CN104774843A - Knickkopf基因dsRNA在害虫防治中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种Knickkopf基因dsRNA在害虫防治中的应用。具体是一种飞蝗Knickkopf基因，该基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，基于SEQ ID NO：1，设计并合成基因片段和相应的dsRNA。设计合成的dsRNA注射进入飞蝗体内，可以使飞蝗出现蜕皮困难，导致死亡。死亡率达到76％。本发明筛选获得的Knickkopf基因可作为害虫防治的分子靶标，为害虫有效控制提供新的途径。

Description

Knickkopf基因dsRNA在害虫防治中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及飞蝗knickkopf(Knk)基因dsRNA在害虫防治中的应用。

背景技术

目前对于农业害虫的防治主要依靠化学杀虫剂的施用。长期施用农药产生一系列问题，害虫对杀虫剂的抗药性增强，导致杀虫剂剂量的加大，农药大量残留加重对环境的污染，最终危害人类的健康。因此，迫切需要开发环境友好型的生物杀虫剂。

RNA干扰(RNAi)是指双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)与同源mRNA特异性结合而使其降解，从而导致基因沉默阻止基因的正常表达。RNAi技术于1998年在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中报道，2006年获得诺贝尔奖。该技术兼具特异性和高效性，是目前基因功能研究的重要手段，同时在作物害虫防治方面展示了广阔的应用前景。采用RNAi技术进行害虫控制具有杀虫专一性高和无残留等特点，已被公认为“第四代杀虫剂”，是植物保护领域未来的重要发展方向之一。因此筛选高效致死昆虫的特异性dsRNA分子靶标对于加速RNAi技术在害虫防治中的应用具有重要的意义。

昆虫表皮可以保护昆虫免受外界机械性损伤和病原微生物的侵害，对昆虫生长发育起着重要的作用。Knk基因参与昆虫表皮几丁质的有序排列，该基因的沉默将导致表皮几丁质排列紊乱，丧失表皮的正常功能而导致昆虫蜕皮阻滞而死亡。因此，本发明基于RNA干扰技术，提供了一种对环境无毒无害、特异性强的新型害虫防治分子靶标。

发明内容

本发明的目的在于提供一种飞蝗Knk基因和其合成的dsRNA，以及dsRNA在害虫防治中的应用。

本发明提供的一种飞蝗Knk基因，该基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的序列。核苷酸序列的获得是将从飞蝗转录组数据库中搜索获得的片段通过GeneDoc软件拼接比对后，进一步同时设计上游引物SEQ ID NO：3和下游引物SEQ ID NO：4，通过PCR扩增获得，将纯化后的PCR产物与PEASY-blunt zero载体同时转入trans-T1感受态细胞中培养，挑取白斑后接入LB液体培养基中培养，后提取质粒。将检测含有目的条带的菌液后送入公司测序，测序获得该基因的核苷酸长度为2074bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

本发明提供的一种飞蝗Knk基因编码的氨基酸，其特征是序列SEQ ID NO：2所示的序列。该氨基酸序列获得是采用ExPaSy在线软件将SEQ ID NO：1翻译为相应的氨基酸并对其蛋白特性进行进一步预测。结果表明Knk基因的编码681个氨基酸，分子量为77KD，理论等电点为5.86。

本发明提供的一种飞蝗Knk基因片段及其合成的dsRNA以及在害虫防治中的应用：基于飞蝗Knk基因的核苷酸序列，采用引物设计软件primer premier5.0分别设计一条均含有T7启动子的上游引物SEQ ID NO：5和下游引物SEQ ID NO：6，经过PCR扩增获得一段长度为538bp的DNA片段，其序列为SEQ ID NO：7所示(两端均含有T7启动子)。收集经过试剂盒纯化后的PCR产物并将其作为dsRNA合成的模板，依照T7RiboMAX^TMExpress RNAiSystem(Promega)试剂盒体外转录合成dsRNA，然后使用微量进样器将其注射进入飞蝗体腔内。对其mRNA表达量进行检测，同时观察其表型。结果显示注射飞蝗Knk基因片段合成的dsRNA后，其表达量显著降低，同时飞蝗出现蜕皮困难最终死亡的表型。

飞蝗Knk基因片段合成的dsRNA对飞蝗致死的原因研究：将注射dsGFP的虫体设为对照组，同时将注射Knk基因片段合成的dsRNA(dsKnk)的飞蝗设为处理组。分别将dsGFP和dsKnk注射进入飞蝗体腔内，将其表皮解剖下来进行固定，采用透射电镜方法揭示dsRNA对飞蝗的致死作用的原因。结果表明，与对照组相比，注射dsKnk的处理组虫体的表皮的几丁质致密排列的层状结构消失。

本发明的有益效果：飞蝗注射Knk基因片段合成的dsRNA后，出现蜕皮困难并致死的现象，具体表现为背部脊线开裂，背部弓起，但虫体难以从旧表蜕出最终死亡。死亡率为76％。本发明飞蝗Knk基因片段合成的dsRNA对飞蝗具有高的致死率，对于害虫防治具有重要的现实意义，可以为害虫防治提供新的途径。

附图说明

图1：飞蝗Knk基因全长cDNA的PCR扩增检测图(M所示为DL5000DNA Marker，从下到上的条带依次为100、250、500、750、1000、1500，2000、3000、5000bp，1所示为飞蝗Knk基因)

图2：SEQ ID NO：7合成的dsRNA进入飞蝗体腔内24h后，飞蝗Knk基因的mRNA表达图(1为注射dsGFP的对照组，2为注射dsRNA的处理组)。β-actin为内参基因。其中*P<0.05，**P<0.01。

图3：SEQ ID NO：7合成的dsRNA对飞蝗5龄若虫蜕皮的影响(1为注射dsGFP的对照组，2和3均为注射dsRNA的处理组)。实验组飞蝗出现蜕皮困难并死亡的表型。

图4：dsRNA对表皮几丁质超微结构影响。实验组飞蝗几丁质致密的层状结构消失。

具体实施方式

实施例1：飞蝗Knk基因全长cDNA获得以及氨基酸预测

1.飞蝗Knk基因片段搜索

从飞蝗的转录组数据库中进行Unigene搜索，后采用NCBI Blastx在线软件进行分析，确定获得1条飞蝗Knk基因片段。

2.飞蝗Knk基因全长cDNA获得

1)PCR扩增所需引物设计：

采用GeneDoc软件对搜索获得的飞蝗Knk基因片段进行拼接比对，并采用primerpremier5.0软件分别设计上游引物AAGAAATGCACGAATTAGCAATATG(SEQ ID NO：3)和下游引物TTAACACTAATTTTGCATCACAGTCC(SEQ ID NO：4)。将设计好的引物送往上海英潍捷基生物有限公司合成。

2)PCR扩增所需模板制备：

选取大小一致、生长状况良好的飞蝗5龄若虫，在体式显微镜下将其表皮快速剥离，并迅速保存于液氮中。参照TaKaRa Trizol试剂盒提取RNA。采用M-MLV反转录酶将所提RNA反转录成第一链cDNA。从而获得PCR反应所需模板。

3)PCR扩增反应

PCR扩增获得飞蝗Knk基因全长cDNA通过琼脂糖凝胶进行检测(图1)。扩增获得的PCR产物通过Gel Extroaction Kit(Omega)纯化后与PEASY-blunt zero(全式金公司)载体同时转入Trans-T1感受态细胞中培养，挑取白斑并接入LB液体培养基中培养，采用PlasmidMini Kit1(Omega)提取质粒。将检测含有目的条带的菌液送入上海英潍捷基生物有限公司进行测序，测序获得该基因全长cDNA的核苷酸长度为2074bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的序列。

3.飞蝗Knk基因氨基酸预测

采用ExPaSy在线软件对飞蝗Knk基因编码氨基酸进行预测，结果表明飞蝗Knk基因编码681个氨基酸，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示的序列。分子量为77KD，等电点为5.86。采用NCBI的Blast软件对其功能域进行预测，结果显示飞蝗Knk基因具有信号肽，2个串联的的DM13结构域和1个多巴胺类似域以及C末端的GPI-锚定位点。飞蝗Knk基因编码的氨基酸与果蝇Knk编码氨基酸序列同源度达到63％。

实施例2：飞蝗Knk基因片段合成的dsRNA

1.飞蝗Knk基因片段dsRNA合成所需引物

基于测序获得飞蝗Knk基因的核苷酸序列SEQ ID NO：1，采用primer premier5.0软件设计一对合成dsRNA所需引物。序列taatacgactcactatagggAACATCACGGCTCAGTCT CC(SEQID NO：5)和taatacgactcactatagggGGGAACCAAGTAGCCATTGA(SEQ ID NO：6)所示分别为上下游引物。(斜体部分为T7启动子)。将设计好的引物送往上海英潍捷基生物有限公司合成。

2.飞蝗Knk基因片段dsRNA合成所需模板制备

将设计合成的用于合成dsRNA的所需引物(均含有T7启动子序列)进行PCR扩增，获得一段长度为538bp的片段。其核苷酸序列为SEQ ID NO：7所示的序列。经过Gel ExtractionKit(Omega)对PCR产物进行纯化后使用NaNoDrop 2000(Thermo scientific)对其浓度进行检测，使其终浓度达到2μg/8μl。以此作为dsRNA合成的模板。

3.飞蝗Knk基因片段dsRNA的合成

基于上述制备得到的用于合成dsRNA的模板，采用T7RiboMAX^TMExpress RNAi System(Promega)试剂盒体外转录合成dsRNA。使用NaNoDrop 2000(Thermo scientific)对其进行定量，最终使其浓度达到2.5μg/μl，并将其保存于-80℃超级低温冰箱中。

实施例3：飞蝗Knk基因片段合成dsRNA对飞蝗的致死实验

1.飞蝗Knk基因片段合成dsRNA的注射

挑取25头生长状况良好、大小一致、雌雄各半的5龄2天若虫用于dsRNA注射所需。将注射dsGFP的虫体设为对照组，同时将knk基因片段合成的dsRNA(dsKnk)设立为实验组。采用微量注射器将2.5μl(6.25μg)的dsKnk轻轻顺着飞蝗腹部收缩的方向轻轻注射进入飞蝗体腔内。同时挑取相同数量的健康若虫注射相同量的dsGFP。待注射完毕后，将两组若虫置于相同条件下(光照：黑暗时间＝14h:10h，温度30±2℃，湿度60％)。饲喂足量的新鲜麦苗和麦麸。

2.飞蝗Knk基因片段mRNA表达检测

待合成的dsRNA注射进入飞蝗体腔内24h后，分别从实验组和对照组中选取9头5龄若虫，快速冻于液氮中。采用TaKaRa Trizol试剂盒提取RNA。并采用M-MLV反转录酶将所提RNA反转录成第一链cDNA。采用Real-time PCR方法分别检测目的基因(LmKnk)和管家基因(β-actin)的mRNA表达，从而对其沉默效率进行比较分析。结果显示，与对照组比较，实验组中目的基因Knk的mRNA表达显著降低(图2)。两组均设置3个生物学重复，其中每个生物学重复含有3头若虫。

3.合成Knk基因片段的dsRNA后对五龄若虫蜕皮的影响

注射dsGFP的对照组在5龄7天全部成功蜕去旧表皮，且蜕皮成功的成虫均可以健康生长。注射dsKnk的实验组若虫同样在第7天出现蜕皮现象，但难以蜕去旧表皮到达成虫，最终导致死亡(图3)，死亡率达到76％。

实施例4：飞蝗Knk基因片段合成dsRNA对飞蝗表皮结构的影响

Knk基因片段合成的dsRNA对飞蝗表皮超微结构的影响

将合成的dsGFP和dsKnk分别注射进入飞蝗体腔内，将飞蝗第三腹节的表皮快速解剖下来并将其固定在2％戊二醛中。经缓冲液漂洗后，进一步固定在1％饿酸中，采用环氧树脂包埋，超薄切片，双染色后，进行超微观察。超微结构显示，与对照相比，处理组飞蝗表皮的几丁质致密排列的层状结构消失(图4)。

Claims (7)

1.一种飞蝗knickkopf基因，其特征在于核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

2.如权利要求1所述的飞蝗knickkopf基因编码的氨基酸，其特征在于氨基酸序列为SEQID NO：2。

3.一种飞蝗knickkopf基因片段，其特征在于核苷酸序列为SEQ ID NO：7。

4.如权利要求3所述的一种飞蝗knickkopf基因片段的获得方法，其特征在于包括如下步骤：基于knickkopf基因，设计含有T7启动子的上游引物SEQ ID NO：5和下游引物SEQID NO：6，通过PCR扩增获得。

5.如权利要求3所述飞蝗knickkopf基因片段合成的dsRNA。

6.一种飞蝗knickkopf基因片段的dsRNA的合成方法，其特征在于包括如下步骤：将核苷酸序列为SEQ ID NO：7的基因片段的PCR产物纯化后，按照T7RiboMAX^TM Express RNAiSystem(Promega)试剂盒说明体外转录合成得到dsRNA。

7.如权利要求5所述飞蝗knickkopf基因片段合成的dsRNA在飞蝗防治中的应用。