至少至大约第328位核苷酸所示的序列构成(不同之处在于，在SEQ ID NO：36中显示为胸腺嘧啶的每个位置存在尿嘧啶残基)，反向互补RNA片断，或反义链是SEQ ID NO：36中大约第328位核苷酸至少至大约第8位核苷酸所示的核苷酸序列的实质反向互补序列，其中，尿嘧啶适当地取代胸腺嘧啶。用DICER或RNAse III去处理双链RNA(dsRNA)的样品，以产生足够量的小干扰RNA(siRNA)。将含有每百万siRNA或dsRNA 0.15部分的样品用于前文所述的CRW膳食生物试验，幼虫被允许进食13天。较之对照，进食含有dsRNA的膳食的CRW幼虫展示出了显而易见的生长抑制和死亡率，所述dsRNA对应于SEQ IDNO：36中示出的序列的全部或部分。
用SEQ ID NO：40所示的序列去设计用于扩增下述CRW基因组DNA序列的引物对，所述序列编码EF1α48D同源蛋白序列。SEQ IDNO：41和SEQ ID NO：42分别对应正向和反向基因组扩增引物(即，引物对)。SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42每个都含有23个核苷酸的T7启动子序列，分别在第1-23位核苷酸。SEQ ID NO：41中示出的第24-41位核苷酸对应于SEQ ID NO：40示出的第61-79位核苷酸。SEQ ID NO：42中示出的第24-45位核苷酸对应于SEQ ID：40中562-583位核苷酸示出的序列的反向互补序列。在用CRW基因组DNA作为模板的扩增反应中，使用由SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42组成的引物对，产生了包含SEQ ID NO：43中示出的核苷酸序列的569个碱基对的扩增子，其高度对应于编码下述蛋白的CRW基因组的一部分，所述蛋白展示出与Drosophila melanogaster中也存在的EF1α蛋白具有高度相同性。SEQ ID NO：43中从大约第24位核苷酸至大约546位核苷酸所示的核苷酸序列与SEQ ID NO：40中示出的大约第61-583位核苷酸示出的核苷酸序列高度对应。在基因组扩增子序列和cDNA中的相应序列之间没有观察到序列差异。
将展示出对应于SEQ ID NO：43的序列的扩增子克隆进质粒载体。回收足够量的质粒DNA，以允许从克隆片段任意末端的嵌入收敛T7启动子进行体外的T7 RNA聚合酶转录。产生双链RNA，将样品进行生物试验；一条RNA片断，正义链，由SEQ ID NO：43中大约第24位核苷酸至少至大约第546位核苷酸所示的序列构成(不同之处在于，在SEQ ID NO：43中显示为胸腺嘧啶的每个位置存在尿嘧啶残基)，反向互补RNA片断，或反义链是SEQ ID NO：43中大约第546位核苷酸至少至大约第24位核苷酸所示的核苷酸序列的实质反向互补序列，其中，尿嘧啶适当地取代胸腺嘧啶。用DICER或RNAse III去处理双链RNA(dsRNA)的样品，以产生足够量的小干扰RNA(siRNA)。将含有每百万siRNA或dsRNA 0.15部分的样品用于前文所述的CRW膳食生物试验，幼虫被允许进食13天。较之对照，进食含有dsRNA的膳食的CRW幼虫展示出了显而易见的生长抑制和死亡率，所述dsRNA对应于SEQ ID NO：43中示出的序列的全部或部分。
26S蛋白体亚基p28同源序列
26S蛋白体是大的、依赖ATP的、多亚基蛋白酶，其在所有真核生物中高度保守。其在选择性除去多种短寿蛋白的过程中具有一般性的功能，所述蛋白先是与泛素共轭连接，然后被26S蛋白酶复合体降解。泛素途径在对细胞周期的控制中有着重要的作用，所述控制通过对多种调控蛋白的特异性降解来实现的，所述蛋白包括有丝分裂细胞周期蛋白和对依赖细胞周期蛋白的激酶的抑制剂，例如，哺乳动物细胞的p27。因此，对26S蛋白体合成的遏制以及对其组成亚基和程度遏制可以是双链RNA介导的抑制的优选目标(Smith et al.，Plant Phys.1997，113：281-291)。
从CRW中肠文库获得的cDNA序列被鉴定为与26S蛋白体亚基氨基酸序列部分同源，其被用于本发明。SEQ ID NO：44实质上对应于CRW中肠cDNA核苷酸序列。SEQ ID NO：44的氨基酸序列翻译展示出了与26S蛋白体亚基p28蛋白(GenBank编号AB009619)的同源性。SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46分别对应于正向和反向的基因组扩增引物(即引物对)，所述引物用于从CRW基因组DNA，从CRWmRNA库或从由此类库产生的cDNA来制造扩增子。以此途径产生的扩增子应当展示出下述序列，所述序列编码下述CRW基因的全部或部分，所述基因编码26S蛋白体亚基蛋白的同源物。SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46每个都含有23个核苷酸的T7启动子序列，分别在第1-23位核苷酸。SEQ ID NO：45中示出的第24-46位核苷酸对应于SEQID NO：34示出的第 130-152位核苷酸。SEQ ID NO：46中示出的第24-41位核苷酸对应于SEQ ID：44中423-440位核苷酸示出的序列的反向互补序列。在用CRW基因组DNA作为模板的扩增反应中，使用由SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46组成的引物对，产生了包含SEQID NO：47中示出的核苷酸序列的1113个碱基对的扩增子。SEQ IDNO：47所示的序列与SEQ ID NO：44所示的序列并不相关，因此与SEQ ID NO：44所示的被报道的cDNA序列并不一致。优选地，使用CRW mRNA库或由此类库获得的cDNA来制造扩增子。
制造展示出下述序列的扩增子，并将其克隆进质粒载体，所述序列对应于SEQ ID NO：44的大约第130位核苷酸至大约第440位核苷酸，回收足够量的质粒DNA，以允许从克隆片段任意末端的嵌入收敛T7启动子进行体外的T7 RNA聚合酶转录。产生双链RNA，将样品进行生物试验；一条RNA片断，正义链，由SEQ ID NO：44中大约第130位核苷酸至少至大约第440位核苷酸所示的序列构成(不同之处在于，在SEQ ID NO：44中显示为胸腺嘧啶的每个位置存在尿嘧啶残基)，反向互补RNA片断，或反义链是SEQ ID NO：44中大约第440位核苷酸至少至大约第110位核苷酸所示的核苷酸序列的实质反向互补序列，其中，尿嘧啶适当地取代胸腺嘧啶。用DICER或RNAse III去处理双链RNA(dsRNA)的样品，以产生足够量的小干扰RNA(siRNA)。将含有每百万siRNA或dsRNA 0.15部分的样品用于前文所述的CRW膳食生物试验，幼虫被允许进食13天。较之对照，进食含有dsRNA的膳食的CRW幼虫展示出了显而易见的生长抑制和死亡率，所述dsRNA对应于SEQ ID NO：44中示出的序列的全部或部分。
保幼激素环氧化物水解酶蛋白
昆虫保幼激素对昆虫生命周期中多种必要的生物学过程加以控制和调控，所述过程包括但不一定限于变态、繁殖和滞育。在合适的时候，保幼激素(JH)浓度被需要在有害昆虫幼虫(特别是鳞翅类和鞘翅类幼虫)形式血淋巴中达到峰值，然后其必须被降解，以中指激素应答作用。降低保幼激素浓度的过程中涉及的酶通过代谢降解的两条主要途径发挥作用。一条途径涉及保幼激素酯酶(JHE)，其能水解甲酯，提供相应的酸。第二种途径利用保幼激素环氧化物水解酶(JHEH)，以获得对环氧化物的水解，导致二醇形成。JHE在JH降解中的贡献已被很好地了解，已发现，其在鳞翅类和鞘翅类物种之间是不变化的。对JH酯酶的抑制与严重的变态变化相关，包括但不限于，幼虫错乱(larval wandering)、化蛹推迟以及畸形中间态的发育。相反，人们对JHEH在JH代谢中的作用了解更少，并且，其已经显示出在物种之间会有变化，但是近来的研究针对下述证据，所述证据暗示JHEH可能是JH代谢的主要途径(Brandon J.Fetterolf，DoctoralDissertation，North Carolina State University(Feb.10，2002)Synthesisand Analysis of Mechanism Based Inhibitors of Juvenile HormoneEpoxide Hydrolase from Insect Trichoplusia ni)。在任何时间中，用基因遏制技术对任意JH降解途径的干扰可以是用于双链RNA介导的有害生物抑制的有用目标。
对从CRW获得的昆虫保幼激素环氧化物水解酶序列加以鉴定，将其用于本发明。SEQ ID NO：48实质上对应于CRW中肠cDNA核苷酸序列。SEQ ID NO：48的氨基酸序列翻译预测了与Manduca sexta中保幼激素环氧化物水解酶(GenBank编号U46682)的同源性。SEQID NO：49和SEQ ID NO：50分别对应于正向和反向的扩增引物(即引物对)，所述引物用于从CRW基因组DNA，从CRW mRNA库或从由此类库产生的cDNA来制造扩增子。此类扩增子的序列应当对应于编码JHEH同源蛋白的CRW基因的全部或部分。SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50每个都含有23个核苷酸的T7启动子序列，分别在第1-23位核苷酸。SEQ ID NO：49中示出的第24-42位核苷酸对应于SEQ ID NO：48示出的第7-26位核苷酸。SEQ ID NO：50中示出的第24-44位核苷酸对应于SEQ ID：48中360-380位核苷酸示出的序列的反向互补序列。在用CRW基因组DNA作为模板的扩增反应中，使用由SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50组成的引物对，产生了包含SEQID NO：52中示出的核苷酸序列的95个碱基对的扩增子。扩增子的序列与SEQ ID NO：48中所示的cDNA序列并不对应。优选地，使用CRW mRNA库或由此类库获得的cDNA作为扩增反应中的模板核苷酸序列来制造扩增子。
将展示出对应于SEQ ID NO：48的序列的扩增子克隆进质粒载体，回收足够量的质粒DNA，以允许从克隆片段任意末端的嵌入收敛T7启动子进行体外的T7 RNA聚合酶转录。产生双链RNA，将样品进行生物试验；一条RNA片断，正义链，由SEQ ID NO：48中大约第7位核苷酸至少至大约第380位核苷酸所示的序列构成(不同之处在于，在SEQ ID NO：48中显示为胸腺嘧啶的每个位置存在尿嘧啶残基)，反向互补RNA片断，或反义链是SEQ ID NO：48中大约第380位核苷酸至少至大约第7位核苷酸所示的核苷酸序列的实质反向互补序列，其中，尿嘧啶适当地取代胸腺嘧啶。用DICER或RNAse III去处理双链RNA(dsRNA)的样品，以产生足够量的小干扰RNA(siRNA)。将含有每百万siRNA或dsRNA 0.15部分的样品用于前文所述的CRW膳食生物试验，幼虫被允许进食13天。较之对照，进食含有dsRNA的膳食的CRW幼虫展示出了显而易见的生长抑制和死亡率，所述dsRNA对应于SEQ ID NO：48中示出的序列的全部或部分。
依赖膨胀的氯通道蛋白同源序列
依赖膨胀的氯通道蛋白被假设为：在真核动物细胞系统渗透调节中扮演关键角色。因此，展示出能表达下述氨基酸序列的能力的核苷酸序列可以是用于在有害生物中进行RNA抑制的有用目标，所述氨基酸序列是展示出与以前鉴定出的依赖膨胀的氯通道蛋白的同源性的。
从CRW cDNA文库推断出依赖膨胀的氯通道(SDCC)的氨基酸序列同源物，将其用于本发明。SEQ ID NO：53实质上对应于CRW中肠cDNA核苷酸序列。SEQ ID NO：53的氨基酸序列被确定为：与斑马鱼Danio rerio中的SDCC蛋白(GenBank编号Y08484)同源。SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：55分别对应于正向和反向的热扩增引物(即引物对)，所述引物用于从CRW基因组DNA，从CRW mRNA库或从由此类库产生的cDNA来制造扩增子。此类扩增子的序列应当对应于编码SDCC同源蛋白的CRW基因的全部或部分。SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：55每个都含有23个核苷酸的T7启动子序列，分别在第1-23位核苷酸。SEQ ID NO：54中示出的第24-43位核苷酸对应于SEQ ID NO：53示出的第78-97位核苷酸。SEQ ID NO：55中示出的第24-41位核苷酸对应于SEQ ID：53中332-349位核苷酸示出的序列的反向互补序列。在用CRW基因组DNA作为模板的扩增反应中，使用由SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：55组成的引物对，产生了包含SEQ ID NO：56中示出的核苷酸序列的318个碱基对的扩增子，其与编码下述蛋白的CRW基因组的一部分高度对应，所述蛋白展示出了与SDCC蛋白的高度相同性。SEQ ID NO：56中大约第24位核苷酸至大约第295位核苷酸所示的核苷酸序列与SEQ ID NO：53中78-349位核苷酸所示的核苷酸序列高度对应。
将展示出对应于SEQ ID NO：56的序列的扩增子克隆进质粒载体，回收足够量的质粒DNA，以允许从克隆片段任意末端的嵌入收敛T7启动子进行体外的T7 RNA聚合酶转录。产生双链RNA，将样品进行生物试验；一条RNA片断，正义链，由SEQ ID NO：56中大约第24位核苷酸至少至大约第295位核苷酸所示的序列构成(不同之处在于，在SEQ ID NO：56中显示为胸腺嘧啶的每个位置存在尿嘧啶残基)，反向互补RNA片断，或反义链是SEQ ID NO：56中大约第295位核苷酸至少至大约第24位核苷酸所示的核苷酸序列的实质反向互补序列，其中，尿嘧啶适当地取代胸腺嘧啶。用DICER或RNAse III去处理双链RNA(dsRNA)的样品，以产生足够量的小干扰RNA(siRNA)。将含有每百万siRNA或dsRNA 0.15部分的样品用于前文所述的CRW膳食生物试验，幼虫被允许进食13天。较之对照，进食含有dsRNA的膳食的CRW幼虫展示出了显而易见的生长抑制和死亡率，所述dsRNA对应于SEQ ID NO：56中示出的序列的全部或部分。
葡糖-6-磷酸1-脱氢酶蛋白同源序列
葡糖-6-磷酸1-脱氢酶蛋白(G6PD)催化葡糖-6-磷酸到6-磷酸葡糖酸酯，同时伴随将尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)的氧化形式还原为NADPH。NADPH作为很多种真核生物合成反应中的必需辅助因子是本领域中已知的，已知其能保持谷胱甘肽为其还原形式。被还原的谷胱甘肽在真核生物中作为危险氧化代谢产物的清道夫发挥作用，并且，在谷胱甘肽过氧化物酶的协助下，将有害的过氧化氢转变为水(Beutler et al，1991，N.Engl.J.Med.324：169-174)。因此，G6PD可以是双链RNA介导的在无脊椎有害生物中的抑制的优选目标。
从CRW cDNA文库推断出葡糖-6-磷酸1-脱氢酶蛋白(G6PD)的同源氨基酸序列，将其用于本发明。SEQ ID NO：57实质上对应于CRW中肠cDNA核苷酸序列。SEQ ID NO：57的氨基酸序列被确定为：展示出与条鳍鱼物种中G6PD蛋白(GenBank编号U72484)的同源性。SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：59分别对应于正向和反向的基因组扩增引物(即引物对)，所述引物用于从CRW基因组DNA，从CRWmRNA库或从由此类库产生的cDNA来制造扩增子。此类扩增子的序列应当对应于编码G6PD同源蛋白的CRW基因的全部或部分。SEQ IDNO：58和SEQ ID NO：59每个都含有23个核苷酸的T7启动子序列，分别在第1-23位核苷酸。SEQ ID NO：58中示出的第24-46位核苷酸对应于SEQ ID NO：57示出的第113-136位核苷酸。SEQ ID NO：59中示出的第24-45位核苷酸对应于SEQ ID：57中373-394位核苷酸示出的序列的反向互补序列。在用CRW基因组DNA作为模板的扩增反应中，使用由SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：59组成的引物对，产生了包含SEQ ID NO：60中示出的核苷酸序列的328个碱基对的扩增子，其与编码下述蛋白的CRW基因组的一部分高度对应，所述蛋白展示出了与G6PD蛋白的同源性。SEQ ID NO：60中大约第24位核苷酸至大约第305位核苷酸所示的核苷酸序列与SEQ ID NO：57中113-394位核苷酸所示的核苷酸序列高度对应。
将展示出对应于SEQ ID NO：60的序列的扩增子克隆进质粒载体，回收足够量的质粒DNA，以允许从克隆片段任意末端的嵌入收敛T7启动子进行体外的T7 RNA聚合酶转录。产生双链RNA，将样品进行生物试验；一条RNA片断，正义链，由SEQ ID NO：60中大约第24位核苷酸至少至大约第305位核苷酸所示的序列构成(不同之处在于，在SEQ ID NO：60中显示为胸腺嘧啶的每个位置存在尿嘧啶残基)，反向互补RNA片断，或反义链是SEQ ID NO：60中大约第305位核苷酸至少至大约第24位核苷酸所示的核苷酸序列的实质反向互补序列，其中，尿嘧啶适当地取代胸腺嘧啶。用DICER或RNAse III去处理双链RNA(dsRNA)的样品，以产生足够量的小干扰RNA(siRNA)。将含有每百万siRNA或dsRNA 0.15部分的样品用于前文所述的CRW膳食生物试验，幼虫被允许进食13天。较之对照，进食含有dsRNA的膳食的CRW幼虫展示出了显而易见的生长抑制和死亡率，所述dsRNA对应于SEQ ID NO：60中示出的序列的全部或部分。
肌动蛋白42A蛋白同源序列
肌动蛋白是普遍存在的、高度保守的真核生物蛋白，其是细胞活动和运动所需要的(Lovato et al.，2001，Insect MoI.Biol.20：333-340)。鉴定出了大量的CRW cDNA序列，它们被预测为可能编码肌动蛋白或者展示出与肌动蛋白相关的氨基酸序列结构的蛋白。因此，有害生物细胞中编码肌动蛋白同源物的基因可以是双链RNA介导的抑制的有用目标。
在玉米根虫中肠cDNA文库中鉴定出的一个UNIGENE簇(簇156_1)由多条单态EST序列构成，其中每条都被预测为能编码肌动蛋白同源蛋白的全部或部分。将这些单态对齐为簇，获得了SEQ ID NO：61所示的共有序列，其被预测为能编码肌动蛋白同源物。注释组中的同源肌动蛋白序列包括但不限于Drosophila melanogaster肌动蛋白3片段、Helicoverpa armigera细胞纤溶酶(cytoplasmin)肌动蛋白A3a(GenBank编号X97614)、Drosophila melanogaster肌动蛋白(GenBank编号X06383)、半索动物Saccoglossus kowalevskii肌动蛋白信使RNA序列以及Strongylocentrotus purpuratus肌动蛋白(GenBank编号X05739)。
SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：63分别对应于正向和反向的基因组扩增引物(即引物对)，所述引物用于从CRW基因组DNA，从CRWmRNA库或从由此类库产生的cDNA来制造扩增子。此类扩增子的序列应当对应于编码肌动蛋白同源蛋白的CRW基因的全部或部分。SEQID NO：62和SEQ ID NO：63每个都含有23个核苷酸的T7启动子序列，分别在第1-23位核苷酸。SEQ ID NO：62中示出的第24-45位核苷酸对应于SEQ ID NO：61示出的第14-35位核苷酸。SEQ ID NO：63中示出的第24-45位核苷酸对应于SEQ ID：61中449-470位核苷酸示出的序列的反向互补序列。在用CRW基因组DNA作为模板的扩增反应中，使用由SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：63组成的引物对，产生了包含SEQ ID NO：64中示出的核苷酸序列的503个碱基对的扩增子，其与编码下述蛋白的CRW基因组的一部分高度对应，所述蛋白展示出了与肌动蛋白的同源性。SEQ ID NO：64中大约第24位核苷酸至大约第480位核苷酸所示的核苷酸序列与SEQ ID NO：61中14-470位核苷酸所示的核苷酸序列高度对应。
将展示出对应于SEQ ID NO：64的序列的扩增子克隆进质粒载体，回收足够量的质粒DNA，以允许从克隆片段任意末端的嵌入收敛T7启动子进行体外的T7 RNA聚合酶转录。产生双链RNA，将样品进行生物试验；一条RNA片断，正义链，由SEQ ID NO：64中大约第24位核苷酸至少至大约第480位核苷酸所示的序列构成(不同之处在于，在SEQ ID NO：64中显示为胸腺嘧啶的每个位置存在尿嘧啶残基)，反向互补RNA片断，或反义链是SEQ ID NO：64中大约第480位核苷酸至少至大约第24位核苷酸所示的核苷酸序列的实质反向互补序列，其中，尿嘧啶适当地取代胸腺嘧啶。用DICER或RNAse III去处理双链RNA(dsRNA)的样品，以产生足够量的小干扰RNA(siRNA)。将含有每百万siRNA或dsRNA 0.15部分的样品用于前文所述的CRW膳食生物试验，幼虫被允许进食13天。较之对照，进食含有dsRNA的膳食的CRW幼虫展示出了显而易见的生长抑制和死亡率，所述dsRNA对应于SEQ ID NO：64中示出的序列的全部或部分。
ADP-核糖基化因子1同源序列
ADP核糖基化因子1已被展示为在细胞中很重要的，因为，它们在DNA损伤修复、致癌、细胞死亡和基因组稳定性的过程中体现完整的作用。因此，可能可以用双链RNA介导的抑制，在无脊椎有害生物物种中选择性地干扰ADP-核糖基化因子的转录。
鉴定出了大量的CRW cDNA序列，它们被预测为：编码展示出与ADP-核糖基化因子的同源性的氨基酸序列。特别地，一个UNIGENE簇(簇88_1)由大约三十(30)条EST单态构成，其中每条都被预测为能编码肌动蛋白同源蛋白的全部或部分。将这些单态对齐为簇，获得了SEQ ID NO：65所示的共有序列。包含该簇的单态CRW cDNA序列的氨基酸序列翻译预测了下述氨基酸序列，所述氨基酸序列展示出与ADP-核糖基化因子同源物的同源性。展示出与从SEQ ID NO：65中的ORF推断的氨基酸序列的显著同源性的ADF-核糖基化因子蛋白序列包括但不限于Drosophila melanogaster ADP-核糖基化因子(GenBank编号Y10618)、Drosophilia obscura ADP-核糖基化因子(GenBank编号AF025798)、Anopheles gambiae ADP-核糖基化因子(GenBank编号L11617)和澳大利亚绵羊丽蝇(Lycilia cuprina)ADP-核糖基化因子(GenBank编号AF218587)。
SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：67分别对应于正向和反向的扩增引物(即引物对)，所述引物用于从CRW基因组DNA，从CRW mRNA库或从由此类库产生的cDNA来制造扩增子。此类扩增子的序列应当对应于编码ADP-核糖基化因子同源蛋白的CRW基因的全部或部分。SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：67每个都含有23个核苷酸的T7启动子序列，分别在第1-23位核苷酸。SEQ ID NO：66中示出的第24-42位核苷酸对应于SEQ ID NO：65示出的第70-88位核苷酸。SEQ IDNO：67中示出的第24-40位核苷酸对应于SEQ ID：65中352-368位核苷酸示出的序列的反向互补序列。在用CRW基因组DNA作为模板的扩增反应中，使用由SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：67组成的引物对，产生了包含SEQ ID NO：68中示出的核苷酸序列的345个碱基对的扩增子，其与编码下述蛋白的CRW基因组的一部分高度对应，所述蛋白展示出了与ADP-核糖基化因子蛋白的同源性。SEQ ID NO：68中大约第24位核苷酸至大约第322位核苷酸所示的核苷酸序列与SEQID NO：65中70-368位核苷酸所示的核苷酸序列高度对应。
将展示出对应于SEQ ID NO：68的序列的扩增子克隆进质粒载体，回收足够量的质粒DNA，以允许从克隆片段任意末端的嵌入收敛T7启动子进行体外的T7 RNA聚合酶转录。产生双链RNA，将样品进行生物试验；一条RNA片断，正义链，由SEQ ID NO：68中大约第24位核苷酸至少至大约第322位核苷酸所示的序列构成(不同之处在于，在SEQ ID NO：68中显示为胸腺嘧啶的每个位置存在尿嘧啶残基)，反向互补RNA片断，或反义链是SEQ ID NO：68中大约第322位核苷酸至少至大约第24位核苷酸所示的核苷酸序列的实质反向互补序列，其中，尿嘧啶适当地取代胸腺嘧啶。用DICER或RNAse III去处理双链RNA(dsRNA)的样品，以产生足够量的小干扰RNA(siRNA)。将含有每百万siRNA或dsRNA 0.15部分的样品用于前文所述的CRW膳食生物试验，幼虫被允许进食13天。较之对照，进食含有dsRNA的膳食的CRW幼虫展示出了显而易见的生长抑制和死亡率，所述dsRNA对应于SEQ ID NO：68中示出的序列的全部或部分。
转录因子IIB蛋白同源序列
如前文所述，转录延伸和翻译终止因子对于代谢来说非常重要，可以是双链RNA介导的抑制的有利目标，用于控制或消除无脊椎有害生物的侵袭。
鉴定出了一种CRW cDNA序列，其被预测为能编码下述氨基酸序列，所述氨基酸序列展示出了与转录因子IIB蛋白的同源性。SEQ IDNO：69被用作为构建引物对的基础，所述引物对被用于从CRW基因组中扩增出编码下述mRNA的序列，所述mRNA形成了针对该cDNA序列的基础。
SEQ ID NO：70和SEQ ID NO：71分别对应于正向和反向的热扩增引物(即引物对)，所述引物用于从CRW基因组DNA，从CRWmRNA库或从由此类库产生的cDNA来制造扩增子。此类扩增子的序列应当对应于编码转录因子IIB同源蛋白的CRW基因的全部或部分。SEQ ID NO：70和SEQ ID NO：71每个都含有23个核苷酸的T7启动子序列，分别在第1-23位核苷酸。SEQ ID NO：70中示出的第24-44位核苷酸对应于SEQ ID NO：69示出的第4-24位核苷酸。SEQ ID NO：71中示出的第24-44位核苷酸对应于SEQ ID：69中409-429位核苷酸示出的序列的反向互补序列。在用CRW基因组DNA作为模板的扩增反应中，使用由SEQ ID NO：70和SEQ ID NO：71组成的引物对，产生了包含SEQ ID NO：72中示出的核苷酸序列的472个碱基对的扩增子，其与编码下述蛋白的CRW基因组的一部分高度对应，所述蛋白展示出了与转录因子IIB蛋白的同源性。SEQ ID NO：72中大约第24位核苷酸至大约第449位核苷酸所示的核苷酸序列与SEQ ID NO：69中4-429位核苷酸所示的核苷酸序列高度对应。
将展示出对应于SEQ ID NO：72的序列的扩增子克隆进质粒载体，回收足够量的质粒DNA，以允许从克隆片段任意末端的嵌入收敛T7启动子进行体外的T7 RNA聚合酶转录。产生双链RNA，将样品进行生物试验；一条RNA片断，正义链，由SEQ ID NO：72中大约第24位核苷酸至少至大约第449位核苷酸所示的序列构成(不同之处在于，在SEQ ID NO：72中显示为胸腺嘧啶的每个位置存在尿嘧啶残基)，反向互补RNA片断，或反义链是SEQ ID NO：72中大约第449位核苷酸至少至大约第24位核苷酸所示的核苷酸序列的实质反向互补序列，其中，尿嘧啶适当地取代胸腺嘧啶。用DICER或RNAse III去处理双链RNA(dsRNA)的样品，以产生足够量的小干扰RNA(siRNA)。将含有每百万siRNA或dsRNA 0.15部分的样品用于前文所述的CRW膳食生物试验，幼虫被允许进食13天。较之对照，进食含有dsRNA的膳食的CRW幼虫展示出了显而易见的生长抑制和死亡率，所述dsRNA对应于SEQ ID NO：72中示出的序列的全部或部分。
几丁质酶蛋白
几丁质是N-乙酰氨基葡萄糖的β(1→4)同聚物，其被发现在昆虫外骨骼中。几丁质在几丁质合酶催化的反应中从UDP-N-乙酰氨基葡萄糖形成。几丁质是结构性的同聚多糖，在对这种高度分支和交联的结构的构建中，涉及很多酶步骤。几丁质给予昆虫形状、刚度和支持，提供内部器官，例如肌肉得以附着的支架。几丁质还应被降解至一定程度，以调控昆虫蜕皮过程中涉及的步骤。因此，人们相信，双链RNA介导的、对这些途径中蛋白的抑制，将可以作为控制无脊椎有害生物侵袭的手段。
从对展示出与几丁质酶蛋白同源性的、玉米根虫中肠cDNA文库序列的翻译鉴定出了氨基酸序列信息。从对两条单态EST序列的对齐，产生了一条几丁质酶共有序列(UNIGENE簇号716_1；SEQ IDNO：73)。从对四条单态序列的对齐，产生了第二种几丁质酶共有序列(UNIGENE簇号1238_1；SEQ ID NO：77)。从这些UNIGENE的ORF获得的氨基酸序列翻译被注释为：辣根猿叶甲(mustardbeetle)(Phaedon cochleariae)几丁质酶氨基酸序列(GenBank编号Y18011)。SEQ ID NO：73和SEQ ID NO：77被用作为构建引物对的基础，用于从CRW基因组中，从CRW mRNA库，或从由此类mRNA库获得的cDNA序列扩增两条序列。此类扩增子的核苷酸序列应当对应于编码几丁质酶同源蛋白的基因的全部或部分。
SEQ ID NO：74和SEQ ID NO：75分别对应于正向和反向的热扩增引物(即引物对)，所述引物用于从CRW基因组DNA，从CRWmRNA库或从由此类库产生的cDNA来制造扩增子。此类扩增子的序列应当对应于如SEQ ID NO：73所示的编码几丁质酶同源蛋白的CRW基因的全部或部分。SEQ ID NO：74和SEQ ID NO：75每个都含有23个核苷酸的T7启动子序列，分别在第1-23位核苷酸。SEQ ID NO：74中示出的第24-42位核苷酸对应于SEQ ID NO：73示出的第1-19位核苷酸。SEQ ID NO：75中示出的第24-47位核苷酸对应于SEQ ID：73中470-493位核苷酸示出的序列的反向互补序列。在用CRW基因组DNA作为模板的扩增反应中，使用由SEQ ID NO：74和SEQ ID NO：75组成的引物对，产生了包含SEQ ID NO：76中示出的核苷酸序列的472个碱基对的扩增子，其与编码下述蛋白的CRW基因组的一部分高度对应，所述蛋白展示出了与几丁质酶蛋白的同源性。SEQ ID NO：76中大约第24位核苷酸至大约第516位核苷酸所示的核苷酸序列与SEQ ID NO：76中1-493位核苷酸所示的核苷酸序列高度对应。
将展示出对应于SEQ ID NO：76的序列的扩增子克隆进质粒载体，回收足够量的质粒DNA，以允许从克隆片段任意末端的嵌入收敛T7启动子进行体外的T7 RNA聚合酶转录。产生双链RNA，将样品进行生物试验；一条RNA片断，正义链，由SEQ ID NO：76中大约第24位核苷酸至少至大约第516位核苷酸所示的序列构成(不同之处在于，在SEQ ID NO：76中显示为胸腺嘧啶的每个位置存在尿嘧啶残基)，反向互补RNA片断，或反义链是SEQ ID NO：76中大约第516位核苷酸至少至大约第24位核苷酸所示的核苷酸序列的实质反向互补序列，其中，尿嘧啶适当地取代胸腺嘧啶。用DICER或RNAse III去处理双链RNA(dsRNA)的样品，以产生足够量的小干扰RNA(siRNA)。将含有每百万siRNA或dsRNA 0.15部分的样品用于前文所述的CRW膳食生物试验，幼虫被允许进食13天。较之对照，进食含有dsRNA的膳食的CRW幼虫展示出了显而易见的生长抑制和死亡率，所述dsRNA对应于SEQ ID NO：76中示出的序列的全部或部分。
SEQ ID NO：78和SEQ ID NO：79分别对应于正向和反向的基因组扩增引物(即引物对)，所述引物用于从CRW基因组DNA，从CRWmRNA库或从由此类库产生的cDNA来制造扩增子。此类扩增子的序列应当对应于如SEQ ID NO：77所示的编码几丁质酶同源蛋白的CRW基因的全部或部分。SEQ ID NO：78和SEQ ID NO：79每个都含有23个核苷酸的T7启动子序列，分别在第1-23位核苷酸。SEQ ID NO：78中示出的第24-44位核苷酸对应于SEQ ID NO：77示出的第64-84位核苷酸。SEQ ID NO：79中示出的第24-44位核苷酸对应于SEQ ID：77中779-799位核苷酸示出的序列的反向互补序列。在用CRW基因组DNA作为模板的扩增反应中，使用由SEQ ID NO：78和SEQ ID NO：79组成的引物对，产生了包含SEQ ID NO：80中示出的核苷酸序列的912个碱基对的扩增子。SEQ ID NO：77中所示的cDNA序列与扩增子序列的比对揭示，在两条序列间存在实质性的区别，仅有大约32％的序列相同性。优选地，使用引物对，例如SEQ ID NO：78盒79所示的引物对，以及mRNA或cDNA作为模板来制造扩增子，以避免此类不一致。
将展示出对应于SEQ ID NO：77的序列的扩增子克隆进质粒载体，回收足够量的质粒DNA，以允许从克隆片段任意末端的嵌入收敛T7启动子进行体外的T7 RNA聚合酶转录。产生双链RNA，将样品进行生物试验；一条RNA片断，正义链，由SEQ ID NO：77中大约第64位核苷酸至少至大约第799位核苷酸所示的序列构成(不同之处在于，在SEQ ID NO：77中显示为胸腺嘧啶的每个位置存在尿嘧啶残基)，反向互补RNA片断，或反义链是SEQ ID NO：77中大约第799位核苷酸至少至大约第64位核苷酸所示的核苷酸序列的实质反向互补序列，其中，尿嘧啶适当地取代胸腺嘧啶。用DICER或RNAse III去处理双链RNA(dsRNA)的样品，以产生足够量的小干扰RNA(siRNA)。将含有每百万siRNA或dsRNA 0.15部分的样品用于前文所述的CRW膳食生物试验，幼虫被允许进食13天。较之对照，进食含有dsRNA的膳食的CRW幼虫展示出了显而易见的生长抑制和死亡率，所述dsRNA对应于SEQ ID NO：77中示出的序列的全部或部分。
泛素结合酶同源序列
泛素途径在对细胞周期的控制中有着重要的作用，这是通过对大量调控蛋白的特异性降解来实现的，所述蛋白包括有丝分裂细胞周期蛋白，或对依赖细胞周期蛋白的激酶的抑制剂，例如，哺乳动物细胞的p27。因此，编码泛素和相关组分的基因可以是双链RNA介导的抑制的优选目标(Smith et al.，Plant Phys.1997，113：281-29)。依赖泛素的蛋白水解途径是真核生物中对细胞内蛋白选择性破坏的主要途径之一。泛素与底物的结合受明显呈多样性排列的酶调节。蛋白水解的靶向还可在底物的泛素化和其被多亚基26S蛋白酶降解为肽之间的步骤受到调控。泛素系统的复杂性暗示了其对于真核细胞调控中蛋白流通的中心作用，并且牵连到途径中的其它蛋白，包括泛素激活酶、泛素结合酶、泛素-蛋白连接酶以及26S蛋白体亚基组分。因此，人们相信，RNA介导的对该途径蛋白的抑制将可作为控制无脊椎有害生物侵袭的手段使用。
鉴定出了下述CRW cDNA文库序列，其被预测为能编码下述氨基酸序列，所述氨基酸序列展示出了与泛素结合酶的同源性。SEQ IDNO：81被用作为构建引物对的基础，所述引物对用于制造扩增子，所述扩增子包含来自玉米根虫的泛素结合酶的全部或部分。
SEQ ID NO：82和SEQ ID NO：83分别对应于正向和反向的基因组扩增引物(即引物对)，所述引物用于从CRW基因组DNA，从CRWmRNA库或从由此类库产生的cDNA来制造扩增子。此类扩增子的序列应当对应于编码泛素结合酶同源蛋白的CRW基因的全部或部分。SEQ ID NO：82和SEQ ID NO：83每个都含有23个核苷酸的T7启动子序列，分别在第1-23位核苷酸。SEQ ID NO：82中示出的第24-42位核苷酸对应于SEQ ID NO：81示出的第16-34位核苷酸。SEQ IDNO：83中示出的第24-42位核苷酸对应于SEQ ID：81中295-313位核苷酸示出的序列的反向互补序列。在用CRW基因组DNA作为模板的扩增反应中，使用由SEQ ID NO：82和SEQ ID NO：83组成的引物对，产生了包含SEQ ID NO：84中示出的核苷酸序列的344个碱基对的扩增子，其与编码下述蛋白的CRW基因组的一部分高度对应，所述蛋白展示出了与泛素结合酶的同源性。SEQ ID NO：84中大约第24位核苷酸至大约第321位核苷酸所示的核苷酸序列与SEQ ID NO：81中16-313位核苷酸所示的核苷酸序列高度对应。
将展示出对应于SEQ ID NO：84的序列的扩增子克隆进质粒载体，回收足够量的质粒DNA，以允许从克隆片段任意末端的嵌入收敛T7启动子进行体外的T7 RNA聚合酶转录。产生双链RNA，将样品进行生物试验；一条RNA片断，正义链，由SEQ ID NO：84中大约第24位核苷酸至少至大约第253位核苷酸所示的序列构成(不同之处在于，在SEQ ID NO：84中显示为胸腺嘧啶的每个位置存在尿嘧啶残基)，反向互补RNA片断，或反义链是SEQ ID NO：84中大约第253位核苷酸至少至大约第24位核苷酸所示的核苷酸序列的实质反向互补序列，其中，尿嘧啶适当地取代胸腺嘧啶。用DICER或RNAse III去处理双链RNA(dsRNA)的样品，以产生足够量的小干扰RNA(siRNA)。将含有每百万siRNA或dsRNA 0.15部分的样品用于前文所述的CRW膳食生物试验，幼虫被允许进食13天。较之对照，进食含有dsRNA的膳食的CRW幼虫展示出了显而易见的生长抑制和死亡率，所述dsRNA对应于SEQ ID NO：84中示出的序列的全部或部分。
甘油醛-3-磷酸脱氢酶同源序列
糖分解途径在大多数生物中是很重要的途径，其涉及从葡萄糖的降解来产生代谢能量。在糖分解途径的第二阶段中，一个重要的酶是甘油醛-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)，在存在NAD+和无机磷酸的情况下，期能催化3-磷酸甘油醛氧化为3-磷酸甘油-磷酸，随之形成NADH。该反应的重要组分是，能量通过NADH的形成贮藏。编码与糖分解途径相关的酶的基因，以及特别地，编码在拥有涉及可用于形成能量储备物的步骤中的酶的基因，可以成为在无脊椎有害生物物中进行双链RNA介导的抑制的特别有用的目标。
鉴定出了下述CRW cDNA文库序列，其被预测为能编码下述氨基酸序列，所述氨基酸序列展示出了与甘油醛-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)蛋白的同源性。从三条单态EST序列的重叠序列装配出SEQ ID NO：85所示的簇的共有序列。核苷酸序列SEQ ID NO：85中ORF的氨基酸序列展示出了与从Crytococcus curvatus G3PDH基因获得的G3PDH氨基酸序列(GenBank编号AF126158)以及来自Drosophilapseudoobscura的G3PDH蛋白氨基酸序列(GenBank编号AF025809)的同源性。因此，SEQ ID NO：85所示的序列的氨基酸序列翻译被预测为CRW G3PDH酶蛋白的一部分。SEQ ID NO：85所示的核苷酸序列被用作为构建热扩增引物对的基础，所述引物对用于制造扩增子，所述扩增子编码CRW G3PDH酶序列的序列。
SEQ ID NO：86和SEQ ID NO：87分别对应于正向和反向的热扩增引物(即引物对)，所述引物用于从CRW基因组DNA，从CRWmRNA库或从由此类库产生的cDNA来制造扩增子。此类扩增子的序列应当对应于编码G3PDH同源蛋白的CRW基因的全部或部分。SEQID NO：86和SEQ ID NO：87每个都含有23个核苷酸的T7启动子序列，分别在第1-23位核苷酸。SEQ ID NO：86中示出的第24-45位核苷酸对应于SEQ ID NO：85示出的第103-124位核苷酸。SEQ ID NO：87中示出的第24-45位核苷酸对应于SEQ ID：85中573-594位核苷酸示出的序列的反向互补序列。在用CRW基因组DNA作为模板的扩增反应中，使用由SEQ ID NO：86和SEQ ID NO：87组成的引物对，产生了包含SEQ ID NO：88中示出的核苷酸序列的538个碱基对的扩增子，其与编码下述蛋白的CRW基因组的一部分高度对应，所述蛋白展示出了与G3PDH酶的同源性。SEQ ID NO：88中大约第24位核苷酸至大约第515位核苷酸所示的核苷酸序列与SEQ ID NO：85中103-594位核苷酸所示的核苷酸序列高度对应。
将展示出对应于SEQ ID NO：88的序列的扩增子克隆进质粒载体，回收足够量的质粒DNA，以允许从克隆片段任意末端的嵌入收敛T7启动子进行体外的T7 RNA聚合酶转录。产生双链RNA，将样品进行生物试验；一条RNA片断，正义链，由SEQ ID NO：88中大约第24位核苷酸至少至大约第515位核苷酸所示的序列构成(不同之处在于，在SEQ ID NO：88中显示为胸腺嘧啶的每个位置存在尿嘧啶残基)，反向互补RNA片断，或反义链是SEQ ID NO：84中大约第515位核苷酸至少至大约第24位核苷酸所示的核苷酸序列的实质反向互补序列，其中，尿嘧啶适当地取代胸腺嘧啶。用DICER或RNAse III去处理双链RNA(dsRNA)的样品，以产生足够量的小干扰RNA(siRNA)。将含有每百万siRNA或dsRNA 0.15部分的样品用于前文所述的CRW膳食生物试验，幼虫被允许进食13天。较之对照，进食含有dsRNA的膳食的CRW幼虫展示出了显而易见的生长抑制和死亡率，所述dsRNA对应于SEQ ID NO：88中示出的序列的全部或部分。
泛素B同源序列
如上所述，泛素蛋白降解途径在对细胞周期的控制中有着重要的作用，这是通过对大量调控蛋白的特异性降解来实现的，所述蛋白包括有丝分裂细胞周期蛋白，或对依赖细胞周期蛋白的激酶的抑制剂，例如，哺乳动物细胞的p27。因此，编码泛素和相关组分的基因可以是用于双链RNA介导的抑制的优选目标(Smith et al.，Plant Phys.1997，113：281-291)。
鉴定出了下述CRW cDNA文库序列，其被预测为能编码下述氨基酸序列，所述氨基酸序列展示出了与泛素B蛋白的同源性。从四条单态EST序列的重叠序列装配出SEQ ID NO：89所示的UNIGENE簇的共有序列。核苷酸序列SEQ ID NO：89的氨基酸序列翻译展示出了与来自Amoeba proteus的聚合泛素氨基酸序列(GenBank编号AF034789)和来自Drosophila melanogaster的泛素蛋白序列(GenBank编号M22428)的同源性。因此，SEQ ID NO：89所示的序列的氨基酸序列翻译被相信能编码泛素B。SEQ ID NO：89被用作为构建用于热扩增反应的引物对的基础，所述引物对用于扩增编码玉米根虫泛素B氨基酸序列的全部或部分的核苷酸序列。
SEQ ID NO：90和SEQ ID NO：91分别对应于正向和反向的热扩增引物(即引物对)，所述引物用于从CRW基因组DNA，从CRWmRNA库或从由此类库产生的cDNA来制造扩增子。此类扩增子的序列应当对应于编码泛素B同源蛋白的CRW基因的全部或部分。SEQ IDNO：90和SEQ ID NO：91每个都含有23个核苷酸的T7启动子序列，分别在第1-23位核苷酸。SEQ ID NO：90中示出的第24-40位核苷酸对应于SEQ ID NO：89示出的第62-78位核苷酸。SEQ ID NO：91中示出的第24-47位核苷酸对应于SEQ ID：89中399-422位核苷酸示出的序列的反向互补序列。在用CRW基因组DNA作为模板的扩增反应中，使用由SEQ ID NO：90和SEQ ID NO：91组成的引物对，产生了包含SEQ ID NO：92中示出的核苷酸序列的407个碱基对的扩增子，其与编码下述蛋白的CRW基因组的一部分高度对应，所述蛋白展示出了与泛素结合酶的同源性。SEQ ID NO：92中大约第24位核苷酸至大约第384位核苷酸所示的核苷酸序列与SEQ ID NO：89中62-422位核苷酸所示的核苷酸序列高度对应。
将展示出对应于SEQ ID NO：92的序列的扩增子克隆进质粒载体，回收足够量的质粒DNA，以允许从克隆片段任意末端的嵌入收敛T7启动子进行体外的T7 RNA聚合酶转录。产生双链RNA，将样品进行生物试验；一条RNA片断，正义链，由SEQ ID NO：92中大约第24位核苷酸至少至大约第384位核苷酸所示的序列构成(不同之处在于，在SEQ ID NO：92中显示为胸腺嘧啶的每个位置存在尿嘧啶残基)，反向互补RNA片断，或反义链是SEQ ID NO：92中大约第384位核苷酸至少至大约第24位核苷酸所示的核苷酸序列的实质反向互补序列，其中，尿嘧啶适当地取代胸腺嘧啶。用DICER或RNAse III去处理双链RNA(dsRNA)的样品，以产生足够量的小干扰RNA(siRNA)。将含有每百万siRNA或dsRNA 0.15部分的样品用于前文所述的CRW膳食生物试验，幼虫被允许进食13天。较之对照，进食含有dsRNA的膳食的CRW幼虫展示出了显而易见的生长抑制和死亡率，所述dsRNA对应于SEQ ID NO：92中示出的序列的全部或部分。
保幼激素酯酶同源物
如上文所述，昆虫保幼激素对昆虫生命周期中多种必要的生物学过程加以控制和调控，其包括但不限于，变态、繁殖和滞育。使用基因遏制技术对JH合成或降解途径的干扰可能是双链RNA介导的有害生物控制的有效目标。
对从CRW获得的昆虫保幼激素酯酶同源序列加以鉴定，将其用于本发明。SEQ ID NO：93高度对应于CRW中肠cDNA核苷酸序列。SEQ ID NO：93的氨基酸序列翻译预测了与保幼激素酯酶(JHE)的同源性。SEQ ID NO：94和SEQ ID NO：95分别对应于正向和反向的扩增引物(即引物对)，所述引物用于从CRW基因组DNA，从CRWmRNA库或从由此类库产生的cDNA来制造扩增子。此类扩增子的序列应当对应于编码JHE同源蛋白的CRW基因的全部或部分。SEQ IDNO：94和SEQ ID NO：95每个都含有23个核苷酸的T7启动子序列，分别在第1-23位核苷酸。SEQ ID NO：94中示出的第24-45位核苷酸对应于SEQ ID NO：93示出的第58-79位核苷酸。SEQ ID NO：95中示出的第24-46位核苷酸对应于SEQ ID：93中338-360位核苷酸示出的序列的反向互补序列。在用CRW基因组DNA作为模板的扩增反应中，使用由SEQ ID NO：94和SEQ ID NO：95组成的引物对，产生了包含SEQ ID NO：96中示出的核苷酸序列的348个碱基对的扩增子优选地，使用CRW mRNA库或从此类库获得的cDNA作为扩增反应中的模板核苷酸序列。
将展示出对应于SEQ ID NO：96的序列的扩增子克隆进质粒载体，回收足够量的质粒DNA，以允许从克隆片段任意末端的嵌入收敛T7启动子进行体外的T7 RNA聚合酶转录。产生双链RNA，将样品进行生物试验；一条RNA片断，正义链，由SEQ ID NO：96中大约第45位核苷酸至少至大约第302位核苷酸所示的序列构成(不同之处在于，在SEQ ID NO：96中显示为胸腺嘧啶的每个位置存在尿嘧啶残基)，反向互补RNA片断，或反义链是SEQ ID NO：96中大约第302位核苷酸至少至大约第45位核苷酸所示的核苷酸序列的实质反向互补序列，其中，尿嘧啶适当地取代胸腺嘧啶。用DICER或RNAse III去处理双链RNA(dsRNA)的样品，以产生足够量的小干扰RNA(siRNA)。将含有每百万siRNA或dsRNA 0.15部分的样品用于前文所述的CRW膳食生物试验，幼虫被允许进食13天。较之对照，进食含有dsRNA的膳食的CRW幼虫展示出了显而易见的生长抑制和死亡率，所述dsRNA对应于SEQ ID NO：96中示出的序列的全部或部分。
在用从双链RNA分子产生的小干扰RNA进行的平行生物试验中，对上文列出的双链RNA分子中的十条进行了检验。将双链RNA序列样品或从双链RNA序列样品制备来的小干扰RNA样品(其每种都对应于下述氨基酸序列，所述氨基酸序列被注释为选定的目标基因同源物，它们包括：40kDa V-ATPase同源物、EF-1-alpha同源物、26S蛋白体亚基p28同源物、保幼激素环氧化物水解酶同源物、CHD3同源物、beta-微管蛋白同源物、两种几丁质酶同源物、转录因子IIB同源物和保幼激素酯酶同源物(分别对应于SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：72和SEQ ID NO：06))以大约每百万十部分的浓度应用于昆虫膳食(将30微升含有被调节为合适浓度的双链RNA样品的溶液加入到含有每孔200微升昆虫膳食的微滴定版孔中)。每种样品使用总共十八个孔。RNA样品扩散进膳食之后，将单只的第一龄幼虫加入到每个孔中。如上文所述，对生物试验培养大约13天，每天监测发病率和死亡率。将氨基酸序列变体Cry3Bb1杀昆虫晶体蛋白(在English et al.(美国专利号6,642,030)中被命名为杀昆虫蛋白11231)用作为阳性对照，用于观察特别针对有害玉米根虫的杀昆虫生物活性。按照English et al.所述，将Cry3Bb用于膳食，不同之处在于膳食中Cry3Bb的浓度被调节为每百万200-300部分。仅用缓冲液或水进行处理的单独对照样品也被包括进试验。双链RNA对照样品和从双链RNA对照样品产生的小干扰RNA对照样品用作为额外的隐性对照被包括进来(RNAi Kit，AMBION，Austin，Texas)。
使用从上述十条序列获得的双链RNA分子进行的最初评测显示，被允许进食含有下述双链RNA的膳食的幼虫较之对照展示出了显著的死亡率，所述双链RNA对应于40 kDa V-ATPase同源物(SEQ ID NO：35)、CHD3同源物(SEQ ID NO：7)和beta-微管蛋白同源物(SEQID NO：31)。基于这样的结果，进行额外的生物试验，以检验小干扰双链RNA颗粒是否比全长双链RNA分子更为有效。
alpha微管蛋白同源序列
真核生物细胞通常利用细胞骨架结构元件，它们不仅重要于作为机械支架，还重要于对细胞形状的保持。半柔韧的微纤丝使得细胞能够移动，帮助它们在有丝分裂(胞质分裂)中分离，以及，在脊椎动物和无脊椎动物中，用于肌肉收缩。相对较硬的微管由alpha和beta微管蛋白构成，它们在下述过程中有着重要的作用：作为转运囊泡和细胞起的一套高速公路发挥作用，以及用于在有丝分裂(核分裂)期间分离染色体。柔韧的中间丝提供了对于整个细胞结果的至少额外的强度。还已知，细胞骨架参与穿过细胞质的信号过程。考虑到这些功能，我们相信，对细胞骨架的任何干扰或者甚至对其完整性的微小改变都可能导致对细胞的疾病后果。
鉴定出了至少一种CRW cDNA文库序列，其被鉴定为能编码展示出与下述蛋白的同源性的氨基酸序列，所述蛋白在本文中被称为alpha微管蛋白，更具体地，在本文中指序列表中示出的SEQ ID NO：163。如SEQ ID NO：163所示的序列的氨基酸序列翻译被相信能编码alpha微管蛋白或其片段。SEQ ID NO：63用作为构建下述序列的基础，所述序列被预测为：由T7表达于E.coli中或者由植物功能性启动子表达于植物中时，能形成双链RNA。用作为用于此类双链RNA编码序列的基础的序列是序列表中示出的SEQ ID NO：97的第58位核苷酸至第1010位核苷酸。该序列可作为RNA分子表达，被纯化，在体外喂饲试验中进行检验，以测定对玉米根虫的抑制。
T7 RNA聚合酶启动子被引入到SEQ ID NO：97的第58位核苷酸至第1010位核苷酸示出的核苷酸序列的上游，从该构建体(pIC17527)来产生RNA。采用三份重复样品，在针对玉米根虫的体外喂饲试验中对此类RNA加以检验，所述检验针对beta微管蛋白阳性对照(上文所述)、200ppm Cry3Bb和未受处理的对照来进行，并且测定平均死亡率。未受处理的对照样品展示出了小于大约3-5％的死亡率，而所有其它检验样品展示出了大约20至大约55％的死亡率。Cry3Bb样品展示出了大约20至大约36％的死亡率，而pIC17527样品(15ppm)则展示出大约38至大约45％的死亡率。同样为大约15ppm的D8(如上文所示的beta微管蛋白)样品展示出大约38至大约52％的死亡率。基于这些结果，alpha微管蛋白构建体被放置于植物功能性启动子的控制之下，用于转化玉米植株，针对抵抗玉米根虫侵袭的能力，对从所述转化产生的转化事件加以检验。
用SEQ ID NO：97所示的核苷酸序列区转化来自R0玉米植株的根部。简言之，将上述SEQ ID NO：97中编码dsRNA构建体的序列在5’端与由可操作连接于玉米hsp70内含子的e35S启动子构成的序列相连，在3’端与NOS3’转录终止和聚腺苷化序列相连。将该表达盒放置于草苷膦选择盒的下游。然后将这些相连的盒放置进Agrobacterium tumefaciens植物转化功能载体，新载体被命名为pMON72829(alpha微管蛋白dsRNA构建体)，用于转化玉米组织，使其具有草苷膦耐受性，选择事件，转移进土壤。R0植株的根被喂饲给western玉米根虫幼虫(WCR，Diabrotica virifera)。用含有抗生素和草苷膦的MS0D培养基将转基因玉米根转移到培养皿上，进行体外选择。用细头刷使每个皿中每条根受到两只WCR幼虫的侵袭。用Parafilm密封这些皿，防止幼虫逃逸。试验在27℃，60％的RH Percival培养箱中于完全黑暗下进行。对污染和幼虫质量加以监测。在根部组织进食六天之后，将幼虫转移到96孔板中的WCR膳食中。幼虫被允许进食该膳食八天，使得总的试验为十四天长。对幼虫质量和存活加以记录，用于分析。一种分析是在幼虫质量数据和Dunnett’s检验基础上进行的，用于寻找与LH244(未转化的阴性对照)进行比较的统计学显著性。WCR幼虫在进食两种事件，ZM_S125922和ZM_S125938之后，较之进食阴性对照植株的幼虫的生长，明显发育迟缓(α＝0.05)(p＜0.02)。进食阴性对照植株的幼虫展示出了大约0.6至大约0.8mg的平均幼虫质量，而进食转基因根部的幼虫则展示出了大约0.1至大约0.2mg的平均幼虫质量。
达到合适大小后，将使用pMON72829产生的转基因植株(R0)种植到含有Metromix土壤的10英寸瓶中。当植株达到V4生长阶段，使大约1000个Western玉米根虫(WCR，Diabrotica virifera)卵侵袭进根部区域。同样基因型的非转基因玉米在相似的生长阶段被侵袭，以用作为阴性对照。对卵进行预孵育，使得能在侵袭的24小时内发生孵化。幼虫被允许在根系统进食3周。从土壤移开植株，对其进行清洗，使得可针对幼虫进食对根部加以评测。使用Node Injury Scale(NIS)对根部损伤加以分级，其中0，表示没有损伤，1表示根的一节短了1.5英寸以内，2表示两节短了，3表示3节短了。因为用于评测的植株是转化之后直接来自组织培养物的，还因为转化事件是独特的，所以此时针对每种事件仅评测单株植株，不能获得统计结果。试验中的所有植株都展示出了幼虫进食的征兆，这表明获得了成功的侵袭。阴性对照植株根部呈现中度至严重损伤，Node Injury Scale上平均为大约1.9。对来自八种不同转基因事件的单株植物加以检验。这些转基因植物中三株的根部提供了对幼虫进食的优秀控制，Node InjuryScale为平均大约0.2或更小。来自转基因植物中两株的根部展示出了中度进食损伤，而三株其它转基因五没有展示出对幼虫进食的控制。该数据表明，表达于转基因植物中并且该植物提供于玉米根虫膳食中时，编码能形成dsRNA的RNA序列的双链核苷酸序列完全能提供针对玉米根虫有害生物侵袭的保护。
关于缺乏一致的可观察到的死亡率或者选用来进行基因遏制的序列(包括EF1alpha、26S蛋白体亚基以及多种其它cDNA序列)的其它作用，一种解释可能是，对于这些基因而言，表达的是编码下述蛋白的基因群中存在的同源物，所述蛋白具有相似的功能，但是展示出足够大的序列差异，使得使用选来进行遏制的这些序列时，RNAi途径不能发挥作用来遏制同源物。
实施例2
本实施例描述了显著的有害生物抑制，这是通过向无脊椎有害生物喂饲含有从该有害生物获得的双链RNA序列的膳食来实现的。
通过应用从六种不同的玉米根虫cDNA文库序列获得的双链RNA序列的样品，来制备足以饲养玉米根虫幼虫的人工膳食。玉米根虫幼虫被允进食膳食数日，较之仅被允许进食对照膳食的玉米根虫，对死亡率、发病率和发育迟缓加以监测。用于膳食中的核苷酸序列是从SEQID NO：35、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：52、SEQID NO：7和SEQ ID NO：31所示的序列获得的，它们每种对应于从玉米根虫cDNA文库获得的核苷酸序列，它们的推断氨基酸序列翻译分别对应于被注释为40kDa V-ATPase同源物、EF1α同源物、26S蛋白体亚基同源物、保幼激素环氧化物羟化酶同源物、CHD3同源物以及β-微管蛋白同源物。
按照上文所述，产生对应于这些序列的双链RNA。通过使用RNAseIII酶对对应的dsRNA加以切割来产生siRNA，已知该酶能将dsRNA切割为12-15bp的dsRNA片段，所述片段含有2-3个核苷酸的3’悬挂以及5’磷酸和3’羟基末端。以这种方式产生的siRNA与技能展示出与用Dicer酶(真核RNAi途径中所涉及的)产生的siRNA相同的性质。
按照上文所述，将dsRNA和siRNA以大约0.15ppm上样到CRW膳食中。按照上文所述，针对每种dsRNA或siRNA样品，对12只单只玉米根虫幼虫进行单独检验，13天后评估结果。
较之未受处理的对照(UTC)，进食含有0.15ppm下述dsRNA序列的膳食的幼虫中观察到了幼虫质量的显著降低(p＜0.05)，所述dsRNA序列是SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：31所示的。对应于SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：7的序列的siRNA也提供了幼虫质量的显著降低(p＜0.05)。但是，幼虫样品大小却不足以确定建立：导致幼虫质量较之对照最大程度减少的dsRNA或siRNA究竟是随机变化的结果？还是明确的基于双链RNA介导的对根虫幼虫中一些生物学功能的抑制的结果？因此，基于这些记过，用较大的幼虫样品大小，对对应于SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：31的RNA序列加以重新评测。
针对评测中四种RNA序列的每一种，将dsRNA或siRNA样品应用到72孔的每个中。通过将含有RNA的30微升体积应用到膳食表面以及允许样品浸入以及允许膳食表面干燥，按照上文所述，向每个孔上样0.15ppm的dsRNA或siRNA。将单只幼虫加入到每个孔中，培养13天。评测幼虫死亡率和发病率，测定存活幼虫的质量。生物试验结果显示于表1中。
表1.生物试验结果
所有siRNA样品都为每孔0.15ppm
UTC-10mM TrisHCl pH 7.5
STE-标准误差
dsRNA生物试验中，1-噬菌体λdsRNA，EPICENTERTECHNOLOGIES，Madison，Wisconsin；siRNA生物试验中，RNAi Kit，AMBION，Austin，Texas
2-Cry3Bb变体，dsRNA生物试验中为300ppm，siRNA生物试验中为200ppm。
使用Tukey’s HSD方法，对所有样品进行互相比较，而非仅与任何单个对照进行比较。每种被检验的dsRNA或siRNA都观察到了显著的幼虫发育迟缓，这是通过较之存活幼虫未受处理的对照的平均质量减少来判断的。更为重要地，双链小干扰RNA样品展示出了导致一定水平的死亡率和发病率(基于减少的幼虫质量)的能力，该水平至少和阳性对照样品Cry3Bb变体11231一样有效。上述结果表明，从玉米根虫细胞中存在的信使RNA序列获得的任何双链RNA分子，在玉米根虫的膳食中提供给玉米根虫时，都有效于抑制有害玉米根虫对植物物种的侵袭。
实施例3
本实施例描述了用于在植物细胞中表达的核苷酸序列，以及在玉米根虫膳食中提供此类核苷酸序列的效果。
用从玉米根虫cDNA文库获得的CHD3编码序列去构建编码经稳定的双链RNA的核苷酸序列。编码CHD3氨基酸序列直向同源物或同源物一部分的、SEQ ID NO：171所示的cDNA序列被用于构建引物对，所述引物对用于热扩增反应，其中使用玉米根虫基因组模板DNA。SEQID NO：5和SEQ ID NO：6示出的引物对能扩增双链基因组扩增子，其中一条链展示出SEQ ID NO：7所示的序列。从SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列来产生三条核苷酸序列片断。使用SEQ ID NO：7示出的核苷酸序列作为模板，在热扩增反应中，用展示出SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示的序列的热扩增引物对，产生了第一条核苷酸片断(SEQ ID NO：174)。使用SEQ ID NO：7示出的核苷酸序列作为模板，在热扩增反应中，用展示出SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的序列的热扩增引物对，产生了第二条核苷酸片断(SEQ IDNO：13)。使用SEQ ID NO：7示出的核苷酸序列作为模板，在热扩增反应中，用展示出SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15所示的序列的热扩增引物对，产生了第三条核苷酸片断(SEQ ID NO：16)。第一条片断链之一的3’端与第二条片断链之一的3’端互补，从而在含有这两条片断的热扩增反应中，这些互补的末端杂交，以允许两条链从它们分别的3’端进行聚合酶介导的延伸。第二条片断另一条链的3’端与第三条片断链之一的3’端互补，从而在含有这两条片断的热扩增反应中，这些互补的末端杂交，以允许两条链从它们分别的3’端进行聚合酶介导的延伸。在含有所有这些片断以及它们互补序列，即第一条、第二条和第三条片断的热扩增反应中，用SEQ ID NO：8和SEQ IDNO：15所示的热扩增引物序列，产生了如SEQ ID NO：17所示的新序列，该新序列被置于在植物中工作的启动子控制之下时，能产生与SEQ ID NO：17所示的序列高度相同的RNA核苷酸序列，只是除了存在尿嘧啶残基以取代胸腺嘧啶残基。该RNA核苷酸序列可以利用第三条片断与第一条片断的反向互补性，形成为经稳定的RNA分子，其中，SEQ ID NO：17中对应于第三条片断的大约第303位核苷酸至大约第473位核苷酸的部分与SEQ ID NO：17中对应于第一条片断的大约第1位核苷酸至大约第171位核苷酸的部分杂交，第一条和第三条片断通过第二条核苷酸序列片断相连，在该实施例中，由SEQ ID NO：17中对应于第二条片断的大约第172位核苷酸至大约第302位核苷酸的部分表示。对应于SEQ ID NO：17的核苷酸序列在植物细胞中的表达导致经稳定的RNA分子的合成。能将SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列转录为RNA序列的植物细胞可被提供于玉米根虫的膳食中。作为CHD3同源蛋白合成被抑制的结果，进食此类植物细胞的玉米根虫停止进食，发育为成年甲虫被阻碍，繁殖被阻碍，死亡或遭到这些影响的任何或全部。
用从玉米根虫cDNA文库获得的β-微管蛋白编码序列去构建编码经稳定的双链RNA的核苷酸序列。编码β-微管蛋白氨基酸序列直向同源物或同源物一部分的、SEQ ID NO：18所示的cDNA序列被用于构建引物对，所述引物对用于热扩增反应，其中使用玉米根虫基因组模板DNA。SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20示出的引物对能扩增双链基因组扩增子，其中一条链展示出SEQ ID NO：21所示的序列。从SEQ ID NO：21所示的核苷酸序列来产生三条核苷酸序列片断。使用SEQ ID NO：21示出的核苷酸序列作为模板，在热扩增反应中，用展示出SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23所示的序列的热扩增引物对，产生了第一条核苷酸片断(SEQ ID NO：173)。使用SEQ ID NO：21示出的核苷酸序列作为模板，在热扩增反应中，用展示出SEQ IDNO：25和SEQ ID NO：26所示的序列的热扩增引物对，产生了第二条核苷酸片断(SEQ ID NO：27)。使用SEQ ID NO：21示出的核苷酸序列作为模板，在热扩增反应中，用展示出SEQ ID NO：28和SEQID NO：29所示的序列的热扩增引物对，产生了第三条核苷酸片断(SEQID NO：36)。第一条片断链之一的3’端与第二条片断链之一的3’端互补，从而在含有这两条片断的热扩增反应中，这些互补的末端杂交，以允许两条链从它们分别的3’端进行聚合酶介导的延伸。第二条片断另一条链的3’端与第三条片断链之一的3’端互补，从而在含有这两条片断的热扩增反应中，这些互补的末端杂交，以允许两条链从它们分别的3’端进行聚合酶介导的延伸。在含有所有这些片断以及它们互补序列，即第一条、第二条和第三条片断的热扩增反应中，用SEQID NO：22和SEQ ID NO：29所示的热扩增引物序列，产生了如SEQID NO：31所示的新序列，该新序列被置于在植物中工作的启动子控制之下时，能产生与SEQ ID NO：31所示的序列高度相同的RNA核苷酸序列，只是除了存在尿嘧啶残基以取代胸腺嘧啶残基。该RNA核苷酸序列可以利用第三条片断与第一条片断的反向互补性，形成为经稳定的RNA分子，其中，SEQ ID NO：31中对应于第三条片断的大约第338位核苷酸至大约第577位核苷酸的部分与SEQ ID NO：31中对应于第一条片断的大约第31位核苷酸至大约第250位核苷酸的部分杂交，第一条和第三条片断通过第二条核苷酸序列片断相连，在该实施例中，由SEQ ID NO：31中对应于第二条片断的大约第251位核苷酸至大约第337位核苷酸的部分表示。对应于SEQ ID NO：31的核苷酸序列在植物细胞中的表达导致经稳定的RNA分子的合成。能将SEQ IDNO：31所示的核苷酸序列转录为RNA序列的植物细胞可被提供于玉米根虫的膳食中。作为β-微管蛋白合成被抑制的结果，进食此类植物细胞的玉米根虫停止进食，发育为成年甲虫被阻碍，繁殖被阻碍，死亡或遭到这些影响的任何或全部。
实施例4
本实施例描述了在无脊椎有害生物膳食中提供一种或多种具有杀虫作用的组合物以及一种或多种从该无脊椎有害生物获得的双链RNA序列的协同效果，其中，所述一种或多种dsRNA序列以前提供于有害生物膳食中时已展示出了杀虫效果。
如实施例3所示，在无脊椎有害生物的膳食中提供从该有害生物获得的双链RNA分子，导致对有害生物中一种或多种生物功能的抑制，以及由此作用于获得杀虫效果，导致了有害生物的死亡，或者一些其它可被测量到的、减少了有害生物侵袭特定环境或宿主能力的特征。加入一种或多种其它杀虫剂(每种互相各不相同，每种都通过与dsRNA获得其杀虫效果的方式不同的方式来获得其杀虫效果)，可以使得对有害生物控制的水平提高，并且将进一步降低：单独使用以获得堆有害生物的抑制时，有害生物可能对一种或多种杀虫剂或dsRNA发展出抗性的可能性。
为对此加以检验，令CRW幼虫进食下述膳食，其中包括进了不同含量的Cry3Bb根虫抑制蛋白，以及固定量的双链RNA，所述RNA是按照实施例2或3中所述来配制的，例如，对应于SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：31的dsRNA。观察到了对有害生物抑制的协同效果。如实施例2和3中所示，Cry3Bb的LD50量被用于获得大约50％的昆虫幼虫死亡率，以及存活幼虫健康程度的随同降低(通过幼虫重量较之阴性对照的减少来判断的)。减少膳食中杀昆虫蛋白的量，导致死亡率的随同降低，以及存活幼虫平均重量的增加。加入对应于SEQ IDNO：31或SEQ ID NO：17的dsRNA，在每种浓度的Cry3Bb中都导致几乎完全的死亡率，任何存活物的平均重量也大幅降低。这表明了协同效果。协同性可能是通过引入任何含量的Cry3Bb(其已被显示为：会在中肠膜中引入孔)导致的对幼虫中肠的干扰来获得的。孔可以允许更高水平的双链RNA种类透入细胞中，或者甚至透入到血淋巴中，导致更为高效的将dsRNA种类运送进幼虫，由此在对目标mRNA的遏制中导致更为有效的降低。孔形成组合物与双链RNA组合物的特定组合导致增加的和协同性的杀虫作用，因为dsRNA更能在血淋巴中分散，对远离有害生物肠道的细胞和组织施加影响。特定的孔形成组合物包括但不限于，从B.thuringiensis和相关物种获得的杀昆虫毒性蛋白(无论它们是否能对某特定昆虫展示出杀昆虫作用)，进一步包括但不限于，此类毒素的孔形成结构域。此类孔形成组合物还可包括一种或多种孔形成毒素或其结构域或其组合物，它们每种都互不相同，每种都展示出不同的作用模式，这是通过每种毒素或结构域的通道形成属性来判断的，其包括，离子通道形成的动力学、电导态(conductance state)的大小、总的膜电导、离子特异性以及离子通道门禁属性。此类孔形成组合物与特异于遏制鞘翅类物种一种或多种基因的dsRNA分子的组合被特别包括进本文。
实施例5
本实施例描述了V-ATPase的核苷酸序列片段，其以双链RNA形式提供于CRW物种膳食中时，有用于控制有害昆虫。
SEQ ID NO：104所示的序列是cDNA克隆，其代表编码下述蛋白的2400个核苷酸的mRNA中的1870个核苷酸，所述蛋白展示出与Drosophila melanogaster液泡ATPase(68kd，亚基2)的高度的序列相同性。使用从最初的序列信息设计的引物，在两条链上对该cDNA克隆进行完全测序。这些测序引物作为SEQ ID NO：105至SEQ IDNO：120列出。SEQ ID NO：121和SEQ ID NO：122是引物序列，用于从克隆载体pSPORT(Invitrogen)中的cDNA产生SEQ ID NO：104的拷贝。每条引物含有20个核苷酸的T7启动子序列，其为1-20位核苷酸。SEQ ID NO：121中的21-44位核苷酸和SEQ ID NO：122中的21-45位核苷酸对应pSPORT载体中插入的cDNA侧翼的序列。这些引物允许对含有cDNA片段(其任意端，侧翼有T7启动子)的DNA模板进行扩增，允许用T7 RNA聚合酶体外产生双链RNA。当将从SEQID NO：104获得的双链RNA包括进CRW膳食中时，观察到大约80％的死亡率。
通过使用下述扩增引物组，对SEQ ID NO：104的六个不同区域加以检验：SEQ ID NO：123和SEQ ID NO：124，其对应于SEQ ID NO：1的1至291位核苷酸(被称为部分#1，271个碱基对)；SEQ ID NO：125和SEQ ID NO：126，其对应于292至548位核苷酸(被称为部分#2，260个碱基对)；SEQ ID NO：127和SEQ ID NO：128，其对应于549至830位核苷酸(被称为部分#3，271个碱基对)；SEQ ID NO：129和SEQ ID NO：130，其对应于840至1345位核苷酸(被称为部分#4，505个碱基对)；SEQ ID NO：131和SEQ ID NO：132，其对应于1360至1621位核苷酸(被称为部分#5，261个碱基对)；SEQ ID NO：133和SEQ ID NO：136，其对应于1540至1870位核苷酸(被称为部分#6，278个碱基对)。注意，部分5和6重叠了大约80个碱基对。当这6个部分分开包括进CRW膳食中时，#1、#2、#3和#4显示出94％至100％范围内的CRW死亡率。部分#5和#6没有显示出高于未受处理的对照中可见背景以上的CRW死亡率。部分#1代表的序列被进一步分为三个更小的部分，这三个更小的部分中的每一个都由部分#1中至少大约150至大约180个相连核苷酸所代表，从而使得部分#1中第一个亚部分与部分#1中第二个亚部分重叠，部分#1中第三个亚部分与第二个亚部分重叠。在CRW生物试验中对这些亚部分中的每种分别进行检验。使用这三种更短的序列，观察到了80％至90％之间的死亡率。
对从CRW基因获得的dsRNA分子的生物活性加以检验的第二种手段是构建自身互补的RNA分子。通过将反向定位的同一DNA序列与T7 RNA聚合酶启动子组合，可以合成能自身互补的单个RNA分子。一种此类RNA分子是通过将SEQ ID NO：104所示的核苷酸序列中的1至345位核苷酸与50至325位核苷酸组合得到的。得到的序列被示为SEQ ID NO：137，其被命名为pIC17527。将pIC17527克隆进pTOPT2.1(Invitrogen)。使用pTOP2.1中的T7启动子，产生了大约500个碱基对核苷酸的dsRNA，将其包括进CRW膳食。得到的死亡率在80％至100％之间。
实施例6
本实施例描述了dsRNA对Colorado薯虫(Leptinotarsadecemlineata)的口服毒性。
使用Ambion mirVana试剂盒(目录号1560)和推荐方案(AmbionInc.，Atustin，TX)，从Colorado薯虫(CPB)，Leptinotarsa decemlineata中分离出总RNA。对于每种制剂，使用占据微离心管中大约200μL体积的CPB幼虫。使用Invitrogen Thermoscript RT-PCR系统(目录号11146)和推荐用于随机引物介导cDNA合成的方案(nvitrogen，Carlsbad，CA)，用5微克总RNA来制备cDNA。该cDNA被用作为模板，以扩增V-ATPase A亚基2直向同源物序列，其中使用Taq DNA聚合酶和寡居核苷酸引物pr 550(SEQ ID NO：160)和pr552(SEQ IDNO：161)。通过比对来自Manduca sexta(SEQ ID NO：151)、Aedesaegypti(SEQ ID NO：152)、Drosophila melanogaster(SEQ ID NO：153)和Diabrotica virgifera(WCR)的最近的V-ATPase A直向同源体核苷酸序列，选出最小简并性的区域，来设计上述引物。引物pr550对应M.sexta基因序列中的230-252位核苷酸，而引物pr552对应M.sexta基因序列中的1354-1331位核苷酸。
使用递减(touchdown)扩增程序来获得扩增，其中使用下述循环参数：
步骤1.94℃，2分钟；
步骤2.94℃，30秒；
步骤3.50℃，2分钟；
步骤4.72℃，2分钟
(步骤2-4进行35个循环，步骤3中每个循环的递减为-0.3℃)
步骤5.72℃，10分钟；以及
步骤6.4℃。
将从cDNA扩增得到的大约1.2kb的DNA片段克隆进载体pCR2.1-TOPO(InVitrogen)，以产生重组质粒pIC17105。克隆插入的核苷酸序列(SEQ ID NO：144)与来自Western玉米根虫，Diabroticavirgifera的V-ATPase A亚基2直向同源物序列仅共享82％的核苷酸序列相同性，但是，关于被编码的V-ATPase A蛋白的推断氨基酸序列却共享97％的序列相同性。
使用引物pr568(SEQ ID NO：162)和pr569(SEQ ID NO：163)，扩增出质粒pIC17105中的V-ATPase A直向同源物序列，所述引物被设计为“通用”引物，用于从pCR2.1-TOPO中产生具有侧翼的T7聚合酶启动子序列的DNA模板。扩增得到的DNA被用作为模板，用于dsRNA合成，其中使用Ambion MEGAscriptTM试剂盒(目录号1626)和推荐方案(Ambion Inc.，Austin，TX)。在昆虫喂饲试验中，将从L.decemlineata V-ATPase A直向同源序列获得的经纯化的dsRNA喂饲给L.decemlineata的幼虫。
CPB膳食由13.2g/L琼脂(Serva 11393)、140.3g/L Bio-Serve预混合物(F9380B)、5ml/L KOH(18.3％w/w)和1.25ml/L福尔马林(37％)构成。将膳食以200μL的小份分散进96孔板上，在应用样品之前简短干燥。向每个孔中应用20μL检验样品，用灭菌水作为未受处理的校验(check)(UTC)。在加入昆虫幼虫之前令平板干燥。用细毛刷向每个孔中加入一只新生的CPB幼虫。用聚酯薄膜密封所述的板，用昆虫针通气。每项处理检验四十只幼虫。在27℃，60％RH和完全黑暗下对生物试验板进行10-12天的培养。对这些平板记录幼虫发育迟缓和死亡率。使用4统计软件(SAS Institute，Cary，N.C.，USA)来分析数据。
表2.dsRNA对CPB幼虫的口服毒性
基于使用CPB特异性V-ATPase dsRNA的口服毒性生物试验，可通过在有害生物膳食中提供表达一种或多种下述dsRNA序列来控制CPB对植物的侵袭，所述dsRNA序列是特异于CPB有害生物中遏制一种或多种基因的。
实施例7
本实施例描述了在使用昆虫特异性dsRNA的人工膳食上对多种鳞翅类幼虫进行的生物试验的结果。
使用Ambion mirVana试剂盒(目录号1560)和推荐方案(AmbionInc.，Atustin，TX)，从Spodoptera frugiperda、Helicoverpa zea、Agrotisipsilon和Ostrinia nubilalis的第二龄至第三龄幼虫中分离出总RNA。对于每种制剂，使用占据微离心管中大约200μL体积的幼虫。
使用Invitrogen Thermoscript RT-PCR系统(目录号11146)和推荐用于随机引物介导cDNA合成的方案(nvitrogen，Carlsbad，CA)，用来自上述鳞翅类物种中每种的5微克总RNA来制备cDNA。该cDNA被用作为模板，以扩增特异于每种鳞翅类物种的V-ATPase A亚基2直向同源物序列，其中使用Taq DNA聚合酶和寡居核苷酸引物pr 550(SEQ ID NO：160)和pr552(SEQ ID NO：161)。
通过比对来自Manduca sexta、Aedes aegypti、Drosophilamelanogaster和Diabrotica virgifera(WCR)的最近的V-ATPase A直向同源体核苷酸序列，选出最小简并性的区域，来设计上述引物。引物pr550对应M.sexta基因序列中的230-252位核苷酸，而引物pr552对应M.sexta基因序列中的1354-1331位核苷酸。
使用递减PCR方案，以及实施例6所述的循环参数来获得扩增。将扩增得到的DNA产物克隆进pCR2.1-TOPO，进行测序以验证它们的相同性。含有直向同源物基因序列的重组质粒列于表3中。
表3.鳞翅类V-ATPase A亚基2直向同源物序列
使用引物pr555(SEQ ID：164)和pr556(SEQ ID NO：156)扩增出质粒pIC17088、pIC17101、pIC17102、pIC17102中的V-ATPase A直向同源物序列，所述引物被设计为：产生侧翼反向有T7聚合酶启动子的DNA片段，用于体外dsRNA合成。
使用Ambion MEGAscriptTM试剂盒(目录号1626)和推荐方案(Ambion Inc.，Austin，TX)，从这些扩增得到的DNA模板来合成针对FAW、BCW和CEW直向同源物序列的双链RNA(dsRNA)，将其以10ppm用于昆虫生物试验。
针对这些试验，制备人工的鳞翅类膳食(165g/L SouthlandMultiple Species Diet，14.48g/L琼脂)，将其分散至128孔板中，每个孔500μl。将样品分散到膳食上，放置于27℃和35％湿度的“干燥”腔中，其中，过量水分蒸发。一旦被干燥，就用单只新生幼虫去侵袭每个孔，用穿孔的聚酯薄膜密封条密封。在27℃对所述的板进行六至八天的培养。未受处理的昆虫在六至八天耗尽了它们各自孔中的全部膳食。用每孔4ml人工膳食来制备五十孔板，将在试验结束之前膳食即耗尽或几乎耗尽的所有昆虫转移到新的板中。密封这些板，将它们放回到培养箱中，在总共十至十二天后，再对所有生物试验加以评测。
较之未受处理的校验，在幼虫死亡率或质量获得方面，来自这些针对鳞翅类昆虫物种的生物试验的结果没有显示出显著的作用(使用Tukey-Kramer HSD针对所有对进行比较)，采用该试验，观察到了生长(regimen)。在使用dsRNA和亚致死量的孔形成BT杀昆虫蛋白(以前的实验中已知对上述鳞翅类有害生物有毒性)的组合进行的生物试验中，也没有观察到对幼虫死亡率和质量获得的影响。
实施例8
本实施例描述了用于测定dsRNA对棉铃象鼻虫，Anthonomusgrandis的口服毒性的生物试验。
使用Ambion mirVana试剂盒(目录号1560)和推荐方案(AmbionInc.，Atustin，TX)，从棉铃象鼻虫(BWV)，Anthonomus grandis的幼虫分离出总RNA。对于每种制剂，使用占据微离心管中大约200μL体积的BWV幼虫。使用Invitrogen Thermoscript RT-PCR系统(目录号11146)和推荐用于随机引物介导cDNA合成的方案(nvitrogen，Carlsbad，CA)，用5微克总RNA来制备cDNA。该cDNA被用作为模板，以扩增V-ATPase A亚基2直向同源物序列，其中使用Taq DNA聚合酶和寡居核苷酸引物pr 550(SEQ ID NO：160)和pr552(SEQ IDNO：161)。
通过比对来自Manduca sexta、Aedes aegypti、Drosophilamelanogaster和Diabrotica virgifera(WCR)的最近的V-ATPase A直向同源体核苷酸序列，选出最小简并性的区域，来设计上述引物。引物pr550对应M.sexta基因序列中的230-252位核苷酸，而引物pr552对应M.sexta基因序列中的1354-1331位核苷酸。
使用递减PCR方案，以及实施例6所述的循环参数来获得扩增。将从cDNA扩增得到的大约1.2kb的DNA片段克隆进pCR2.1-TOPO(Invitrogen)，对插入测序，以进行验证。使用引物pr568(SEQ ID：162)和pr569(SEQ ID NO：163)扩增出V-ATPase A直向同源物序列(SEQ ID NO：149)，所述引物被设计为“通用”引物，用于从pCR2.1-TOPO中产生具有侧翼的T7聚合酶启动子序列的DNA模板。
使用Ambion MEGAscriptTM试剂盒(目录号1626)和推荐方案(Ambion Inc.，Austin，TX)，从该扩增得到的DNA模板来合成双链RNA(dsRNA)。
为进行棉铃象鼻虫，Anthonomus grandis Boheman的生物试验，按照厂商说明书，使用基于琼脂的人工昆虫膳食(Bioserv-F9247B；Gast and Davich，1966)。将大约200μl的融化膳食分散进96孔微滴定板，令其冷却固化。然后将含有大约10ppm dsRNA的样品(20μl)覆盖到膳食上，令其干燥，所述dsRNA对应于V-ATPase A之相同源物序列(SEQ ID NO：149)。然后将25μl 0.1％琼脂中的昆虫卵(0-14)分散到膳食上。然后用穿孔密封条(Zymark#72281)去密封微滴定板。在27℃对试验进行十至十二天的培养，通过测定幼虫粪便积累来评估活性。没有观察到对幼虫死亡率或质量获得的影响，但是这可能是棉铃象鼻虫特定进食生理学的结果。在膳食中挖洞可能显著降低了摄取的dsRNA的剂量，因此显著减少了采用表面进食生理学时会观察到的任何作用。以均匀方式将dsRNA包括进山市将可能获得显著的死亡率和减少的质量获得。
来自棉铃象鼻虫的其它目标基因序列可被克隆，并被用作为模板，用于体外合成dsRNA，然后可在昆虫生物试验中对dsRNA加以检验，以评定它们的效果。例如，核糖体蛋白L19(rpl19)基因可被用作为用于dsRNA合成的模板。为设计简并寡核苷酸引物的目的，对来自Bombyx mori(SEQ ID NO：154)、Drosophila melanogaster(SEQID NO：155)、Anopholes gambiae(SEQ ID NO：156)和Diabroticavirgifera(SEQ ID NO：157)的针对rpl19直向同源物的核苷酸序列进行比对，鉴定出最小简并性的共有区域。引物pr574(SEQ ID NO：166)和pr577(SEQ ID NO：168)或引物pr575(SEQ ID NO：167)和pr577(SEQ ID NO：168)可被用于从很多种不同昆虫物种中扩增出可能的rpl19直向同源物序列。
使用递减扩增方案以及如实施例6所述的循环参数来获得扩增。将从棉铃象鼻虫cDNA扩增得到的大约0.4kb的DNA片段克隆进载体pCR2.1-POTO(Invitrogen)，对插入测序，以进行验证。使用引物pr568(SEQ ID：162)和pr569(SEQ ID NO：163)扩增出rpl19直向同源物序列(SEQ ID NO：149)，所述引物被设计为“通用”引物，用于从pCR2.1-TOPO中产生具有侧翼的T7聚合酶启动子序列的DNA模板。
实施例9
本实施例描述了用于测定dsRNA对赤拟谷盗，Triboliumcastaneum幼虫的口服毒性的生物试验。
一些有害昆虫是商业上特别重要的，因为它们会侵袭从特定作物生产的农产品制品以及经过加工的材料。一种特别的此类有害生物是赤拟谷盗。在从特定作物生产的农产品制品以及经过加工的材料中存在特异于抑制此类有害生物中一种或多种基因的一种或多种dsRNA种类，将有用于控制此类有害生物侵袭。
使用Ambion mirVana试剂盒(目录号1560)和推荐方案(AmbionInc.，Atustin，TX)，从赤拟谷盗(RFB)，Tribolium castaneum的幼虫分离出总RNA。对于每种制剂，使用占据微离心管中大约200μL体积的RFB幼虫。使用Invitrogen Thermoscript RT-PCR系统(目录号11146)和推荐用于随机引物介导cDNA合成的方案(nvitrogen，Carlsbad，CA)，用5微克总RNA来制备cDNA。该cDNA被用作为模板，以扩增V-ATPase A亚基2直向同源物序列，其中使用Taq DNA聚合酶和寡居核苷酸引物pr 550(SEQ ID NO：160)和pr552(SEQ IDNO：161)。
通过比对来自Manduca sexta、Aedesaegypti、Drosophilamelanogaster和Diabrotica virgifera(WCR)的最近的V-ATPase A直向同源体核苷酸序列，选出最小简并性的区域，来设计上述引物。引物pr550对应M.sexta基因序列中的230-252位核苷酸，而引物pr552对应M.sexta基因序列中的1354-1331位核苷酸。
使用递减PCR方案，以及实施例6所述的循环参数来获得扩增。将从cDNA扩增得到的大约1.2kb的DNA片段克隆进pCR2.1-TOPO(Invitrogen)，对插入测序，以进行验证。使用引物pr568(SEQ ID：162)和pr569(SEQ ID NO：163)扩增出V-ATPase A直向同源物序列(SEQ ID NO：150)，所述引物被设计为“通用”引物，用于从pCR2.1-TOPO中产生具有侧翼的T7聚合酶启动子序列的DNA模板。
使用Ambion MEGAscriptTM试剂盒(目录号1626)和推荐方案(Ambion Inc.，Austin，TX)，从该扩增得到的DNA模板来合成双链RNA(dsRNA)，将其用于昆虫生物试验。将小麦面粉与水和对应于V-ATPase A直向同源物序列(SEQ ID NO：150)的dsRNA均匀混合物，令其干燥，组合物被用作为赤拟谷盗生物试验的底物。在数天培养之后，通过从面粉/dsRNA混合物中提取象鼻虫幼虫来观察杀昆虫效果。
来自赤拟谷盗的其它目标基因序列可被克隆，并被用作为模板，用于体外合成dsRNA，然后可在昆虫生物试验中对dsRNA加以检验，以评定它们的效果。例如，核糖体蛋白L19(rpl19)基因可被用作为用于dsRNA合成的模板。为设计简并寡核苷酸引物的目的，对来自Bombyx mori、Drosophila melanogaster、Anopholes gambiae和Diabrotica virgifera的针对rpl19直向同源物的核苷酸序列进行比对，鉴定出最小简并性的共有区域。引物pr574(SEQ ID NO：166)和pr577(SEQ ID NO：168)或引物pr575(SEQ ID NO：167)和pr577(SEQID NO：168)可被用于从很多种不同昆虫物种中扩增出可能的rpl19直向同源物序列。
使用递减扩增方案以及如实施例6所述的循环参数来获得扩增。将从赤拟谷盗cDNA扩增得到的大约0.4kb的DNA片段克隆进载体pCR2.1-POTO(Invitrogen)，对插入测序，以进行验证。使用引物pr568(SEQ ID：162)和pr569(SEQ ID NO：163)扩增出rpl19直向同源物序列(SEQ ID NO：159)，所述引物被设计为“通用”引物，用于从pCR2.1-TOPO中产生具有侧翼的T7聚合酶启动子序列的DNA模板。
实施例10
本实施例描述了用于测定dsRNA对白蛴螬(white grub)和铁线虫(wireworm)的口服毒性的生物试验。
使用Ambion mir Vana试剂盒(目录号1560)和推荐方案(AmbionInc.，Atustin，TX)，从白蛴螬或铁线虫的幼虫分离出总RNA。对于每种制剂，使用占据微离心管中大约200μL体积的幼虫。使用InvitrogenThermoscript RT-PCR系统(目录号11146)和推荐用于随机引物介导cDNA合成的方案(nvitrogen，Carlsbad，CA)，用5微克总RNA来制备cDNA。该cDNA被用作为模板，以扩增V-ATPase A亚基2直向同源物序列，其中使用Taq DNA聚合酶和寡居核苷酸引物pr 550(SEQ ID NO：160)和pr552(SEQ ID NO：161)。
通过比对来自Manduca sexta、Aedes aegypti、Drosophilamelanogaster和Diabrotica virgifera(WCR)的最近的V-ATPase A直向同源体核苷酸序列，选出最小简并性的区域，来设计上述引物。引物pr550对应M.sexta基因序列中的230-252位核苷酸，而引物pr552对应M.sexta基因序列中的1354-1331位核苷酸。
使用递减PCR方案，以及实施例7所述的循环参数来获得扩增。将从cDNA扩增得到的大约1.2kb的DNA片段克隆进pCR2.1-TOPO(Invitrogen)，对插入测序，以进行验证。使用引物pr568(SEQ ID：162)和pr569(SEQ ID NO：163)扩增出V-ATPase A直向同源物序列(SEQ ID NO：150)，所述引物被设计为“通用”引物，用于从pCR2.1-TOPO中产生具有侧翼的T7聚合酶启动子序列的DNA模板。
使用Ambion MEGAscriptTM试剂盒(目录号1626)和推荐方案(Ambion Inc.，Austin，TX)，从该扩增得到的DNA模板来合成双链RNA(dsRNA)，将其用于昆虫生物试验。数天生物试验后，观察口服毒性的效果。
来自白蛴螬或铁线虫的其它目标基因序列可被克隆，并被用作为模板，用于体外合成dsRNA，然后可在昆虫生物试验中对dsRNA加以检验，以评定它们的效果。例如，核糖体蛋白L19(rpl19)基因可被用作为用于dsRNA合成的模板。为设计简并寡核苷酸引物的目的，对来自Bombyx mori、Drosophila melanogaster、Anopholes gambiae和Diabrotica virgifera的针对rpl19直向同源物的核苷酸序列进行比对，鉴定出最小简并性的共有区域。引物pr574和pr577或引物pr575和pr577可被用于从很多种不同昆虫物种中扩增出可能的rpl19直向同源物序列。
使用递减扩增方案以及如实施例7所述的循环参数来获得扩增。将从赤拟谷盗cDNA扩增得到的大约0.4kb的DNA片段克隆进载体pCR2.1-POTO(Invitrogen)，对插入测序，以进行验证。使用引物pr568(SEQ ID：162)和pr569(SEQ ID NO：163)扩增出rpl19直向同源物序列，所述引物被设计为“通用”引物，用于从pCR2.1-TOPO中产生具有侧翼的T7聚合酶启动子序列的DNA模板。
实施例11
本实施例描述了用于测定dsRNA对蚊，Aedes aegypti的口服毒性的生物试验。
使用Ambion mir Vana试剂盒(目录号1560)和推荐方案(AmbionInc.，Atustin，TX)，从Aedes aegypti的幼虫分离出总RNA。对于每种制剂，使用占据微离心管中大约200μL体积的Aedes aegypti幼虫。使用Invitrogen Thermoscript RT-PCR系统(目录号11146)和推荐用于随机引物介导cDNA合成的方案(nvitrogen，Carlsbad，CA)，用5微克总RNA来制备cDNA。该cDNA被用作为模板，以扩增V-ATPaseA亚基2直向同源物序列，其中使用Taq DNA聚合酶和寡居核苷酸引物pr 550(SEQ ID NO：160)和pr552(SEQ ID NO：161)。
通过比对来自Manduca sexta、Aedes aegypti、Drosophilamelanogaster和Diabrotica virgifera(WCR)的最近的V-ATPase A直向同源体核苷酸序列，选出最小简并性的区域，来设计上述引物。引物pr550对应M.sexta基因序列中的230-252位核苷酸，而引物pr552对应M.sexta基因序列中的1354-1331位核苷酸。
使用递减PCR方案，以及实施例7所述的循环参数来获得扩增。将从cDNA扩增得到的大约1.2kb的DNA片段克隆进pCR2.1-TOPO(Invitrogen)，对插入测序，以进行验证。使用引物pr568(SEQ ID：162)和pr569(SEQ ID NO：163)扩增出V-ATPase A直向同源物序列(SEQ ID NO：150)，所述引物被设计为“通用”引物，用于从pCR2.1-TOPO中产生具有侧翼的T7聚合酶启动子序列的DNA模板。
使用Ambion MEGAscriptTM试剂盒(目录号1626)和推荐方案(Ambion Inc.，Austin，TX)，从该扩增得到的DNA模板来合成双链RNA(dsRNA)，将其用于昆虫生物试验。数天生物试验后，观察对昆虫幼虫的效果。
来自蚊的其它目标基因序列可被克隆，并被用作为模板，用于体外合成dsRNA，然后可在昆虫生物试验中对dsRNA加以检验，以评定它们的效果。例如，核糖体蛋白L19(rpl19)基因可被用作为用于dsRNA合成的模板。为设计简并寡核苷酸引物的目的，对来自Bombyx mori、Drosophila melanogaster、Anopholes gambiae和Diabrotica virgifera的针对rpl19直向同源物的核苷酸序列进行比对，鉴定出最小简并性的共有区域。引物pr574和pr577或引物pr575和pr577可被用于从很多种不同昆虫物种中扩增出可能的rpl19直向同源物序列。
使用递减扩增方案以及如实施例7所述的循环参数来获得扩增。将从cDNA扩增得到的大约0.4kb的DNA片段克隆进载体pCR2.1-POTO(Invitrogen)，对插入测序，以进行验证。使用引物pr568(SEQID：162)和pr569(SEQ ID NO：163)扩增出rpl19直向同源物序列，所述引物被设计为“通用”引物，用于从pCR2.1-TOPO中产生具有侧翼的T7聚合酶启动子序列的DNA模板。
使用Ambion MEGAscriptTM试剂盒(目录号1626)和推荐方案(Ambion Inc.，Austin，TX)，从该扩增得到的DNA模板来合成双链RNA(dsRNA)，将其用于昆虫生物试验。
其它蚊类物种可被包括进本发明的范围。可使用合适的寡核苷酸引物，对来自Aedes、Culex和Anopholes物种的合适目标基因序列加以扩增，将其克隆进载体pCR2.1-POTO(Invitrogen)，对插入测序，以进行验证。使用引物pr568(SEQ ID：162)和pr569(SEQ ID NO：163)扩增出克隆目标序列，所述引物被设计为“通用”引物，用于从pCR2.1-TOPO中产生具有侧翼的T7聚合酶启动子序列的DNA模板。
使用Ambion MEGAscriptTM试剂盒(目录号1626)和推荐方案(Ambion Inc.，Austin，TX)，从这些扩增得到的DNA模板来合成双链RNA(dsRNA)，将其用于昆虫生物试验。
实施例12
本实施例描述了：从V-ATPase的3’UTR区域制得的dsRNA是如何显示出对目标的调控的。
WCR V-ATPase 3’UTR的片断(ca.300bp的dsRNA)已被用于进行WCR生物试验，但是却未能在12天的生物试验中显示出发育迟缓和死亡率。V-ATPase编码区域中大小相当的片断却在一定浓度范围内展示出了显著的发育迟缓和死亡率。对从喂饲WCR V-ATPase 3’UTR片断4天的WCR幼虫提取的总RNA进行Northern印记杂交(以及用编码区域探针去进行探测)显示：较之未受处理的幼虫，V-ATPase目标RNA显著降低(概括为NBP#7497215)。但是，留下了可被探测到的信号，这表明，用3’UTR dsRNA片断(较之使用编码区域片断)对目标的敲除较为无效，和/或来自可能的第二种V-ATPase基因的贡献，所述第二种基因具有与第一种V-ATPase基因明显不同的3’UTR。对WCR进行的Southern印记杂交数据与基因组中存在超过一种杂交基因序列的观点一致，但是对EST的检验以及有局限的家族PCR却未显示有可能的第二种基因被转录。
在此要重要指出，虽然确定出使幼虫发育迟缓以及杀死幼虫的潜在目标是关键的，但是通过Northern印记杂交或定量PCR对目标基因的表达进行简单检测也能发现可运用RNAi策略的目标。上述结果加上着眼于V-ATPase目标的其它Northern实验已经显示，在昆虫中，dsRNA存在的数小时内，RNA对于转录本丰度的影响是可以看出的。
实施例13
本实施例描述了一种方法，用于使用ta-siRNA介导的沉默方法来执行对有害昆虫基因的遏制。
在对植物有害的生物中使基因沉默的方法使用了近来发现的反式作用小干扰RNA(ta-siRNA)类组(Dalmay et al.，Cell 101：543-553，2000；Mourrain et al.，Cell 101：533-542，2000；Peragine et al，Genes andDevelopment，18：2368-2379，2004；Vazquez et al，MoI Cell 16(l)：69-79，2004；Yu et al.，Mol Plant Microbe Interact 16：206-216，2003)。ta-siRNA是从天然存在的miRNA靶向的单链RNA转录本获得的。使用微小RNA以诱发ta-siRNA用于在植物中进行基因沉默的方法被描述于美国临时专利申请序列号60/643,136(Carrington et al.2004)中，其通过引用整体并入本文。鉴定出了至少一种在玉米根虫幼虫肠道上皮细胞中表达的有害生物特异性miRNA。然后用该有害生物特异性miRNA去鉴定出：至少一种目标RNA转录本序列，所述序列与细胞中表达的miRNA互补。对应的目标序列是不超过21个相连核苷酸的短序列，当在具有功能性RNAi途径的细胞类型中，RNA转录本的一部分与其对应的miRNA接触时，所述短序列导致沉默子介导的对所述转录本的切割。一旦鉴定出了miRNA目标序列，将至少一种miRNA目标序列与第二条序列融合，所述第二条序列对应于将使用该方法进行沉默的有害生物基因的一部分。例如，将miRNA目标序列与玉米根虫液泡ATPase(V-ATPase)基因的序列融合。miRNA目标序列可被放置于V-ATPase基因的5’端，3’端或嵌入到该基因中间。使用对应于多种miRNA基因的多种miRNA目标序列，或者在miRNA目标序列和V-ATPase序列的嵌合体中多次使用同一种miRNA目标序列使用可能是优选的。V-ATPase序列可以是任意长度的，但最小为21bp。
使用大量合适的启动子或其它转录调控元件中的任何物质，将miRNA目标序列和v-ATPase的嵌合体表达于植物细胞中，至少在将被提供于有害生物膳食的细胞类型(例如，用于控制玉米根虫的玉米根部)中能发生转录即可。
该方法可以具有额外优点：能将较长的RNA分子运送至目标有害生物。典型地，在植物中产生的dsRNA会被Dicer快速加工为短RNA，当以外源方式喂饲给一些有害生物时，这可能没有用。在该方法中，在植物细胞中产生单链转录本，其被有害生物摄取，在有害生物细胞中转化为dsRNA，在细胞中，其再被加工为能对一种或多种有害生物中的一种或多种基因造成转录后沉默的ta-siRNA。
实施例14
本实施例描述了对CRW cDNA序列与来自非CRW的其它来源的序列的比较，以及对(1)与其它来源的序列一样的序列以及(2)CRW独有的序列的鉴定。在两种生物中保守的cDNA序列是潜在的RNAi候选序列，其可被用于靶向这两种生物的基因表达和功能。或者，选出用于CRW基因遏制的下述序列可能是人们需要的，在(a)其它有害生物，(b)非目标生物以及(c)被选来用CRW遏制序列转化的植物基因组中，没有所述序列的已知同源序列存在。
选出六条CRW cDNA序列，用于于其它来源的序列进行比较。特定的序列包括编码alpha-微管蛋白、beta-微管蛋白、CHD3、液泡质子泵E亚基、V-ATPase A亚基以及丝蛋白(thread protein)的序列。核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103中。使用NCBI megablast程序(Altschul et al.，J.Mol.Biol.215：403-410，1990)，将CRW cDNA序列与来自GenBank的多种生物的所有公开cDNA相比，搜索参数如下所示：
-W21 -b50 -v50
这需要至少21体(21-mer)的完美匹配，仅保留最好的50个匹配和对齐。对结果进行过滤，仅包括属于Insecta目的生物，并且蜜蜂(Apis mellifera)被排除在外。虽然仅在六条CRW cDNA序列上进行了分析，但同样的方法可用于CRW或其它目标生物中所有的cDNA或unigene序列，而不会有过分的负担和实验。
使用六条CRW cDNA序列，从20种不同的昆虫生物中鉴定出了总共145种匹配。它们包括若干有害生物物种，例如，豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)、亚洲柑橘木虱(Diaphorina citri)和人头虱(Pediculus humanus)。
这些结果展示于下表4中，其中展示了查询序列与击中序列之间的匹配、匹配百分比相同性以及获得击中序列的昆虫物种。例如，鉴定出，来自SEQ ID NO：98中第844至1528位核苷酸的片断与来自豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)的GenBank序列编号GI：47521748中第812至128位核苷酸的片断高度相同。这两条序列共享大约85％的相同性。
实施例15
本实施例描述了：使用与已知序列和现有的结构域共有模型的匹配，从对本文公开的核苷酸序列的翻译来鉴定预测的蛋白质功能性结构域，以及基因家族。
首先用“翻译器”程序产生蛋白序列，所述程序将Unigene翻译为钛序列，这是通过下述步骤进行的：与已知蛋白的同源性；基于模型的从头开头的基因结构预测；以及最长的开放读码框(ORF)。校正由于测序错误导致的框移位。然后针对Pfam数据库(覆盖很多常见蛋白家族的隐Markov模型(HMM)和多种序列比对的大集合)来搜索蛋白序列(The Pfam Protein Families Database，Bateman et al.，Nucleic Acids Research 32：D138-D141，2004)。使用缺省严谨度，用程序HMMPAM(Durbin et al.，Biological Sequence Analysis：ProbabilisticModels of Proteins and Nucleic Acids，Cambridge University Press，1998)来搜索蛋白HMM模型。进行进一步的过滤，仅保留期望值为0.1或更小的那些匹配作为显著匹配。20303条玉米根虫肽序列中，用1317种不同的蛋白结构域和家族鉴定了4199(21％)条。
分析结果被展示于序列表文件的特征(feature)区域，具有下述特性：Pfam名、Pfam描述以及与HMMPFAM分数的匹配水平、期望值(E-值)和肽序列中结构域拷贝的数量。
实施例16
本实施例描述了一种方法，用于提供用于dsRNA介导的基因沉默的DNA序列。更具体地，本实施例描述了对可用于dsRNA介导的基因沉默中的改进的DNA的选择，这是通过下述步骤来实现的：(a)从目标基因选出最初的DNA序列，其包括多于21个的相连核苷酸；(b)鉴定出至少一条更短的DNA序列，其来自最初DNA序列的区域，由被预测为不产生不想要的多肽的区域构成；以及(c)选出用于dsRNA介导的基因沉默的DNA序列，其包括至少一条更短的DNA序列。不想要的多肽包括但不限于，与致敏性多肽同源的多肽以及与已知的多肽毒素同源的多肽。
WCR V-ATPase已展示出：能在玉米根虫喂饲试验中发挥作用，以检验dsRNA介导的沉默(作为控制幼虫生长的手段)。来自Western玉米根虫(WCR)(Diabrotica cirgifera virgifera LeConte)的液泡ATPase基因(V-ATPase)的cDNA序列被选出，用作为最初的DNA序列(SEQ ID NO：104)。针对下述区域对该最初的DNA序列加以筛选，在所述区域中，每一条包含至少21个核苷酸的相连片段仅与已知脊椎动物序列中21个相连核苷酸中的小于21个匹配。鉴定出了三条超过大约100个相连核苷酸的片断，其中不含上述21/21击中；第一条序列片断对应于SEQ ID NO：104中的739-839位核苷酸，第二条序列片断对应于SEQ ID NO：104中的849-987位核苷酸，第三条序列片断对应于SEQ ID NO：104中的998-1166位核苷酸。组合这三条序列，构建嵌合DNA序列(SEQ ID NO：1)，用于对相应得CRW V-ATPase编码序列进行dsRNA介导的基因沉默。在上文所述的CRW生物试验中对新颖的嵌合DNA序列加以检验。
本说明书中提到的所有公开文本、专利和公开的专利申请都通过引用被并入本文，这与特别地、单独地声明将每种单独的公开本文或专利通过引用并入本文一样。

Claims (14)

1.用于控制植物中玉米根虫侵袭的方法，包含在所述植物中表达抑制玉米根虫中基因的dsRNA和展示出针对所述玉米根虫的生物活性的杀虫剂，其中所述杀虫剂是Bacillus thuringiensis杀昆虫蛋白。
2.权利要求1的方法，其中所述植物是选自由以下构成的组的植物：紫花苜蓿、莳萝(aneth)、苹果、杏、朝鲜蓟、芝麻菜、芦笋、鳄梨、香蕉、大麦、豆、甜菜(beet)、黑莓、蓝莓、椰菜、抱子甘蓝、卷心菜、芥菜、香瓜、胡萝卜、木薯、花椰菜、芹菜、樱桃、芫荽、柑橘、克莱门氏小柑橘、咖啡、玉米、棉花、黄瓜、花旗松、茄子、苦苣、宽叶莴苣、桉树、茴香、无花果、葫芦、葡萄、柚子、哈密瓜、豆薯、奇异果、莴苣、韭菜、柠檬、酸橙、火炬松、芒果、瓜、蘑菇、坚果、燕麦、黄秋葵、洋葱、桔、装饰用植物、木瓜、欧芹、豌豆、桃、花生、梨、胡椒、柿、松树、菠萝、大蕉、李、石榴、白杨、马铃薯、南瓜(pumpkin)、温柏、辐射松、菊苣、萝卜、覆盆子、水稻、裸麦、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜(squash)、草莓、甜菜(sugarbeet)、甘蔗、向日葵、红薯、苏合香、蜜柑、茶、烟草、番茄、草皮、蔓生植物、西瓜、小麦、薯蓣以及小胡瓜植物。
3.权利要求1的方法，其中所述基因是编码蛋白质的目标基因，其预测的功能选自由下述功能所构成的组：肌肉形成，保幼激素的形成，保幼激素的调控，离子调控和转运，消化性酶的合成，细胞膜势的保持，氨基酸生物合成，氨基酸降解，精子形成，信息素的合成，信息素传感，触角的形成，翅膀形成，腿的形成，发育和分化，卵的形成，幼虫成熟，消化性酶的形成，血淋巴的合成，血淋巴的保持，神经传递，细胞分裂，能量代谢，呼吸和凋亡。
4.权利要求1的方法，其中所述Bacillus thuringiensis杀昆虫蛋白选自由以下构成的组：Cry1、Cry3、TIC851、CryET70、Cry22、双元杀昆虫蛋白CryET33和CryET34、双元杀昆虫蛋白CryET80和CryET76、双元杀昆虫蛋白TIC100和TIC101、以及双元杀昆虫蛋白PS149B1。
5.权利要求1的方法，其中所述玉米根虫选自由Diabroticavirgifera、Diabrotica barberi和Diabrotica undecimpunctata构成的组。
6.权利要求1的方法，其中所述方法包含将包含抑制玉米根虫中基因的dsRNA的植物和展示出针对所述有害生物的生物活性的杀虫剂以有害生物抑制量提供于所述目标有害生物的膳食中，并且抑制所述玉米根虫进食所述膳食，其中所述杀虫剂是Bacillusthuringiensis杀昆虫蛋白。
7.权利要求6的方法，其中所述膳食选自由植物细胞、植物组织、植物的根、植物种子以及从植物种子生长来的植物所构成的组，其中，所述膳食包含有害生物抑制量的所述dsRNA和所述杀虫剂。
8.权利要求6的方法，其中所述膳食是多种植物细胞。
9.权利要求2的方法，其中所述控制的有害生物侵袭提高了由所述方法生产的作物的产量。
10.用于从田间收获作物的方法，包含在田间培养由权利要求2的方法生产的作物且从田间收获所述作物，其中所述作物包含所述dsRNA和所述杀虫剂。
11.用于生产种子的方法，包含培养由权利要求9的方法生产的作物且由所述作物生产种子，其中所述种子包含可探测量的编码所述dsRNA的基因。
12.由权利要求10的作物生产的农产品或者农产品制品，其中所述农产品或者农产品制品包含可探测量的编码所述dsRNA的基因，其中所述农产品或者农产品制品不包含可再生的植物或其种子，且其中所述农产品或者农产品制品是肉、油、碾碎的植物谷粒，或者包含任何肉、油或下述碾碎的谷粒的任何食物产品，所述谷粒是含有一种或多种本发明的序列的重组植物的。
13.权利要求11的方法，其中所述方法进一步包含将Bacillusthuringiensis杀昆虫蛋白应用于所述种子。
14.权利要求13的方法，其中所述植物的细胞包含所述dsRNA和所述杀虫剂。
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