CN103088023B - dsRNA及其组合在控制蚜虫危害中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了dsRNA及其组合在控制蚜虫危害中的应用。本发明提供的dsRNA，为如下1）、2）或3）：1）由序列表中序列4所示的核苷酸和其反向互补序列所示的核苷酸组成的双链RNA；2）由序列表中序列5所示的核苷酸和其反向互补序列所示的核苷酸组成的双链RNA；3)由如下两条双链RNA组成：1）所示的双链RNA和2）所示的双链RNA。本发明的实验证明，本发明得到麦长管蚜生长发育相关基因8273和22544cDNA的dsRNA，采用体外饲喂dsRNA方法，进行了利用RNAi技术沉默麦长管蚜体内生长发育相关基因8273和22544，导致麦长管蚜生长发育受阻并产生致死效应。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及dsRNA及其组合在控制蚜虫危害中的应用。
背景技术
麦蚜（尤其是麦长管蚜）是危害中国小麦生产的主要害虫之一，据统计，中国每年小麦蚜虫危害面积可高达0.17亿公顷，占小麦总种植面积的62%，造成减产15%—30%，严重时可高达50%。近年来，由于全球气候变暖、耕作制度变化等因素，使蚜虫的繁殖能力和适应性显著增强，其危害日趋严重。目前，蚜虫防治以喷洒农药为主，但大量使用农药，不仅对人畜有害，而且造成了严重的环境污染。培育抗蚜虫小麦和蔬菜品种是防止蚜虫危害的最有效途径，但由于现有种质资源中缺乏有效的抗蚜基因，抗性机制尚不明确，常规育种难以奏效。挖掘和利用新型抗蚜基因并通过基因工程培育小麦抗蚜新种质具有重要意义。
植物介导的RNAi技术已成为农作物抗虫基因工程的热点之一，通过寄主植物表达相应昆虫特异基因的dsRNA，昆虫取食植物后沉默其相应的基因从而达到控制害虫危害的目的。RNAi现象其作用过程是双链RNA（dsRNA）进入生物体内，被Dicer酶切割成21-23nt的siRNA，siRNA与RNA诱导沉默复合物结合，与互补序列的靶mRNA结合，被Dicer识别，造成靶基因表达量的下降。近年来，利用dsRNA体外饲喂或注射来筛选RNA靶标基因，导致靶标基因表达和沉默，已经广泛应用于昆虫生长发育关键基因的鉴定和功能分析。孟山都公司通过植物介导的昆虫肠道特异基因RNAi技术成功获得了抗玉米根螟的转基因玉米，有效缓解了长期应用Bt转基因玉米诱发昆虫产生抗性等问题，目前已完成生产性试验。棉铃虫肠道中特异P450基因可提高棉铃虫幼虫对棉花次生代谢物质和棉酚的耐受性，试验表明，利用表达棉铃虫P450基因dsRNA的转基因烟草和棉花叶片饲喂棉铃虫幼虫，可导致幼虫体内P450基因的表达量下降，同时幼虫发育受阻，表现出抗棉铃虫性能；Zha等从褐飞虱中肠中克隆了3个高度表达的基因：NlHT1、Nlcar和Nltry，构建载体，转化水稻，褐飞虱取食转基因水稻后，体内3种基因的mRNA表达水平下降了40%到70%，并且在水稻的筛管部发现了dsRNA和siRNA的存在。Pitino等将桃蚜的MpC002（主要在唾液腺中表达）和Rack-1（主要在肠道中表达）2个基因分别导入烟草和拟南芥中，用转基因植物饲喂桃蚜，导致桃蚜体内的MPC002或Rack-1的表达量降低了高达60%，蚜虫的产仔数目减少。
小麦抗蚜虫种质资源缺乏，抗性机制尚不明确，常规育种难以奏效，每年给农业生产造成巨大经济损失。迫切需要挖掘和鉴定新型抗蚜基因并通过基因工程育种提高小麦抗蚜特性。
发明内容
本发明的一个目的是提供了dsRNA。
本发明提供的dsRNA，为如下1）、2）或3）：
1）由序列表中序列4所示的核苷酸和其反向互补序列所示的核苷酸组成的双链RNA；
2）由序列表中序列5所示的核苷酸和其反向互补序列所示的核苷酸组成的双链RNA；
3)由如下两条双链RNA组成：1）所示的双链RNA和2）所示的双链RNA。
上述3)所示的dsRNA中，1）所示的双链RNA和2）所示的双链RNA的质量比为1:1。
上述1）、2）或3）所示的所述dsRNA的编码基因也是本发明保护的范围，具体如下：
1）所示的dsRNA的编码基因具体为序列表中序列1所示的核苷酸；
2）所示的dsRNA的编码基因具体为序列表中序列2所示的核苷酸；
3）所示的dsRNA的编码基因具体为由序列表中序列1所示的核苷酸所示的DNA分子和序列表中序列2所示的核苷酸所示的DNA分子组成的组合物。
上述dsRNA或上述的编码基因的下述任一种应用也是本发明保护的范围：
1）在防治蚜虫中的应用或在制备防治蚜虫产品中的应用；
2）在促进蚜虫死亡中的应用或在制备促进蚜虫死亡产品中的应用；
3）在抑制蚜虫生长中的应用或在制备抑制蚜虫生长产品中的应用；
4）在抑制蚜虫体内生长发育相关基因8273和/或22544的表达中的应用或在制备抑制蚜虫体内生长发育相关基因8273和/或22544的表达产品中的应用。
上述应用为将上述dsRNA导入蚜虫，实现防治蚜虫、促进蚜虫死亡、抑制蚜虫生长、抑制蚜虫体内生长发育相关基因8273和/或22544的表达；所述导入具体为饲喂；
所述蚜虫具体为麦长管蚜。
上述基因8273的核苷酸序列为序列表中的序列1，基因22544的核苷酸序列为序列表中的序列2。
含有上述dsRNA的编码基因的重组表达载体、转基因细胞系、重组菌或表达盒也是本发明保护的范围。
上述重组表达载体、转基因细胞系、重组菌或表达盒的下述任一种应用也是本发明保护的范围：
1）在防治蚜虫中的应用或在制备防治蚜虫产品中的应用；
2）在促进蚜虫死亡中的应用或在制备促进蚜虫死亡产品中的应用；
3）在抑制蚜虫生长中的应用或在制备抑制蚜虫生长产品中的应用；
4）在抑制蚜虫体内生长发育相关基因8273和/或22544的表达中的应用或在制备抑制蚜虫体内生长发育相关基因8273和/或22544的表达产品中的应用。
所述蚜虫具体为麦长管蚜。
本发明的另一个目的是提供产品，其活性成分为如下A-C中至少一种：
A、上述dsRNA；
B、上述的编码基因；
C、上述重组表达载体、转基因细胞系、重组菌或表达盒；
所述产品为如下1）-4）中任意一种：1）防治蚜虫产品；2）促进蚜虫死亡产品；3）抑制蚜虫生长产品；4）抑制蚜虫体内生长发育相关基因8273和/或22544的表达产品；
所述蚜虫具体为麦长管蚜。
抑制蚜虫体内生长发育相关基因8273和/或22544表达的物质的下述任一种应用也是本发明保护的范围：
1）在防治蚜虫中的应用或在制备防治蚜虫产品中的应用；
2）在促进蚜虫死亡中的应用或在制备促进蚜虫死亡产品中的应用；
3）在抑制蚜虫生长中的应用或在制备抑制蚜虫生长产品中的应用所述蚜虫具体为麦长管蚜。
本发明中抑制蚜虫体内生长发育相关基因8273和/或22544表达的物质为上A-C中任意一种。
本发明的实验证明，本发明得到麦长管蚜生长发育相关基因8273和22544cDNA的序列的dsRNA，采用体外饲喂dsRNA方法，无论是单独饲喂一种dsRNA还是饲喂dsRNA的混合物，均导致麦长管蚜产生致死效应，并且随着dsRNA浓度增大和饲喂时间延长，麦长管蚜的死亡率均逐渐增大，研究表明利用RNAi技术沉默麦长管蚜体内生长发育相关基因8273和22544表达。表明蚜虫生长发育相关基因8273和22544的保守序列可应用于通过植物介导的RNAi技术提高小麦抗蚜性的研究。
附图说明
图1为基因8273、22544和GFP的PCR扩增
图2为饲喂8天后麦长管蚜的生长发育情况
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中麦长管蚜（钱幼亭，周广和，张淑香，张向才.麦长管蚜有性世代的研究.植物保护，1982,1：14-15。公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得）由中国农业科学院植物保护研究所提供，饲养蚜虫的小麦品种为科农199，将蚜虫接种到小麦幼苗上，放入人工气候箱中（温度（20±2）℃，湿度60%—80%，光周期L∶D=16∶8）进行繁殖。
质粒提取试剂盒购自Biomega公司，内切酶BamHⅠ、EcoRⅤ及Hiscribe T7体外转录试剂盒购自NEB公司，大肠杆菌菌株DH5α、反转录试剂盒购自北京全式金公司，rTaq DNA聚合酶购自TaKaRa公司，MinElute PCR Cleaning Kit、MinElute Gel Extraction Kit、RNACleaningKit购自Qiagen公司，各种氨基酸及其它试剂均购自北京拜尔迪公司。
实施例1、生长发育相关基因8273dsRNA和22544dsRNA的获得
1、麦长管蚜总RNA的提取和cDNA的合成
分别取约20头麦长管蚜，按照北京全式金公司的Trizol试剂盒说明书提取总RNA，用RNACleaningKit进行纯化，反转录合成cDNA第一链，操作步骤均参考试剂盒说明书。
2、引物设计与基因克隆
根据本实验室对于麦长管蚜转录组测序的结果得到生长发育相关基因8273（序列1）和22544（序列2），利用Primer Primer5.0软件设计引物P1和P2（表1），由北京华大基因公司合成。绿色荧光蛋白基因（GFP）片段从国家小麦改良中心实验室保存的GFP质粒上扩增，利用Primer Primer5.0软件设计引物P3（表1）。
PCR反应体系为10×PCR Buffer5μL、dNTP（2.5mmol·L-1）4μL、rTaq0.5μL，Forward primer（20μmol·L-1）1μL、Reverse primer（20μmol·L-1）1μL、cDNA/GFP质粒1μL，用ddH2O补足至50μL。PCR的反应条件为94℃4min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，39个循环；72℃10min；4℃保存。
以麦长管蚜的cDNA为模板，用P1作为引物进行扩增，得到279bp PCR产物即为8273基因序列上部分片段（含40bp的T7启动子序列），经过测序，该279bp PCR产物具有序列表中的序列1（可人工合成）所示的核苷酸。
以麦长管蚜的cDNA为模板，用P2作为引物进行扩增，得到263bp PCR产物22544基因序列上部分片段（含40bp的T7启动子序列），经过测序，该263bp PCR产物具有序列表中的序列2（可人工合成）所示的核苷酸。
以GFP质粒为模板，用P3作为引物进行扩增，得到324bp PCR产物（含40bp的T7启动子序列），其具有序列表中的序列3（可人工合成）所示的核苷酸。
将上述PCR电泳结果如图1所示，M：Trans2K DNA marker；1：8273基因；2：22544基因；3：GFP，可以看出得到目的片段。
表1为PCR扩增引物
下划线处是T7RNA聚合酶启动子。
3、8273基因、22544基因和GFP的dsRNA的制备
分别回收由上述2得到的三种PCR产物，测定浓度，作为体外转录dsRNA的模板。dsRNA的体外转录体系为10×Transcription Buffer4μL、20×Ribonucleotide Solution Mix2μL、模板（1μg）XμL、20×HMW Mix2μL、T7RNA Polymerase（500units·μL-1）2μL，RNase-Free ddH2O补足至40μL。42℃过夜孵育。
反应结束后，取0.5μL反应产物琼脂糖凝胶电泳检测，加入DNaseI和RNaseA消化残留的模板DNA和单链RNA，用MinElute PCR Cleaning Kit纯化反应产物，操作过程参考试剂盒说明书，用无RNase水溶解dsRNA，分光光度计（波长260nm）定量，置于-20℃冰箱中保存，分别得到麦长管蚜8273dsRNA、22544dsRNA和GFPdsRNA。
将麦长管蚜8273dsRNA、22544dsRNA和GFPdsRNA分别测序，结果如下：
麦长管蚜8273dsRNA为双链RNA，由正义链和反义链组成，其正义链的核苷酸序列为序列表中的序列4，其反义链的核苷酸序列为序列表中的序列4的反向互补序列，8273dsRNA编码基因的核苷酸序列为序列表中序列1；
麦长管蚜22544dsRNA为双链RNA，由正义链和反义链组成，其正义链的核苷酸序列为序列表中的序列5，其反义链的核苷酸序列为序列表中的序列5的反向互补序列，22544dsRNA编码基因的核苷酸序列为序列表中序列2。
GFPdsRNA为双链RNA，由正义链和反义链组成，其正义链的核苷酸序列为序列表中的序列6，其反义链的核苷酸序列为序列表中的序列6的反向互补序列，GFPdsRNA编码基因的核苷酸序列为序列表中序列3。
也可以人工合成麦长管蚜8273dsRNA、22544dsRNA和GFPdsRNA。
实施例2、dsRNA在抑制蚜虫生长中的应用
1、蚜虫人工饲料的配制和饲育器的准备
人工饲料配制和饲育器的准备过程参考文献（李彩霞,高丽锋,高玲玲,李润植.全纯人工营养液饲养蚜虫的研究.山西农业大学学报,1997,17(3):225-228.Li C X,GaoL F,Gao L L,Li R Z.Study on the rearing of aphids on a artificially holidic diets.Journal ofShanxi Agricultural University,1997,17(3):225-228.(in Chinese)）进行，用0.2μm的细菌过滤器过滤人工饲料，分装到2.0mL灭菌的离心管保存于-20℃的冰箱中，避免反复冻融。
2、dsRNA（22544dsRNA、8273dsRNA）在抑制蚜虫生长中的应用
蚜虫饲喂方法参照如下文献中记载：纠敏,刘树生.利用人工饲料饲养蚜虫的技术.华东昆虫学报,2004,13(2):102-109.Jiu M,Liu S S.Aphid rearing with artificial diets.Entomological Journal of East China,2004,13(2):102-109。
麦长管蚜22544dsRNA喂养组（ds22544）：每个蚜虫饲育器中分别放入15头3龄麦长管蚜若蚜，按照每100μL人工饲料中依次分别加入0和750ng的麦长管蚜22544dsRNA饲喂蚜虫；
麦长管蚜8273dsRNA喂养组（ds8273）：每个蚜虫饲育器中分别放入15头3龄麦长管蚜若蚜，按照每100μL人工饲料中依次分别加入0和750ng的麦长管蚜8273dsRNA饲喂蚜虫；
麦长管蚜dsGFP组：每个蚜虫饲育器中分别放入15头3龄麦长管蚜若蚜，按照每100μL人工饲料中依次分别加入0和750ng的GFPdsRNA饲喂蚜虫；
麦长管蚜22544dsRNA+8273dsRNA喂养组：每个蚜虫饲育器中分别放入15头3龄麦长管蚜若蚜，按照每100μL人工饲料中依次加入750ng的麦长管蚜8273dsRNA饲喂蚜虫和750ng的麦长管蚜22544dsRNA饲喂蚜虫；以不加入任何dsRNA为对照（CK）。
上述各组设置3个重复，每两天统计各饲育器中蚜虫的存活数，并更换新的饲料和对应的dsRNA，置于人工气候箱（温度（20±2）℃，湿度60%-80%，光周期L∶D=16∶8）。使用Excel2003软件对蚜虫死亡率进行统计学分析，计算每种处理的平均值与方差，并进行显著性差异的分析（t-test，n=3，P<0.01或0.05）。
统计各组每个饲育器中存活蚜虫的数目，计算死亡率，结果如表2-表4所示：
表2为麦长管蚜8273dsRNA喂养组和麦长管蚜dsGFP组的死亡率
＊表示与对照组（0ng/μL）相比，试验组结果差异显著(t-test,n=3,P<0.05)，
＊＊表示与对照组相比，试验组结果差异极显著(t-test,n=3,P<0.01)。
表3为麦长管蚜22544dsRNA喂养组和麦长管蚜dsGFP组的死亡率
＊表示与对照组（0ng/μL）相比，试验组结果差异显著(t-test,n=3,P<0.05)，
＊＊表示与对照组相比，试验组结果差异极显著(t-test,n=3,P<0.01)。
表4为麦长管蚜22544dsRNA+8273dsRNA喂养组和麦长管蚜dsGFP组的死亡率
＊表示与对照组（CK组，0ng/μL）相比，试验组结果差异显著(t-test,n=3,P<0.05)，
＊＊表示与对照组相比，试验组结果差异极显著(t-test,n=3,P<0.01)。
从表2、表3和表4可以看出，麦长管蚜的死亡率均随着饲喂dsRNA的时间而不断升高；7.5ng·μL-18273dsRNA饲喂2天、4天、6天和8天后，麦长管蚜的平均死亡率为33.33%、48.89％、60％和60％，22544dsRNA饲喂2天、4天、6天和8天后的平均死亡率为16.67％、43.30％、56.67％和63.30％，混合饲喂2天、4天、6天和8天后的平均死亡率为33.33%、44.44%、60.00%、68.89%这些处理与对照相比均存在显著性差异，饲喂GFPdsRNA的试验组死亡率与对照相比则没有显著性的差异。
使用显微镜观察饲喂8天后各组蚜虫的生长发育情况，结果如图2（左图为dsGFP组，右图为ds8273组；CK组和dsGFP组结果无显著差异；ds8273+ds22544组、ds22544组与ds8273组结果无显著差异）和表5所示，CK:没有饲喂dsRNA的蚜虫组（0ng·μL-1）；dsGFP:饲喂7.5ng·μL-1浓度GFP dsRNA的蚜虫组；ds8273:饲喂7.5ng·μL-1浓度8273dsRNA的蚜虫组；ds22544:饲喂7.5ng·μL-1浓度22544dsRNA的蚜虫组；ds8273+ds22544:饲喂7.5ng·μL-1浓度8273dsRNA和7.5ng·μL-122544dsRNA的蚜虫组。可以看出，未饲喂dsRNA和饲喂GFPdsRNA的蚜虫发育正常，分别饲喂8273dsRNA、22544dsRNA和混合饲喂8273dsRNA、22544dsRNA试验组的蚜虫发育受阻，体型较对照组CK小，不能发育为成虫，尚未观察到其它表型变化，说明饲喂8173和22544dsRNA能够在蚜虫的体能引发RNAi的效应，导致蚜虫死亡。
表5为麦长管蚜发育数量
3、dsRNA（8273、22544dsRNA）抑制体内目标基因8273和22544的表达
去掉T7启动子序列合成荧光定量8273引物P4和22544引物P5（表1），合成内参基因引物P6（表1）。
收集上述2中各组7.5ng/μldsRNAs饲喂后存活的麦长管蚜（2、4、6和8d），提取蚜虫的RNA，反转录成cDNA稀释100、101、102、103、104、105倍，作为荧光定量PCR的模板，以P4和P5作为引物进行相对定量RT-PCR分析。内参（ACTIN）引物为P6。
实时荧光定量PCR体系为Forward Primer（10μmol·L-1）0.5μL、Reverse Primer（10μmol·L-1）0.5μL、2×TransStartTM Green qPCR SuperMix12.5μL、Passive Reference Dye0.5μL、模板cDNA1μL，用ddH2O至25μL。
PCR循环程序为95℃30s，95℃5s，57℃15s，72℃10s，40个循环，每个样本3个重复。最终结果的计算采用2-△△Ct法（Ct表示循环数）进行计算，即△△Ct=（Ct(dsRNA)－Ct(actin)）试验组－（Ct(dsRNA)－Ct(actin)）对照组，使用Excel2003软件进行统计学分析，计算每种处理的平均值与方差，并进行显著性差异的分析（t-test，n=3，P<0.01或0.05）。
统计在饲喂8273dsRNA、22544dsRNA、8273dsRNA+22544dsRNA的2、4、6和8d后，各组蚜虫体内8273(序列1）和22544(序列2）的表达量，以不饲喂为对照（第0d），结果如表6和表7：
表6为单独饲喂不同dsRNA后麦长管蚜8273和22544相对表达量
＊表示与对照组相比，试验组结果差异显著(t-test,n=3,P<0.05)，
＊＊表示与对照组相比，试验组结果差异极显著(t-test,n=3,P<0.01)。
表7为混合饲喂不同dsRNA后麦长管蚜8273和22544相对表达量
可以看出，麦长管蚜体内8273（序列1）表达量依次降低了31%、51%、42％和65％，22544（序列2）表达量依次降低了19％、38%、78％和91％，，与对照（0天的表达量）相比，饲喂GFP dsRNA的蚜虫体内的8273和22544基因表达水平则没有显著性的变化，进一步说明通过饲喂dsRNA能够在麦长管蚜体内引起相应基因的RNAi效应，导致生长发育相关基因8273和22544的表达量明显降低，引起蚜虫死亡或生长受到抑制。混合饲喂后结果基本与单独饲喂时23028和coo2表达量差异变化基本一致。
Claims (11)
1.dsRNA，为如下1）或2）：
1）由序列表中序列4所示的核苷酸和其反向互补序列所示的核苷酸组成的双链RNA；
2）由如下两条双链RNA组成：1）所示的双链RNA，和由序列表中序列5所示的核苷酸和其反向互补序列所示的核苷酸组成的双链RNA。
2.根据权利要求1所述的dsRNA，其特征在于：所述2)所示的dsRNA中，1）所示的双链RNA和由序列表中序列5所示的核苷酸和其反向互补序列所示的核苷酸组成的双链RNA的质量比为1:1。
3.权利要求1中1）或2）所示的所述dsRNA的编码基因；
权利要求1中1）所示的dsRNA的编码基因为序列表中序列1所示的核苷酸；
权利要求1中2）所示的dsRNA的编码基因为由序列表中序列1所示的核苷酸所示的DNA分子和序列表中序列2所示的核苷酸所示的DNA分子组成的组合物。
4.权利要求1或2所述dsRNA或权利要求3所述的编码基因的下述任一种应用：
1）在防治蚜虫中的应用或在制备防治蚜虫产品中的应用；
2）在促进蚜虫死亡中的应用或在制备促进蚜虫死亡产品中的应用；
3）在抑制蚜虫生长中的应用或在制备抑制蚜虫生长产品中的应用；
4）在抑制蚜虫体内生长发育相关基因8273或，基因8273和22544的表达中的应用，或在制备抑制蚜虫体内生长发育相关基因8273或，基因8273和22544的表达产品中的应用；
所述蚜虫为麦长管蚜。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述应用为将权利要求1或2所述dsRNA导入蚜虫，实现防治蚜虫、促进蚜虫死亡、抑制蚜虫生长、抑制蚜虫体内生长发育相关基因8273或，基因8273和22544的表达；
所述蚜虫为麦长管蚜。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述导入为饲喂。
7.含有权利要求1或2所述的dsRNA的编码基因的重组表达载体。
8.含有权利要求1或2所述的dsRNA的编码基因的重组菌。
9.含有权利要求1或2所述的dsRNA的编码基因的表达盒。
10.权利要求7所述重组表达载体、权利要求8所述重组菌或权利要求9所述表达盒的下述任一种应用：
1）在防治蚜虫中的应用或在制备防治蚜虫产品中的应用；
2）在促进蚜虫死亡中的应用或在制备促进蚜虫死亡产品中的应用；
3）在抑制蚜虫生长中的应用或在制备抑制蚜虫生长产品中的应用；
4）在抑制蚜虫体内生长发育相关基因8273或，基因8273和22544的表达中的应用或在制备抑制蚜虫体内生长发育相关基因8273或，基因8273和22544的表达产品中的应用；
所述蚜虫为麦长管蚜。
11.产品，其活性成分为如下A-C中至少一种：
A、权利要求1或2所述dsRNA；
B、权利要求3所述的编码基因；
C、权利要求7所述的重组表达载体、权利要求8所述重组菌或权利要求9表达盒；
所述产品为如下1）-4）中任意一种：1）防治蚜虫产品；2）促进蚜虫死亡产品；3）抑制蚜虫生长产品；4）抑制蚜虫体内生长发育相关基因8273或，基因8273和22544的表达产品；
所述蚜虫为麦长管蚜。
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