CN102675438B - 基于RNAi技术的抗虫制剂及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基于RNAi技术的抗虫制剂及方法。揭示了一些对于防治鳞翅目昆虫有用的靶标基因(片段)，基于这些靶标基因的核酸序列制备核酸抑制物或表达核酸抑制物的宿主法，可有效地杀灭鳞翅目昆虫。本发明还揭示了所述核酸抑制物或表达核酸抑制物的宿主的施用方法。

Description

基于RNAi技术的抗虫制剂及方法
技术领域
本发明属于生物技术领域和农业应用领域；更具体地，本发明涉及基于RNAi技术防治鳞翅目害虫的靶标基因，描述了将靶标基因合成为双链RNA制剂并直接应用于鳞翅目害虫田间防治的方法。
背景技术
亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis Guenée)是重要世界性农业害虫，主要危害玉米、高粱、向日葵等重要的粮食经济作物，目前对亚洲玉米螟的防治，仍然是以化学防治为主，但是其对生态环境及粮食安全生产造成了巨大的损害。
化学防治技术的诸多问题已经使得人们不得不寻求更好的害虫治理办法，生物防治虽然可以起到一定的防治作用，但是由于其见效缓慢，效果不明显，受环境影响较大而得不到大众认可，转基因植物可以有效地防治害虫，但是随着单一转基因作物的长期种植，会诱导害虫抗性增加，非靶标害虫危害增加，而且转基因植物安全性目前还存在一些争议，制约着该技术的发展。
RNAi现象自从1991年发现以来迅速发展，研究表明，通过特异基因的RNAi，可以达到定向干涉物种的靶基因，出现某些生理现象，达到研究基因功能的目的，同时，这种现象有着极高的特异性，即同源基因的特定片段对不同物种所发挥的干涉效果并不相同，因此是一种理想的害虫种类特异的防治体系。
目前，利用RNAi技术进行害虫防治已有报道，Baum等(2007)证明v-ATPase对玉米根萤叶甲(Western corn rootworm WCR，Diabrotica virgifera LeConte)有致死效果，可以用于田间防治；同年，Mao等通过将P450的dsRNA导入棉花中，可以导致棉铃虫(cottonbollworm Helicoverpa armigera)死亡；Tian证实通过饲喂的方法可以导致甜菜夜蛾(Spodoptera exigua Hübner)的死亡，一系列的综述文章都表明，RNAi技术作为一种新型的害虫防治方法是完全可行的。
但是，之前的研究也表明，基于RNAi技术的害虫防治还有很多问题需要解决，如：1)如何快速高通量的发掘靶标基因；2)如何简便的应用于田间生产；3)抗性问题；4)安全性问题等等。要想利用RNAi技术进行害虫防治，就需要解决以上问题，首先需要获得足够多的、有效的靶标基因，这样，大量的靶标基因通过不同的组合方式，不同的时期使用不同的基因进行防治，可有效地避免害虫抗性的出现。因此，利用RNAi技术的害虫防治集中在靶标基因的获得以及如何方便地应用于田间这两个急需解决的问题，本发明旨在解决这些问题。
发明内容
本发明的目的在于提供基于RNAi技术的抗虫制剂及抗虫方法。
在本发明的第一方面，提供一种分离的多肽，该多肽选自下组：
(a)SEQ ID NO：43-52任一所示氨基酸序列的多肽；
(b)将SEQ ID NO：43-52任一所示氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-15个；更佳地1-10个；更佳地1-5个；如3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。
在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组：
(a)编码如前所述多肽的多核苷酸；
(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，该多核苷酸选自下组的一种：
(a)SEQ ID NO：1-10、SEQ ID NO：33-42、SEQ ID NO：53-60，任一所示序列的多核苷酸，或互补序列；
(b)与(a)限定的序列在严格条件下杂交的任一多核苷酸或互补序列，其中有害生物对包含至少一条与所述多核苷酸互补的链的dsRNA的摄取，抑制所述有害生物的生长；
(c)与(a)限定的序列具有至少70％(优选至少75％、80％、85％、90％，更优选至少95％、96％、97％、98％、99％)以上的序列一致性的任一多核苷酸或互补序列，其中有害生物对包含至少一条与所述多核苷酸互补的链的dsRNA的摄取，抑制所述有害生物的生长；
(d)包含(a)限定的任一所示序列之至少17-21个连续核苷酸的序列或互补序列，其中有害生物对包含至少一条与所述多核苷酸互补的链的dsRNA的摄取，抑制所述有害生物的生长
在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有权所述的多核苷酸中的一种、二种或多种。
在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体，或其基因组中整合有所述的多核苷酸中的一种、二种或多种。
在本发明的另一方面，提供所述的多核苷酸的用途，用于作为制备特异性干扰有害生物基因表达或抑制有害生物生长的干扰分子的抑制或沉默靶标，所述的有害生物基因选自：LIM蛋白1基因、肌球蛋白3轻链基因、胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因、胰凝乳蛋白酶样蛋白酶C1基因、胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶C3基因、羟丁酸脱氢酶基因、Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂1基因、脂肪酸结合蛋白1基因、羧肽酶4基因。
在本发明的另一方面，提供一种核酸抑制物，选自：
(a)以所述的多核苷酸作为抑制或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，其中有害生物摄取所述核酸抑制物，抑制所述有害生物的生长；或
(b)以有害生物基因作为抑制或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，其中有害生物摄取所述核酸抑制物，抑制所述有害生物的生长，所述的有害生物基因选自：LIM蛋白1基因、肌球蛋白3轻链基因、胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因、胰凝乳蛋白酶样蛋白酶C1基因、胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶C3基因、羟丁酸脱氢酶基因、Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂1基因、脂肪酸结合蛋白1基因、羧肽酶4基因；或
(c)能表达或形成(a)、(b)所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物。
在另一优选例中，所述的核酸抑制物是所述的多核苷酸表达产生的dsRNA，其中有害生物摄取所述dsRNA，抑制所述有害生物的生长。
在另一优选例中，所述的dsRNA，其具有如下结构：
其中，
Seq’正向是与所述的多核苷酸所对应的RNA序列，或它们的序列片段，或包含与选自权利 要求2或3中所限定序列的核苷酸序列之至少一部分互补的核苷酸序列所对应的RNA序列；
Seq’反向为与Seq’正向基本上互补的序列；
X’为无；或为位于Seq’正向和Seq’反向之间的间隔序列，所述间隔序列与Seq’正向和Seq’反向不互补；
||示在Seq’正向和Seq’反向之间形成的氢键。
在另一优选例中，所述的核酸抑制物是构建物，所述构建物含有以下结构：
Seq正向-X-Seq反向；
其中，
Seq正向是所述的多核苷酸或它们的序列片段，或包含与选自权利 要求2或3中所限定序列的核苷酸序列之至少一部分互补的核苷酸序列；
Seq反向为与Seq正向基本上互补的序列；
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反 向不互补。
在本发明的另一方面，提供一种宿主细胞，其包含所述的核酸抑制物。
在本发明的另一方面，提供所述的核酸抑制物或所述的宿主细胞的用途，用于制备防治有害生物的制剂。
在本发明的另一方面，提供一种防治有害生物的制剂，其包含：
安全有效量选自以下的物质：所述的核酸抑制物或所述的宿主细胞；以及；
农药学上可接受的载体。
在另一优选例中，其还包含至少一种选自以下的杀虫剂：化学杀虫剂、马铃薯糖蛋白、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、致病杆菌杀虫蛋白、光杆状菌杀虫蛋白、侧孢芽孢杆菌杀虫蛋白和球形芽孢杆菌杀虫蛋白。
在本发明的另一方面，提供一种防治有害生物的方法，干扰有害生物基因表达，所述的有害生物基因选自：LIM蛋白1基因、肌球蛋白3轻链基因、胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因、胰凝乳蛋白酶样蛋白酶C1基因、胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶C3基因、羟丁酸脱氢酶基因、Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂1基因、脂肪酸结合蛋白1基因、羧肽酶4基因。
在另一优选例中，所述方法包括：将所述的核酸抑制物或所述的宿主细胞喂食和/或喷洒有害生物。
在另一优选例中，所述方法包括：在植物体内表达特异性干扰有害生物基因表达的干扰分子；所述的昆虫基因选自：LIM蛋白1基因、肌球蛋白3轻链基因、胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因、胰凝乳蛋白酶样蛋白酶C1基因、胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶C3基因、羟丁酸脱氢酶基因、Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂1基因、脂肪酸结合蛋白1基因、羧肽酶4基因。
在另一优选例中，所述方法包括：将所述的核酸抑制物导入到植物中。
在本发明的另一方面，提供一种植物或其种子，所述植物由所述的多核苷酸转化获得。
在另一优选例中，所述多核苷酸在植物细胞中表达为dsRNA。
在另一优选例中，所述有害生物是选自：昆虫、螨、真菌、酵母、霉菌、细菌、线虫、杂草和寄生虫以及腐生植物。
在另一优选例中，所述的有害生物是昆虫有害生物，包括但不限于：鳞翅目有害生物、鞘翅目有害生物、半翅目有害生物、以及双翅目有害生物。
在另一优选例中，所述的昆虫有害生物选自鳞翅目昆虫，优选为玉米螟或棉铃虫。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、dsRNA合成示意图。其中，内含子(内元，intro)长度为24nt，序列为AATTACACTGTAACTTGCATGTAA。
图2、10个基因的生物测定结果。CK为空白对照，为正常人工饲养的亚洲玉米螟。
图3、Real-time PCR验证基因表达量结果。
图4、细菌合成的dsRNA纯化后进行电泳检测的结果。DS12和DS28的阳性电泳条带的大小为400-500bp。
图5、荧光标记DS12dsRNA的昆虫体壁渗透点滴试验，右竖列显示在染料Cy3相应的波长下虫体上发生荧光的位置。A：刚滴在体表上的状态；B：1-2小时后已经渗入体内2-3个体节；C：4-5小时后可以渗透到整体虫体。
图6、棉铃虫靶标基因dsRNA对于棉铃虫的致死效果。
具体实施方式
本发明人经过广泛的研究，找到了一些对于防治鳞翅目昆虫有用的靶标基因(片段)，基于这些靶标基因的核酸序列制备核酸抑制物或表达核酸抑制物的宿主，可有效地杀灭鳞翅目昆虫。
术语
如本文所用，所述的“植物”没有特别的限制，只要所述“植物”是易于被昆虫(如鳞翅目昆虫)侵染的，如各种农作物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是(不限于)：双子叶植物、单子叶植物、或裸子植物。更具体地，所述的植物包括(但不限于)：棉花、小麦、大麦、黑麦、水稻、玉米、高梁、甜菜、苹果、梨、李、桃、杏、樱桃、草莓、木莓、黑莓、豆、扁豆、豌豆、大豆、油菜、芥、罂粟、齐墩果、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、花生、葫芦、黄瓜、西瓜、亚麻、大麻、黄麻、柑桔、柠檬、葡萄柚、菠菜、苘苣、芦笋、洋白菜、大白菜、小白菜、胡萝卜、洋葱、土豆、西红柿、青椒、鳄梨、桂皮、樟脑、烟叶、坚果、咖啡、茄子、甘蔗、茶叶、胡椒、葡萄树、蚝麻草、香蕉、天然橡胶树和观赏植物等。
如本文所用，所述的“鳞翅目昆虫”是指任何基因组中包括有选自SEQ ID NO：1-10任一所示的基因(片段)序列的鳞翅目昆虫，且这些基因在所述的昆虫中作为该昆虫生长或生存所必需的基因。所述的鳞翅目包括蛾(moths)，实例包括：谷蛾科(Tineidae)和织蛾科(Oecophoridae)比如衣蛾(Tineola bisselliella)(普通衣蛾(Common Clothes Moth))，和螟蛾科(Pyralidae)比如紫斑谷螟(Pyralis farinalis)(膳食飞蛾(Meal Moth))等。
如本文所用，术语“RNA干扰(RNA interference，RNAi)”是指一些RNA可以高效、特异地阻断体内特定基因的表达，促使mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，其也称为RNA干预或者干涉。RNA干扰是高度特异的在mRNA水平上的基因沉默机制。
如本文所用，术语“干扰RNA”或“dsRNA”是指一种RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰途径(RNAinterference pathway)。
如本文所用，“基本上互补”是指核苷酸的序列是足够互补的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构(如茎环结构)。通常，两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70％的核苷酸是互补的；优选的，至少有80％的核苷酸是互补的；更优选的，至少有90％的核苷酸是互补的；进一步优选的，至少有95％的核苷酸是互补的；如98％、99％或100％。一般地，两条足够互补的分子之间可以具有最多7个不匹配的核苷酸；优选的，具有最多6个不匹配的核苷酸；更优选的，具有最多5个不匹配的核苷酸；进一步优选的，具有最多4个不匹配的核苷酸，如具有0、1、2、3、4个不匹配的核苷酸。
如本文所用，“互补”的序列通常是指将5’-3’方向的序列转换为其3’-5’方向的序列(如5’ATCG 3’→GCTA)，然后再取其互补序列(如GCTA→5’CGAT 3’)。
如本文所用，“茎环”结构也被称作“发夹”结构，是指一种核酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该核酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至少一个“环”结构，包括非互补的核酸分子，即单链区域。即使该核酸分子的两个区域不是完全互补的，核酸的双链部分也可保持双链状态。例如，插入、缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形式的二级结构，然而，该两个区域仍可基本上互补，并在可预见的方式中发生相互作用，形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核酸后，本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环结构。
如本文所用，所述的“核酸抑制物”是指基于本发明的对于防治鳞翅目昆虫有用的靶标基因(片段)或其片段或截短形式制备获得的、具有防治鳞翅目昆虫活性的一类物质的总称。所述的“核酸抑制物”例如是一些干扰分子，包括dsRNA(又称为，双链RNA、双链核糖核酸或双链核糖核苷酸序列)、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA等，或是可以表达或形成所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA或微小RNA的构建物。
如本文所用，所述的“可操作(性)地连接”或“操作性连接”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。
如本文所用，“与DNA序列对应的RNA序列”是指一种RNA序列，若DNA序列是“AT”则RNA序列是“AU”。
“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......构成”、“基本上由......构成”、和“由......构成”；“主要由......构成”、“基本上由......构成”和“由......构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
基因
为了寻找对于防治鳞翅目昆虫有用的靶基因(片段)，本发明人经过了广泛而深入的研究，本发明人深入研究后发现，来自昆虫的LIM蛋白1基因(例如玉米螟LIM蛋白1基因)、肌球蛋白3轻链基因、胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因、胰凝乳蛋白酶样蛋白酶C1基因、胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶C3基因、羟丁酸脱氢酶基因、Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂1基因、脂肪酸结合蛋白1基因、羧肽酶4基因是昆虫发育或生长相关的关键基因，这些基因的表达下调或抑制可以导致昆虫生长发生问题或死亡。
以上述基因作为抑制或沉默靶标，可制备特异性干扰分子，抑制玉米螟生长。本发明还在棉铃虫中获得上述基因的高度同源基因，将其作为抑制或沉默靶标，可制备特异性干扰分子，抑制棉铃虫生长。上述基因还可以是来自其它生物，所述基因的功能已被建立于文献中，其核苷酸序列与玉米螟基因具有高度同源性，可预见这些高度同源基因可作为靶标，制备特异性干扰分子，抑制其他生物的生长。
本文中使用的术语“高度同源”或者“高度同源性”，在提到核酸序列时，表示在严谨条件下与玉米螟基因SEQ ID NO：43-52任何序列或其互补序列能杂交的核苷酸序列。在严谨条件下与玉米螟基因SEQ ID NO：43-52或其互补序列能杂交的序列，是允许两条序列间发生反平行比对的序列，然后两条序列能在严谨条件下以相反链上的对应碱基形成氢键，以形成二体分子，其在严谨条件下是足够稳定的，使用本领域公知方法能探测到。优选地，此类高度同源的序列与玉米螟基因SEQ ID NO：43-52任何序列所示的对照核苷酸序列或其互补序列具有大约65％至大约70％的序列一致性，或者更优选地，大约80％至大约85％的序列一致性，或者最优选地，大约90％至大约95％的序列一致性，至大约99％的序列一致性。
用于确定序列一致性的方法是本领域常规的，其包括使用Blast软件和EMBOSS软件(The European Molecular Biology Open Software Suite(2000)，Rice，P.Longden，I.andBleasby，A.Trends in Genetics 16，(6)pp276-277)。本文使用的术语“一致性”是指序列之间在核苷酸水平上的关系。通过在比较窗中对最优比对的序列(例如，两条或更多)进行比较来确定“一致性百分比”，其中所述比较窗中的序列部分与最优序列比对的参考序列相比可包含插入或缺失。所述参考序列不包含插入或缺失。所述参考窗选自至少10个连续核苷酸至约50、约100或者至约150个核苷酸，优选约50～150个核苷酸。然后，通过测定所述窗中的序列之间一致的核苷酸数目并将该数目除以所述窗中的核苷酸数并乘以100来计算“一致性百分比”。
针对上述靶基因，本发明人进一步研究了可有效下调这些靶基因的靶标基因片段，最终找到了10个靶标基因片段，它们的核苷酸序列选自SEQ ID NO：1-10任一所示的序列。
所述的靶标基因(片段)的片段或截短形式也包括在本发明中，只要这些片段或截短形式在被用于制备所述的核酸抑制物后，该核酸抑制物也具有杀灭鳞翅目昆虫的活性。
本发明人意外地发现，这些靶标基因片段或它们的截短体在昆虫体内发挥着重要的作用，它们被抑制、干扰或沉默将导致昆虫存活率的显著下降或直接死亡。因此，可基于这些靶标基因片段来设计各种核酸抑制物，从而用于害虫的防治。
本发明还提供了一个多核苷酸集(集合)，所述多核苷酸集包括SEQ ID NO：1-10所示的序列。当需要制备防治鳞翅目昆虫的核酸抑制物(如构建物或dsRNA)或其制剂时，可从所述的多核苷酸集中获取1-10条多核苷酸。可基于多个多核苷酸的序列(较佳地，例如是10个)来分别制备核酸抑制物或表达核酸抑制物的宿主，当同时(或混合)应用时，可达到更为广谱、更为有效的杀灭鳞翅目昆虫的效果。
核酸抑制物
任何基于本发明提供的靶标基因(片段)或其片段或截短形式制备获得的、具有防治鳞翅目昆虫活性的物质都可作为核酸抑制物，用于防治鳞翅目昆虫。所述等核酸抑制物较佳的是一些干扰分子，例如，dsRNA、反义核酸、小干扰RNA或微小RNA的构建物，或可以表达或形成所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA或微小RNA的构建物。更佳地是dsRNA或可以表达所述dsRNA的构建物。
根据本发明所提供的基因及其序列，可设计出用于表达dsRNA、反义核酸、小干扰RNA或微小RNA的构建物。因此，本发明提供了一种人工构建的构建物。根据本发明提供的基因及其序列来设计所述的构建物是本领域技术人员可了解的，通常可使该构建物包含一个内含子序列(与两侧序列不互补)，两端连接上互补的基因序列，导入细胞后，能产生“茎环”结构，并且“茎”状部分能够形成dsRNA、反义核酸、小干扰RNA或微小RNA，这种dsRNA、反义核酸、小干扰RNA或微小RNA能特别有效的抑制目的基因的表达。
作为本发明的一种优选方式，所述的构建物含有至少一个如下所示的结构：
Seq正向-X-Seq反向
其中，Seq正向的核苷酸序列选自SEQ ID NO：1-10任一所示的序列或序列片段，Seq正向与Seq反向为基本上互补的核苷酸序列；
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补；
式I所示的结构在可形成如下所示的二级结构：
该结构可进一步被剪切、加工形成双链形式的干扰分子，从而发挥基因沉默的作用。
所述的构建物可以制备成可形成多于1个茎环结构的形式，例如，可以包含2个或2个以上的茎环结构。
通常，所述的构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的构建物。所述的表达载体通常还含有与所述的构建物操作性相连的启动子、复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡那霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当基因序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主。在本发明的方法中，所述的宿主可以是任何适合于携带所述表达载体并能够表达出核酸抑制物的宿主。例如，所述的宿主为大肠杆菌，真菌，酵母，植物细胞，动物细胞等。
用重组DNA转化宿主可用本领域技术人员熟知的常规技术进行，具体视植物种类的不同而定。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。真菌和酵母细胞、植物细胞、动物细胞的转化也是本领域技术人员熟知的。
携带所述构建物或表达载体并能够表达出核酸抑制物的宿主能够直接施用于需要防治的对象(如植物)，以达到防治鳞翅目昆虫的目的。
以上所述的茎环结构的“茎”状部分即由Seq正向和Seq反向相互作用形成，可被加工形成核酸抑制物。所形成的核酸抑制物具有如下结构：
其中，Seq’正向选自SEQ ID NO：1-10任一所示序列对应的RNA序列或序列片段；Seq’反向为与Seq’正向基本上互补的序列。X’为位于Seq’正向和Seq’反向之间的间隔序列，所述间隔序列与Seq’正向和Seq’反向不互补。X’序列可在体外进行切除，也可不进行切除，待dsRNA进入昆虫体内后由昆虫体内的酶(如核酸酶Dicer)加工切除。
所述的核酸抑制物可直接施用于需要防治的对象(如植物)，以达到防治鳞翅目昆虫的目的。
转基因植物
本发明还涉及一种改良植物的抗虫性的方法，该方法包括将所述的核酸抑制物导入到植物中。植物的转基因是本领域技术人员熟知的技术，例如可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得具有抗虫性的植物。
优选的，一种改良植物的抗虫性的方法包括：
(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有所述的核酸抑制物；
(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述的核酸抑制物转入植物细胞或组织或器官；
(3)选择出转入了所述的核酸抑制物的植物细胞或组织或器官；和
(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植物。
可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施所述的方法。
目前，利用植物作为媒介，通过使昆虫服食可干扰昆虫基因表达的核酸抑制物(干扰分子)，从而抑制昆虫的生长或杀灭昆虫已经是本领域人员熟知的技术了，例如Ying-BoMao等，Silencing a cotton bollworm P450 monooxygenase gene by plant-mediated RNAiimpairs larval tolerance of gossypol(NATURE BIOTECHNOLOGY VOLUME 25NUMBER 11 NOVEMBER 2007)中证明了该种方法的有效性。
组合物和防治鳞翅目昆虫的方法
本发明还提供了一种制剂(如农药组合物)，其含有安全有效量的携带所述构建物或表达载体并能够表达出核酸抑制物的宿主(细胞)(如表达)或所述的核酸抑制物(如：20-500μg/ml)；以及农药学上可接受的载体。
本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。
本发明中，“农药学上可接受的”的成分是适用于农业用途而对人或动物(除鳞翅目昆虫以外)、植物没有过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。
本发明中，“农药学上可接受的载体”是用于将本发明的携带所述构建物或表达载体并能够表达出核酸抑制物的宿主或本发明的核酸抑制物传送给鳞翅目昆虫的可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。农药学上可接受的载体可以是液体或固体，较佳的是能够较高程度保持宿主或核酸抑制物活性的载体。
所述制剂(或农药组合物)的剂型可以是多种多样的，包括但不限于：水溶液，悬浮剂，可湿粉剂，可乳化浓缩物，乳液，可喷洒溶液，水性分散系，粉剂，颗粒剂，或微胶囊。应理解，只要能够将本发明的携带所述构建物或表达载体并能够表达出核酸抑制物的宿主或本发明的核酸抑制物在保持全部或部分活性的前提下递送到鳞翅目昆虫的剂型都是可取的。优选那些易于递送的剂型，例如，所述农药组合物是液体喷洒剂、或喷雾剂。
在本发明中，所述的辅剂是一种辅助成分，在组合物中起辅助调节功能，比如其可以是一种表面活性剂、附着助剂或其它类型助剂。
浓缩型的农药组合物中活性成分(即：携带所述构建物或表达载体并能够表达出核酸抑制物的宿主或本发明的核酸抑制物)的含量较高，如含有核酸抑制物200-500μg/ml，而稀释型农药和实际使用的组合物中活性成分含量较低，如含有核酸抑制物20-100μg/ml，施用量为50-1000μl/300-500头，或根据携带所述构建物或表达载体并能够表达出核酸抑制物的宿主(细胞)表达的核酸抑制物含量，参照核酸抑制物施用量，施用一定量的宿主(细胞)。此外，还可以包含其他合适的化学剂、增效剂、微量元素、稳定剂、粘合剂、润湿剂、分散剂、乳化剂、渗透剂、鞣化剂、溶剂、充填剂等常用组分。本发明农药组合物中还可以含有其它活性杀虫剂或杀微生物剂。
在制备农药组合物时，合适的固体稀释剂包括但不限于：硅藻土，玉米壳，磷酸三钙，软木粉，高岭土、膨润土或硅镁土等粘土，和水溶性聚合物。
此外，固体组合物还可以含有一种或多种相容性润湿剂，分散剂，乳化剂或色素，这些成分在固态时也可起稀释剂的作用。
这样的固体组合物可以是粉剂，颗粒剂或可湿粉剂的形式。通常通过研磨获得粉剂，通过造粒或压片获得颗粒剂、片剂或砖型剂。
液体组合物的形式可以是溶液，悬浮液和乳液，也可以将其包在天然或合成聚合物中，并可以包含润湿剂、分散剂或乳化剂。这样的乳液、悬浮液或溶液可用水性、有机或水-有机稀释剂来制备水溶性聚合物(以及上述稀释剂的混合物)。此外，所述稀释剂中可含有例如以上所述离子型或非离子型的润湿剂、分散剂或乳化剂或它们的混合物。
各种制剂的原理都是已知的，并在例如以下文献中有所描述：Winnacker-Kuchler，“Chemische Technologie″化学技术，Vol.7，C.Hauser Verlag Munich，第4版，1986；van Valkenburg，“农药剂型”，Marcel DekkerN.Y.，第2版，1972-73；K.Martens，“喷雾干燥手册”，第3版，G.Goodwin Ltd.London。
用于本发明组合物的所需的配制辅剂，(例如惰性物质，表面活性剂，溶剂和其他添加剂)，也是已知的，其描述例如：Watkins“杀虫粉剂稀释剂和载体手册”第2版，DarlandBooks，Caldwell N.J.；H.v.Olphen，“粘土胶体化学导引”第2版，J.Wiley & Sons，N.Y.，Marsden，“溶剂指南”第2版，Interscience，N.Y.1950；McCutcheon’s，“除垢剂和乳化剂年刊”，MC Publ.Corp.，Ridgewood N.J.；Sisley和Wood，“表面活性剂百科全书”，Chem.Publ.Co.Inc.，N.Y.1964；Schonfelt，“GrenzflachenaktiveAthvlenoxidaddukte”表面活性环氧乙烷加成产物，Wiss.Verlagsgesell.，Stuttgart 1976；Winnacker-Kuchler，“Chemische Technologie″化学技术，Vol.7，C.Hauser Verlag Munich，第4版，1986。
可湿粉剂可均匀分散于水。除活性物质之外，可湿粉剂还可包含润湿剂，分散剂，稀释剂等无环境公害的物质。粉剂的制备可以是：将活性物质与精细粉碎后的滑石、高岭土、膨润土之类天然粘土或硅藻土等固体物质一同研磨。颗粒剂的制备可以是用活性物质喷涂吸附于惰性物质颗粒，或将活性物质溶液通过粘合剂(例如聚乙烯醇、聚丙烯酸钠，或矿物油)施加于载体(例如砂、高岭土或惰性物质颗粒)表面。如果欲与化肥混合施用，则可将合适的活性物质象制备化肥颗粒那样制备成颗粒。
就控制植物中昆虫侵袭的目的而言，通过喷雾应用将昆虫控制用的dsRNA运送到植物表面提供了另一种保护植物的手段。在这种情况下，被工程改造以产生和积累dsRNA的细菌可被发酵，发酵产品被配方为可与常见农业应用兼容的喷雾产品。所述配方可以包括：高效叶片覆盖所需的合适的胶粘物和润湿剂，以及用于保护dsRNA免受UV损害的UV保护剂。此类添加剂是生物杀昆虫剂工业中常用的，也是本领域技术人员公知的。同样地，用于土壤应用的配方可以包括下述颗粒配方，其用作为土壤有害昆虫(例如，玉米根虫)幼虫的饵。
其中所述细菌或酵母细胞被灭活或被杀死，例如通过热处理或机械处理。
本发明人意外地发现，所述的核酸抑制物可通过渗透的方式由昆虫体表进入到昆虫体内。因此可通过将各种核酸抑制物或含有各种核酸抑制物的组合物施用于昆虫体表来达到防治昆虫的目的。所述的施用方式包括但不限于喷洒、涂覆、滴加于昆虫的体表。所述的核酸抑制物选自：dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA；或能表达或形成所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物。
本发明还提供了一种防治鳞翅目昆虫的方法，所述方法包括：将所述的携带所述构建物或表达载体并能够表达出核酸抑制物的宿主(细胞)或所述的核酸抑制物施用于需要防治的对象(如植物，特别是被鳞翅目昆虫侵害的植物；或昆虫本身)。
也可直接用所述的核酸抑制物或含有该核酸抑制剂的农药组合物或表达所述核酸抑制物的宿主细胞喂食昆虫或喷洒昆虫。所述的农药组合物可被制成喷洒剂，从而可直接喷洒用于害虫防治。
本发明针对鳞翅目害虫防治难题，基于RNAi技术开发了10个可用于田间防治的靶标基因的有效片段，并证明了通过喷雾这种简便的方法可以使核酸抑制物起到抑制基因表达的效果，最终导致鳞翅目害虫的死亡，从而达到防治的目的，所述方法方便、快捷、准确且无公害。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明首次揭示了10个用于防治鳞翅目害虫的靶标基因，同时证明了基于这些靶标基因获得的核酸抑制物可直接应用于害虫防治。所述害虫防治方法方便、快捷、准确，并能很好地解决目前害虫防治中所面临的害虫抗性和环境兼容性的问题。
(2)RNAi技术是一种新型高效、定点控制、无公害的害虫防治技术；获得的dsRNA可直接应用于田间，进行害虫防治。
(3)有大量的靶标基因可供筛选，不定期的替换靶标或者混用靶标基因可避免目标害虫产生抗性。
(4)可筛选出物种特异的靶标基因，将对非靶标的影响程度降到最低。
(5)开发成本低，可快速用于生产。
(6)使用方便、环境兼容性好。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1、玉米螟全长靶基因的克隆及靶标基因片段的信息
本发明人从大量的基因中筛选得到10个靶标基因(Wang et al.，PLoS ONE，6(4)：e18644；以及发明专利201010197328.9)，它们的所包含的基因序列片段及信息如表1所示。10个靶标基因编码的蛋白的暂定名称见表2。
表1
表2
根据表1的靶标基因片段，克隆它们的全长靶基因，方法如下：
1、亚洲玉米螟总RNA的提取
以亚洲玉米螟的3龄幼虫为材料，采用常规Trizol法提取RNA，常规方法纯化，DNA酶处理，获得浓度≥300ng/ul、总量≥6ug、OD260/280为1.8～2.2的总RNA样品。
2、mRNA的分离及cDNA的合成
用带有oligo-dT的磁珠分离出带有polyA的mRNA，然后用随机六聚物和Invitrogen的Superscript II reverse transcriptase试剂盒合成cDNA第一链。
3、基因的扩增及测序
利用如表5所示的全长靶基因特异的引物进行RACE克隆，RACE反应参照试剂盒说明书(SMARTer RACE cDNA Amplification Kit)。扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的片段。将获得的基因片段纯化，连接到pMD18-T载体(Takara)中，转化入大肠杆菌Top10菌株，蓝白斑筛选，阳性菌株测序。
表5、玉米螟10个基因RACE引物
克隆的全长靶基因cDNA序列如下：
＞DS2，612bp cDNA序列(SEQ ID NO：33)
GGATTCGACCTCCGCGCACCGCAGTCTCGGCATCTTCGCCCTGTACTGTAATACGCGTTCGGGAGCTCGACTCTCGTAGCGACTCGACGAACAGGATAAGTTAAGCGAGCACAATGCCTTTCAAACCAGCAGACAACCCCAAGTGTCCGAAATGCGGCAAGTCCGTATACGCAGCCGAGGAGAGAGTAGCCGGTGGACTGAAGTGGCACAAGATGTGCTTCAAGTGCGGACTGTGCCAGAAGTTGCTGGACTCCACCAACTGCTCAGAACACGAAGGTGAACTGTTCTGCAAAGTATGCCACGCGCGCAAGTTCGGTCCCAAGGGCTACGGCTTCGGCGGTGGCGCTGGCTGCCTTTCCATGGACGCTGGTGAACACCTGAAGGCTGAAGATGCGAATTGAGCGCGAGCAGCCATCCAGCAGAGCTAGCGGGTCGCCGACACACATCTCGGCCAACCAGCGGTGCCTCGCGAACGCACGCCATACTGTACTTTAATTACTTTAGTTAGGGTTATTTATTCGCTATTGCTTAATTTATTTTGTTTATCGGAACAATATTTATAATTTATACAAAATCCAATAAAAGAGTCGACTACCAACAAAAAAAAAAAAA
＞DS2，95aa(SEQ ID NO：43)
MPFKPADNPKCPKCGKSVYAAEERVAGGLKWHKMCFKCGLCQKLLDSTNCSEHEGELFCKVCHARKFGPKGYGFGGGAGCLSMDAGEHLKAEDAN
＞DS3，819bp cDNA序列(SEQ ID NO：34)
GGGACTGCCGTCGAGCACAGTCTCTCCTTCGTCGATCGTCCAACACACAACACAATGGCGGATAAGGATAAGAAAGTAAAGAAGAAGAAGGCGAAAGAAGATGCGCCAGCTGAGGAGGCGCCCGCACCAGCGGCGCCCGCAGCCAGCGGCGGCAGCGAGAGGCAATCCTCCCGCGGCAGCCGCAAGGCCAAGCGCACCGGCTCCAACGTCTTCTCCATGTTCTCACAGAAGCAGGTCGCCGAATTCAAGGAGGCCTTCCAGCTAATGGACCACGACAAGGACGGCATCATCGGCAAGAACGACCTCCGCGCCACCTTCGACTCGCTCGGCAGGCTGGCGTCCGAGAAGGAGCTGGACGAGATGGTGAACGAGGCCCCCGGCCCGATCAACTTCACGCAGCTGCTGACCCTCTTCGCCAACCGCATGTCCGGCGGCTCCGACGAGGACGACGTCGTCATCAACGCCTTCAAGACCTTCGACGAGGAGGGCAAGATCGACTCCGAGAGGCTCAGGCACGCGCTCATGACCTGGGGAGACAAGTTCTCCGCCGACGAGGTCGACGAGGCGTACGACCAGATGGAAATCGACGACAAGGGCTTCATCGACACCACCAAGCTCATCACCATGCTGACCGCCGCCGCGGAGGAGGACGAGGGCGGCGAAGCTGCGTAGTTCCACCCGCGCCAGTCTCCGCCCGACCCGCGGTTCGCAACATCTAGAACCGACTTTTTATTATAATTTCTATATGTAATTTATTGTTTCCATTTTTTTATTTATATATAATGAAAATATAGTTCTACTATTACCAAAAAAAAAAAA
＞DS3，205aa(SEQ ID NO：44)
MADKDKKVKKKKAKEDAPAEEAPAPAAPAASGGSERQSSRGSRKAKRTGSNVFSMFSQKQVAEFKEAFQLMDHDKDGIIGKNDLRATFDSLGRLASEKELDEMVNEAPGPINFTQLLTLFANRMSGGSDEDDVVINAFKTFDEEGKIDSERLRHALMTWGDKFSADEVDEAYDQMEIDDKGFIDTTKLITMLTAAAEEDEGGEAA
＞DS5，938bp cDNA序列(SEQ ID NO：35)
GCACGAGGGCCGTCCAATGAAGTCAATGAAGTCAATGAAGTCGTCCCTCTTGTTCCTGTTGGTGGTGGCGGTGGCGGCGGCGGAGCTGCTGCAGCCCAACACGCGCTACCACGAGACCGAGGGCATCCCGAAGTTCCAGCTGATGAAGCAGCTGGAGGAGGGAACCGACTTCGATGGCGGCAGGATCTGGGGCGGGCAGGCCGTCAGCGGCGGTACCCATCCTCACCTGGGAGGACTGTGGATCACCCTGACCACTGGACAGAACTCGATCTGCGGCAGTTCGCTGGTCAGCAACACGCGCTCGGTGACGGCGGCTCACTGCTGGCGCACCAGCACCTTGCAGGCGACCATGTTCACCATCGTGTGGAACTCTAACTCTATATTCTGGGGCGGCACGCGCATAAACACCAACCAGGTCATAGAGCACCCGAATTACAACGTGTGGAACTTGAACAACGATGTGGCCGTCATCATACACAACCACGTAAATTTCAACAATAATATCCAGCCAATTGCCCTGGCCACTGGCTCGCAAACCTACGCGGGAACCTGGGCAGTCGCTGCTGGATACGGCCAGACTGGCGATGGTAATTCACCGTCTGGCACTAAGTTCCAAGCCAATCTGCTGGTGATCACCAACTCAGCGTGCCAGGGAACCTGGATGCCCGGCATCGTCATCGCGTCCACGCTGTGCGTGAGCACCGCGCACGGCAGCAGCACCTGCCCCGGCGACTCCGGCGGCCCGCTTGCCGTCGGCTCCGGCAACAACAGGCAACTGATCGGTATTACTTCTTTTGGAACTCAGTGGTGCGCTCAACACCACCCTGCTGGATTCGCTCGAGTCACCTCGTTTGCGTCATGGTTTAACAGCCATATGTAAAAAAACTACAACGTATAAATAAAAGTATAAGTCTTGTACCAAATAAATCTTTCACTAT
＞DS5，287aa(SEQ ID NO：45)
MKSMKSMKSSLLFLLVVAVAAAELLQPNTRYHETEGIPKFQLMKQLEEGTDFDGGRIWGGQAVSGGTHPHLGGLWITLTTGQNSICGSSLVSNTRSVTAAHCWRTSTLQATMFTIVWNSNSIFWGGTRINTNQVIEHPNYNVWNLNNDVAVIIHNHVNFNNNIQPIALATGSQTYAGTWAVAAGYGQTGDGNSPSGTKFQANLLVITNSACQGTWMPGIVIASTLCVSTAHGSSTCPGDSGGPLAVGSGNNRQLIGITSFGTQWCAQHHPAGFARVTSFASWFNSHM
＞DS6，913bp cDNA序列(SEQ ID NO：36)
GGGCAAAAAAAATCCTTCTCGGGCTTCCAAAATGGCAGTAAAAACCGGAATACTTTTCTTCACCCTGCTCGTGGGATGTCTAGCTATCCCCAAGCCCGCGTCGGATGACCTGTCCCAGTTCTTCGAGCATGCCAACCCAGATTCCCGCATCGTCGGCGGGACGGTGGCAGCCATCGGCGCCCACCCTCACATGGTGGCCATGAGCAACGGTCTCCTGATCAGGAGCTTCGTTTGCGGTGGCTCTCTCATCTCCTCCCGTACTGTTCTGACCGCTGCCCACTGCATCGCTGCTGTCTTCAGCTTCGGCTCTCTGAGCAGCTCCCTCCGCGTGACCGTCGGCACCAACAACTGGAACCAGGGTGGAGTGGCCTACGCCCTGGCCCGCAACGTGACTCACGAGCACTACGTCAGCCAGATCATCAAGAACGACATCGGAGTGCTGATCACCTCCTCGCCTGTGGTGTTCACCAATCTCGTCCAGCCCATCACTGTGTCTTATGATTACGCCGGTGCTGGAATCCAGTCCAGAGCCGCTGGTTGGGGCAGAATCAGGGCCGGCGGTCCCATCTCCGCTCAGCTCCTCGAGTTGACCGTGACCACCATCTCCGGCGATCAGTGCGTGCGTGGCGTGGCCCAGGCCTCCGTCGACTTCAACGTCGCCGCCCCACCGGTGGAACCCCACATCGAACTCTGCATCATCCACTCGCCGAACCACGGCATGTGCAACGGTGACTCCGGCAGCGCTCTAGTCCGCCTGGACCGCGGCACCCAGATCGGAATCGTGTCATGGGGCTTCCCCTGCGCCCGCGGCGCTCCCGATATGTTCGTCCGAGTCAGCGCTTTCCAAGACTGGGTCGCCCGCCACTTCGTTGCTTGAATAAATGACTTGATATGATCGTGCAAAAAAAAAAAA
＞DS6，281aa(SEQ ID NO：46)
MAVKTGILFFTLLVGCLAIPKPASDDLSQFFEHANPDSRIVGGTVAAIGAHPHMVAMSNGLLIRSFVCGGSLISSRTVLTAAHCIAAVFSFGSLSSSLRVTVGTNNWNQGGVAYALARNVTHEHYVSQIIKNDIGVLITSSPVVFTNLVQPITVSYDYAGAGIQSRAAGWGRIRAGGPISAQLLELTVTTISGDQCVRGVAQASVDFNVAAPPVEPHIELCIIHSPNHGMCNGDSGSALVRLDRGTQIGIVSWGFPCARGAPDMFVRVSAFQDWVARHFVA
＞DS10，967bp cDNA序列(SEQ ID NO：37)
GGGAGCGTTCATTAACACTAACAACATGAAGGTACTTCTTGGGTCAGTGGTTCTGGTCTTGGCCATCGCGGCTTCTTATGCTGAGGGGCCAGTTAACTACCATCAGAGGATTGGCATTCCTGAGGCAGCTAAGATCAGAAGGACTGAGGAAGATGCGGCCAAGGCTGGTGTCGATCTCAGAATCGTTGGTGGATCCAATGTTGACATCTCCCAAGTACCTTACCAAGTTGGTCTAGTCATCCAAATCCTGTGGATCCTGACTTCTGTGTGCGGAGGCAGCTTGATCTCAAACACCCGTGTGATCACCGCTGCGCACTGCCACCATGACGGTAGCGTCACCGCTCAGTCCCACACCGTCGTGCTCGGCTCCAACACTATCTTCAGCGGTGGTGTCCGTCAAACCACCTCTGACATTGTCATGCACCCACAGTGGACCCCGGAGACCGTTGCTAATGACATTGCCGTCATTAGGATTAACGCTGTTACTTTCACCAATGTGATCCAGCCCATCTCTCTGCCCAGCGGATCTCAGCTAAATAACAACTTCGTAGGCCAGGTCGGAATTGCTTCTGGATTCGGACGCACTTCTGATGGTGCTAACATCCCGAACAACCAACTCGTGAGCTGGGTGAGAGTGCCGATCATCACCAACCAGGCGTGCGCCTCAGTCTTCGGACCCTTCATCTTAAGTAGCACCATCTGCACCAACGGCTCTGGTGGTATGGGCACGTGCCAGGGAGACTCTGGTGGTCCTCTCGCTGTGGAAGTTGGCAACTCTAGGGTCTTGGTCGGTGTGACTTCCTTTGGTGCTGCTGCCGGTTGCCAAGCTGGATTACCTGCGGCGTACGCTCGCGTCACCTCATTCATCTCTTGGATCTTGGCCATATAAGTAAAATGATCTAACGAACCCTACCTGATCTGTAACGTGTGATTGTTATTAAATAATTTAAAAAATAAAAAAAAAAAA
＞DS10，287aa(SEQ ID NO：47)
MKVLLGSVVLVLAIAASYAEGPVNYHQRIGIPEAAKIRRTEEDAAKAGVDLRIVGGSNVDISQVPYQVGLVIQILWILTSVCGGSLISNTRVITAAHCHHDGSVTAQSHTVVLGSNTIFSGGVRQTTSDIVMHPQWTPETVANDIAVIRINAVTFTNVIQPISLPSGSQLNNNFVGQVGIASGFGRTSDGANIPNNQLVSWVRVPIITNQACASVFGPFILSSTICTNGSGGMGTCQGDSGGPLAVEVGNSRVLVGVTSFGAAAGCQAGLPAAYARVTSFISWILAI
DS12
＞DS12，850bp cDNA序列(SEQ ID NO：38)
GGAAATAATTGTCATAAGCAAGATGAGTTTCAACAATAAAGTAGCGTTAGTGACTGGTGCGAGCTCTGGGATCGGAGCAGCTATTGCTCTTAAATTCGCTGGAGAGGGAGCGAACGTTGCCATCGTTGGAAGAAACGCAGCTAAACTAAAAGATGTTACGGAAAGTATCTCGAAGGTCGGTAACAAGCCTCTTGTGATCACCGCCGATGTTACCAAAGAAAGTGATGCTCAAAGAATCATCAACGATACAGTAAAACATTTTGGAAAACTTGACATTCTTGTCAACAATGCAGGAGTGATTCGCTATGCCAGCATTACTGAAGCAGAAGCCATGGCAGCATTTGACCATATCATGAGTACCAACCTGCGTTCCGCTGTCTACATGACCAATCTGGCTGCCAAGCATCTTATTGAAACGAAAGGGAATATAATAAACATATCAAGCGTTACTGGTCAAATGGTGATGGAAAAATCGTTTGCTTACTGCACATCAAAAGCTGCCATGGATCATTTCGCGAGAGCAATCGCGTTGGACTTTGCGCCACATGGTGTTCGCGTGAACAACATTAGCCCTGGGCCGGTGAGGACCGATATCGTTGAAAATATGGGAGTCAGTGCGGAGATTCAAGCAGCAGTATGGGAAACATTCAAAGCAGCAACTCCTTTGAAAAGAATTAGTGAACCAAGTGAGATTGCCGAGCTAGCGGCGTTCTTGGCTAGTGACAAAGCTGTTGGTATCACTGGATCAATTTACGTAACTGATAATGGAGTTTTGCTATCACGTTCAAAGTAATTCACTTAGACAAAAATATCTATTAATATACTTAAGGTAACTTCTGAAAAAAAAAAA
＞DS12，256aa(SEQ ID NO：48)
MSFNNKVALVTGASSGIGAAIALKFAGEGANVAIVGRNAAKLKDVTESISKVGNKPLVITADVTKESDAQRIINDTVKHFGKLDILVNNAGVIRYASITEAEAMAAFDHIMSTNLRSAVYMTNLAAKHLIETKGNIINISSVTGQMVMEKSFAYCTSKAAMDHFARAIALDFAPHGVRVNNISPGPVRTDIVENMGVSAEIQAAVWETFKAATPLKRISEPSEIAELAAFLASDKAVGITGSIYVTDNGVLLSRSK
＞DS28，1008bp cDNA序列(SEQ ID NO：39)
GGGGTTCTTGAAGAAACCATGACCATGGACAAACTGATTGTGTTAGCCGCCTGCATTGCCGCAGCCAGCGCACTTGGATCCTGGAAAAGTGGATTGAGCGTGCGTTTTGGGGTTGGCCTCTTCGGATGGGGTTCTTCCTACTTCATTCATGTCCCCCAGACTGTGGCTGATGCCAAGAACTCCCGCTGGTTGGAAACCCCAAGACCCGATGGCCCCCTGAGCAGTTTGATTATGATGTGTCCTTCCCAGAACGATGTGGTCCTCTGTGCCCTCTATGATGACAATGGTGATGTGGCTGGTCTCCAGATTGCTCTGCCCACTGATAGTTACACCGGCGCTGTCTTGGACTGGGCTACCCAAGGCTACACGTACTGGACTGCACCGGCAAACTCTAATGGACAAGTTAGGAATTACTGGACCTTGCAGCAATACTTCGTTTCTGAAGCCACATTGAAGAAGAGCAAGGAGGAGCGCCGCGCCTCCCGCGTGGCAGGCCGCGTACTGCAGGAGAATGCTGTGTGGGTCACCGGCTTCAACGGAGACCTGATGAGGATCTCCGGCAACGCCAACGAGGTCACCGACACCGCCACCACCCACTTCACCAAACAAGCTTGCATTATTCTCATGGGTCGCCACTACTACTACAACATGACAACCGCCACCGAGTGCAGGTCTGACACCCTCCTGCCGTGGTTCCCACTGCTGGACGTGGGCACTGATCAGCTGATCGGCATGGGTTTCACGTCGTTTGGCCAGCTGCCCGCTAACGCCCTCGTCAAGGACTACTTCGAAAGGCCTAACGTGAGCAATGTTAAGTTGATAGTCCCCGACGGCCCCGAATGCCTCTTCGAACTGGCGGACAGCCCTGGCCTGACCACCATGCACATCTACTACGTGGACTCACCCTGGCTCATCAACTGCATCAACAACTAGGCTCAAGAACTCTACCTCTGTCCTCTACACATGGAATGTAAATAGTTAATAAATTCTGCAGCCAAAAAAAAAAAA
＞DS28，304aa(SEQ ID NO：49)
MTMDKLIVLAACIAAASALGSWKSGLSVRFGVGLFGWGSSYFIHVPQTVADAKNSRWLETPRPDGPLSSLIMMCPSQNDVVLCALYDDNGDVAGLQIALPTDSYTGAVLDWATQGYTYWTAPANSNGQVRNYWTLQQYFVSEATLKKSKEERRASRVAGRVLQENAVWVTGFNGDLMRISGNANEVTDTATTHFTKQACIILMGRHYYYNMTTATECRSDTLLPWFPLLDVGTDQLIGMGFTSFGQLPANALVKDYFERPNVSNVKLIVPDGPECLFELADSPGLTTMHIYYVDSPWLINCINN
＞DS30，798bp cDNA序列(SEQ ID NO：40)
ACATGGGGATGTTTTTCATCCTCGCAGTTTATCAGAACACAATTAAATTAATTAATTTAAAATGTTCAAATTAAGTTTCATTATTTTCATGTTGGTGGCTATTGCGAACGTTTTAAGCAGTGACGCCCCAGCCCCAGACTGCACCTCGCCTCTTGAGACCGGACCATGCAGAGGCGGGAAGGTTGCTTTCGGCTACGATACTGACTTGGAAGGATGCAAACAGTTCATCTACGGAGGATGTGACGGCAACGGCAACCGTTACAACACTCTAGAGGAGTGTCAGGCTGCTTGCGAGAGTGACTGCAACAAATAATAACGAAATGCAAGCAATCAATTGGGTATTTGACAGCACAGTCAATTGACATACTTTTTTTAAACTGTCAAAACGCACCATTCCCTATTTTTCACATTTTGCAAAGTAGAGGGAATCTAAAGGTCATAGCAGACTTATCAACTCGGAAAGGGATCATGACGAGCTATCATCGCCTTTCCCGCGTTGTCAACTGTCAACTGCGAGGCGAGGCGTTTACGTTACTGTGCGGATAGGTGTGGGTTACAGTATGGAGTTTCATACAAATACTGATCGCATCGAGTTGATACGGTTACAATCCCTGTCCGTGTTGATAAGTGTGCTACGTCCTTGAGTTAGCAATGATAACTAAAGCTAAGTGGTGTCGTGTTATTATCGGTAATTAGTGTCAACTACCCAATTGTATCGATATGATTTACCTAAAAGATGAGAAATATTCTTTTTATTTAACTATGTATTTATTATAAAAGCAACAGCCAAAAAAAAAA
＞DS30，83aa(SEQ ID NO：50)
MFKLSFIIFMLVAIANVLSSDAPAPDCTSPLETGPCRGGKVAFGYDTDLEGCKQFIYGGCDGNGNRYNTLEECQAACESDCNK
＞DS34，624bp cDNA序列(SEQ ID NO：41)
AGTTTGTGAAGGACTCTGATCAAAATGGCATACTTTGGAAAGGAATTCTCCTTCGAAAGGGAAGAAAATTTCGATGCATTCGCCGATTTTATCGGTGCCTTTGACGCCAACGCCAAGGGCTTCATGCAGTACAAGCCGAACCAGATCCTCGAGAAGAACGGGGACTCCTACAAGCTGATCTTCAAGACCCCCGCCCTGAACCACGAGGTGGTGTTCAAGTCTGGAGTGCCTTACAGCGACGTCATCCGTGAAGGTTTGACGGCTGAATCCACCATCACCGTCGATGGAGACACCTTCACTCAGGTCCAGGACTACGGCCCCCTTGGCTCCATCACCTTCAAGAGAGAGTACAGCGCCGACCAACTTAAAGTGACTGTCACCAGCAGTAAATGGGACGGCGTTGCCTACAGATACTACAAGGCGTAATCTTCCTACAGTTTAACTTAAGATTTAGGTAGACTTTAAATTAATTTAATAACTCTGATTTGCTATAAATGTAAGCCAACGAAGAAATAATTTTAAAATTGCAGTTATAAACTAACTATTGTAAATAACGAGACACCAATTCACAAGTTTTGATCTGTTATTGTAATAAAATACTTTTTCACCGAAAAAAAAAAAAAA
＞DS34，133aa(SEQ ID NO：51)
MAYFGKEFSFEREENFDAFADFIGAFDANAKGFMQYKPNQILEKNGDSYKLIFKTPALNHEVVFKSGVPYSDVIREGLTAESTITVDGDTFTQVQDYGPLGSITFKREYSADQLKVTVTSSKWDGVAYRYYKA
＞DS35，1433bp cDNA序列(SEQ ID NO：42)
ACATGGGAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATGGGAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATGGGGAGCTATCGAGATGAAGGTTTTGGCGATCGCATTGCTTTTCGTGGCGGTCTACGCCAAGCACGAGGAATATGCTGGTTACAAATCCTACTGTGTAGGACAGAAGAACCAAGCACAGCAACATGCTCTGCAGTCCTTAGAGAATGAGTTCCAGCTAGACTTTCTGGGCCGTGTGACCAGCAGCCAGGAGACCTTGGTCCTGGTCAAGCCTGAATTCCAGGCTGCGTTCACCAAAAGCCTGAAAGCCTTTGGCCTCTCCTACAGGGTCCATGCCGATGACGTAGTCAAAGCGCTCCAGAATGATGATAGGATTATCGAGGAGGTGGTTCAAGAGAAGGCCAGGAATGGGGGTGCCAGGATCCCTTATGACAATTATCAGCCTCTAAGTGTCTACGACGCCTACCTCGACGACATCGCTCGTCGCTACCCCAACGTGGTCACCCTCGTCAGCCCCGCCAACTCCTTCGAAGGCCGCCCCATCAAGTACCTGAAGATATCCACCACCAACTTCCAAGACACCAGCAAGCCTGTCATCTTCATTGACGGAGGCATCCACTCCAGGGAATGGATCTCACCACCCACTGTCACTTGGGCGATCAGGAAACTGGTGGAGGATGTCACCGAACCTGACCTCCTGGAGAGGTTCGACTGGATCCTCTTGCCTATGGTCAACCCTGATGGTTATGAACACAGCCACACATCTAACCGTTTCTGGAGGAAGACACGTTCGGCCACCAGCATTGCATTATGCCGGGGAGTCGACGGCAACCGCAACTACGACTTCGCATGGAACACCGTCGGAACCAGCACCAACCCTTGCTCCGACACTTACGGAGGCCCTACAGCCTTCTCCGAAATCGAGACCAGGGTTGTTCGTGACATCCTCCACGAGAACCTCAGCAGAATGGCTCTGTACCTCACCATGCATAGCTTTGGTAGCATGATCCTCTACCCTTGGGGACATGATGGTTCTTTATCCAACAACGCATTTGCACTCCAGACCGTTGGAGTTGCTATGGCTGATGAGATCTTCACTCATAGTCTCCCTAATTTCCCTAGATATTCCGTTGGCAATTCTCTTCTGACTATTGGGTACGGCGCATCAGGTGCTTCTGAGGATTACGCTCACAGCATCGGCGTGCCCCTGTCGTATACTTACGAGCTTCCAGGGTTGAACGCTGGTATGAACGGTTTCATTCTGGACCCTCGGTTCATCGAGCAGGTCTGCCGGGAGACTTGGGCAGGCATCGTCGTGGGCGCCAGGAGAGCTGGCGACCTCTTCGTCCCCCATCCTTAAATTCTCTATTTGAATAAGTTGTTGATGATCTTTTTTTATAATAAACATTTTTATATTAAACAAAAAAAAAA
＞DS35，427aa(SEQ ID NO：52)
MKVLAIALLFVAVYAKHEEYAGYKSYCVGQKNQAQQHALQSLENEFQLDFLGRVTSSQETLVLVKPEFQAAFTKSLKAFGLSYRVHADDVVKALQNDDRIIEEVVQEKARNGGARIPYDNYQPLSVYDAYLDDIARRYPNVVTLVSPANSFEGRPIKYLKISTTNFQDTSKPVIFIDGGIHSREWISPPTVTWAIRKLVEDVTEPDLLERFDWILLPMVNPDGYEHSHTSNRFWRKTRSATSIALCRGVDGNRNYDFAWNTVGTSTNPCSDTYGGPTAFSEIETRVVRDILHENLSRMALYLTMHSFGSMILYPWGHDGSLSNNAFALQTVGVAMADEIFTHSLPNFPRYSVGNSLLTIGYGASGASEDYAHSIGVPLSYTYELPGLNAGMNGFILDPRFIEQVCRETWAGIVVGARRAGDLFVPHP
实施例2、靶标基因的提取
1、亚洲玉米螟总RNA的提取
以亚洲玉米螟的3龄幼虫为材料，采用常规Trizol法提取RNA，常规方法纯化，DNA酶处理，获得浓度≥300ng/ul、总量≥6ug、OD260/280为1.8～2.2的总RNA样品。
2、mRNA的分离及cDNA的合成
用带有oligo-dT的磁珠分离出带有polyA的mRNA，然后用随机六聚物和Invitrogen的Superscript II reverse transcriptase试剂盒合成cDNA第一链。
3、基因的扩增及测序
利用如表3所示的靶标基因特异的引物进行扩增，将获得的基因片段纯化，连接到pMD18-T载体(Takara公司)中，转化入大肠杆菌Top10菌株，蓝白斑筛选，阳性菌株测序。
表3、10个靶标基因合成dsRNA所用引物
其中，EYFP为增强型黄色荧光蛋白基因，作为外源基因对照。
实施例3、dsRNA的合成
利用本发明所述的方法，运用于玉米螟的研究当中，将前述获取的10个代表性的靶标基因片段或外源基因对照(EYFP)从pMD18-T载体(Takara公司)中切下，连接入改造过的pET-22b质粒，获得了可用于生物测定的dsRNA(如图1)。具体构建方法如下：
dsRNA合成方法：
(1)引物序列(正义链)F：TCG GGATCC XXXXXXXXXX
(正义链)R：GAC AAGCTT XXXXXXXXXX
(反义链)F：CTG CATATG XXXXXXXXXX
(反义链)R：TCG TCTAGA XXXXXXXXXX
其中TCG/GAC为保护位点，标记下划线序列为正义链BamHI/HindIII酶和反义链NdeI/XbaI酶切位点，XXX代表不同基因的引物序列，反义链为反义互补序列，参照表3。
以亚洲玉米螟cDNA为模板分别进行正义链与反义链的PCR扩增，获得PCR产物(扩增条件：94℃3min，94℃30s，55℃30s，72℃30s，72℃10min)，PCR产物用1％的琼脂糖电泳检测。
将获得的PCR产物分别依次连接到改造后的pET-22b(在NcoI和MscI酶切位点之间加入intro形成改造质粒)质粒。即根据酶切位点的位置，先连入正义链，之后再连入反义链，intro在两个酶切位点之间，验证成功后即形成具有两条插入片段的闭合环。
将连接产物转化入HT115(DE3)(购自addgene公司)感受态细胞(此菌株为缺陷性大肠杆菌菌株，具有以下位点：F-，mcrA，mcrB，IN(rrnDrrnE)1，rnc14::Tn10(DE3 lysogen：lavUV5 promoter-T7 polymerase)；在四环素的诱导下通过Tn10转座子的影响导致RNaseIII gene缺失，HT115可以在IPTG的介导下特异的表达T7聚合酶，通过识别插入位点的T7引物序列并折叠产生dsRNA，蓝白斑筛选阳性克隆。
挑取单克隆转入含有100ug/ml的氨苄青霉素和12.5四环素ug/ml的LB液体培养基中，37℃培养10-14h。
将培养液稀释100倍，加入2×YT培养基(蛋白胨16g、酵母提取物10g、氯化钠4g，融入1L水中，PH7.0)待OD595达到0.4时加入0.4mM的IPTG，37℃震荡孵育4h，即获得的基因的dsRNA表达产物。(参照Ravi S Kamath，Maruxa Martinez-Campos，PederZipperlen，Anderw G Fraser，J.Ahringer，Effectiveness of specific RNA-mediatedinterference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans，GenomeBiol 2，0002.1(2000)。
获得的菌可直接用于施药；也可从中纯化重组质粒并分离出dsRNA，用于施药。
实施例4、dsRNA的纯化
根据上一步获得含有dsRNA的表达产物进行纯化，纯化重组质粒并分离出dsRNA的方法如下：
(1)取2ml菌液做质粒小抽，证明质粒得到有效扩增；剩余菌液倒入50ml离心管，4℃5500rpm离心10min；倒置离心管，让剩余LB尽量除去；
(2)加入6.6ml碱裂解液I(50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl(pH 7.6)，10mmol/L EDTA，溶于1L灭菌水后水高温灭菌，加入1％RNase 0.5ml)，吹吸或Vortex重悬细菌；加入1ml新鲜配制的10mg/ml溶菌酶；13.3ml新配制的碱裂解液II(0.2NNaOH，1％SDS)，轻轻转动混匀，室温放置5-10分钟，不可放置超过10min；加入10ml冰预冷的碱裂解液III(5mol/L乙酸钾60.0ml，冰乙酸11.5ml，H2O 28.5ml)，轻轻但完全地颠倒混匀，离心管冰上放置10min；
(3)4℃ 20000g离心30min；根据上清的体积，将其连同0.6倍体积的异丙醇一起加入新的50ml离心管(体积太大则分为两管)，充分混匀，室温放置10min；室温12000g离心15min；
(4)弃上清，用70％乙醇涮洗管壁，倒掉乙醇，倒置干燥10-15min；用3ml水溶解沉淀；用冰预冷核酸溶液至0℃；加入等体积(3ml)冰预冷的5mol/L LiCl，混匀，4℃12000g离心10min；
(5)转移上清至一新的50ml离心管中，加入等体积(6ml)异丙醇，混匀，室温12000g离心10min；
(6)倒去上清后，倒置离心管使液体流干，室温下用70％乙醇洗沉淀和管壁，倒置流干乙醇，使沉淀中乙醇挥发；
(7)用500μl含RNaseA(20μg/ml)的水溶解核酸沉淀，转移溶液到1.5ml离心管中，37℃消化30min；
(8)加等体积(500μl)酚：氯仿，Vortex混匀，用最高速4℃离心2min，转移上清至另一离心管(如蛋白质膜较多，则可重复此步骤直至蛋白除尽)；
(9)加等体积(500μl)氯仿，Vortex混匀以萃取酚，最高速4℃离心2min，转移上清至另一离心管；加入2倍体积的无水乙醇(1ml)，混匀，冰浴15～30min沉淀核酸；最高速4℃离心5min，吸去上清，倒置流尽；
(10)加1ml 70％乙醇，颠倒数次洗涤，最高速4℃离心2min，吸去上清，倒置10-15min使乙醇挥发；
(11)将质粒沉淀用1ml水溶解，再加0.5ml PEG-MgCl2溶液；混匀后室温放置超过10min，室温最高速离心20min，回收质粒；
(12)沉淀用0.5ml 70％乙醇重悬以去除PEG，室温最高速离心5min；重复洗涤一次，吸干乙醇后放置10-20min，使乙醇挥发；
(13)湿润的质粒用200μl ddH2O或TE(pH 8.0)溶解，-20℃保存。
(14)获得的质粒利用BamHI/HindIII酶切，即可获得特异的dsRNA。
上述的dsRNA纯化后进行电泳检测，得到了与目的片段大小一致的电泳图以DS12和DS28为例，电泳结果如图4。
实施例5、dsRNA的应用——喷药
昆虫体壁渗透试验：为了证明dsRNA能够穿过昆虫的体壁，本发明人合成了带荧光的双链RNA(相应于DS12和DS28)。利用标记了Cy3荧光染料的dCTP合成dsRNA(Ambion公司，MEGAscript RNAi Kit)，合成后取0.5μl dsRNA滴在亚洲玉米螟幼虫第5腹节背部，随后在荧光显微镜下进行观察拍照，如图5A；之后每隔半小时观察一次，1小时后可以观察到dsRNA已经渗入体内，见图5B；4小时后，dsRNA已经扩散到整个虫体，见图5C。
本发明人将前述获得的各dsRNA(溶于ddH2O，浓度为50μg/mL)直接喷雾于亚洲玉米螟初孵幼虫上(施用量为300μl/300-500头)。在施用后第5天，9个靶标基因(DS2，DS3，DS6，DS10，DS12，DS28，DS30，DS34，DS35)相应的dsRNA的致死率达到70％以上，如图2所示。而空白对照(CK)和外源基因对照(EYFP)没有显著致死效果。由此表明，RNA可以通过昆虫体表进入昆虫体内，抑制靶标基因，起到杀虫作用，所以基于本发明靶标基因的其它形式的核酸抑制物也可以通过喷洒昆虫起到杀虫作用。
qRT-PCR的方法参照TARAKA公司的SYBR试剂盒中的具体操作步骤。qRT-PCR得结果证实了是由于靶标基因的沉默造成的死亡，证明了本发明的可靠性，如图3所示。
结果
通过dsRNA体壁点滴试验，进一步证明可以利用喷洒双链dsRNA的办法进行害虫防治。
实施例6、表达dsRNA的宿主的应用——喂食
实施例3获得的表达dsRNA的细菌直接添食实验：
1、按实施例3，37℃培养dsRNA表达菌液，培养菌液到OD6000＝2.0左右。待OD595达到0.4时加入0.4mM的IPTG，37℃震荡孵育至OD600＝2.0左右。
2、将菌液与亚洲玉米螟饲料混合(0.1ml/g饲料)，饲料每天更换，用未表达dsRNA的菌液为空白对照，50头幼虫为一个处理组，每天观察记录昆虫死亡率，饲喂1-7天，统计结果。结果如表4。表达dsRNA的宿主喂食产生的杀虫效果，实际上是宿主表达的dsRNA的核酸抑制作用，产生的杀虫作用，所以本发明靶标基因dsRNA或其它形式的核酸抑制物都可以起到喂食杀虫作用。
表4、20μg/ml细菌合成dsRNA喂食玉米螟幼虫死亡率
  编号   死亡率(％)
  CK   10
  dsEYFP   10
  DS2   50
  DS3   56
  DS5   32
  DS6   20
  DS10   64
  DS12   48
  DS28   42
  DS30   46
  DS34   40
  DS35   26
实施例7、DS12和DS28截短形式及其效果
本发明人基于DS12(SEQ ID NO：6)和DS28(SEQ ID NO：7)设计了较短的dsRNA片段。如下：
DS12-M1 dsRNA：合成和纯化方法如实施例3和4，不同点在于靶标基因片段为SEQ ID NO：6中第1-488位。
DS12-M2 dsRNA：合成和纯化方法如实施例3和4，不同点在于靶标基因片段为SEQ ID NO：6中第7-491位。
DS28-M1 dsRNA：合成和纯化方法如实施例3和4，不同点在于靶标基因片段为SEQ ID NO：7中第1-437位。
DS28-M2 dsRNA：合成和纯化方法如实施例3和4，不同点在于靶标基因片段为SEQ ID NO：7中第4-433位。
如实施例5的方法，将以上获得的4种dsRNA分别喷洒于亚洲玉米螟初孵幼虫上(施用量为300μl/300-500头)。在施用后第5天，这些dsRNA对于幼虫的致死率达到70％以上。
实施例8、组合物
dsRNA的农药学上可接受的载体的配方(1L体系)：
50mM NaHPO4，pH 7.0，10mM β-巯基乙醇(b-mercaptoethanol)，10mM EDTA，0.1％十六烷基磺酸钠(sodium lauryl sarcosine)，0.1％聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)，加H2O补足1L。
以上配方为缓冲液配方，只需要在该缓冲液内直接加入任何纯化后的dsRNA，终浓度达到要求即可，如50mg/L。也可以视需要制备成浓缩制剂。
实施例9、棉铃虫全长靶基因及dsRNA的合成
基于实施例1中的全长靶基因与棉铃虫的转录组数据库(Wang et al.，PLoS ONE，6(4)：e18644；以及发明专利201010197328.9)比对，得到与实施例1玉米螟靶基因同源的8个棉铃虫靶标基因片段，它们的所包含的全长基因序列如下：
＞HarmDS2(SEQ ID NO：53)
ATTCGAACATCGCGCACCGCAGTCTCGGCATCTACGCCCTGAACTGTATACGCGTCCGGGAGATCATCCCGCAGCGACTTCGACGAACAGGATAAGTTAAGCGAGCACAATGCCTTTCAAACCAGCAGATAACCCTAAGTGCCCTAAATGCGGCAAATCAGTATACGCAGCTGAGGAGAGAGTCGCCGGAGGACTCAAATGGCACAAAATGTGCTTCAAGTGCGGCCTGTGCCAGAAGTTGCTGGACTCCACCAACTGCTCAGAACACGAAGGTGAACTGTACTGCAAAGTGTGCCATGCACGTAAATTCGGACCAAAAGGCTACGGCTTCGGCGGTGGTGCTGGCTGCCTGTCCATGGACACTGGTGACCACCTGAAGGCTGAGAATGCGAATTGAGCGAGCAGCCCTCCAGCAGAACTAGCGGGTCGCCGACACACATCTCGGCCCACCAGCGACGCCTCGCGAACGCACGCCATACTGTACTTTAAATTACTCTAGTTAGGATTATTTATTCGCTATCGCTTAATTTAATTTGTTCATCGGTATTATTTATTATTTATAAAAAACACAAATAAATAAAACAGTCGACTGTTTTATTTATTTGTGTTTTTTATAAATAATAAATAATACCGATGAA
与玉米螟相关序列的同源性为85.3％。
＞HarmDS5(SEQ ID NO：54)
ACATGGGGAGTATTTGTTAGATTAGGTACGTTACCAGTGTTGCGTCTTGTAGAACATTAGTTTAATTTTTTTGTAGTTTCAGCTCCTAGTTTTGCCTGGAAACACGATGAAAACCTTCATTGTAGTGTGTTTGGCTCTGGCTAGCTTCGCCTGTGCGGAGCAGGGATCTTTCCCTGGGTACTCCACGTTTGGGTACCTAGAGAAGTATGCTATTCCTCATGCGGAGAAACTTCGCGCGGCTGAGGAAAAGTTCCTCGCTAGCCAGTCTGGCTCCAGGATCGTAGGTGGAGTTCCCGCTGGCCAGGGACAGTACCCATACCAGGCTGGTCTCCTCCTCTCCATCATCGGTTTCGAAGGCAACGGTATCTGCGGAGGCTCCCTGATCAGCGCCAACCGAGTAGCAACAGCCGCCCACTGCTGGTTCGACGGTATCCACCAAGGATGGAAGGTCACAGTTGTGCTCGGTTCCACCCTGCTGTTCTCTGGAGGCACTCGTCTTGAGACCAGTGTGGTCGCCATGCACCCTAACTGGACTCCTGCACTCGTCCGCAATGATGTTGCTGTGATTTACTTGCCCAACTCYGTRCAGATTTCAGCCAATATTGCACCAATTGCTTTGGCTAGCGGMTCTTCAGAATTCGCCGGTGTCTCCGCCATTGCCTCCGGTTTTGGATTAACCAGCTCTAGCGGACAAATCACCGCTAACCAGTTCCTGAGCCACGTCAACCTGAACGTGATCACCAACATCGCCTGCAGCGTCGCCTTCCCCTTCATTGTCCAGCCTTCCAACATCTGCACCAGTGGTATCGGAGGTGTTGGTACTTGCAGCGGTGACTCTGGTGGTCCTCTGGTCACCAACCAGAATGGACAGAACGTCTTGATTGGTATCACTTCCTTCGGCTCGGCTTTCGGCTGCCAGGTCAACCTGCCCTCAGTCTTCGCTCGTGTCACATCATTCGTCTCTTTCCTCAACCAACATTTGTAATTCTGAACAAACTGTAAACTATACTGTAAATAAGACTGGAGTTGGAATCTTTTCCAGCATATTCGTTGTATTTTTACAAAAAAATTGAAGCTATATAATAAGCAATAAAATAAAATCTGCTCTCGTAAAAAAAAAAAA
与玉米螟相关序列的同源性为60.7％。
＞HarmDS6(SEQ ID NO：55)
TTTTTTTTTTTTTTTCATTCAAATTCATTTATTTCTCCCCATTAAATTAAGATGCAGTCTTAAGCAGTTTCCAAAGTCCTTTTATCGGAATATTTACAAGTCCTTTAGTCTGTCTATTTAGACTACATTAGCCTGGAGCCAGGACTGGTAGGCGCTGACTCTGACGAACATGTCGGGGGCGCCGCGGGCGCAGGGGAAGCCCCAGGACACGATGCCGAACTGCTGGCCGTTGTCGGCGCGGGTCAGAGCGCTGCCGGAGTCACCATTGCAAGTTCCGAATCCAGGAGCGTGGAAGGTGCAGACCTCGATGTGAGGTTCAACGGGAGGAGCGCGTACATTCAGCTCGACGGAGGCGCGGGCCACGCGAGCCACGCAGTCGTTACCGTCGATGGTGGTGGGGAACAGCTCCAGGAGAGTGGCTGAGAGGGCACCGCCAGCCCTGATTCTACCCCATCCAGCGACCCTAGCGTTAACACCACCAGGGATGTGAGCGTAAGTCAGAGGCACAGTCCTGACGAGGTTGTTCAGAGCCACGTTGTTGGAGGTGATGAGGATACCGATGTCGTTCTTGATGGTGGCAGACACGTAGTTGGGGTGGGTGACGTTGCGGGCCAAGGTGTAGGCCACGCCGCCGCTGTTCCAGCGGTTTGTGCCGACTGTCACGCGGAGAGAGTTAACCAGCGAGCCACCACTGAACACCGCAGCGATACAGTGAGCAGCTGTCAGCACAGTCCTAGTCGTGATCAAGGAACCGCCGCAGAGGAAGCTCCTCACCAGCACGCCACTGGACATGGCCACCATGTGAGGGTGGCTGCCCACAGCCGCCTGGGTGCCGCCAACGATGCGAGCGCTGGCGTCAGTGTGGTCGAAGAAGCGTGACATGTCATCTTCGGGCGCGGGGAGGGCAATACACCCAACCAGGAGCGAGATCACCAGAAGTCCGGTTTTGAAGTCCATGTTTAACAACG
与玉米螟相关序列的同源性为71.9％。
＞HarmDS10(SEQ ID NO：56)
ATCCAAGAATTCGCACGAGACAAATCAACATGAGCTGTCCCTAGGAGTGTGCTAGCTTGGCCGTCGCCGTATCGGCAGTGGAGATCGCCACTCCTGATGCCGACAGCCCTGTCTTCGGCTACCACGCCAAGTTTGGTATTGCTGAGGCTGCGAGGATCAAGAGCGCGGAGGAAGTTCAGAGCTTCAACGGCCAGAGGATCGTTGGAGGATCCATCACCAACATTGCCAACGTCCCATACCAGGCTGGTCTTGTGATCACCATCTTCATCTTCCAATCCGTGTGCGGTGCTTCCCTCATCTCCCACAACCGCCTGGTGACTGCTGCTCACTGCAAATTCGACGGTGTCTTGAACGCTAGCTCCTTCACCGTTGTGCTTGGCTCCAACACCCTGTTCTTCGGCGGTACTCGCATCAACACCAATGATGTCGTCATGCACCCCAACTGGAATCCTGCTACCGTTGCCAATGACATCGCTGTCATTCGCATCAGTTCCGTCAGCTTCAACAATGTGATCCAGCCCATCGCTCTTCCCAGTGGAGACGAACTCAACAACCTCTTCGTCGGCGCCAACGCTCTTGCCTCCGGATTTGGCCGCACTAGCGACAGTGGAAGCATTGGTACCAACCAACAGCTGAGCTCTGTGACCATCCCCGTGATCACCAACGCTCAGTGCGCTGCCGTGTACGGCCCCGCCTTTGTGCACGCCTCCAACATCTGCACCAGCGGCGCCGGCGGCAAGGGTACTTGCAACGGTGACTCCGGTGGCCCTCTCGCTGTCGACAGCAACAACAGGAAGATCTTGATCGGTGTTACTTCATACGGTGCTGCTGACGGTTGCGCCGCTGGTTTCCCTGCTGCCTTCGCCAGAGTCACCTCCTTCGTCAGCTGGGTCCAGTCCCAATAATCTCCTCCTCTCTTAAACTTATAATGCTTAAATTAAATTTATTTTACTTC
与玉米螟相关序列的同源性为65.2％。
＞HarmDS12(SEQ ID NO：57)
AGAAACTGAAGAATACTGCCAAGAAATGTGGAAACCCTTTAGTGATCGTCGCTGATGTCACAAAAGAAGACGACGTCAAAAGAATTGCCAGTGAAACGTTGAAACATTTTGGGAAACTCGATGTTCTGGTCAACAATGCTGGCATTTGTCCATTTGCTAGTATTCAAGCTGACAACGCAATGCAGGTCTACGATGAAATAATGTCTACAAACCTCCGGTCTACCGTTCTACTGACACATCTTACCGTCCCTGAACTTGTGAAAACTAAAGGCAACATTATCAATATTTCAAGTGTTGCTGCTTTCAAAGTCGCTCTAGGTCTTTTTGCGTACTGTGCGTCGAAGGCAGCTATGGATCACTTCTCTAGAGCGATTGCACTAGAGCTGGCTCCAAGTGGTGTACGTGTAAATGTAGTCAATCCAGGACCCGTGGCGACTGACATCGGTGCTACCATGTTCCCAACAAAAGAGGAACAAGACAATTTCTTTAAAAAAGTCGTGGATGGAACTGCATTGGGCAGGATATCGGAGCCTGAAGAAATAGCTGATATTGTTCTGTTCCTAGCGAGTGATAAAGCTAGAGGGATCACCGGTTCAAGTTATGTTTCTGATAATGGATATTCGGTTAAAGGCGTACAAGCTTGATTAATTTTATTAATAAACGTAATTTTAAATAGTGC
与玉米螟相关序列的同源性为68.8％。
＞HarmDS28(SEQ ID NO：58)
AGACCGGCCCTACCCTCCCAAGTGGCTATGAGAACCTGGTACTGTATGGCCCCGCTGACGACAACACCCTCAACTTATACTACGATGACAACTATCAGATTGCTGCATTCCAAATTGGTCTGGACAAAGAACAAATAAGCGATTCGGTATACGATTTCGAAAATCAAGGATTCGCAAGCTGGACCACTACATTGTCTAATGGCACATCTAGAGATTATTGGACCATCAGAGCATACTTTTCCACTGCTGATTATCTTGCGACTGACGCAACAACTCGCAACTCTTCAAGAAATACTGAGACGTTGATCCAGGGTGGTTCCATGGTAGTGACTGGTTTCAACGGAGAATTGTACACCATTTCCTCCGACCCTACCGTACTTGCCGACACAAGCGTCAGTGGGTTCACAGAACAAGCCTGCATGATATATATGGGTCACCATTTCTACTACAACATGACTACAAGCTTGGAGTGCGCTGAAGGAAGGCTGTTCCCCTGGTTCCCACTTTCCTACAACGGAGTAGTGATGGGCATTGGTTTCAACTTTATCGGCAAATACGACGTGAGACCTGACAATTTCAATTATTTCGAAAGCCCTGGAGTAGCAGCTGTTAAGATCATCGTACCAAAAGGCCCGCAATGTTTCTACGAGTTAGCAGAAAACCCCGGCGTGG
与玉米螟相关序列的同源性为71.5％。
＞HarmDS34(SEQ ID NO：59)
TTCAGTCAACATGTCTTTCCTTGGCAAAACTTACACCTTCGTCAAACAGGAGAATATGGACGGATTCCTGAAATCTGTCGGTCTCCCTGACGACAAAATCGAGCCAGTCCTGAAGTTCACTCCTGAACAGAAGATCATTCAGGAAGGTGATGGCTACAAGTACATCACTCAGGGTCGCGATGGCCCTAGAGAAGTCACATTCAAGTCCGGAGTAGAATTCGACGATCTTATTGGACCTGAGAAAATTCCCGCTAAGACTACATACGTCGTTGATGGCAACAAAGTGACACAGACCATCAAATCAGCTATGGGAGTCGGCACCTTCACCAGGGAGTTCGTTGGCGATGAACTTATCATCACCATGGTCACCGACAAATGGGACGGCGTTGCCAAGAGATAC
与玉米螟相关序列的同源性为73.2％。
＞HarmDS35(SEQ ID NO：60)
CATTCCTCGAAAGGTCGTCCCATCAAGTACGTCAAAATCCTCCACAACCTACTTTGAAGACCACAGCCAAGCCTGTCATCCTCATCGATGGTGGTATCCACGCCAGGGAAATGGATCTCTCCCCCCACTGTTACCTTGGGCTATTCATAAGCTGGTTGAAGATGTTACTGAAAGAGATCTTCTAGATAATTTTGACTGGATCCTCTTGCCTGTGGTCAACCCTGATGGATATAAATTCACTTTTACCAATTCCCGTTTCTGGCGTAAGACTCGTTCCACGGACCAGCACGTTTTAAGCGGTATCTGCCCAGGAGTCGACGGTAACCGCAACTATGACTTCTTCTGGAACACCGTTGGTACCAGCAACACCCCATGCTCAGACGTCTACGCTGGATCCAGAGCCTTCTCCGAAGTCGAAACCAGGGTCGTCAGAGATATCCTCCATGAACATTTAGCACGCATGGCTCTGTACATCACCATGCACAGTTTCGGAAGCATGATCTTATACCCATGGGGTCATGATGGCTCCCTATCTCATAACGGCCTTGGTCTTCATACGGTGGGAGTTGCTATGGCAACGGCAATCAATCAGAATTCTCTATCTCACTTCCGATCTTATGTTGTTGGAAATTCAGCTTTAGTTCTGAACTATCCAGCGGCTGGTGCGTCAGAAGATTATGCTCATCAAATTGGCGTGCCTCTATCCTATACTTTTGAGCTACCTGGTCTATCCAACACATTACTTGGATTCAATTTGAACCCTAGGTACATTCAACAAGTATGCAATGAAACTTGGCAAGGTCTCATCGTTGGAGCTAGGAGAGCTGGTGATTTATTTAGAAATAAAAAACTTTAAAGACTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
与玉米螟相关序列的同源性为79.9％。
以前面所示棉铃虫全长靶基因序列为PCR扩增模板，引物如表6，如前所示方法获得8个棉铃虫靶标基因的dsRNA。
表6、棉铃虫8个靶标基因的dsRNA合成所用引物
实施例10、棉铃虫靶标基因dsRNA的应用——喷药
本发明人将实施例9获得的各dsRNA(溶于ddH2O，浓度为50μg/mL)直接喷雾于棉铃虫初孵幼虫上(施用量为300μl/300-500头)。与空白对照(CK)和外源基因对照(EYFP)相比，各靶标基因相应的dsRNA能提高棉铃虫的致死效果(表7、图6)。由此表明，基于本发明靶标基因的核酸抑制物可以起到杀虫作用。
表7、dsRNA喂食棉铃虫幼虫死亡率
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (13)

1.一种分离的多核苷酸，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:56所示。
3.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1或2所述的多核苷酸。
4.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求3所述的载体，或其基因组中整合有权利要求1或2所述的多核苷酸；所述的宿主是原核生物。
5.权利要求1所述的多核苷酸的用途，用于作为制备特异性干扰亚洲玉米螟基因表达或抑制亚洲玉米螟生长的干扰分子的抑制或沉默靶标，所述的亚洲玉米螟基因是胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶C3基因。
6.权利要求2所述的多核苷酸的用途，用于作为制备特异性干扰棉铃虫基因表达或抑制棉铃虫生长的干扰分子的抑制或沉默靶标，所述的棉铃虫基因是胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶C3基因。
7.一种核酸抑制物，所述的核酸抑制物是dsRNA，其中有害生物摄取所述dsRNA，抑制所述有害生物的生长；所述的dsRNA，其具有如下结构：
或Seq’正向-X’-Seq’反向
其中，
Seq’正向是以SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22序列为引物以SEQ ID NO:5为模板扩增获得的多核苷酸所对应的RNA序列；或是以SEQ ID NO:107和SEQ ID NO:108序列为引物以SEQ ID NO:56为模板扩增获得的多核苷酸所对应的RNA序列；
Seq’反向为与Seq’正向互补的序列；
X’为无；或为位于Seq’正向和Seq’反向之间的间隔序列，所述间隔序列与Seq’正向和Seq’反向不互补；
||表示在Seq’正向和Seq’反向之间形成的氢键；
其中，当Seq’正向是以SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22序列为引物以SEQ ID NO:5为模板扩增获得的多核苷酸所对应的RNA序列时，所述的有害生物是亚洲玉米螟；当Seq’正向是以SEQ ID NO:107和SEQ ID NO:108序列为引物以SEQ ID NO:56为模板扩增获得的多核苷酸所对应的RNA序列时，所述的有害生物是棉铃虫。
8.一种核酸抑制物，所述的核酸抑制物是构建物，所述构建物含有以下结构：
Seq正向-X-Seq反向；
其中，
Seq正向是以SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22序列为引物以SEQ ID NO:5为模板扩增获得的多核苷酸；或以SEQ ID NO:107和SEQ ID NO:108序列为引物以SEQ IDNO:56为模板扩增获得的多核苷酸；
Seq反向为与Seq正向互补的序列；
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反 向不互补；
其中，当Seq正向是以SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22序列为引物以SEQ ID NO:5为模板扩增获得的多核苷酸时，所述的有害生物是亚洲玉米螟；当Seq正向是以SEQID NO:107和SEQ ID NO:108序列为引物以SEQ ID NO:56为模板扩增获得的多核苷酸时，所述的有害生物是棉铃虫。
9.一种宿主细胞，其包含权利要求7-8任一所述的核酸抑制物；所述的宿主是原核生物。
10.权利要求7-8任一所述的核酸抑制物或权利要求4或9所述的宿主细胞的用途，用于制备防治亚洲玉米螟或棉铃虫的制剂。
11.一种防治亚洲玉米螟或棉铃虫的制剂，其包含：
安全有效量选自以下的物质：权利要求7-8任一所述的核酸抑制物或权利要求4或9所述的宿主细胞；以及；
农药学上可接受的载体。
12.权利要求10或11任一项的制剂，其还包含至少一种选自以下的杀虫剂：化学杀虫剂、马铃薯糖蛋白、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、致病杆菌杀虫蛋白、光杆状菌杀虫蛋白、侧孢芽孢杆菌杀虫蛋白和球形芽孢杆菌杀虫蛋白。
13.一种防治亚洲玉米螟或棉铃虫的方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求7-8任一所述的核酸抑制物或权利要求4或9所述的宿主细胞喂食和/或喷洒亚洲玉米螟或棉铃虫；或将权利要求7-8任一所述的核酸抑制物导入到植物中。
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