CN105230651B - 鳞翅目昆虫几丁质合成酶CHSA‑2b/19b在害虫防治中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了鳞翅目昆虫几丁质合成酶CHSA‑2b/19b在害虫防治中的应用，本发明通过充分鳞翅目昆虫注射干涉外显子2b和19b的dsRNA，发现昆虫翅脉畸形，变皱与薄，翅变小，表明含有2b和/或19b的转录本影响昆虫翅的发育。可将抑制鳞翅目昆虫中含2b和/或19b的几丁质合成酶转录本表达的人工合成物质或从植物筛选的化合物作为抑制剂，如对鳞翅目昆虫注射CHSA‑2b的dsRNA，可以实现害虫防治的目的。同样，也可以将促进鳞翅目昆虫中含2b和/或19b的几丁质合成酶转录本降解的物质、或者抑制含2b和/或19b的几丁质合成酶转录本发挥正常作用的物质作为害虫杀虫剂，均可实现害虫防治的目的。

Description

鳞翅目昆虫几丁质合成酶CHSA-2b/19b在害虫防治中的应用

技术领域

本发明涉及鳞翅目昆虫几丁质合成酶基因外显子2b、19b在害虫防治中的应用，具体涉及CHSA-2b/19b影响鳞翅目昆虫蛹翅发育这一功能，从而围绕该基因开展转基因或抑制剂研发，通过阻碍昆虫翅正常发育，影响其飞翔、求偶和繁殖，达到害虫防治的目的。

背景技术

昆虫表皮与翅的主要成分是几丁质，几丁质(chitin)是仅次于纤维素的第2大生物高分子，是一个线型多聚糖复合体，由N-乙酰-β-D葡萄糖胺（β-N-Acetyl-D-glucosamine）通过β-1,4糖苷键聚合而成。在节肢动物中几丁质是表皮外骨骼的重要成分对节肢动物的生长发育起重要作用，是昆虫外表皮骨骼、气管角质层、中肠围食膜基质等的组成成分。昆虫几丁质含量随昆虫的生长发育而发生变化，在昆虫蜕皮期含量减少，反之，新皮生成期含量增加。几丁质合成酶催化有活性的糖供体尿苷二磷酸-N-乙酰葡萄糖胺(uridinedi -pho-sphate N-acetyl glucosamine, UDP-GlcNAc) 聚合形成几丁质。因此几丁质合成酶在昆虫生长发育中起着重要的作用，成为杀虫剂开发的首选靶基因，市场已有不少该基因抑制剂在使用。

昆虫几丁质合成酶有两类，分别负责表皮和中肠几丁质合成。目前的杀虫剂基本是根据表皮型几丁质合成酶研发的。中肠型的暂没有发现剪切形式，但表皮型几丁质合成酶（CHSA）在所有物种中，其cDNA后部皆有一个可变剪切外显子存在，鳞翅目昆虫的是第19个外显子。研究发现这第19外显子的第一种剪切形式19a主要表达于表皮，而另一种剪切19b主要表达于气管（Qu, M., Yang, Q., 2011. A novel alternative splicing siteof class A chitin synthase from the insect Ostrinia furnacalis - Geneorganization, expression pattern and physiological significance. InsectBiochemistry and Molecular Biology. 41, 923-931.）。而在鳞翅目昆虫玉米螟，Qu andYang（2011）首次发现CHSA的第2个外显子存在两种不同的剪切方式，分别由不同的启动子启动表达，其中CHSA-2a与其他物种几丁质酶相似，主要负责表皮几丁质的合成。但仍不清楚CHSA-2b的功能。并且至今也没有报道关于表皮几丁质酶不同剪切方式在昆虫翅发育中的功能研究。目前市场上的抑制剂都是根据CHSA-2a转录本开发的。

发明内容

本发明的目的在于提供昆虫CHSA-2b的抑制剂在制备杀虫剂中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

鳞翅目昆虫表皮几丁质合成酶外显子2b和/或19b作为害虫防治靶点的应用。

对鳞翅目昆虫表皮几丁质合成酶外显子2b和/或19b具有抑制作用的物质在害虫防治中的应用。

进一步的，上述对鳞翅目昆虫几丁质合成酶外显子2b和/或19b具有抑制作用的物质选自抑制外显子2b和/或19b表达的物质、促进外显子2b和/或19b RNA降解的物质、抑制外显子2b和/或19b发挥正常作用的物质中的至少一种。

进一步的，上述抑制鳞翅目昆虫几丁质合成酶外显子2b和/或19b表达的物质为能够对外显子2b和/或19b进行RNA干涉的序列。

进一步的，上述能够对外显子2b和/或19b进行RNA干涉的序列选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7中的至少一种。

进一步的，上述鳞翅目昆虫为斜纹夜蛾、蚕、玉米螟、玉带凤蝶。

一种斜纹夜蛾表皮几丁质合成酶的cDNA序列，其序列如SEQ ID NO：8所示。

本发明的有益效果是：

1）昆虫的生长发育伴随着几丁质降解与生物合成，而人类和其他脊椎动物不存在这一现象，所以几丁质合成酶作为害虫防治的一个潜在靶位点，具有重要的研究价值。本研究针对几种鳞翅目昆虫发现的几丁质合成酶外显子2的可变剪切2b，开展功能研究，发现其并非像2a影响昆虫的表皮形成，而是专一影响翅的发育，因此，我们研究鉴定出的CHSA-2b和/或19b影响鳞翅目昆虫斜纹夜蛾和家蚕蛹翅发育这一功能，可直接利用其dsRNA对鳞翅目昆虫进行专一害虫防治。

2）本发明研究发现家蚕表皮几丁质合成酶的不同剪切方式在翅的发育中所起的作用不一样。CHSA外显子2b和19b皆影响翅的发育，以及都有相似的表达谱，两者可能参与组成一个cDNA， 并且为特殊昆虫所特有。因此，可以根据几丁质合成酶含2b和19b的全长蛋白编码序列发展抗鳞翅目昆虫的抑制剂。昆虫翅对飞行、取食和繁殖具有重要的意义，因此本发明的几丁质合成酶CHSA-2b和/或19b的抑制剂将通过阻碍翅的发育而达到害虫防治的目的。

附图说明

图1为分别注射dsBmCHSA-2b、dsGFP后家蚕成虫的表征，左列为雄虫，右列为雌虫；

图2为分别注射dsBmCHSA-2b、dsGFP后家蚕成虫翅放大图，左列为整翅，右列为翅脉放大图；

图3为分别注射dsBmCHSA-2b、dsGFP后家蚕成虫翅放大图，左列为整翅，右列为翅脉放大图；

图4为分别注射dsBmCHSA-2b、 dsBmCHSA-19b和dsGFP后家蚕成虫翅的平均面积（左图）和注射ds BmCHSA-2b、dsGFP后翅中CHSA-2b的表达水平（右图）；

图5为几丁质合成酶几种剪切方式在家蚕变态发育中的mRNA水平分析；其中，5LD1-5为5龄1-5天大的幼虫；W0-2为游走期0-2天虫子； PP为预蛹期，P0-6为蛹期0-6天大的虫；

图6为蜕皮激素对家蚕几丁质合成酶几种剪切方式的诱导作用；其中2µg、4µg为蜕皮激素的剂量，DMSO为对照；

图7为家蚕和斜纹夜蛾几丁质合成酶基因结构图；图中黑框代表了外显子，虚线代表内含子或启动子区域；

图8为分别注射ds SlCHSA-2b、ds GFP后家蚕成虫的表征；

图9为玉带凤蝶PpCHSA-2b、玉米螟OfCHSA-2b与家蚕BmCHSA-2b的序列比对。

具体实施方式

70 %农业害虫属于鳞翅目，为此本发明选择鳞翅目模式昆虫家蚕和害虫斜纹夜蛾开展了CHSA-2b的克隆与功能分析，确定了该两种昆虫皆存在与玉米螟表皮几丁质合成酶同样的结构， 在外显子2存在两种可变剪切。分别在可变剪切片段区域设计引物，进一步分析不同剪切方式在翅不同发育时期的表达谱，发现分别含剪切片段2b和19b 的转录本CHSA-2b与CHSA-19b皆在蛹翅的第3天方开始表达上调，并且都受昆虫蜕皮激素的诱导， 暗示两者可能共享一个启动子；而CHSA-2a与CHSA-19a 的表达谱一致，在成蛹第一天和蛹后期高表达，并且不受昆虫蜕皮激素的直接诱导。

由于大量的研究表明一般表皮几丁质合成酶（CHSA-2a/19a）负责表皮的几丁质合成，那么含2b片段的几丁质合成酶（CHSA-2b）与含19b片段的几丁质合成酶（CHSA-19b）的作用是什么。本发明通过注射干涉外显子2b和19b的dsRNA，发现翅脉畸形，变皱与薄，翅变小，表明含有2b和/或19b的转录本影响家蚕蛹翅的发育，即可变剪切外显子2b和/或19b与其他外显子组成的转录本影响家蚕蛹翅的发育。

由于并不是所有昆虫表皮几丁质合成酶皆在外显子2和19存在两种不同的剪切方式，因此可以利用该特点，对鳞翅目昆虫进行CHSA-2b和/或CHSA-19b RNAi，可以利用转基因植物的方法，使害虫进食CHSA-2b和/或CHSA-19b dsRNA，破坏翅的正常发育，影响求偶和繁殖，达到害虫防治的目的。也可以针对CHSA-2b和/或CHSA-19b筛选抑制剂进行害虫防治。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1 家蚕BmCHSA-2b被抑制表达的家蚕翅畸形

（1）家蚕BmCHSA-2b和BmCHSA-19b dsRNA的合成

根据试剂盒T7 RiboMAX™ Express RNAi System（购自Promega公司）的说明书分别合成家蚕BmCHSA-2b dsRNA、BmCHSA-19b dsRNA和GFP dsRNA，各dsRNA的序列如下所述。

1）家蚕CHSA的外显子2b cDNA序列为：

ATTATGAGTGAACAAGAACGTAGGAGTCAATACGAGAACGAGGAGACGGAGGAAGTCGTTTACATTCCAAATAACAATTACTCGATATACAGTAATGGAACTTTGCATTACTGTAGCATATACAG（SEQ ID NO：1）。

2）家蚕BmCHSA-2b dsRNA（以下简称ds BmCHSA-2b）序列为：

GGAGACGGAGGAAGUCGUUUACAUUCCAAAUAACAAUUACUCGAUAUACAGUAAUGGAACUUUGCAUUACUGUAGCAUAUACAGUCAGCGCACAGUACAAGAAACGAAAGGAUGGGACGUGUUCAGAGAAUUUCCGCCGAAACAGGACAGUGUGUCCAUGGAGACUCAGAAAUGUUUGGAAUUCACAGUGCGAAUGUUAAAAGUGGUCGCUUACCUGGUCACCUUCAUCGUGGUCCUUGGAUCAGGAGUUAUCGCAAAGGGGACAAUUUUGUUCAUGACGUCACAAAUUAGGAAAGACAAGCGAUUAGAAUUCUGCAAUAAAAACUUAGGUCGAGAUAAGCAGUUUGUGGUGAGUUUACCAGACGAGGAGCGUGUUGCCUGGAUGUGGGCUA（SEQ ID NO：2）。

3）家蚕BmCHSA的外显子19b cDNA序列为：

AGGCTCGCATAGCAGGCGATCTACTAGAACTTCGCAATAAATCAGTTTTCGCATTTGTTATGTTCAATGCTTTATTTATATTGATAGTATTTTTATTACAACTCAATAAAGATCAGCTTCACGTGGTCTGGCCTTTGGGAGTTAAGACAAACATTACGTACATGGAGGAAACAGGCCAG（SEQ ID NO：3）。

4）家蚕BmCHSA-19b dsRNA（以下简称ds BmCHSA-19b）序列为：

AGGCUCGCAUAGCAGGCGAUCUACUAGAACUUCGCAAUAAAUCAGUUUUCGCAUUUGUUAUGUUCAAUGCUUUAUUUAUAUUGAUAGUAUUUUUAUUACAACUCAAUAAAGAUCAGCUUCACGUGGUCUGGCCUUUGGGAGUUAAGACAAACAUUACGUACAUGGAGGAAACAGGCCAG（SEQ ID NO：4）。

5）GFP dsRNA（以下简称ds GFP）序列为：

UACGGCGUGCAGUGCUUCAGCCGCUACCCCGACCACAUGAAGCAGCACGACUUCUUCAAGUCCGCCAUGCCCGAAGGCUACGUCCAGGAGCGCACCAUCUUCUUCAAGGACGACGGCAACUACAAGACCCGCGCCGAGGUGAAGUUCGAGGGCGACACCCUGGUGAACCGCAUCGAGCUGAAGGGCAUCGACUUCAAGGAGGACGGCAACAUCCUGGGGCACAAGCUGGAGUACAACUACAACAGCCACAACGUCUAUAUCAUGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCAUCAAGGUGAACUUCAAGAUCCGCCACAACAUCGAGGACGGCAGCGUGCAGCUCGCCGACCACUACCAGCAGAACACCCCCAUCGGCGACGGCCCCGUGCUGCUGCCCGACAACCACUACCUGAGCAC（SEQ ID NO：5）。

（2）家蚕BmCHSA-2b 和BmCHSA-19b分别被RNAi后的表型

1）家蚕BmCHSA-2b被RNAi后的表型

方法：

本实施例选择变态时期的游走期第二天的家蚕分别进行BmCHSA-2b、BmCHSA-19bRNAi。将家蚕于冰上麻醉1小时后，在2和3胸节交接处分别向每条虫体注射10 μg的上述合成的dsBmCHSA-2b和dsBmCHSA-19b 片段，对照组注射10 μg dsGFP，观察RNAi后对蛹至成虫变态发育的影响。

结果：图1为注射dsRNA后各组家蚕的表型，从中可以看出，干涉家蚕CHSA-2b后，家蚕翅畸形，翅卷曲、残缺，翅脉混乱。翅不能鼓动而不能交配，从而影响生殖。

进一步观察注射dsBmCHSA-2b、dsGFP后家蚕翅表型（如图2），可见敲除家蚕CHSA- 2b后，家蚕翅变小，翅脉变薄、混乱、起皱。

）家蚕BmCHSA-19b 被RNAi后的表型

同上述1）中的操作方法，将合成的dsBmCHSA-19b、dsGFP分别注射家蚕，观察注射后各组家蚕的表型。

图3为注射dsBmCHSA-19b、dsGFP后家蚕翅的表型，可见敲除家蚕CHSA-19b后，家蚕翅同样变小，翅脉变薄，混乱、起皱。

分别对注射dsBmCHSA-2b、dsBmCHSA-19b和dsGFP后家蚕成虫残翅率进行统计，统计结果见表1，从中可以看出，注射dsBmCHSA-2b、dsBmCHSA-19b后家蚕成虫残翅率显著增高，可高达67.6%。

表1分别对注射ds BmCHSA-2b、ds BmCHSA-19b和dsGFP后家蚕成虫残翅率分析

名称	总数	残翅数	百分比（%）
				dsGFP	51	11	21.6
dsBmCHSA-2b	37	25	67.6
				ds BmCHSA-19b	23	14	60.8

对上述分别注射dsBmCHSA-2b、ds BmCHSA-19b和dsGFP后家蚕成虫翅的面积进行统计，计算各组家蚕成虫翅的平均面积，同时检测各组家蚕翅中BmCHSA-2b的表达水平。

图4为分别注射ds BmCHSA-2b、ds BmCHSA-19b和ds GFP后家蚕成虫翅的平均面积（左图）和注射ds BmCHSA-2b、ds GFP后翅中CHSA-2b的表达水平（右图）；从中可以看出，BmCHSA-2b和BmCHSA-19b的RNAi明显影响家蚕翅大小的发育。检测RNAi后BmCHSA-2b的表达，发现在96 h （蛹期第三天，P3）BmCHSA-2b mRNA水平与对照组相比明显降低（图4右）。

综上所述，含外显子2b的几丁质合成酶BmCHSA-2b 和含外显子19b的BmCHSA-19bRNAi后成虫的翅卷曲、残缺、翅脉混乱、变薄和起皱，检测RNAi后BmCHSA-2b的表达，发现在96 h （蛹期第三天，P3）BmCHSA-2b mRNA水平与对照组相比明显降低，统计结果显示敲除BmCHSA-2b和BmCHSA-19b后，残翅家蚕的比率为67.6% 和60.8%，对照组为21.6%；结果表明BmCHSA-2b和BmCHSA-19b在家蚕蛹-成虫的蜕变过程中的翅发育发挥着重要功能，而且外显子2b和19b可能与其他非剪切外显子共同组成转录本发挥作用。

（3）家蚕几丁质合成酶不同剪切方式在翅发育过程中的表达

分别在家蚕几丁质合成酶BmCHSA的外显子2a、2b、19a和19b片段设计引物，在家蚕发育的不同阶段qRT-PCR检测该4种外显子的表达情况。

检测结果如图5所示，从中可以看出，含外显子2a、19a 的几丁质合成酶的表达谱相似，而含外显子2b、19b的几丁质合成酶表达谱相似，表明可能外显子2a+19a与其他外显子组成转录本，而外显子2b+19b可能与其他外显子组成另一转录本。并且BmCHSA-2b和BmCHSA-19b都是在蛹期第3天表达上调，说明它们在蛹翅发育中均具有重要作用。

（4）蜕皮激素对家蚕几丁质合成酶不同剪切形式的诱导作用

蜕皮激素（20E）是启动昆虫蜕皮和变态发育的重要激素。将不同剂量的蜕皮激素注射进入蛹期一天大的虫体中，不同时间后测量体内各个几丁质合成酶剪切形式的mRNA水平。

检测结果如图6所示，从中可以看出BmCHSA-2b 与BmCHSA-19b响应蜕皮激素的信号，在注射蜕皮激素24h后开始表达上调；而BmCHSA-2a与BmCHSA-19a不响应蜕皮激素的信号，进一步说明了外显子2b与19b与其他外显子组合形成了一个转录本。

实施例2 斜纹夜蛾SlCHSA-2b/19b在翅发育中的作用

为了证明鳞翅目其他物种含外显子2b、19b的几丁质合成酶是否也具有与家蚕BmCHSA-2b、BmCHSA-19b同样的功能，本实施例克隆了斜纹夜蛾中含2b和19b的全长cDNA，并对外显子2b片段进行了RNAi 实验。 结果表明，斜纹夜蛾含外显子2b几丁质合成酶具有与家蚕含外显子2b几丁质合成酶同样的功能，同样影响蛹翅的发育。

（1）斜纹夜蛾SlCHSA-2b cDNA序列和SlCHSA-2b dsRNA的合成

斜纹夜蛾SlCHSA 外显子2b cDNA序列为：

TATGAGTGATAACGATCGTAAAAGTCACTATGAAAGGGACGATGCCGAGGAACCGCTTTATGTCGCCAACAACAATAATTCAATTTACAGCAATGGGACTTTGCATTATTGTAGCATATACAG（SEQ ID NO：6）。

斜纹夜蛾SlCHSA-2b dsRNA（以下简称ds SlCHSA-2b）序列为：

UAUGAGUGAUAACGAUCGUAAAAGUCACUAUGAAAGGGACGAUGCCGAGGAACCGCUUUAUGUCGCCAACAACAAUAAUUCAAUUUACAGCAAUGGGACUUUGCAUUAUUGUAGCAUAUACAG（SEQ ID NO：7）。

斜纹夜蛾含外显子2b和19b的全长cDNA序列如SEQ ID NO：8所示。

（2）SlCHSA与BmCHSA基因序列比较

对家蚕与斜纹夜蛾表皮几丁质合成酶的基因结构进行分析，从中可以发现两者非常相似（图7），外显子2皆具有可变剪切，比其他物种多出的启动子位于外显子2b之前，可以启动外显子2b的表达。

（3）斜纹夜蛾SlCHSA-2b被RNAi后的表型

采用与家蚕同样的方法，利用斜纹夜蛾几丁质合成酶基因外显子2b片段合成dsRNA，敲除体内SlCHSA-2b，观察斜纹夜蛾的表型。

斜纹夜蛾表型结果如图8所示，从中可以看出，斜纹夜蛾表型的结果和家蚕的相似。注射dsSlCHSA-2b的斜纹夜蛾翅畸形，变小，卷起，不能起飞。

另外，对玉带凤蝶PpCHSA-2b、玉米螟OfCHSA-2b与家蚕BmCHSA-2b的序列进行比对，比对结果如图9所示，结果显示这三种物质的CHSA皆具有外显子2b，说明干涉玉带凤蝶、玉米螟的外显子2b，也能达到害虫防治的目的。。

本发明用鳞翅目模式昆虫家蚕和农业害虫斜纹夜蛾进行实验，证实含2b和19b的表皮几丁质合成酶影响昆虫的翅发育。昆虫翅对飞翔、取食、求偶和繁殖具有重要的意义，因此可以通过阻碍翅的发育而达到害虫防治的目的。

综合上述的实验结果，可将抑制鳞翅目昆虫中含2b和/或19b的几丁质合成酶转录本表达的人工合成物质或从植物筛选的化合物作为抑制剂，如对鳞翅目昆虫注射CHSA-2b的dsRNA，可以实现害虫防治的目的。同样，也可以将促进鳞翅目昆虫中含2b和/或19b的几丁质合成酶转录本降解的物质、或者抑制含2b和/或19b的几丁质合成酶转录本发挥正常作用的物质作为害虫杀虫剂，均可实现害虫防治的目的。

为本领域的专业技术人员容易理解，以上所述仅为本发明专利的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均落在本发明要求的保护范围之内。

<110> 华南师范大学

<120> 鳞翅目昆虫几丁质合成酶CHSA-2b/19b在害虫防治中的应用

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<170> PatentIn version 3.5

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<212> DNA

<213> 家蚕

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attatgagtg aacaagaacg taggagtcaa tacgagaacg aggagacgga ggaagtcgtt 60

tacattccaa ataacaatta ctcgatatac agtaatggaa ctttgcatta ctgtagcata 120

tacag 125

<210> 2

<211> 392

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggagacggag gaagucguuu acauuccaaa uaacaauuac ucgauauaca guaauggaac 60

uuugcauuac uguagcauau acagucagcg cacaguacaa gaaacgaaag gaugggacgu 120

guucagagaa uuuccgccga aacaggacag uguguccaug gagacucaga aauguuugga 180

auucacagug cgaauguuaa aaguggucgc uuaccugguc accuucaucg ugguccuugg 240

aucaggaguu aucgcaaagg ggacaauuuu guucaugacg ucacaaauua ggaaagacaa 300

gcgauuagaa uucugcaaua aaaacuuagg ucgagauaag caguuugugg ugaguuuacc 360

agacgaggag cguguugccu ggaugugggc ua 392

<210> 3

<211> 179

<212> DNA

<213> 家蚕

<400> 3

aggctcgcat agcaggcgat ctactagaac ttcgcaataa atcagttttc gcatttgtta 60

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<213> 人工序列

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<212> RNA

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acccccaucg gcgacggccc cgugcugcug cccgacaacc acuaccugag cac 413

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tatgagtgat aacgatcgta aaagtcacta tgaaagggac gatgccgagg aaccgcttta 60

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cag 123

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<212> DNA

<213> 斜纹夜蛾

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accgtgagtt atctttctcc ttactagtct ctctacaatt ctgactcctg gagcgtcttt 1740

aactttttct ttttccgcta cttatgatgc tttgatatag ccaagtgtgc ctattgtggc 1800

caagaagagg ctttcgataa ttcagtagtc tagtctaatg gtcctatatg cgtacgcgat 1860

gatacaccgt gctttgattt ctgctctact atctcaagaa cttcaggtaa gaagccaatc 1920

tactcctagt cacgcgagcc gcacatcgag ttttcataaa tgctcagcaa ctgggactaa 1980

taatacttaa gctttgtgta taaaagaatc tgctgcggaa gctttatagt ctagtgtcac 2040

tactactaag cgttcactta gctaagcact ttgacgaaca cctgtgataa ctacttcgtc 2100

gaaggcttca tgtagtctgc ttataagcgt aagctggtgg attcttcata ggtcgtggaa 2160

tgcctcctgc aaactgtacc cacgacggtc ctttctgttt ctactaaaca gtaaacttcc 2220

tattccgttt ctaagcagtg tcctttgcaa ccagagtcca ctacatgtac atgatggatg 2280

agccagtggc tgattacctt gacggttata gacacctagc atttcttcaa taccgactct 2340

tgtgcaaaaa cgactgagac ctgcctctgt agctaaaggt cggagtacga catgcaaacg 2400

aataactaaa ctacttcttc ttgttcttag accctcgacg aacgccagca taagtaggac 2460

atccgagacc aggataccac accatagttt acaagctcat gcgataacca gtaaccgacg 2520

ttttccgctg acttgtgtac taaccgacac atgagacatc gggacctacg aagagggata 2580

agtctccttt ccgaaactac ctactgttgc agtacttctt catatgaaat tccagactac 2640

ttcgagccgt aatgcatgtc atgctagttc cccttctatc taccgataca tgcgaaaatg 2700

aagttgcacc aatggcacat ctcatgagtc gacggaggct gcggatatga gtgacagggc 2760

ttccaaagtt gctcaagatg ttagttgcag cagcgaccca cggaaggtgg tagcggttat 2820

aatacctgaa cgaacggcta atgtttgtgt gatagtttta attgctattg tagaggtcag 2880

gaatatagcg tatagtctac tacaactacc caccatgcta gaacccaggg ccttgatata 2940

aggaatacaa ccacccacgg aagcaccgac gaaaggctta gctgttgacc tgaagaaagc 3000

ttatattgaa catagggtaa aactataagt acaaacaaac gaaatgctac tttaggcttt 3060

aagttaatga ccatcgagtc tataatagct gccgtatacg gtactattac taccgacact 3120

agcagccatg gcgcgaagtc aatccgctcc tgccatagcc tagaggaagc cgatataaga 3180

actatagtga atgctcaagc tggaagtatc ggcgaacgaa cgtaggcgtc ctcaagacca 3240

catagcatgg tccttattaa atagaaaata gatatgggag atacatgaac gaaaactaaa 3300

atataagcta atatttagat ttgcatcata gaaccccatg agctcttcat cgtcaattct 3360

tctgcttctt cctttaactt cgtcttttct ttcttcgcct taatcgtttc tttagccggt 3420

ttgtcttcag ggagaatcca aaggaagttc ctcatttgtc gttacttctt cttcctagat 3480

aacttaagag caagcgacca aataagttca cagataacac atgagtgggc tttcctttac 3540

ttctctttca cgttgaaaac gtataacgta gatgaaacct ctttaacctt ttctttgatc 3600

tttgacaact ctcccgacag ctaggagtac cttactcgtc tcctgcattt gatagccaac 3660

ctggttctcc atcgtgacga cctctagtac caaacctgcg agaccgactt cctggtcttc 3720

ttctgccgct gagtctaaga ctttggctgt gagaaagatg atgcggttct cttttctctc 3780

tactagagta tttgggaatg acctaactcc taggactcaa cttcttccca cttcatctaa 3840

aaaactcagg gcgacttaat agaaagacct ttctagagta actgtttata aatataggat 3900

agctacgatt gttcctgctc gtccgggcat ataggttcct ggactttctt aactctctaa 3960

gcacacaaaa aagaaagaaa taccagttac gggagaaaca taactaacat aagaacgatg 4020

ttgacttgtt cctgttggaa gtgaaattca ccgggaagcc tcaattttga ttgtattgaa 4080

tgctactcca atgagttctc cattgcactc tcaggtgatg tttcgctagc cgtaagttgc 4140

tactgagccc tgacgctcga cactagctct aaactgtaaa ctttcatgac ttggaaccgg 4200

tacagggggc agtgggaact ttcaactaat gtaaataaat tttataaaca aaatacttat 4260

aaatgtccgt gcttaacgtc gtctgaacga acttgaagcg ttattcagcc aaaagcgtaa 4320

acaatacaag ttacgaaata agtataacta tcacaaaaat aatgttgact tgtttctagt 4380

tgaggtgcac taaaccggaa acccttaatt ctgtttatat tgcatgtagc tcctttgtcc 4440

gctccatatc ggtttacaat ggtgacttca cacagtgatg tgttaggatt gctggaagaa 4500

gattggccag acagaccctc ccgtgtggtc gtacctcagg gccgctgtga cttctgattt 4560

attgagacta ccaaaatgca gattagttat aggttggacc acaggaatac taaaccaaaa 4620

cacctttggg gcgcataata ggcattattg ttctcttaag ctgatgccac aatgttgtct 4680

cgactaatgt agaaaccgca acttcgagct tcggggatac aacctgtgga ataggatttg 4740

tcgggaatct gacctgtaat gctggttagg tccttaaagg acgagaggtt aggttaaggc 4800

tcgtatactg gacgtggaac tttatgtcaa aagttaaggc ggcatcagct tagactgggt 4860

tttatacctc aaaaatctac actgttggta agtgaaaggg ttatacacgt ggcaaaggtt 4920

aggttaagtg gctcctcatt gaattacaaa gacagacaga taattccacc tccttaaaga 4980

aaattataat gaacattgtc cctgtgacca aaggaaacat gtattcataa acatgtggga 5040

tttcctacac cactaaacga attgtgctaa atatcaagag tcctaataca ccttttataa 5100

aaacctcaag acatatgact cgttaccgca caaaacacac ttgattcaca aagttataaa 5160

gttacaagtt acacctcgcg cttgtaaagt ctttatttag attcacaaag tgtctttatt 5220

ttttattgcg tgaacattta ttgttttgcc aaaataaaag actttaattg atagcgttaa 5280

tacaaagaaa aattacaaag cattggtcta cacttgaaaa aacttgctta aaaataccga 5340

taatgtaaag ccacttaata attaatccat aacaatttta aagtttatct acttttcacg 5400

tgtaaactga ttaataataa ttgccaatta aaattgatta aattaaacaa ataactaaaa 5460

catgtcttac cttttggatt tcgtataaat tttaaaagtc cacaattaaa gttttcttat 5520

agacgttgac ctcggataac caaatcacaa gcataagaag aagcggaact agaaccacta 5580

tgtcaagagg cggtacaaca aggtatctaa accttggtag agcgtgtata atcgcagctg 5640

tcttgacttg accaagacaa gattcttcag gctgctgaat agagttctgc gtgatgatct 5700

attcttacgt tatcgttatc actttctgga cgtctttaat ttaccagacc tgctgctaat 5760

actattgctg agaccgagcc caggagtatt gcagccatct tctttctggt aagtgttaaa 5820

cctcttccgc tctgtcttct tctccttata tccgtgtaat ctgcaccgga agttcttctc 5880

taagaaatta tacttgcgtt tactacccgg tccatgtggt catgaattag cgttctactg 5940

caacgctgct ctttgcgatt tccgaaatct ctgctcttct ttaagtcact accgactttc 6000

ttcctttaga gtctacgttt gtgaaccacg gttattgctt atacctcact gtccttacga 6060

gttattattg aatttacaac ccggagccgt gtcttgtagt ttacggttgt atagtcactt 6120

tctgcaaaag ccgctcggtt tgcctccagt ccagttggct ccgatgcttt ggtgggaccc 6180

gctgcttctg ctgtggttga gttactctaa tgttggatct gttttggttc aaaggaaggt 6240

cccatctaag attttctcaa cagtttgatt cacggatcca atttgtttac atctatgatc 6300

tttatatctg acatctttaa aaatgttact tgtttgagtc gtcgacaaac gcactcagta 6360

cataacgaac actatatatg aaaaaatcca gcactgtcgt tacacggcag taatttatgg 6420

ttgtagcctg ttaaatgtcg aaataacatt ctattttgta tgcttaaatg tgacggtgaa 6480

ttgaaatgta taataatata actagaaaaa tatggataat tttattatag aaacataatt 6540

tctaaaaaca aaatcaagaa tacttacatc tgtagcttaa tcacaacata cataatttac 6600

tctaatttaa ttatacaaaa cgtaataaat tggacgaatg aaaaagaggt ttaatgtttc 6660

gcaaaaatat tttatgtgtc gcattaaatc cataattaga gaactacctt atatttcttt 6720

ttggtttcat tgattacatt atttattgaa tgaattaaga gattctttct ttgcttaagc 6780

caattaaact tgtcgaccag aagtgaccta cacacctcac cacgtccgac ccacccacca 6840

caacccgagt gtcactaagg tagaagtaag ttgtaggtaa acgccagaga cgtctgtaca 6900

tcttgacgta gaaacgagtt cggccagtat ctctggtgta ccagttaact atatcttgac 6960

atactcgctg gttagtccaa cttacacgcg agggaataca atagaagatt tcgagcctac 7020

tataatcgtt gtccaagtca ggtcaacttt cgacgatctc ggaccatcca tgggccatcc 7080

agaaaaaagg tattgaagac tggatggcgg gtataacgac tataaaggcc taatgatgaa 7140

caatacaaga ctccctaaga gaaggtatcc ttaaaacgta atgtatttag caaaactata 7200

tttatataac ggttctcaac acgcatacat cttcctctac gatatggcca tcctcggagg 7260

ttaagaacga aaagatctag aggtgtctca aatagtttca aacattagta acacatttaa 7320

gatgaaaatg cttttattac ttattataag cgtttgttaa taaagcgtgt agttaagtga 7380

aactgtcgtt ttgttcggca ggtttttg 7408

Claims (5)

1.对鳞翅目昆虫表皮几丁质合成酶外显子2b和/或19b具有抑制作用的物质在害虫防治中的应用，其特征在于：所述对鳞翅目昆虫几丁质合成酶外显子2b和/或19b具有抑制作用的物质选自抑制外显子2b和/或19b表达的物质、促进外显子2b和/或19b RNA降解的物质、抑制外显子2b和/或19b发挥正常作用的物质中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述抑制鳞翅目昆虫几丁质合成酶外显子2b和/或19b表达的物质为能够对外显子2b和/或19b进行RNA干涉的序列。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：能够对外显子2b和/或19b进行RNA干涉的序列选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7中的至少一种。

4.根据权利要求1～3任一所述的应用，其特征在于：所述鳞翅目昆虫为斜纹夜蛾、蚕、玉米螟、玉带凤蝶。

5.一种斜纹夜蛾表皮几丁质合成酶的cDNA序列，其序列如SEQ ID NO：8所示。