CN102517295A

CN102517295A - 一种dna序列、干扰rna及其在防治害虫中的应用

Info

Publication number: CN102517295A
Application number: CN2011104596941A
Authority: CN
Inventors: 夏玉先; 郑小莉
Original assignee: Chongqing University
Current assignee: Chongqing University
Priority date: 2011-12-31
Filing date: 2011-12-31
Publication date: 2012-06-27

Abstract

本发明提供了一种DNA序列，和能使其沉默的干扰RNA，并提供了一种利用此DNA序列和干扰RNA防治害虫的方法。这种防治害虫的方法效率高，易于操作，成本低且环保，对非靶标生物影响小。而且，本方法在害虫整个生命期都能发挥防治效果，不受害虫生命期限制，应用范围更广，具有良好的推广应用前景。

Description

一种DNA序列、干扰RNA及其在防治害虫中的应用

技术领域

本发明涉及一种DNA序列和使其基因沉默的干扰RNA，以及在防治害虫中的应用。

背景技术

农业害虫危害是我国农业产量的重要制约因素，长期施用化学杀虫剂导致一系列问题：1)昆虫出现抗药性，用药剂量加大，防治成本提高；2)农药残留导致环境污染严重；3)对非靶标生物有较大影响。现有生物杀虫剂在害虫防治中应用较广，但杀虫效果缓慢。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是由双链RNA(double stranded RNA，dsRNA)分子在mRNA水平关闭相应序列基因表达或使其沉默的过程。dsRNA可以抑制不同类型细胞的靶向基因表达，用特异性的抗体几乎检测不到靶向基因所表达的蛋白质。因此，RNAi技术又被形象地称为基因敲除或基因沉默。RNAi的发现是基因的功能研究方法学的重大突破。2007年“Nature Biotechnology”杂志先后两篇论文表明能够表达靶向害虫的重要致死基因V ATPase A，CYP6AEl4 and GSTI的dsRNA转基因植物可以控制病虫害的发生，是害虫防治的新方法(Baum et a1，2007；Mao et al，2007)。2008年，Price和Gatehouse提出了基于RNAi的害虫防治策略，该策略有如下优势：1)选择对害虫专一的基因进行干扰，对高等动物和人类是安全的：2)抗虫具有专一性，对非靶标生物不具有杀伤性；2)对环境无毒无害。

广泛用于昆虫RNAi实验的基本方法有两种。一种方法是采用体外合成的dsRNA，然后将其导入昆虫体内或细胞中，称为外源性RNAi；另一种方法是用DNA表达载体导入昆虫体内或细胞中，在体内或细胞中表达时合成dsRNA，称为内源性RNAi。尽管内源性方法可以在昆虫生活史的任何时间实现细胞特异性或组织特异性的RNAi，具有遗传性等优点，但由于很多昆虫还没有建立成功的转基因体系，所以这种方法目前还并不适合许多昆虫的基因功能研究。因此外源性RNAi是目前研究的重点手段。而实现基于RNA干扰进行害虫有效控制的关键则是筛选对昆虫高效致死的干扰RNA。

目前利用RNA干扰技术杀灭害虫的研究虽然有一定的进展，但能够实现对害虫进行有效杀灭的靶点仍然十分稀少且效果仍难以令人满意，例如昆虫蜕皮基因是目前研究较多的一个靶点，利用对该基因的干扰可以实现杀灭昆虫，但是对该基因的干扰必须是在昆虫蜕皮前四天进行，因此对时间的要求较高，从而使得实验实施起来较为复杂（Zhang, Yin et al，2007）。

酚氧化酶原激活系统（prophenoloxidase activated system, proPGAS）在参与无脊椎动物的黑化防御反应中起着重要作用。β-1,3-葡聚糖识别蛋白(β-1,3-glucan-recognition protein, βGRP)是一种重要的真菌模式识别受体，它主要参与识别真菌细胞壁成分β-1,3-葡聚糖，进而激活酚氧化酶（phenoloxidase, PO）的酶原形式，即酚氧化酶原（prophenoloxidase, PPO）存在，无活性的PPO在丝氨酸型蛋白酶作用下被激活转变成具有活性的PO，进而将体内多巴胺催化生成黑色素并最终实现生物体的黑化防御反应。黑化防御反应伴随着动物的一生。β-1,3-葡聚糖识别蛋白参与识别真菌细胞壁成分,在活化酚氧化酶原激活系统中具有关键作用，因此采用RNAi技术，开展β-1,3-葡聚糖识别蛋白dsRNA在害虫防治中的作用具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种DNA序列，可编码β-1,3-葡聚糖识别蛋白。

本发明的另一目的在于提供用于沉默上述DNA序列的干扰RNA。

本发明的另一目的在于提供一种防治害虫的方法。

本发明的目的是通过如下措施实现的。

一种DNA序列，它具有序列表中SEQ ID NO:1所述的碱基序列或对SEQ ID NO:1所示碱基序列进行一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加所获得的，具有与SEQ ID NO:1相同功能的碱基序列。

一种DNA序列，它具有能在高度严格条件下与SEQ ID NO:1所示碱基序列或对SEQ ID NO:1所示核苷酸序列进行一个或多个核酸的取代、缺失或添加所获得的，具有与SEQ ID NO:1相同功能的碱基序列杂交的碱基序列。

上述DNA序列，来源于昆虫纲。优选地，上述DNA序列，来源于蝗虫。更优选地，上述DNA序列，来源于东亚飞蝗。

发明人利用SignalP3.0等软件和基因进化树等方法对上述cDNA序列编码的氨基酸序列进行了分析后得出，上述DNA序列编码β-1,3-葡聚糖识别蛋白。见图2、3。

一种氨基酸序列，由上述DNA序列编码。

一种氨基酸序列，具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列或对SEQ ID NO:2所示氨基酸序列进行一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加所获得的，具有与SEQ ID NO:2相同功能的氨基酸序列。

上述DNA序列包含一些重要的基因片段，它们在DNA序列中以及其编码的氨基酸序列是相对保守的，一般情况下是不可取代或缺失的。图4所示即上述DNA序列中重要的基因片段和对应的氨基酸序列。图5中黑色标记的片段是最为保守的，灰色标记的片段氨基酸的性质是保守的，在不改变氨基酸性质的前提下序列是相对可变的。

发明人利用RNA干扰技术以上述DNA作为靶标使之沉默，以用于后续研究。

一种使上述DNA序列沉默的干扰RNA。优选地，上述干扰RNA由SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7引物对逆转录得到。

发明人对将上述的DNA序列和干扰RNA序列用于防治害虫的研究。

一种防治害虫的方法，其特征在于利用上述干扰RNA使上述DNA序列沉默。

本发明具有如下有益效果

本发明所述DNA序列参与调控动物的黑化防御反应，当所述DNA的表达受到抑制时，防御反应同时被抑制。使用本发明所述的防治害虫的方法效率高；易于操作，成本低；保护环境，对非靶标生物影响小；且在害虫整个生命期都能发挥防治效果，不受害虫生命期限制。

附图说明

图1 东亚飞蝗βGRP基因全长cDNA序列及其编码的氨基酸序列；cDNA序列中多聚腺苷酸尾AATAAA用双实线标出，终止密码子TAG 用▲标出

图2 采用signalP3.0对东亚飞蝗LmβGRP序列分析的结果

图3 DAN序列编码的氨基酸序列与含有β-1,3-葡聚糖酶同源结构域的蛋白家族成员的进化树分析

图4 DAN序列中重要的基因片段和对应的氨基酸序列

图5 DAN序列编码的氨基酸序列推导的β-1,3-glucanase-like区域与其他昆虫βGRP的同源性比较

图6 东亚飞蝗βGRP基因全长cDNA序列PCR结果电泳图

图7 东亚飞蝗βGRP基因全长cDNA序列测序峰图

图8 βGRP被双链RNA干扰后生测结果分析及干扰效率分析

图9 干扰后东亚飞蝗异常黑色稀便 a：注射了ds-gfp的野生型东亚飞蝗排泄的为灰色硬便；b：βGRP干扰后的东亚飞蝗排泄的为异常黑色稀便

具体实施方式：

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明做出一些非本质的改进和调整。

本发明实施例中的试剂药品未做具体说明的均为普通市售，材料方法未做具体说明的均参考《分子克隆实验指南》（Sambrook和Russell,2001）

实施例1

制备DNA序列和干扰RNA

1．东亚飞蝗β-1,3-葡聚糖识别蛋白（βGRP）基因全长cDNA的获得

根据已公布的果蝇、埃及按蚊β-1,3-葡聚糖识别蛋白氨基酸序列，用Blast本地化tblastn分析比对蝗虫表达序列标签（expressed sequence tag，EST）库，查到一段序列LMC_004145与βGRP蛋白氨基酸序列相似性较高。根据此序列采用软件Primer Premier 5.0设计上游引物SEQ ID NO 3和下游引物SEQ ID NO 4。东亚飞蝗羽化后四天雄虫，去其足、翅膀和内脏后液氮研磨至粉末状，按SV Total RNA Isolation System试剂盒说明书操作提取总RNA。cDNA第1链的合成分别按照M-MLV反转录酶（Promega）说明书操作，RT-PCR扩增βGRP；以扩增得到的东亚飞蝗βGRP为依据，设计基因特异性引物SEQ ID NO 5，采用3??-RACE扩增东亚飞蝗βGRP 3??-端未知序列并最终获得βGRP全长cDNA序列，克隆βGRP全长cDNA序列的PCR结果电泳图见图6。将获得的序列进行测序分析，测序峰图见图7，序列分析结果见图2。合成引物和测序由上海生物工程公司完成。

根据最终扩增获得东亚飞蝗βGRP基因全长序列，采用软件Primer Premier 5.0设计合成dsRNA的上游引物和下游引物SEQ ID NO 6和SEQ ID NO 7，在引物的5′ 端均引入23bp长的T7启动子，扩增长度为1528bp的1个片段。按照根据MEGAScript ?? High Yield Transcription Kit (Ambion)试剂盒说明书进行操作体外转录合成dsRNA。得到的dsRNA用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测其纯度，-70℃保存备用。

实施例2

有益效果验证

1．东亚飞蝗β-1,3-葡聚糖识别蛋白基因片段dsRNA的注射

选取大小均一、健康状况一致的东亚飞蝗雄性成虫用于注射上述合成的dsRNA。dsRNA的注射参看文献(He, Cao et al. 2006)。注射后，每天观察计数蝗虫死亡和存活头数。

选取25u 1规格微量注射器用于注射，注射时不可用力过度，顺着血液流动的方向，侧腹部第2至3腹节的连接处作为注射点，要避开气门。注射东亚飞蝗β-1,3-葡聚糖识别蛋白基因片段dsRNA的量为2μg，并以注射等量dsgfp　dsRNＡ的为对照组，每组15头虫子，3个生物学重复，共计90头。注射完毕后放入笼中饲养，饲养条件为相对湿度70-75%，光照周期14：10h(L：D)，每天喂食新鲜禾本科植物叶苗、糠麸、酵母粉和水。

2．注射dsRNA后东亚飞蝗死亡情况观察

成虫注射完毕后继续饲养，并每天定时观察。β-1,3-葡聚糖识别蛋白被dsRNA干扰后，可以引起东亚飞蝗存活率下降，其中干扰合并真菌感染的东亚飞蝗LT50为3.6天，低于LT50为5.4天的单纯真菌感染的东亚飞蝗组（(P<0.05）；而单纯干扰组的东亚飞蝗的LT50为6.0天，明显低于注射dsgfp的对照组东亚飞蝗（(P<0.01）（见图4A）。同时，干扰后4-5天干扰组和干扰合并真菌感染组的死亡虫体均可见液态黑色粪便，与正常东亚飞蝗或者单纯真菌感染东亚飞蝗所排粪便不同（见图9）。

3．东亚飞蝗β-1,3-葡聚糖识别蛋白基因沉默效应检测

选取注射3天的成虫，每组取虫5只，实验组和对照组均取3个生物学重复。采用Trizol法提取总RNA，采用MMLV反转录酶获得第一链cDNA，以SEQ ID NO 8和 SEQ ID NO 9为引物对进行定量PCR（引物见表1），检测β-1,3-葡聚糖识别蛋白基因转录是否降低。结果表明实验组β-1,3-葡聚糖识别蛋白基因mRNA的表达量显著降低（见图8 B）。

Claims

1.一种DNA序列，其特征在于具有序列表中SEQ ID NO:1所述的碱基序列或对SEQ ID NO:1所示碱基序列进行一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加所获得的，具有与SEQ ID NO:1相同功能的碱基序列。

2.一种DNA序列，其特征在于具有能在高度严格条件下与SEQ ID NO:1所示碱基序列或对SEQ ID NO:1所示核苷酸序列进行一个或多个核酸的取代、缺失或添加所获得的，具有与SEQ ID NO:1相同功能的碱基序列杂交的碱基序列。

3.根据权利要求1或2所述DNA序列，其特征在于来源于昆虫纲。

4.根据权利要求1或2所述DNA序列，其特征在于来源于东亚飞蝗。

5.根据权利要求1或2所述DNA序列，其特征在于编码β-1,3-葡聚糖识别蛋白。

6.一种氨基酸序列，其特征在于由权利要求1或2所述DNA序列编码。

7.一种氨基酸序列，具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列或对SEQ ID NO:2所示氨基酸序列进行一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加所获得的，具有与SEQ ID NO:2相同功能的氨基酸序列。

8.一种干扰RNA，其特征在于使权利要求1或2所述DNA序列沉默的。

9.一种干扰RNA，其特征在于由SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7引物对逆转录得到，能使权利要求1或2所述DNA序列沉默。

10.一种防治害虫的方法，其特征在于利用权利要求8或9所述的干扰RNA使权利要求1或2所述的DNA序列沉默。