CN101805746B

CN101805746B - 昆虫几丁质酶基因及其dsRNA的应用

Info

Publication number: CN101805746B
Application number: CN2010101363305A
Authority: CN
Inventors: 张建珍; 李大琪; 张建琴; 马恩波; 郭亚平; 杨美玲
Original assignee: Shanxi University
Current assignee: Shanxi University
Priority date: 2010-03-26
Filing date: 2010-03-26
Publication date: 2011-08-17
Anticipated expiration: 2030-03-26
Also published as: CN101805746A

Abstract

本发明提供几丁质酶基因序列及其dsRNA的应用，可沉默特定的几丁质酶基因使昆虫发育受阻死亡。通过对多个东亚飞蝗几丁质酶基因克隆、测序及表达分析，得到序列为SEQ IDNO：1的几丁质酶基因，从中选出序列为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的几丁质酶基因，用于dsRNA的合成。将dsRNA注入昆虫的体腔后，昆虫在发育过程中表现为蜕皮困难而死亡。本发明为害虫实现基于RNA干扰的有效防治提供依据，为安全无公害的害虫防治方法研制提供新的途径。

Description

昆虫几丁质酶基因及其dsRNA的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体涉及昆虫几丁质酶基因序列及其dsRNA的应用。

背景技术

农业害虫为害是我国农业产量的主要制约因素，长期施用化学杀虫剂导致一系列问题：1)昆虫出现抗药性，用药剂量加大，防治成本提高；2)农药残留导致环境污染严重；3)对非靶标生物有较大的影响。现有的生物杀虫剂在害虫防治中应用也较广，但杀虫时间较长，效果缓慢。

RNA干扰(RNAi)是一种通常由双链RNA分子引起的特异性转录后基因沉默现象，于2006年获得诺贝尔奖。这一发现不仅为基因的功能研究提供了方法上的突破，同时也为人类的疾病治疗和作物害虫防治开辟了新的途径。2007年的“Nature Biotechnology”杂志先后两篇论文报道了施用表达靶向害虫重要致死基因V-ATPase A，CYP6AE14 and GST1的dsRNA转基因植物作为一种控制病虫害的新方法(Baum et al，2007；Mao et al，2007)。2008年，Price and Gatehouse提出了基于RNAi的害虫防治策略。基于RNA干扰技术的害虫防治具有如下优势：1)选择对害虫专一的基因进行干扰，对高等动物和和人类是安全的；2)抗虫具有专一性，对非靶标生物无杀伤作用；3)对环境无毒无害。

发明内容

本发明的目的提供一种昆虫几丁质酶基因及其dsRNA的在致死害虫中的应用。

本发明提供的一种昆虫几丁质酶基因，其核苷酸序列是SEQ ID NO：1，是通过对东亚飞蝗EST数据库的搜索，鉴别出7条东亚飞蝗几丁质酶基因片段，检测了这7个几丁质酶基因在东亚飞蝗不同组织部位的表达，筛选出在组织表皮特异表达的与东亚飞蝗蜕皮相关几丁质酶基因LmCHT10，通过RACE-PCR扩增并进一步克隆获得958bp的东亚飞蝗几丁质酶基因。

本发明提供的一种昆虫几丁质酶基因，其核苷酸序列是SEQ ID NO：2，是根据SEQ ID NO：1设计上游引物SEQ ID NO：4和下游引物SEQ ID NO：5，通过PCR扩增获得SEQ ID NO：2，其含有T7启动子。进一步利用试剂盒合成dsRNA。

本发明提供的一种合成dsRNA的昆虫几丁质酶基因，其核苷酸序列是SEQ ID NO：3，是根据SEQ ID NO：1设计上游引物SEQ ID NO：6和下游引物SEQ ID NO：7，通过PCR扩增获得SEQ ID NO：3，其含有T7启动子。进一步利用试剂盒合成dsRNA。

SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3合成的dsRNA的在致死害虫中的应用：注射上述dsRNA到昆虫体腔，结果表明：SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3合成的dsRNA均可以特异性地沉默几丁质酶基因LmCHT10的mRNA表达，并导致蝗虫蜕皮困难而死亡。

附图说明

图1：东亚飞蝗注射SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3合成的dsRNA后出现蜕皮困难而死亡的表型。A：2龄东亚飞蝗(左侧为注射dsGFP的对照，右侧为注射SEQ ID NO：2合成的dsRNA)；B：2龄东亚飞蝗(左侧为注射dsGFP的对照，右侧为注射SEQ ID NO：3合成的dsRNA)；C：5龄东亚飞蝗(左侧为注射dsGFP的对照，右侧为注射SEQ ID NO：3合成的dsRNA)。

图2：东亚飞蝗注射SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3合成的dsRNA后几丁质酶基因LmCHT10的mRNA表达，β-actin做为内参基因。A：2龄东亚飞蝗(1为注射dsGFP的对照，2为注射SEQ ID NO：2合成的dsRNA)；B：2龄东亚飞蝗(3为注射dsGFP的对照，4为注射SEQ ID NO：3合成的dsRNA)；C：5龄东亚飞蝗(5为注射dsGFP的对照，6为注射SEQ ID NO：3合成的dsRNA)。

图3：中华稻蝗注射SEQ ID NO：3合成的dsRNA后出现蜕皮困难而死亡的表型：左侧为注射dsGFP的对照，右侧为注射SEQ ID NO：3合成的dsRNA的中华稻蝗。

具体实施方式

实施例1：东亚飞蝗几丁质酶基因片段及其dsRNA的获得

1、东亚飞蝗几丁质酶基因片段的获得

1)东亚飞蝗几丁质酶基因在东亚飞蝗表达序列标签EST数据库的搜索

基于东亚飞蝗的表达序列标签(EST)数据库，采用生物信息学方法对东亚飞蝗几丁质酶基因进行搜索，经过序列分析及比对后，共获得7条几丁质酶基因片段。

2)东亚飞蝗几丁质酶基因RACE引物的设计

基于已获得几丁质酶基因片段的碱基序列，采用primer premier5.0软件设计。所有引物均由上海英潍捷基生物有限公司合成。

3)东亚飞蝗总RNA获得

选取大小一致雌雄各半东亚飞蝗5龄若虫，四头一组，冷冻于液氮中，待提取RNA，具体操作步骤参照TaKaRa Trizol试剂盒。

4)RACE cDNA合成

RACE cDNA合成步骤参照SMART^TMRACE cDNA Amplification试剂盒。

5)东亚飞蝗几丁质酶基因片段的获得

根据

2Polymerase说明书进行3’和5’RACE末端快速扩增，进一步克隆获得的东亚飞蝗几丁质酶基因序列。

6)东亚飞蝗几丁质酶基因片段碱基序列的分析

利用Expasy网站中相关在线软件和GENEDOC、基因探索者等软件分析所得序列，之后在NCBI网站中使用BLAST功能进行序列同源性比对。

2、东亚飞蝗蜕皮相关几丁质酶基因的筛选

1)东亚飞蝗几丁质酶基因表达引物的设计

基于7条几丁质酶基因片段的碱基序列，采用primer premier5.0软件设计。所有引物均由上海英潍捷基生物有限公司合成。

2)东亚飞蝗不同组织部位总RNA的提取及纯化

选取活力旺盛的5龄东亚飞蝗，6头虫子(雌雄各半)一个生物学重复，共3个生物学重复。解剖其11个组织部位：前肠、中肠、后肠、胃盲囊、脂肪体、马氏管、表皮、气管、肌肉、精巢和卵巢。将解剖好的3个生物学重复置于液氮中冻存。各个组织部位总RNA的提取及纯化方法具体操作步骤参照TaKaRa Trizol试剂盒和RNA纯化说明书

3)第一链cDNA的合成

参照M-MLV反转录TaKaRa试剂说明书，进行第一链cDNA的合成。

4)RT-PCR法检测7个几丁质酶基因在11个组织部位的表达

7个几丁质酶基因在不同组织部位的表达采用常规RT-PCR检测，在凝胶成像仪上采集图像并分析。

5)东亚飞蝗蜕皮相关几丁质酶基因的筛选

选取在表皮中高表达东亚飞蝗几丁质酶基因LmCHT1开展进一步的研究。

3、东亚飞蝗几丁质酶基因dsRNA合成

1)东亚飞蝗几丁质酶基因dsRNA引物的设计

基于本研究所得到东亚飞蝗几丁质酶基因的序列SEQ ID NO：1，采用primer premier5.0软件设计。共设计2对dsRNA引物，其序列分别为SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7。所有引物均由上海英潍捷基生物有限公司合成。

2)东亚飞蝗几丁质酶基因dsRNA的合成

用上述2对dsRNA引物合成PCR产物，经

SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega)试剂盒纯化后按照T7RiboMAX^TM Express RNAi System(Promega)试剂盒说明体外转录合成dsRNA。dsRNA浓度采用酶标仪SpectraMax 190测定，并浓缩至终浓度为3μg/μl。

实施例2：几丁质酶基因dsRNA致死东亚飞蝗

1、东亚飞蝗几丁质酶基因dsRNA注射

将2μl(约6μg)SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的dsRNA用25μl规格微量注射器注射到东亚飞蝗任一龄若虫二、三腹节之间，共注射3组生物学重复，每组10只，雌雄各半。注射相同体积浓度的dsGFP至对照组体内。将注射后东亚飞蝗置于28℃恒温生化培养箱中饲养。

2、注入dsRNA后东亚飞蝗表型的观察

注射dsRNA东亚飞蝗实验组与对照组在取食量、体型变化及体重增长并无显著差异。在蜕皮过程中，对照组飞蝗顺利蜕皮，从脊线开裂至身体完全蜕出只需短短几分钟；而dsRNA注射组飞蝗，脊线可以开裂，但头部及腹部新皮与旧皮无法分离，导致飞蝗无法移动，保持同一状态长达数小时甚至两天，直至死亡。表型见附图1。死亡率统计见下表：

表1：5龄东亚飞蝗注射SEQ ID NO：3的dsRNA及dsGFP的死亡率

组名	注射虫数(只)	死亡虫数(只)	死亡率
				N5-1	10	10	100％
N5-2	10	9	90％
				N5-3	10	9	90％
N5dsGFP-1	10	0	0
				N5dsGFP-2	10	0	0
N5dsGFP-3	10	0	0

N5-1、N5-2、N5-3为注射SEQ ID NO：3的dsRNA实验组；N5dsGFP-1、N5dsGFP-2、N5dsGFP-3为注射dsGFP的对照组。

3、东亚飞蝗几丁质酶基因沉默检测

即将蜕皮死亡的东亚飞蝗置于液氮中冻存，每组收虫4只，雌雄各半，采用Trizol法提取总RNA并纯化，采用MLV反转录酶获得cDNA。对照组东亚飞蝗蜕皮时收虫，提取总RNA并纯化，采用MLV反转录酶获得cDNA，作为对照。

东亚飞蝗几丁质酶基因经RNA干扰后其基因表达情况，采用常规RT-PCR检测，在凝胶成像仪上采集图像并分析。附图2为检测结果。

实施例3：几丁质酶基因dsRNA致死中华稻蝗

1、中华稻蝗SEQ ID NO：3的dsRNA注射

将2μl(约6μg)SEQ ID NO：3的dsRNA用25μl规格微量注射器注射到中华稻蝗任一龄若虫二、三腹节之间，共注射2组生物学重复，每组10只，雌雄各半。注射相同体积浓度的dsGFP至对照组体内。将注射后中华稻蝗置于28℃恒温生化培养箱中饲养。

2、注入dsRNA后，中华稻蝗的观察

注射dsRNA组中华稻蝗在龄期中间与对照组在取食量、体型变化及体重增长并无显著差异。在蜕皮过程中，对照组稻蝗顺利蜕皮，从脊线开裂至身体完全蜕出只需短短几分钟；而dsRNA组稻蝗，脊线可以开裂，腹部可以抽出，但头部新皮与旧皮无法分离，稻蝗无法行动，保持同一状态长达数小时甚至一天，直至死亡。表型见附图3。

SEQUENCE LISTING

<110>山西大学

<120>昆虫几丁质酶基因序列及其dsRNA的应用

<160>7

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>958

<212>DNA

<213>东亚飞蝗(Locusta migratoria manilensis)

<400>1

gcacgaggac aaaagtctct ggattaagaa aaagggaatc aaagttctcc tagcaattgg 60

tggttggaat gattcccttg gtgacaaata cagtcggctt gcaaacaatc catcagcaag 120

aagaaaattt gttgaacatg ttgtgaagtt cattgaaaag tatggatttg aaggactaga 180

ccttgattgg gaatatccaa aatgttggca ggttgactgc aatgctggac cagattctga 240

taaacaagga tttgcagacc tagtgaaaga actgagcata gctttcaaac cacgaggctt 300

actcttgtca tcagcagtat caccgagcaa agttgtcatt gactcaggct atgatgttcc 360

tgttctgtct cagtactttg attacatctc tgtgatgact tatgatctcc atggccattg 420

ggataagcag actggtcatg ttgctcctct gtattactat cctggagata cttatgatta 480

cttcaatgct aacttcacaa tgcattactg gatagagaag ggagctgaca ggaaaaagct 540

tataatgggt atgcccatgt atggacagtc attctcactg gctgacgcta aaaatcatgg 600

tctgaatgct aagtcatatg gtcctggtga ggctggagag tttacacggg ctggtggatt 660

catggcttat tatgagatat gttataatgt gaagaacaaa ggatggacta cggtaaggga 720

tcccgaagga agaattggtc catatgcata ccgtggtaat cagtgggttt cttatgatga 780

tgtgtccgac atcagaagaa agactaagtt cattaaagaa cttggacttg gtggtggaat 840

gatatgggct ctcgacctcg atgacttccg caatcgctgt ggttgtggca cttatccact 900

gttgcgcact attaacagtg aacttcgagg tctgactgca aatacacgtg actgcaca 958

<210>2

<211>260

<212>DNA

<213>东亚飞蝗(Locusta migratoria manilensis)

<400>2

taatacgact cactataggg gcacgaggac aaaagtctct ggattaagaa aaagggaatc 60

aaagttctcc tagcaattgg tggttggaat gattcccttg gtgacaaata cagtcggctt 120

gcaaacaatc catcagcaag aagaaaattt gttgaacatg ttgtgaagtt cattgaaaag 180

tatggatttg aaggactaga ccttgattgg gaatatccaa aatgttggca ggttgactgc 240

ccctatagtg agtcgtatta 260

<210>3

<211>569

<212>DNA

<213>东亚飞蝗(Locusta migratoria manilensis)

<400>3

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ttatgattac ttcaatgcta acttcacaat gcattactgg atagagaagg gagctgacag 240

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tggtggaatc cctatagtga gtcgtatta 569

<210>4

<211>41

<212>DNA

<213>东亚飞蝗(Locusta migratoria manilensis)

<400>4

taatacgact cactataggg gcacgaggac aaaagtctct g 41

<210>5

<211>40

<212>DNA

<213>东亚飞蝗(Locusta migratoria manilensis)

<400>5

taatacgact cactataggg gcagtcaacc tgccaacatt 40

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<211>41

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<400>6

taaatacgac tcactatagg gcagcagtat caccgagcaa a 41

<210>7

<211>41

<212>DNA

<213>东亚飞蝗(Locusta migratoria manilensis)

<400>7

taaatacgac tcactatagg gattccacca ccaagtccaa g 41

Claims

1.一种昆虫几丁质酶基因，其核苷酸序列是SEQ ID NO：1。

2.一种昆虫几丁质酶基因，其核苷酸序列是SEQ ID NO：3。

3.如权利要求2所述的昆虫几丁质酶基因合成的dsRNA，所述的dsRNA是用上游引物SEQ ID NO：6，下游引物SEQ ID NO：7，合成PCR产物，经Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega）试剂盒纯化后按照T7 RiboMAX™ Express RNAi System（Promega）试剂盒说明体外转录合成的dsRNA。

4.如权利要求3所述的dsRNA在致死害虫中的应用。