CN104404042A - 一种东亚飞蝗ATP合酶β亚基基因及其dsRNA在害虫防治中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了蝗虫的ATP合成酶酶β亚基cDNA的保守序列，并构建其RNA、DNA等构建体，利用RNAi技术沉默蝗虫体内ATP合酶β亚基，使体内ATP合酶β亚基的表达明显受到抑制，导致蝗虫产生致死效应，可应用于RNAi技术对东亚飞蝗害虫防治。

Description

一种东亚飞蝗ATP合酶β亚基基因及其dsRNA在害虫防治中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种ATP合酶β亚基基因、dsRNA及其在东亚飞蝗防治中的应用。

背景技术

害虫严重危害农业生产，由于长期施用有机氯、有机磷等化学杀虫剂，导致一系列问题：农药残留导致环境污染严重；有毒农药危害人类身体健康；昆虫出现抗药性，防治成本提高等。目前已有将生物杀虫剂应用于害虫防治，但杀虫时间较长，杀虫效果不稳定，因此迫切需要新型的害虫防治方法。

RNA干扰(RNAi)是一种通常由双链RNA分子引起的特异性转录后基因沉默现象，于2006年获得诺贝尔奖。这一发现不仅为基因的功能研究提供了方法上的突破，同时也为人类的疾病治疗和害虫防治开辟了新的途径。2008年，Price和Gatehouse总结了众多实验结果后，提出来基于RNAi的害虫防治策略。基于RNA干扰技术的害虫防治具有如下优势：1)选择对害虫专一的基因进行干扰，对高等动物和人类是安全的；2)对害虫具有专一性，对非靶标生物无杀伤作用；对环境无毒无害。

发明内容

本发明的目的是提供一种核酸分子，可以编码东亚飞蝗ATP合成酶β亚基的基因，并作为药物靶点，使蝗虫致死。

本发明的目的是通过以下措施实现的：

一种核酸分子，其特征在于：序列为SEQ ID NO.1及其互补序列。

优选地，上述核酸分子中，SEQ ID NO.2序列及其互补序列可以作为有效的药物靶点，干扰基因的转录表达。

本发明的另一目的在于针对上述核酸分子，提供有效干扰其转录表达的dsRNA(双链核糖核酸)。

RNA构建体，其包含至少一个双链RNA区，其至少一条链包含与上述任一核酸分子互补的核苷酸序列。

上述RNA构建体，其中所述至少一个双链RNA区至少具有17bp。

优选地，RNA构建体，其序列为SEQ ID NO.3或其互补序列。

DNA构建体，包含了上述核酸分子，或者包含编码上述RNA构建体的区域。

表达构建体，包含了上述DNA构建体。

宿主细胞，包含上述RNA构建体、DNA构建体或表达构建体。

杀虫组合物，包含了上述RNA构建体和/或上述DNA构建体和/或上述表达构建体和/或上述宿主细胞以及适合的载体。

上述任一项RNA构建体和/或DNA构建体和/或表达构建体和/或宿主细胞以及适合的载体和/或杀虫组合物在防治蝗虫中的应用。

有益效果

1.本发明获得了蝗虫的ATP合成酶酶β亚基cDNA的保守序列，并构建其RNA、DNA等构建体沉默了蝗虫体内ATP合酶β亚基，经验证体内ATP合酶β亚基的表达明显受到抑制，并导致蝗虫产生致死效应，本发明可应用于RNAi技术对东亚飞蝗害虫防治。

2.本发明用于防治蝗虫尤其是东亚飞蝗，种属特异性强，不会对其它物种造成干扰，如蜜蜂、人等；本发明基因特异性强，不会对除ATP合酶或β亚基之外的基因产生干扰影响。

3.本发明防治蝗虫具有高效性，尤其是东亚飞蝗，剂量小(dsRNA用量为100ng)，起效快(处理2天左右导致蝗虫致死)。

附图说明

图1 五龄飞蝗注射SEQ ID NO：2合成的dsRNA后的致死情况。

图2 五龄飞蝗注射序列为SEQ ID NO：3的dsRNA后ATP合酶β亚基基因(LmATP5B)的不同时间点mRNA表达，RP49做为内参基因。12，24，36h为注射dsRNA后的小时数。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。以下实施例仅限于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1：飞蝗ATP合酶β亚基基因及其dsRNA的获得

i、飞蝗ATP合酶β亚基基因的获得

1)飞蝗ATP合酶β亚基基因在飞蝗EST数据库的搜索

基于飞蝗的EST数据库，采用生物信息学方法对飞蝗ATP合酶β亚基基因进行搜索，经过序列拼接及比对后，共获得1条飞蝗ATP合酶β亚基基因。

2)飞蝗ATP合酶β亚基基因引物的设计

基于已获得LmATP5B的碱基序列，设计引物。

3)飞蝗总RNA获得

选取大小一致雌雄各半飞蝗5龄若虫，3头一组，冷冻于液氮中，待提取RNA，具体操作步骤参照TRIzol(Invitrogen)说明书。

4)第一链cDNA的合成

参照Promega M-MLV反转录酶试剂说明书，进行第一链cDNA的合成。

5)飞蝗ATP合酶β亚基基因的获得

根据Thermo Fusion说明书进行PCR，进一步克隆获得飞蝗ATP合酶β亚基基因cDNA序列。

6)飞蝗ATP合酶β亚基基因碱基序列的分析

利用Expasy网站中相关在线软件和GENEDOC、基因探索者等软件分析所得序列，之后在NCBI网站中使用BLAST功能进行序列同源性比对。经序列验证后，获得的ATP合酶β亚基LmATP5B)序列全长1914bp，开放阅读框1575bp。

II、飞蝗ATP合酶β亚基基因片段及其dsRNA合成

1)飞蝗ATP合酶β亚基基因片段的获得

基于本研究所得到飞蝗ATP合酶β亚基基因的序列SEQ ID NO：1；1，设计dsRNA引物，引物序列分别为SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5。选取大小一致雌雄各半东亚飞蝗5龄若虫，三头一组，冻存于液氮中，待提取RNA，具体操作步骤参照TRIzol(Invitrogen)说明书。M-MLV反转录酶将所提RNA反转录成第一链cDNA，以此为模板，以SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5为引物进行PCR扩增，获得ATP合酶β亚基基因片段。

2)飞蝗ATP合酶β亚基dsRNA的合成

胶回收试剂盒纯化基因片段，试剂盒纯化后按照MEGAscript highyield transcription kit(Ambion)说明书合成dsRNA，dsRNA浓度采用紫外分光光度计测定，并稀释至终浓度为20ng/μl。所述的dsRNA片段如SEQ ID NO：3所示。

实施例2：飞蝗ATP合酶β亚基dsRNA致死五龄飞蝗

1、飞蝗ATP合酶β亚基dsRNA注射

选取五龄第三天、大小均一、健康状况一致的若虫用于注射上述合成的dsRNA(SEQ ID NO：3)，25μl规格微量注射器用于注射，注射时不可用力过大，顺着血液流动的方向，侧腹部第2至3腹节的连接处作为注射点，避开气门。注射dsRNA的量为100ng，并设置dsGFP(100ng)的对照组，每组20头虫，3个生物学重复，共计60头。注射完毕后，将试虫用朔料笼子饲养(光照：黑暗时间为14h：10h，温度30±2℃)，给以新鲜小麦幼苗。

2、注射dsRNA后五龄飞蝗表型的观察

五龄幼虫经注射dsRNA后，注射dsGFP对照组5天后开始蜕皮并全部成功蜕皮至成虫，蜕皮至成虫后形态活力正常。注射SEQ ID NO：3的dsRNA的处理组幼虫共60头，第2天开始死亡，第4天死亡率超过90％，生测图如图1和表1所示。

3、飞蝗ATP合酶β亚基基因mRNA水平检测

对5龄飞蝗若虫dsRNA注射后不同时间点的沉默效率检测，选择注射后12h、24h和36h的虫体作为RNA提取对象，每组各个时间点设置3个生物学重复。提取各样品的总RNA并反转录成第一链eDNA，用RT-PCR检测目的基因(LmATP5B)和管家基因(RP49)的表达量(图2)。

经数据分析发现，飞蝗体内注射ATP合酶β亚基双链RNA后，LT₅₀为2.4±0.4天；mRNA表达量在注射后12小时、24小时和36小时依次降低了91.7％，93.6％和95.7％(见表2和图2)。而注射GFP dsRNA的东亚飞蝗体内的ATP合酶β亚基的mRNA没有显著性的变化，也不引起致死。

按照实施例2所述方法将dsRNA(SEQ ID NO：3)分别注射入蜜蜂、蜘蛛体内，未发现致死现象。

表1 实施例2中注射dsRNA后体内β亚基相对表达量

表2 实施例2中注射dsRNA后存活率数据(单位为％)

<110>重庆大学 夏玉先

<120>一种东亚飞蝗ATP合酶β亚基基因片段及其dsRNA在害虫防治中的应用

 

<210> 1

<211> 1914

<212> DNA

<213> Artificial(人工序列)

 

<220>

<221>

<222>（76）..（1647）

<223> 开放阅读框

 

<400> 1

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<210> 2

<211> 333

<212> DNA

<213>人工序列

 

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<210> 3

<211>333

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<213> 人工序列

 

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<210> 4

<211>40

<212> DNA

<213> 人工序列

 

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<210> 5

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<213> 人工序列

 

<400> 5

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Claims (10)

1. 一种核酸分子，其特征在于：序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2，或SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2的互补序列。

2. 一种RNA 构建体，其包含至少一个双链RNA 区，其至少一条链包含与权利要求1或2所述任一核酸分子互补的核苷酸序列。

3. 权利要求2的RNA构建体，其中所述至少一个双链RNA区至少为17bp。

4. 权利要求2的RNA构建体，序列为SEQ ID NO.3或其互补序列。

5. 一种DNA构建体，包含了权利要求1或2核酸分子，或者包含编码权利要求3或4所述RNA构建体的区域。

6. 表达构建体，包含了如权利要求5所述DNA构建体。

7. 一种宿主细胞，包含权利要求3或4所述RNA构建体或权利要求5所述DNA构建体或权利要求6所述表达构建体。

8. 一种杀虫组合物，包含了权利要求3或4所述RNA构建体和/或权利要求5所述DNA构建体和/或权利要求6所述表达构建体和/或权利要求7所述宿主细胞以及适合的载体。

9. 权利要求3或4所述RNA构建体和/或权利要求5所述DNA构建体和/或权利要求6所述表达构建体和/或权利要求7所述宿主细胞以及适合的载体和/或权利要求8所述杀虫组合物在防治蝗虫中的应用。

10. 如权利要求9所述的蝗虫为东亚飞蝗。