CN106318956A - 一种绿盲蝽V‑ATPase‑A基因cDNA及其应用 - Google Patents
一种绿盲蝽V‑ATPase‑A基因cDNA及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106318956A CN106318956A CN201610847151.XA CN201610847151A CN106318956A CN 106318956 A CN106318956 A CN 106318956A CN 201610847151 A CN201610847151 A CN 201610847151A CN 106318956 A CN106318956 A CN 106318956A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- atpase
- gene
- green plant
- plant bug
- cdna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N57/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds
- A01N57/10—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds having phosphorus-to-oxygen bonds or phosphorus-to-sulfur bonds
- A01N57/16—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds having phosphorus-to-oxygen bonds or phosphorus-to-sulfur bonds containing heterocyclic radicals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1096—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA cDNA Synthesis; Subtracted cDNA library construction, e.g. RT, RT-PCR
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y306/00—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6)
- C12Y306/01—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6) in phosphorus-containing anhydrides (3.6.1)
- C12Y306/01003—Adenosine triphosphatase (3.6.1.3)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种绿盲蝽V‑ATPase‑A基因cDNA及其应用,属于生物防治领域。本发明首次从绿盲蝽中克隆得到的V‑ATPase‑A基因,其序列如SEQ ID NO:1所示,以该基因作为RNAi的靶标,设计与合成绿盲蝽V‑ATPase‑A dsRNA,采用注射法向绿盲蝽若虫导入dsV‑ATPase‑A后,V‑ATPase‑A基因表达分别受阻,绿盲蝽生长与代谢受抑制,死亡率提高。实验表明,本发明绿盲蝽V‑ATPase‑A基因为未来绿盲蝽RNA干扰(RNAi)介导的害虫防治策略提供了防治效果良好的候选基因。
Description
技术领域
本发明属于昆虫分子生物学与生理学领域,具体涉及绿盲蝽V型ATP酶A亚基(V-ATPase-A)cDNA的克隆,绿盲蝽V-ATPase-A基因双链RNA(dsRNA)的设计,合成与及其在生物防治绿盲蝽害虫中的应用。
背景技术
绿盲蝽(Lygus lucorum),隶属于半翅目,盲蝽科,又称花叶虫,小臭虫。除青海西藏等少数地方,几乎遍布我国所有省份,是我国黄河流域长江流域为害棉花的多种绿盲蝽的优势种,几遍全国各棉区。绿盲蝽为杂食性害虫,寄主范围十分广泛,寄主包括棉花、十字花科蔬菜、豆类、玉米、瓜类、花卉、马铃薯、以及各种果树等,给我国农业和林业造成了巨大损失。2000年以前,绿盲蝽并非是我国棉产区农业生产的主要害虫,其种群数量低,基本不需专门防治。在防治棉花其它主要害虫的同时即可将绿盲蝽杀死。近几年来,由于蔬菜、果树以及其他寄主作物种植面积的大幅度增加,给绿盲蝽提供了适宜的越冬场所和多样的寄主,规模化种植转基因Bt棉花有效的减少以绿盲蝽为主的鳞翅目害虫的危害,减少了农药的使用。另外,多种高毒农药的停用,致使绿盲蝽的种群数量迅速上升,并呈灾变的趋势。在很多地区已经成为了农业生产的重要害虫。目前对绿盲蝽的防治主要依靠化学防治,该方法不仅容易导致其产生抗药性,而且对环境造成污染。因此,发展一种经济有效、环境友好的方法控制绿盲蝽具有重要意义。利用转基因作物进行抗虫可以有效抵抗虫害,并且安全环保,这些优点使转基因作物成为抗虫策略的首选。基于目前以RNAi为基础发展抗虫转基因作物是当前的研究热点,且该技术在害虫防治领域已经取得一些进展,然而目前很少有关于绿盲蝽合适靶标基因的报道。因此,寻找合适的杀虫靶标是一项非常紧迫的工作。
RNA干扰(RNAi)是由双链RNA引发的基因沉默现象,其作用机制是通过阻止同源基因的翻译或者转录而实现基因沉默。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时,该mRNA发生断裂而导致基因表达沉默。
V型ATP酶(V-ATPase)是一种存在于几乎所有真核生物膜结构上的质子泵之一。它能将ATP水解所释放的能量转化为生物膜两侧的H+质子势能。H+质子势能进一步推动细胞内各种生理反应的进行。在农业害虫防治领域,Buam等人在2007年取得了突破性进展。他们选取鞘翅目昆虫西方玉米根虫(WCR)多达290种基因作为靶标,合成dsRNA,将其涂在西方玉米根虫的食物表面。最终得到125种基因有明显致死效果。其中,对效果最为显著的V-ATPase-A,构建了可以表达其靶标基因的dsRNA玉米,转基因玉米相对于对照,在WCR取食时表现出良好的防护性,可以明显的降低WCR的侵害。这个研究表明了通过RNAi技术防治农业害虫的可行性,展现出良好的前景可见,昆虫的V-ATPase在昆虫的生长、发育、生殖等重要生命活动过程中起着非常重要的作用。
发明内容
本发明提供一种绿盲蝽(Lygus lucorum)V型ATP酶A亚基(V-ATPase-A)的cDNA及其应用,设计与合成绿盲蝽V-ATPase-A基因dsRNA,然后用显微注射法将dsRNA输入到绿盲蝽体内,绿色荧光蛋白(GFP)作为对照组,统计饲喂后7天内每日死亡率,结果实验组7天后死亡率达到60%以上,同时实时荧光定量PCR结果显示靶标基因表达水平显著降低,绿盲蝽生长与代谢受抑制,从而用于绿盲蝽的生物防治。
一种绿盲蝽V-ATPase-A基因的cDNA,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
上述cDNA的克隆方法,包括以下步骤:
(1)从绿盲蝽幼虫提取总RNA,然后反转录合成cDNA;
(2)设计V-ATPase-A的特异性引物,所述特异性引物正向序列分别如SEQ ID NO.2所示,反向序列如SEG ID NO.3所示;
(3)以步骤(1)得到的cDNA为模板,用步骤(2)所述的引物进行PCR扩增,得到扩增片段;
(4)纯化PCR产物,回收目的片段,取纯化产物连接到pGME-T载体上,然后转化大肠杆菌感受态细胞Top 10,筛选含目的片段的阳性克隆;
(5)将阳性克隆进行序列测定,得到目标基因的cDNA。
上述cDNA在绿盲蝽RNA干扰介导的植物害虫防治中的应用。
所述绿盲蝽RNA干扰介导中以上述cDNA序列中的第82-473位作为V-ATPase-A干涉靶标合成dsRNA。
所述绿盲蝽RNA干扰介导以显微注射方法传递。
所述植物为棉花、烟草、小麦、玉米、高梁、大豆、豌豆、苜蓿、芝麻、番茄、辣椒、向日葵。
本发明人首次从绿盲蝽中克隆得到的V-ATPase-A基因,其序列如SEQ ID NO:1所示,该基因能够作为RNAi的靶标,在绿盲蝽的防治中具有很大的应用价值。
从上述的cDNA序列中选取SEQ ID NO.1中第82-473位作为V-ATPase-A干涉靶标合成dsRNA。将合成的dsRNA通过显微注射方法传递到体内,绿色荧光蛋白(GFP)作为对照组,统计饲喂后7天内每日死亡率,结果实验组7天后死亡率分别达到60%以上,同时实时荧光定量PCR结果显示靶标基因表达水平显著降低。
本发明为未来绿盲蝽RNA干扰(RNAi)介导的害虫防治策略提供了防治效果良好的候选基因。
本发明首次克隆绿盲蝽V-ATPase-A基因cDNA。V-ATPase-A是一种真核生物膜结构上的质子泵,在真核生物细胞内行使基础的、必不可少的功能,在昆虫的生长、发育、生殖等生命活动过程中发挥非常重要的作用。V-ATPase-A的沉默会破坏细胞基本的代谢与生理过程,造成昆虫生长、发育、生殖等一系列生命活动的紊乱与异常。
目前,RNAi技术已经在害虫生物防治领域展现出广阔的应用前景,以害虫靶基因dsRNA或siRNA作为有效成分研制生物农药是一个新的发展方向。本发明人首次以绿盲蝽V-ATPase-A作为干涉靶标,设计与合成V-ATPase-A的dsRNA,对绿盲蝽进行显微注射,以沉默V-ATPase-A的转录表达,抑制绿盲蝽的种群数量,研究基础好,前瞻性高,害虫产生抗性的风险低,是一种防治绿盲蝽的好方法,因此本发明具有重大的应用前景。
由于绿盲蝽食性杂,寄主广泛,除为害棉花外,十字花科蔬菜、豆类、玉米、瓜类、花卉、马铃薯、以及各种果树等作物。因此,本发明所设计的V-ATPase-A的dsRNA可施用于其它寄主植物,同样可用于绿盲蝽的生物防治。
附图说明
图1为V-ATPase-A dsRNA饲养7天内绿盲蝽的存活率。以GFP(绿色荧光蛋白)dsRNA为对照。
图2为绿盲蝽V-ATPase-A dsRNA对其靶标基因的干扰效率。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步说明本发明。以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换,均属于本发明的范围。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料,如无特殊说明,均为市售常规生化试剂。
实施例1:V-ATPase-A基因克隆、V-ATPase-A基因dsRNA的具备,显微注射法注射V-ATPase-A基因dsRNA。
基因的生物信息学分析
1.利用生物信息学技术及软件对绿盲蝽转录组数据进行初步的分析,筛选到绿盲蝽V-ATPase-A基因。本发明从绿盲蝽克隆到V型ATP酶A亚基(V-ATPase-A)的cDNA,其具有SEQ ID NO.1所示的序列:
2.供试昆虫及组织收集
绿盲蝽为中国农业科学院植物保护研究所使用新鲜玉米(Zea mays)及四季豆(Phaseolus vulgaris L)饲养,饲养温度为25-28℃,相对湿度为60%-70%,光照为16:8(L:D)。
3.RNA的提取
a)昆虫总RNA提取的全部过程在无RNase条件下进行。整个提取步骤如下所示:
b)取-70℃保存的昆虫组织,加入已经用液氮预冷的玻璃匀浆器中,立即向匀浆器内加入1mL Trizol试剂,将组织充分研磨磨碎;将研磨好的组织溶液用无RNA酶的枪头转移到无RNA酶的1.5mL离心管中,暂时至于冰上。
c)4℃,12000g离心15min,将上清转移到新的无RNA酶的1.5mL离心管中。
d)将上清在室温下放置5min后,向离心管中加入0.2mL氯仿,用手剧烈震荡15s,再室温静置2-3min。
e)4℃,12000g离心15min,混合物在此后分层,下层为有机相,上层为水相(RNA就在水相中),用无RNA酶的枪头将上层水相转移到新的无RNA酶的1.5mL离心管中,注意尽量不要吸到中间层,以免造成蛋白质或DNA污染。
f)加入0.5mL异丙醇,混匀后,室温静置10min来沉淀RNA。
g)4℃,12000g离心10min后,观察到的沉淀即为RNA,弃上清(尽量吸净),加入1mL75%的乙醇(用DEPC水配置,现用现配),轻轻震荡离心管悬浮沉淀,洗涤沉淀。
h)4℃,7500g离心10min后,弃上清(尽量吸净),超净台中干燥沉淀5-10min。
i)加入10-20μL RNase-free H2O(根据RNA量而定),轻弹离心,使沉淀充分溶解。
j)55-60℃温育后,取1μL样品稀释至5μL,其中2.5μL进行电泳检测,2.5μL用NanoDrop仪器检测;剩余的样品用于cDNA合成或者保存于-70℃冰箱。
5.第一链cDNA的合成
整个反转录过程在无RNA酶污染的条件下进行,操作步骤按Revert Aid FirstStrand cDNA Synthesis Kit进行,具体如下:
a)在无RNA酶的PCR管中依次加入:2μg RNA(根据NanoDrop定量的结果计算应该加入RNA的体积数),DNaseⅠ1μL,1μL Ribolock RNase Inhibitor,1μL 10×Reaction Bufferwith MgCl2,用RNase-free水将体系补足到10μL;轻微震荡后离心;
b)37℃温育30min后,向体系内加入1μL 50mM EDTA,震荡后离心,然后65℃温育10min,以去除DNA酶I;
c)加入1μL Oligo-dT,用RNase-free H2O补至12μL;
d)65℃温育5min后,立即置于冰上;
e)依次加入下列试剂,使体系达到20μL:4μL的5×Reaction buffer;2μL的dNTPMix(10mM);1μL的Revert Aid Reverse Transcriptase和1μL的Ribolock RNaseInhibitor;简单混匀离心;
f)42℃温育1h,然后再70℃温育5min;
g)合成后存于-20℃或者-70℃冰箱,使用前按情况稀释若干倍。
3、靶标基因的克隆
本发明从绿盲蝽克隆到V型ATP酶A亚基(V-ATPase-A)的cDNA,其具有SEQ ID NO.1所示的序列。
靶标基因引物的设计:
(1)利用BLAST检索数据库,搜索绿盲蝽的相近物种同一靶标基因的蛋白或者cDNA编码的氨基酸序列,用绿盲蝽成虫若虫转录组组建的本地BLAST库进行比对查询,确定所选基因的序列。
(2)根据靶标基因的片段,用Primer Premier 5.0软件设计带T7启动子的引物,引物设计原则如下:
a)引物设计的区间要在靶标基因的编码区,中间片段大小在400~500bp左右。
b)中间片段尽量选在靶标基因的特异区域。
c)引物之间不能形成引物二聚体,交叉二聚体。
d)根据以上引物设计原则设计引物后,送至华大基因进行引物合成。V-ATPase-A的T7启动
子的正引物如SEQ ID NO.2所示,T7启动子的反向序列如SEG ID NO.3所示:
SEQ ID NO.2:TAATACGACTCACTATAGGGTTTACCCAGAATCCGTGAT
SEQ ID NO.3:TAATACGACTCACTATAGGGATGGAGTGAAGTCCCAAGC
4.目的片段的PCR扩增、测序及序列分析
以绿盲蝽cDNA为模板,用ExTaq酶扩增V型ATP酶A亚基(V-ATPase-A)的cDNA。反应体系为25μl:17μl重蒸水,2.5μl 10×反应缓冲液,2μl dNTPs(2.5mM),1μl cDNA,1μl F引物(10mM),1μl R引物(10mM)和0.5μl DNA聚合酶。反应条件为:94℃预变性3min;94℃变性30s,60-65℃退火30s,72℃延伸30s,35个循环;最后72℃延伸10min。
PCR产物用溶解在1×TAE缓冲液的1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。检测正确的PCR产物,用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收(操作步骤按试剂盒内附带的说明书进行),回收的片段连接到pGME-T载体上(体系为8μl胶回收产物、1μl 10×T4链接反应缓冲液、0.5μlpGME-T载体和0.5μl T4连接酶,16℃条件下连接过夜),连接体系转化Top10感受态细胞(转化步骤按感受态细胞附带的说明书进行),培养过夜后,挑取8个阳性克隆进行PCR验证(体系和条件同上),将检测正确的克隆用液体LB培养基(含氨苄抗生素)培养过夜检验目的片段序列。
根据测序结果,将正确的菌株加入含有氨苄抗生素的新鲜LB培养基重新摇菌,获得新鲜的菌液,进行质粒提取。
5、dsRNA模板的制备
以带有靶标基因片段的质粒为模板,用聚合酶扩增。反应体系为25μl:17μl重蒸水,2.5μl10×反应缓冲液,2μl dNTPs(2.5mM),1μl载有靶标基因片段的质粒,1μl带有T7序列的正向引物(10mM),1μl带有T7序列的正向反向引物(10mM)和0.5μl DNA聚合酶。反应条件为:94℃预变性3min;94℃变性30s,55-60℃退火45s,72℃延伸30秒,35个循环;最后72℃延伸10min。
将1μl PCR产物用溶解在1×TAE缓冲液的1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。如果所得条带长度与目的片段长度一致,并且结果显示为单一明亮的条带,则将剩余的PCR产物进行酚氯仿抽提与纯化。
PCR产物的酚氯仿抽提的步骤:
a)将需要纯化的PCR产物用无RNA酶的H2O定容至200μl
b)加入等体积(200μl)的酚氯仿试剂(一定取酚氯仿试剂的下层,并且拿试剂瓶时要平稳,不能晃动)。
c)温和混匀,在4℃离心机下离心(12000rpm,4℃)15min.
d)4.取上清,加入1/10体积(20μl)的3M乙酸钠(pH5.2)和2倍体积(400μl)的100%乙醇(-20℃贮存),温和混匀后放于-20℃静置沉淀至少3小时或者过夜。
e)在4℃离心机下离心(12000rpm,4℃)30min.
f)白色沉淀积于离心管底部,弃上清液(为防止沉淀一起被吸出,可保留些许上清液),加入75%乙醇(-20℃贮存)轻轻混匀,洗涤沉淀
g)在4℃离心机下离心(7500rpm,4℃)5min.
h)将乙醇慢慢吸出(注意不要吸出沉淀),接近沉淀的残留液体用10μl移液枪慢慢吸出。将离心管开盖放入37℃恒温培养箱干燥,10min左右,待乙醇全部挥发。
i)加入5μl RNase-free H2O轻弹管底,让沉淀充分均匀溶解于无RNA酶的H2O。
j)取1μl溶液溶于4μl无RNA酶的H2O中,用浓度测量仪器检测浓度和OD值。用凝胶电泳检测产物单一性,如果检测条带是单一明亮的条带,并且其OD值为:
260/280:1.8-2.0
260/230:1.8-2.0
则说明PCR产物质量良好,可以作为下一步合成dsRNA的模板使用。
6、dsRNA的合成
a)将ATP,CTP,GTP,UTP(100mM)放于冰上慢慢融化,5×反转录缓冲液室温融化,T7RNA聚合酶放于-20℃贮存,随用随拿,用完立即放入-20℃环境下贮存。溶解以后轻弹管底,瞬时离心,将试剂离心到管底。
b)按以下比例将试剂混合:
按以下比例将试剂混合:
轻弹混匀,瞬时离心。放入37℃金属浴中4小时。
c)从金属浴中取出离心管,放入75℃金属浴中5min,然后放置室温冷却(切勿放在冰上)。
吸出1μl,稀释5倍,凝胶电泳检测产物条带。
d)去除DNA和ssRNA.按照比例加入下列试剂:
充分混匀,轻弹管底,瞬时离心后,放入金属浴37℃30min,加入EDTA试剂1μl,65℃金属浴中放置5min终止反应。取1μl产物,稀释5倍,凝胶电泳检测产物单一性,浓度检测仪器检测浓度和OD值。如果检测条带是单一明亮的条带,并且其OD值为:
260/280:1.8-2.0
260/230:1.8-2.0
则说明dsRNA质量良好,可以进行下一步dsRNA酚氯仿抽提。
7、dsRNA的酚氯仿抽提
a)将需要纯化的dsRNA(~60μl)用无RNA酶的H2O定容至200μl(可根据实际需要等比例扩大体系)。
b)加入1/2体积(100μl)的水饱和酚试剂(一定取水饱和酚试剂的下层,并且拿试剂瓶时要平稳,不能晃动)和1/2体积的氯仿(100μl)。
c)轻轻混匀,在4℃离心机下离心(12000rpm,4℃)15min。
d)取上层水相,加入的等体积氯仿(200μl),轻轻混匀,在4℃离心机下离心(12000rpm,4℃)15min。
e)取上层水相,加入1/10体积(20μl)的3M乙酸钠(pH5.2)和2.5倍体积(500μl)的100%乙醇(-20℃贮存),温和混匀后放于-20℃静置沉淀至少3小时或者过夜。
f)在4℃离心机下离心(12000rpm,4℃)30min。
g)白色沉淀积于离心管底部,弃上清液(为防止沉淀一起被吸出,可保留些许上清液),加入80%乙醇(-20℃贮存)轻轻混匀,洗涤沉淀。
h)在4℃离心机下离心(7500rpm,4℃)5min。
i)将乙醇慢慢吸出(注意不要吸出沉淀),接近沉淀的残留液体用10μl移液枪慢慢吸出。将离心管开盖放入37℃恒温培养箱干燥,10min左右,待乙醇全部挥发。
j)加入5μl无RNA酶的H2O轻弹管底,让沉淀充分均匀的溶解于无RNA酶的H2O中。
k)取1μl溶解的dsRNA产物稀释于4μl DEPC H2O中,用凝胶电泳检测产物单一性,并用浓度检测仪器检测浓度和OD值。如果检测的条带是单一明亮的条带,并且其OD值为:
260/280:1.8-2.0
260/230:1.8-2.0
则证明dsRNA质量良好,可以进行绿盲蝽体内注射RNAi实验。
8、3龄(3L)绿盲蝽的准备
本发明中所选绿盲蝽为3L若虫,现以3L若虫的收集方法如下:收集1L初孵若虫(200~300头),放入养虫盒中,盒中放入干净滤纸和一根去皮的新鲜玉米,约4天后所有1L若虫成长为3L若虫,准备铺好滤纸和7~8粒新鲜玉米粒的塑料培养皿,每个培养皿里放15只3L若虫,放若虫时,用软毛刷轻轻挑取,以免对若虫造成不必要的机械损伤。见图1。
同时设计绿色荧光蛋白基因(GFP)双链dsRNA作为对照,将所述dsRNA用显微注射法注入绿盲蝽若虫体内,7天内随机取样用于荧光定量PCR方法检测干扰效率,其V-ATPase-A的荧光定量PCR正引物如SEQ ID NO.4,荧光定量PCR反引物序列如SEG ID NO.5所示:
SEQ ID NO.4:GTTGAAATTGATGGCGTTACTGAG
SEQ ID NO.5:CGGAAGTATTCGGACAAGGTGA
如图2,结果显示V-ATPase-A表达受抑制,正常的代谢与生理过程受破坏,绿盲蝽死亡率提高,从而用于绿盲蝽的生物防治。
所述植物为棉花、烟草、小麦、玉米、高梁、大豆、豌豆、苜蓿、芝麻、番茄、辣椒、向日葵等绿盲蝽寄主植物。
Claims (6)
1.一种绿盲蝽V-ATPase-A基因的cDNA,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述绿盲蝽V-ATPase-A基因的cDNA克隆方法,包括以下步骤:
(1)从绿盲蝽幼虫提取总RNA,然后反转录合成cDNA;
(2)设计V-ATPase-A的特异性引物,所述特异性引物正向序列分别如SEQ ID NO.2所示,反向序列如SEG ID NO.3所示;
(3)以步骤(1)得到的cDNA为模板,用步骤(2)所述的引物进行PCR扩增,得到扩增片段;
(4)纯化PCR产物,回收目的片段,取纯化产物连接到pGME-T载体上,然后转化大肠杆菌感受态细胞Top 10,筛选含目的片段的阳性克隆;
(5)将阳性克隆进行序列测定,得到绿盲蝽V-ATPase-A基因的cDNA。
3.权利要求1所述的绿盲蝽V-ATPase-A基因的cDNA在绿盲蝽RNA干扰介导的植物害虫防治中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用,所述绿盲蝽RNA干扰介导中以上述cDNA序列中的第82-473位作为V-ATPase-A干涉靶标合成dsRNA。
5.根据权利要求3所述的应用,所述绿盲蝽RNA干扰介导以显微注射方法传递。
6.根据权利要求3所述的应用,所述植物为棉花、烟草、小麦、玉米、高梁、大豆、豌豆、苜蓿、芝麻、番茄、辣椒、向日葵。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201610847151.XA CN106318956A (zh) | 2016-09-23 | 2016-09-23 | 一种绿盲蝽V‑ATPase‑A基因cDNA及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201610847151.XA CN106318956A (zh) | 2016-09-23 | 2016-09-23 | 一种绿盲蝽V‑ATPase‑A基因cDNA及其应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN106318956A true CN106318956A (zh) | 2017-01-11 |
Family
ID=57820645
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201610847151.XA Pending CN106318956A (zh) | 2016-09-23 | 2016-09-23 | 一种绿盲蝽V‑ATPase‑A基因cDNA及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN106318956A (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111394371A (zh) * | 2020-03-31 | 2020-07-10 | 山西大学 | 飞蝗V-ATPase-V1结构域基因及其dsRNA在害虫防治中的应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101686705A (zh) * | 2007-04-27 | 2010-03-31 | 孟山都技术有限责任公司 | 来自Bacillus thuringiensis的半翅目和鞘翅目活性的毒素蛋白 |
WO2015153339A2 (en) * | 2014-04-01 | 2015-10-08 | Monsanto Technology Llc | Compositions and methods for controlling insect pests |
-
2016
- 2016-09-23 CN CN201610847151.XA patent/CN106318956A/zh active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101686705A (zh) * | 2007-04-27 | 2010-03-31 | 孟山都技术有限责任公司 | 来自Bacillus thuringiensis的半翅目和鞘翅目活性的毒素蛋白 |
WO2015153339A2 (en) * | 2014-04-01 | 2015-10-08 | Monsanto Technology Llc | Compositions and methods for controlling insect pests |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
SHUANGXIA JIN等: "Engineered chloroplast dsRNA silences cytochrome p450 monooxygenase,V-ATPase and chitin synthase genes in the insect gut and disrupt Helicoverpa armigera larval development and pupation", 《PLANT BIOTECHNOLOGY JOURNAL》 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111394371A (zh) * | 2020-03-31 | 2020-07-10 | 山西大学 | 飞蝗V-ATPase-V1结构域基因及其dsRNA在害虫防治中的应用 |
CN111394371B (zh) * | 2020-03-31 | 2022-01-28 | 山西大学 | 飞蝗V-ATPase-V1结构域基因及其dsRNA在害虫防治中的应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN102776189B (zh) | 一种细胞色素P450基因dsRNA及其在抑制蚜虫生长中的应用 | |
CN107012174A (zh) | CRISPR/Cas9技术在获得家蚕锌指蛋白基因突变体中的应用 | |
CN103993079B (zh) | 对绿盲蝽进行rna干扰的注射方法及其在基因筛选上的应用 | |
CN103201385A (zh) | 下调昆虫害虫中的基因表达 | |
CN103088023B (zh) | dsRNA及其组合在控制蚜虫危害中的应用 | |
CN103088024B (zh) | 两种dsRNA及其组合在控制蚜虫危害中的应用 | |
CN104178490B (zh) | 用于生物防控的禾谷孢囊线虫RNAi位点序列及其载体和应用 | |
US20190037854A1 (en) | Rna interference for control of insect pests | |
CN106399483A (zh) | 对绿盲蝽进行rna干扰的饲喂方法及其在基因筛选上的应用 | |
Rahmani et al. | A gene silencing of V‐ATPase subunit A interferes with survival and development of the tomato leafminer, Tuta absoluta | |
CN104561006A (zh) | 舞毒蛾CYP6AN15v1基因dsRNA及其在无公害防治中的应用 | |
CN107916264A (zh) | 翅发育相关基因vestigial的dsRNA及其在防治橘小实蝇中的应用 | |
CN106367428A (zh) | 一种绿盲蝽V‑ATPase‑D基因cDNA及其应用 | |
CN106350529A (zh) | 绿盲蝽V‑ATPaseE基因及其在RNAi介导的害虫防治方面的应用 | |
CN106318956A (zh) | 一种绿盲蝽V‑ATPase‑A基因cDNA及其应用 | |
CN107760682A (zh) | 一种可用于分子防治害虫的核酸序列及其应用 | |
CN108588072A (zh) | 一种棉铃虫CYP4L11基因的dsRNA及其应用 | |
CN108048467A (zh) | 一种氨基酸序列、核酸序列及其应用 | |
CN108753791B (zh) | 绿盲蝽decapentaplegic基因及其RNAi在害虫防控中的应用 | |
CN108949769B (zh) | 一种棉铃虫蜕皮激素调控因子E78-C基因cDNA及其应用 | |
CN110951730B (zh) | 青翅蚁形隐翅甲V-ATPase-A基因的dsRNA及其人工饲料和应用 | |
CN104263731B (zh) | 一种蚜虫共生菌基因的dsRNA及其在降低蚜虫存活率中的应用 | |
CN102517295A (zh) | 一种dna序列、干扰rna及其在防治害虫中的应用 | |
CN104109671A (zh) | 一种蚜虫共生菌基因的dsRNA及其在抑制蚜虫生长中的应用 | |
CN105838727A (zh) | 用于控制昆虫侵袭的核苷酸序列及其方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20170111 |
|
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |