CN105165885A - miR-375-3p在鳞翅目害虫防治中的应用 - Google Patents
miR-375-3p在鳞翅目害虫防治中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105165885A CN105165885A CN201510590961.7A CN201510590961A CN105165885A CN 105165885 A CN105165885 A CN 105165885A CN 201510590961 A CN201510590961 A CN 201510590961A CN 105165885 A CN105165885 A CN 105165885A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mir
- prodenia litura
- insects
- pests
- mirna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108091031438 miR-375-3 stem-loop Proteins 0.000 title claims abstract description 74
- 108091065376 miR-375 stem-loop Proteins 0.000 title claims abstract description 73
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 title abstract description 10
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 title abstract description 7
- 230000002265 prevention Effects 0.000 title abstract 2
- 241000985245 Spodoptera litura Species 0.000 claims abstract description 50
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims abstract description 46
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 claims abstract description 6
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 claims description 9
- 241000426497 Chilo suppressalis Species 0.000 claims description 4
- 241000500437 Plutella xylostella Species 0.000 claims description 4
- 241000256259 Noctuidae Species 0.000 claims description 3
- 241001046947 Ectropis obliqua Species 0.000 claims description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 7
- 230000034994 death Effects 0.000 abstract description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 abstract description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 abstract description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 abstract 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 25
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 23
- 244000178993 Brassica juncea Species 0.000 description 19
- 235000005855 Brassica juncea var. subintegrifolia Nutrition 0.000 description 18
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 13
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 13
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 10
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 6
- 210000002468 fat body Anatomy 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 5
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 5
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 101100364962 Arabidopsis thaliana STE1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 108091036407 Polyadenylation Proteins 0.000 description 2
- 101100096884 Rattus norvegicus Sult1e1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100219191 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) byr1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 2
- 239000012526 feed medium Substances 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000029052 metamorphosis Effects 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trimethyl-N-[3-(trifluoromethyl)phenyl]benzenesulfonamide Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1S(=O)(=O)NC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003858 Chymases Human genes 0.000 description 1
- 108090000227 Chymases Proteins 0.000 description 1
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000047351 Exportin-5 Human genes 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000847058 Homo sapiens Exportin-5 Proteins 0.000 description 1
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- 108091093189 Mir-375 Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012271 agricultural production Methods 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008436 biogenesis Effects 0.000 description 1
- QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N bis(2-chloroethyl) sulfide Chemical group ClCCSCCCl QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 1
- 210000000087 hemolymph Anatomy 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 1
- 230000003914 insulin secretion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000005184 irreversible process Methods 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 210000003750 lower gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000003123 plant toxin Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 108091007428 primary miRNA Proteins 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了miR-375-3p在鳞翅目害虫防治中的应用；本发明用农业害虫斜纹夜蛾进行实验，发现Sl-miR-375-3p可能通过抑制虫体内消化食物所需的解毒酶和代谢酶的表达，从而影响虫体进食，最终导致虫体的瘦小甚至死亡。本发明发现斜纹夜蛾miR-375-3p可用于任何鳞翅目昆虫的害虫防治，同理，任何鳞翅目昆虫的miR-375-3p皆可用于其他同类昆虫的害虫防治。可将昆虫miR-375-3p用于杀虫剂的制备，或制备表达miR-375-3p的转基因植物进行害虫防治。
Description
技术领域
本发明涉及miR-375在斜纹夜蛾防治中的应用，具体涉及miR-375-3p抑制斜纹夜蛾抗植物毒素机制从而达到高效杀虫这一功能，从而围绕miR-375-3p开展转基因或抑制剂研发，达到高效害虫防治的目的。
背景技术
microRNA(miRNA)为20世纪90年代发现的一类内源性的非编码RNA（Lee
RC, Feinbaum RL, Ambros V.
The C. elegans heterochronic
gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity
to lin-14. Cell, 1993, 75(5): 843-54.），约22个核苷酸。它们的生物合成由RNA聚合酶II（RNA
polymerase II, pol II）转录，形成长度为几百甚至上千个碱基的初级转录本（pri-miRNA），其中pri-miRNA的5’端具有帽子结构和poly(A)尾巴。pri-miRNA于细胞核内在RNase III的作用下，被剪切生成miRNA前体（pre-miRNA）。前体miRNA通过Ran-GTP介导的exportin-5蛋白转运到细胞质中（Bartel DP. MicroRNAs：genomics,
biogenesis, mechanism, and function. Cell, 2004, Vol. 116 (2) : 281-297）。在RNase III/Dicer复合体的作用下，pre-miRNA被剪切成两个不完全配对的miRNA和miRNA*（miRNA*就是与miRNA不完全互补配对的序列）。最后在解旋酶的作用下miRNA/miRNA*复合体解旋形成成熟单链的miRNA。成熟的miRNA会与沉默复合体（RISC）结合，而剩下的miRNA*在细胞质中被RNase所降解。
miRNA作用机制主要包括两点：抑制翻译和降解mRNA。miRNA与靶mRNA的3’UTR不完全互补配对进而破坏靶基因mRNA转录本的稳定性，从而达到抑制核糖体翻译的目的。而降解作用则是通过加速靶mRNA中的多聚腺苷酸尾巴（poly（A）tail）去腺苷酸化，使mRNA的结构被破坏，导致mRNA失去保护而迅速被核酸外切酶降解。就目前研究而言，miRNA对靶基因mRNA的翻译抑制和对靶基因mRNA的加速降解是两个相互独立的机制，不仅如此，这两个不同的机制所产生的结果也有明显的区别：miRNA对mRNA的降解是一个不可逆的过程，一旦被降解就彻底地消失了；但是，miRNA对mRNA翻译的抑制却是可以被解除的调控（Wu L,
Fan J, BelascoJ G. MicroRNAs
direct rapid deadenylation of mRNA. Proc Natl AcadSci USA, 2006, Vol.
103(11): 4034-4039.）。
大量的研究工作表明，miRNA具有调控生物体生长和发育，细胞分化和凋亡，激素的分泌和信号的传导以及应答各种胁迫。但是在昆虫与植物关系中的重要miRNA仍没见有报道。斜纹夜蛾是一种杂食性昆虫，可以进食290多种植物，对农业生产影响很大，
研究调控其进食植物的重要miRNA对发展害虫防治新靶标有着重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供昆虫miR-375-3p在制备杀虫剂中的应用。
本发明所采取的技术方案是：
昆虫类miR-375-3p在制备杀虫剂中的应用。
进一步的，上述昆虫为鳞翅目昆虫。
进一步的，上述鳞翅目昆虫为斜纹夜蛾、蚕、茶尺蠖、小菜蛾、草地贪夜蛾、水稻二化螟。
进一步的，上述昆虫类miR-375-3p的序列如SEQ
ID NO：1所示。
本发明的有益效果是：
本发明发现斜纹夜蛾类miR-375-3p可有效防治斜纹夜蛾，该序列在别的鳞翅目昆虫内也存在，高度保守，因此也可用于防治其他害虫。
本发明发现斜纹夜蛾miR-375-3p可用于任何鳞翅目昆虫的害虫防治，同理，任何鳞翅目昆虫的miR-375-3p皆可用于其他同类昆虫的害虫防治。
附图说明
图1为注射miR-375-3p后斜纹夜蛾幼虫的生长情况；
图2 为qRT-PCR分别检测进食芥菜和人工培养基后斜纹夜蛾中肠miR-375-3p的表达水平，CK代表培养基对照，B.juncea为芥菜；
图3为 qRT-PCR检测进食培养基斜纹夜蛾不同组织中miR-375-3p的表达情况并与斜纹夜蛾细胞株进行比较；FB：脂肪体；
spli221：斜纹夜蛾细胞株；mg：中肠； head：头部；EP：表皮；
图4为qRT-PCR检测相关基因的表达与miR-375-3p之间的关系；
图5为western检测注射了miR-375-3p斜纹夜蛾幼虫体内蛋白GSTE1的表达量；图中NC表示对照组，给幼虫体内注射的序列为SEQ
ID NO：2；375mimic表示处理组，给幼虫体内注射的序列为SEQ
ID NO：1；
图6为家蚕幼虫体内注射斜纹夜蛾miR-375-3p 72 h 的表征；左边三条虫体为注射NC序列后的表型，
右边三条虫为注射斜纹夜蛾miR-375-3p后的表型，其中间一条为死亡虫；
图7为不同物种的miR-375-3p序列比较；其中，
序号1-13包括了人、哺乳动物和昆虫； 15-19为鳞翅目昆虫；
图8为不同物种miR-375-3p聚类图。
具体实施方式
本发明将5龄大的斜纹夜蛾喂食其喜好的芥菜，然后提取其消化吸收主要场所中肠的RNA，通过高通量测序分析，并与已有数据库数据进行比对分析，确定了有差异表达的163个miRNA。对其中几个表达量显著下调的miRNA进行了人工序列合成，并注射入5龄大的斜纹夜蛾， 结果发现miR-375-3p
显著抑制斜纹夜蛾的生长，注射后一天，昆虫死亡率增加了约70%。表明MiR-375-3p对斜纹夜蛾防治的有效性。目前miR-375-3p在人类胰岛素代谢，癌症，细胞凋亡等途径中都有报道参与调控，在昆虫中只有一篇报道，在蚊子吸血后miR-375-3p表达上升。miR-375-3p通过抑制人类磷脂酰肌醇依赖性激酶1，从而抑制胰岛素的分泌的
（Ouaamari A, Baroukh N, Martens GA, Lebrun P, Pipeleers
D, van Obberghen E. miR-375
targets 3'-phosphoinositide-dependent protein kinase-1 and regulates
glucose-induced biological responses in pancreatic beta-cells. Diabetes. 2008，57(10):2708-17.），但我们发现斜纹夜蛾miR-375-3p并不作用胰岛素分泌过程的相关基因，而是作用一些免疫基因。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例
1
一、
miR-
375-3p
处理影响斜纹夜蛾的生长
选取大小一致、健康状况一致的五龄第一天斜纹夜蛾幼虫，称量每只虫子的重量，随机分为miR-375-3p处理组和NC对照组，每组40只，重复3次。顺血液循环流动方向，用微量注射器从斜纹夜蛾幼虫的侧腹部第一和第二腹足之间，分别注射人工合成的miR-375-3p，序列为5’- UUUGUUCGCCCCGGCUCGAGUCG -3’（SEQ ID NO：1）和NC：5'-
UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’ （SEQ
ID NO：2），已知的不作用任何基因的无义小分子片段；注射量为每只虫4μg，注射后喂饲芥菜。注射后第1、2、3天观察虫子的形态变化并拍照取证，每天统计虫子的死亡率。
表1注射miR-375-3p后斜纹夜蛾幼虫的死亡情况
实验结果如表1和图1所示，从表1中可以看出注射miR-375-3p的处理组在注射24后，死亡率达68.97%，远远高于对照组的7.14%，72小时后死亡率达86.21%，而对照组仅为10.71%。图1为注射miR-375-3p和NC 3天后斜纹夜蛾幼虫的生长情况，从中可以看出miR-375-3p处照后存活的幼虫瘦小，而对照组的幼虫明显肥大许多。
二、
M
iR-375-3p
在斜纹夜蛾进食芥菜时表达量下降
将五龄第二天的斜纹夜蛾分别分为两组，一组继续喂食人工培育基作为对照，另一组改喂食芥菜，分别于喂食芥菜后6、12、24 和48 h取斜纹夜蛾中肠进行miR-375-3p
含量的测定，测定方法为qRT-PCR。并且，对喂食芥菜的斜纹夜蛾中脂肪体（FB）、中肠（mg）、头部（head）、和表皮（EP）中miR-375-3p
的表达量进行检测，并与斜纹夜蛾细胞株（spli221）中miR-375-3p
表达量进行比较。
从图2中可以看出，进食芥菜6 h 后，
与进食培养基的斜纹夜蛾相比，进食芥菜组的中肠miR-375-3p 含量显著下降。
因此如果此时注射大量miR-375-3p将抑制相关基因的表达，而导致斜纹夜蛾的死亡（表1 和图1）。
从图2和图3中可以看出，五龄第二天的斜纹夜蛾改喂食芥菜后，miR-375-3含量显著下降。它是通过自身对miR-375-3p的降解，解除了对靶基因的抑制作用，从而促进了靶基因的表达上调，从而响应芥菜的进食。图3分析了miR-375-3p在各组织的分布，其含量在脂肪体最高，暗示其可能与斜纹夜蛾的免疫功能有关。
三、
miR-375-3p
通过调控免疫相关基因响应斜纹夜蛾进食芥菜
为了了解miR-375-3p 可能的靶基因，本发明对斜纹夜蛾进食芥菜的中肠进行了高通量测序，通过分析，发现表达量上调显著的基因多与免疫和生长有关，将这些显著上调基因的3’末端序列与miR-375-3p进行配对，最后挑出结合可能性高的靶基因
（自由能ΔG<-19）。如下表2所示，miR-375-3p与多个二相解毒酶如GST和UGT、抗氧胁迫基因如氧化还原酶和转录因子Ets、参与代谢的蛋白水解酶和脂肪酶等。
表2 高通量测序法筛选miR-375-3p
可能的靶基因
为了进一步研究表2中筛选出的靶基因与miR-375-3p的关系，将斜纹夜蛾幼虫注射miR-375-3p并喂食芥菜72 h后，对斜纹夜蛾幼虫中肠进行qRT-PCR，以检测这些靶基因的表达情况。
qRT-PCR方法：喂食芥菜的虫子解剖，取中肠、前肠、后肠、脂肪体、表皮、血淋巴等组织，按Trizol 法抽提总RNA，测定浓度后取2 μg 总RNA 进行反转录（参考TAKARA的One
Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit说明书进行），得到的cDNA 产物稀释后用于荧光定量PCR的模板，按照说明书进行qRT-PCR。采用相对定量的方法（2−ΔΔCt）来确定目标基因相对内标基因（GAPDH，HQ012003）的相对表达倍数。应用SPSS16.0统计分析软件，采用ANOVA（多个处理间的两两比较）或独立样本T检验（两个样品间比较）来进行处理间的差异比较分析。
实验结果如图4所示，从中可以看出，在注射miR-375-3p的斜纹夜蛾幼虫体内，蛋白水解酶chymotrypsin-like protease、解毒酶UGT和GSTe1
表达量显著下调，说明miR-375-3p在体内抑制这些基因的表达。
本实施例还用western方法作进一步检测，将斜纹夜蛾幼虫注射了miR-375-3p后再喂食芥菜，然后分别在注射24 h、48 h后提取斜纹夜蛾中肠蛋白，用western方法检测目的蛋白GSTE1（解毒酶）的表达量。
检测结果如图5所示，从结果可以看出在处理组（注射了miR-375-3p斜纹夜蛾幼虫体）中GSTE1蛋白表达水平明显低于对照组（NC），说明miR-375-3p抑制GSTE1蛋白表达。而正常情况下该蛋白在斜纹夜蛾进食芥菜后表达量上调。
实施例
2
Sl-miR-375-3p
对家蚕生长发育的影响
既然miR-375-3p在鳞翅目昆虫较保守， 那么斜纹夜蛾Sl-miR-375-3p是否同样影响其他鳞翅目昆虫的生长发育？为此对家蚕5龄幼虫进行了同实施例1中“一”相似的注射实验，注射后观察虫子的形态变化并拍照取证，每天统计虫子的死亡率。
检测结果如图6所示，可以看出注射2 ug斜纹夜蛾Sl-miR-375-3p后的家蚕100%生长不正常，虫体瘦小，72 h后，死亡率达54 %（见表3）。
表3 注射斜纹夜蛾miR-375-3p的家蚕死亡率统计
下面将斜纹夜蛾Sl-miR-375-3p序列与鳞翅目其他昆虫的miR-375-3p序列进行比较，同时与其他物种（如人、哺乳动物）的miR-375-3p序列进行比较，比较结果如图7和图8所示。
从图7中可以看出鳞翅目昆虫中小菜蛾（Plutella xylostella）、家蚕（Bombyx mori ）和水稻二化螟（Chilo suppressalis）的miR-375-3p序列完全一样，而草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）和斜纹夜蛾（Spodoptera litura）的miR-375-3p序列完全一样，
两组鳞翅目昆虫间的miR-375-3p序列只有一个碱基的差异，一个为U，
另一个为A。而鳞翅目昆虫的miR-375-3p序列与别的物种差别较大。从图8中可以看出鳞翅目昆虫miR-375-3p聚为一类，而与其他物种差距较大。
上述结果说明，miR-375-3p抑制虫体内用于消化食物所需的解毒酶和代谢酶的表达，从而影响虫体进食，最终导致虫体的瘦小甚至死亡。斜纹夜蛾miR-375-3p可用于任何鳞翅目昆虫的害虫防治。同理，任何鳞翅目昆虫的miR-375-3p皆可用于其他同类昆虫的害虫防治。可将昆虫miR-375-3p用于杀虫剂的制备，或制备表达miR-375-3p的转基因植物进行害虫防治。
为本领域的专业技术人员容易理解，以上所述仅为本发明专利的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均落在本发明要求的保护范围之内。
<110> 华南师范大学
<120> miR-375-3p在鳞翅目害虫防治中的应用
<130>
<160>
2
<170>
PatentIn version 3.5
<210>
1
<211>
23
<212>
RNA
<213> 人工序列
<400>
1
uuuguucgcc ccggcucgag ucg
23
<210>
2
<211>
19
<212>
RNA
<213> 人工序列
<400>
2
uucuccgaac gugucacgu
19
Claims (4)
1.昆虫类miR-375-3p在制备杀虫剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述昆虫为鳞翅目昆虫。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述鳞翅目昆虫为斜纹夜蛾、蚕、茶尺蠖、小菜蛾、草地贪夜蛾、水稻二化螟。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述昆虫类miR-375-3p的序列如SEQ ID NO：1所示。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510590961.7A CN105165885B (zh) | 2015-09-16 | 2015-09-16 | miR‑375‑3p在鳞翅目害虫防治中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510590961.7A CN105165885B (zh) | 2015-09-16 | 2015-09-16 | miR‑375‑3p在鳞翅目害虫防治中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105165885A true CN105165885A (zh) | 2015-12-23 |
| CN105165885B CN105165885B (zh) | 2017-03-22 |
Family
ID=54888742
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510590961.7A Expired - Fee Related CN105165885B (zh) | 2015-09-16 | 2015-09-16 | miR‑375‑3p在鳞翅目害虫防治中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105165885B (zh) |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106614711A (zh) * | 2016-11-07 | 2017-05-10 | 华南师范大学 | 一种植物小分子核糖核蛋白rna在害虫防治中的应用 |
| CN108165574A (zh) * | 2017-12-27 | 2018-06-15 | 杭州更蓝生物科技有限公司 | 一种控制害虫的方法 |
| CN109258681A (zh) * | 2018-09-27 | 2019-01-25 | 华南师范大学 | miR-71-5p在害虫防治中的应用 |
| CN109385422A (zh) * | 2017-08-09 | 2019-02-26 | 浙江大学 | 一种对二化螟致死及延缓发育的昆虫特异性Csu-miR-14基因及其应用 |
| CN112369428A (zh) * | 2020-11-19 | 2021-02-19 | 山东农业大学 | 一种调控昆虫翅发育的miR-318及其在害虫防治中的应用 |
| CN113621620A (zh) * | 2021-08-17 | 2021-11-09 | 安徽农业大学 | 具有调控小菜蛾免疫功能的基因及其制备方法和应用 |
| CN114350661A (zh) * | 2021-12-08 | 2022-04-15 | 华南师范大学 | 一种小麦源miRNA在昆虫防治中的应用 |
| CN117965544A (zh) * | 2024-03-29 | 2024-05-03 | 中国农业大学 | 一种防治鳞翅目害虫的miR-8529-5p及其应用 |
| CN117965545A (zh) * | 2024-03-29 | 2024-05-03 | 中国农业大学 | 一种防治鳞翅目害虫的miR-8492-3p及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007080127A2 (en) * | 2006-01-12 | 2007-07-19 | Devgen N.V. | Dsrna as insect control agent |
| CN102517295A (zh) * | 2011-12-31 | 2012-06-27 | 重庆大学 | 一种dna序列、干扰rna及其在防治害虫中的应用 |
-
2015
- 2015-09-16 CN CN201510590961.7A patent/CN105165885B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007080127A2 (en) * | 2006-01-12 | 2007-07-19 | Devgen N.V. | Dsrna as insect control agent |
| CN102517295A (zh) * | 2011-12-31 | 2012-06-27 | 重庆大学 | 一种dna序列、干扰rna及其在防治害虫中的应用 |
Cited By (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106614711A (zh) * | 2016-11-07 | 2017-05-10 | 华南师范大学 | 一种植物小分子核糖核蛋白rna在害虫防治中的应用 |
| CN106614711B (zh) * | 2016-11-07 | 2019-03-05 | 华南师范大学 | 一种植物小分子核糖核蛋白rna在害虫防治中的应用 |
| CN109385422A (zh) * | 2017-08-09 | 2019-02-26 | 浙江大学 | 一种对二化螟致死及延缓发育的昆虫特异性Csu-miR-14基因及其应用 |
| CN108165574B (zh) * | 2017-12-27 | 2021-11-12 | 杭州光之林科技有限公司 | 一种控制害虫的方法 |
| CN108165574A (zh) * | 2017-12-27 | 2018-06-15 | 杭州更蓝生物科技有限公司 | 一种控制害虫的方法 |
| CN109258681A (zh) * | 2018-09-27 | 2019-01-25 | 华南师范大学 | miR-71-5p在害虫防治中的应用 |
| CN109258681B (zh) * | 2018-09-27 | 2020-12-22 | 华南师范大学 | miR-71-5p在害虫防治中的应用 |
| CN112369428A (zh) * | 2020-11-19 | 2021-02-19 | 山东农业大学 | 一种调控昆虫翅发育的miR-318及其在害虫防治中的应用 |
| CN112369428B (zh) * | 2020-11-19 | 2021-08-13 | 山东农业大学 | 一种调控昆虫翅发育的miR-318及其在害虫防治中的应用 |
| CN113621620A (zh) * | 2021-08-17 | 2021-11-09 | 安徽农业大学 | 具有调控小菜蛾免疫功能的基因及其制备方法和应用 |
| CN114350661A (zh) * | 2021-12-08 | 2022-04-15 | 华南师范大学 | 一种小麦源miRNA在昆虫防治中的应用 |
| CN114350661B (zh) * | 2021-12-08 | 2023-06-20 | 华南师范大学 | 一种小麦源miRNA在昆虫防治中的应用 |
| CN117965544A (zh) * | 2024-03-29 | 2024-05-03 | 中国农业大学 | 一种防治鳞翅目害虫的miR-8529-5p及其应用 |
| CN117965545A (zh) * | 2024-03-29 | 2024-05-03 | 中国农业大学 | 一种防治鳞翅目害虫的miR-8492-3p及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105165885B (zh) | 2017-03-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105165885A (zh) | miR-375-3p在鳞翅目害虫防治中的应用 | |
| AU2020257097B2 (en) | Compositions and methods for controlling arthropod parasite and pest infestations | |
| Desai et al. | Reduction in deformed wing virus infection in larval and adult honey bees (Apis mellifera L.) by double‐stranded RNA ingestion | |
| CN103571844B (zh) | dsRNA及其组合在控制蚜虫危害中的应用 | |
| US9932590B2 (en) | Control of Varroa mite infestation | |
| AU2022201685B2 (en) | Compositions and methods for controlling arthropod parasite and pest infestations | |
| Wang et al. | MicroRNA‐dependent development revealed by RNA interference‐mediated gene silencing of LmDicer1 in the migratory locust | |
| CN103088024B (zh) | 两种dsRNA及其组合在控制蚜虫危害中的应用 | |
| Kang et al. | Integrative mRNA-miRNA interaction analysis associated with the immune response of Epinephelus coioddes to Vibrio alginolyticus infection | |
| Hadj-Moussa et al. | Potential role for microRNA in regulating hypoxia-induced metabolic suppression in jumbo squids | |
| CN109258681B (zh) | miR-71-5p在害虫防治中的应用 | |
| CN113106100A (zh) | 一种调控鳞翅目害虫致死的miRNA、类似物、抑制剂及其应用 | |
| CN103088031A (zh) | 一种昆虫翅盘异常发育基因片段及其dsRNA和应用 | |
| Ghosh et al. | Double strand RNA-mediated RNA interference through feeding in larval gypsy moth, Lymantria dispar (Lepidoptera: Erebidae). | |
| Xie et al. | Integrated analysis of miRNA and mRNA expression profiles in response to gut microbiota depletion in the abdomens of female Bactrocera dorsalis | |
| Russo et al. | Aphidius ervi venom regulates Buchnera contribution to host nutritional suitability | |
| Deng et al. | A Dicer2 from Scylla paramamosain activates JAK/STAT signaling pathway to restrain mud crab reovirus | |
| CN102326542A (zh) | 棕榈酸作为南方根结线虫驱避剂的新用途 | |
| CN102550594A (zh) | 用RNAi有效防治昆虫及蜘蛛类有害生物的方法 | |
| Huang et al. | Functional characteristics of Dicer genes in Plutella xylostella | |
| CN110144351B (zh) | 一种飞蝗脂肪酸合成酶基因LmFAS2的dsRNA及其制备方法和应用 | |
| CN105230651B (zh) | 鳞翅目昆虫几丁质合成酶CHSA‑2b/19b在害虫防治中的应用 | |
| CN112616858B (zh) | Loc663462基因在防治害虫中的应用 | |
| CN106614711B (zh) | 一种植物小分子核糖核蛋白rna在害虫防治中的应用 | |
| CN116426534B (zh) | 褐飞虱NlsNPF基因及其dsRNA在防治褐飞虱的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20170322 |