CN104109671A - 一种蚜虫共生菌基因的dsRNA及其在抑制蚜虫生长中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蚜虫共生菌基因的dsRNA及其在抑制蚜虫生长中的应用。本发明提供的dsRNA，为由序列表中序列2所示的核苷酸和其反向互补序列所示的核苷酸组成的双链RNA。本发明的实验证明，本发明得到麦蚜体内共生菌Hamiltonella defensa28469基因，采用体外饲喂dsRNA方法，可抑制或沉默麦蚜体内共生菌Hamiltonella defensa28469基因，导致麦蚜生长发育受阻并产生致死效应。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种蚜虫共生菌基因的dsRNA及其在抑制蚜虫生长中的应用。
背景技术
麦蚜是危害中国小麦生产的主要害虫之一，据统计，中国每年小麦蚜虫危害面积可高达0.17亿公顷，占小麦总种植面积的62％，造成减产15％-30％，严重时可高达50％。近年来，由于全球气候变暖、耕作制度变化等因素，使蚜虫的繁殖能力和适应性显著增强，其危害日趋严重。目前，蚜虫防治以喷洒农药为主，但大量使用农药，不仅对人畜有害，而且造成了严重的环境污染。培育抗蚜虫小麦和蔬菜品种是防止蚜虫危害的最有效途径，但由于现有种质资源中缺乏有效的抗蚜基因，抗性机制尚不明确，常规育种难以奏效。挖掘和利用新型抗蚜基因并通过基因工程培育小麦抗蚜新种质具有重要意义。
植物介导的RNAi技术已成为农作物抗虫基因工程的热点之一，RNAi现象其作用过程是双链RNA(dsRNA)进入生物体内，被Dicer酶切割成21-23nt的siRNA，siRNA与RNA诱导沉默复合物结合，与互补序列的靶mRNA结合，被Dicer识别，造成靶基因表达量的下降。近年来，利用dsRNA体外饲喂或注射来筛选RNA靶标基因，导致靶标基因表达和沉默，已经广泛应用于昆虫生长发育关键基因的鉴定和功能分析。孟山都公司通过植物介导的昆虫肠道特异基因RNAi技术成功获得了抗玉米根螟的转基因玉米，有效缓解了长期应用Bt转基因玉米诱发昆虫产生抗性等问题，目前已完成生产性试验。棉铃虫肠道中特异P450基因可提高棉铃虫幼虫对棉花次生代谢物质和棉酚的耐受性，试验表明，利用表达棉铃虫P450基因dsRNA的转基因烟草和棉花叶片饲喂棉铃虫幼虫，可导致幼虫体内P450基因的表达量下降，同时幼虫发育受阻，表现出抗棉铃虫性能。
共生菌在昆虫体内的生长、繁殖过程中起着十分重要的作用，如营养功能、解毒作用、调控生殖及与寄主适应性等等。Hamiltonella defensa是半翅目昆虫体内存在的一种次级共生细菌，存在于刺吸食害虫如蚜虫、木虱和粉虱体等昆虫体内。在蚜虫体内中，Hamiltonella defensa在含菌体、肠道、卵巢等部位存在。通过寄主植物表达相应昆虫寄生菌特异基因的dsRNA，昆虫取食植物后沉默其体内相应的共生菌的基因，导致共生菌死亡或者数量下降，影响昆虫的正常生长，从而达到控制害虫危害的目的。通过RNAi技术沉默共生菌相关基因的方式，间接控制蚜虫的研究还尚未有报道。此研究将为挖掘有效的RNAi靶标基因及利用其创制新型抗蚜转基因新种质奠定基础。
发明内容
本发明的一个目的是提供了dsRNA。
本发明提供的dsRNA，为由序列表中序列2所示的核苷酸和其反向互补序列所示的核苷酸组成的双链RNA。
上述dsRNA的编码基因或含有该编码基因的DNA片段也是本发明保护的范围，上述dsRNA的编码基因具体为序列表中序列1所示的核苷酸。
上述dsRNA或上述的编码基因在如下1)-4)中至少一种中的应用也是本发明保护的范围：
1)防治蚜虫或制备防治蚜虫产品；
2)促进蚜虫死亡或制备促进蚜虫死亡产品；
3)抑制蚜虫生长中或制备抑制蚜虫生长产品；
4)抑制蚜虫体内共生菌Hamiltonella defensa28469基因的表达或在制备抑制蚜虫体内共生菌Hamiltonella defensa28469基因的表达产品。
上述应用为将上述dsRNA导入蚜虫，实现防治蚜虫、促进蚜虫死亡、抑制蚜虫生长和/或抑制蚜虫体内共生菌Hamiltonella defensa28469基因的表达；所述导入具体为饲喂；
所述蚜虫为麦蚜。
本发明的另一个目的是提供具有功能的产品，其活性成分为上述dsRNA或其编码基因；
所述功能为如下1)-4)中任意一种：1)防治蚜虫；2)促进蚜虫死亡；3)抑制蚜虫生长；4)抑制蚜虫体内共生菌Hamiltonella defensa28469基因表达。
所述蚜虫为麦蚜。
蚜虫体内共生菌Hamiltonella defensa28469基因的核苷酸序列为序列表中序列1。
本发明的实验证明，本发明得到麦蚜的共生菌Hamiltonella defensa28469cDNA的保守序列的dsRNA，采用体外饲喂dsRNA方法，进行了利用RNAi技术沉默麦蚜体内共生菌Hamiltonella defensa28469基因，导致麦蚜产生致死效应，并且随着饲喂时间延长，麦蚜的死亡率均逐渐增加。对饲喂后蚜虫体内共生菌Hamiltonella defensa28469基因实时荧光定量PCR研究表明，28469的表达明显受到抑制。表明蚜虫体内共生菌Hamiltonella defensa的28469基因的保守序列可应用于通过植物介导的RNAi技术提高小麦抗蚜性的研究。
附图说明
图1蚜虫体内共生菌Hamiltonella defensa28469基因和GFP的PCR扩增
图2蚜虫体内共生菌Hamiltonella defensa28469基因和GFP的体外合成dsRNA
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中麦蚜(钱幼亭，周广和，张淑香，张向才.麦蚜有性世代的研究.植物保护，1982,1：14-15。公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得)由中国农业科学院植物保护研究所提供，饲养蚜虫的小麦品种为科农199，将蚜虫接种到小麦幼苗上，放入人工气候箱中(温度(20±2)℃，湿度60％—80％，光周期L∶D＝16∶8)进行繁殖。
质粒提取试剂盒购自Biomega公司，内切酶BamHⅠ、EcoRⅤ及Hiscribe T7体外转录试剂盒购自NEB公司，大肠杆菌菌株DH5α、反转录试剂盒购自北京全式金公司，rTaq DNA聚合酶购自TaKaRa公司，MinElute PCR Cleaning Kit、MinElute Gel Extraction Kit、RNA Cleaning Kit购自Qiagen公司，各种氨基酸及其它试剂均购自北京拜尔迪公司。
实施例1、蚜虫体内共生菌Hamiltonella defensa28469基因的dsRNA的获得
1、麦蚜总RNA的提取和cDNA的合成
分别取约20头麦蚜，按照北京全式金公司的Trizol试剂盒说明书提取总RNA，用RNA Cleaning Kit进行纯化，反转录合成cDNA第一链，操作步骤均参考试剂盒说明书。
2、引物设计与基因克隆
根据麦蚜肠道转录组测序得到蚜虫共生菌相关基因28469(获得的28469的一个片段用于RNAi干扰)，利用Primer Primer5.0软件设计引物P1(表1)，由北京华大基因公司合成。绿色荧光蛋白基因(GFP)片段从国家小麦改良中心实验室保存的GFP质粒上扩增，利用Primer Primer5.0软件设计引物P2(表1)。
PCR反应体系为10×PCR Buffer5μL、dNTP(2.5mmol·L-1)4μL、rTaq0.5μL，Forward primer(20μmol·L-1)1μL、Reverse primer(20μmol·L-1)1μL、cDNA/GFP质粒1μL，用ddH2O补足至50μL。PCR的反应条件为94℃4min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，39个循环；72℃10min；4℃保存。
以麦蚜的cDNA为模板，用P1作为引物进行扩增，得到283bp PCR产物(含40bp的T7启动子序列)，经过测序，该283bp PCR产物具有序列表中的序列1(可人工合成)所示的核苷酸。
以GFP质粒为模板，用P2作为引物进行扩增，得到360bp PCR产物(含40bp的T7启动子序列)，其具有序列表中的序列3(可人工合成)所示的核苷酸。
将上述PCR电泳结果如图1所示，M：100bp marker；1：麦蚜Sitobion avenae2：GFP，可以看出得到目的片段。
将上述283bp PCR产物核苷酸序列去掉T7启动子序列提交到NCBI数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)进行BLAST比对分析，BLAST结果表明，与豌豆蚜体内次级共生菌基因具有100％同源性，可确定该核苷酸序列为保守序列。
表1 为共生菌基因28469与GFP的PCR扩增引物
下划线处是T7RNA聚合酶启动子。
3、蚜虫体内共生菌Hamiltonella defensa28469基因和GFP的dsRNA的制备
分别回收由上述2得到的2种PCR产物，测定浓度，作为体外转录dsRNA的模板。dsRNA的体外转录体系为10×Transcription Buffer4μL、20×Ribonucleotide Solution Mix2μL、模板(1μg)XμL、20×HMW Mix2μL、T7RNA Polymerase(500units·μL-1)2μL，RNase-Free ddH2O补足至40μL。42℃过夜孵育。
反应结束后，取0.5μL反应产物琼脂糖凝胶电泳检测，加入DNaseI和RNaseA消化残留的模板DNA和单链RNA，用MinElute PCR Cleaning Kit纯化反应产物，操作过程参考试剂盒说明书，用无RNase水溶解dsRNA，分光光度计(波长260nm)定量，置于-20℃冰箱中保存，分别得到麦蚜蚜虫体内共生菌Hamiltonella defensa基因28469和GFP dsRNA。结果如图2所示，M：100bp marker；1：麦蚜体外转录产物28469dsRNA；2：GFP体外转录产物GFP dsRNA；可以看到，得到目的转录产物。
将蚜虫体内共生菌Hamiltonella defensa28469dsRNA和GFP dsRNA分别测序，结果如下：
蚜虫体内共生菌Hamiltonella defensa28469dsRNA为双链RNA，由正义链和反义链组成，其正义链的核苷酸序列为序列表中的序列2，其反义链的核苷酸序列为序列表中的序列2的反向互补序列，28469dsRNA编码基因的核苷酸序列含有序列表中序列1；
GFP dsRNA为双链RNA，由正义链和反义链组成，其正义链的核苷酸序列为序列表中的序列4，其反义链的核苷酸序列为序列表中的序列4的反向互补序列，GFPdsRNA编码基因的核苷酸序列为序列表中序列3。
也可以人工合成麦蚜28469dsRNA和GFP dsRNA。
实施例2、28469dsRNA在抑制蚜虫生长中的应用
1、蚜虫人工饲料的配制和饲育器的准备
人工饲料配制和饲育器的准备过程参考文献(李彩霞,高丽锋,高玲玲,李润植.全纯人工营养液饲养蚜虫的研究.山西农业大学学报,1997,17(3):225-228.Li C X,GaoL F,Gao L L,Li R Z.Study on the rearing of aphids on a artificially holidic diets.Journal ofShanxi Agricultural University,1997,17(3):225-228.(in Chinese))进行，用0.2μm的细菌过滤器过滤人工饲料，分装到2.0mL灭菌的离心管保存于-20℃的冰箱中，避免反复冻融。
2、dsRNA(28469dsRNA)在抑制蚜虫生长中的应用
蚜虫饲喂方法参照如下文献中记载：纠敏,刘树生.利用人工饲料饲养蚜虫的技术.华东昆虫学报,2004,13(2):102-109.Jiu M,Liu S S.Aphid rearing with artificial diets.Entomological Journal of East China,2004,13(2):102-109。
麦蚜共生菌Hamiltonella defensa28469dsRNA喂养组(ds28469)：每个蚜虫饲育器中分别放入15头3龄麦蚜若蚜，按照每100μL人工饲料中依次分别加入0和750ng的麦蚜共生菌Hamiltonella defensa28469dsRNA饲喂蚜虫；
麦蚜dsGFP组：每个蚜虫饲育器中分别放入15头3龄麦蚜若蚜，按照每100μL人工饲料中依次分别加入0和750ng的GFP dsRNA饲喂蚜虫；
上述各组设置3个重复，每两天统计各饲育器中蚜虫的存活数，并更换新的饲料和对应的dsRNA，置于人工气候箱(温度(20±2)℃，湿度60％-80％，光周期L∶D＝16∶8)。使用Excel2003软件对蚜虫死亡率进行统计学分析，计算每种处理的平均值与方差，并进行显著性差异的分析(t-test，n＝3，P<0.01或0.05)。
统计各组每个饲育器中存活蚜虫的数目，计算死亡率，结果如表2所示：
表2为麦蚜共生菌Hamiltonella defensa28469dsRNA喂养组和麦蚜dsGFP组死亡率
*表示与对照组(0ng/μL)相比，试验组结果差异显著(t-test,n＝3,P<0.05)，**表示与对照组相比，试验组结果差异极显著(t-test,n＝3,P<0.01)。
从表2可以看出，麦蚜的死亡率均随着饲喂28469dsRNA的时间增加，麦蚜的平均死亡率随之增加，7.5ng·μL-128469dsRNA饲喂2天、4天、6天和8天后，麦蚜的平均死亡率为53.3％、60％、64.5％和73.3％，这些处理与对照相比均存在显著性差异，饲喂GFPdsRNA的试验组死亡率与对照相比则没有显著性的差异。
2、dsRNA(28469dsRNA)抑制共生菌Hamiltonella defensa28469基因的表达
利用Primer Primer5.0软件设计共生菌Hamiltonella defensa28469基因(表1)，扩增片段大小为243bp，合成内参基因(ACTIN)引物P4(表1)。
收集上述2中各组7.5ng/μl dsRNAs饲喂后存活的麦蚜(2、4、6和8d)，提取蚜虫的RNA，反转录成cDNA稀释100、101、102、103、104、105倍，作为荧光定量PCR的模板，以P3作为引物进行相对定量RT-PCR分析。内参引物为P4。
实时荧光定量PCR体系为Forward Primer(10μmol·L-1)0.5μL、Reverse Primer(10μmol·L-1)0.5μL、2×TransStartTM Green qPCR SuperMix12.5μL、Passive Reference Dye0.5μL、模板cDNA1μL，用ddH2O至25μL。
PCR循环程序为95℃30s，95℃5s，57℃15s，72℃10s，40个循环，每个样本3个重复。最终结果的计算采用2-△△Ct法(Ct表示循环数)进行计算，即△△Ct＝(Ct(28469)－Ct(actin))试验组－(Ct(28469)－Ct(actin))对照组，使用Excel2003软件进行统计学分析，计算每种处理的平均值与方差，并进行显著性差异的分析(t-test，n＝3，P<0.01或0.05)。
统计在饲喂麦蚜共生菌Hamiltonella defensa28469dsRNA2、4、6和8d后，各组蚜虫体内28469表达量，结果如表3所示：
表3为饲喂共生菌Hamiltonella defensa28469dsRNA和GFP dsRNA后麦蚜共生菌Hamiltonella defensa28469基因相对表达量
*表示与对照组相比，试验组结果差异显著(t-test,n＝3,P<0.05)，**表示与对照组相比，试验组结果差异极显著(t-test,n＝3,P<0.01)。
可以看出，麦蚜共生菌Hamiltonella defensa28469表达量依次降低了39.62％、32.46％、80.6％和100％。与对照(0天的表达量)相比，在统计学上表现为差异显著。饲喂GFPdsRNA的蚜虫体内共生菌Hamiltonella defensa28469表达水平则没有显著性的变化，进一步说明通过饲喂28469dsRNA能够在麦蚜体内引起共生菌Hamiltonelladefensa28469的RNAi效应，致使共生菌Hamiltonella defensa基因28469表达量明显降低甚至沉默，导致蚜虫死亡。
Claims (8)
1.dsRNA，为由序列表中序列2所示的核苷酸和其反向互补序列所示的核苷酸组成的双链RNA。
2.权利要求1所述dsRNA的编码基因或含有该编码基因的DNA片段。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述dsRNA的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列1。
4.权利要求1所述dsRNA或权利要求2所述的编码基因在如下1)-4)中至少一种中的应用：
1)防治蚜虫或制备防治蚜虫产品；
2)促进蚜虫死亡或制备促进蚜虫死亡产品；
3)抑制蚜虫生长中或制备抑制蚜虫生长产品；
4)抑制蚜虫体内共生菌Hamiltonella defensa28469基因的表达或在制备抑制蚜虫体内共生菌Hamiltonella defensa28469基因的表达产品。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述应用为将权利要求1或2所述dsRNA导入蚜虫，实现防治蚜虫、促进蚜虫死亡、抑制蚜虫生长和/或抑制蚜虫体内共生菌Hamiltonella defensa28469基因的表达。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：
所述导入为饲喂。
7.根据权利要求4-6中任一所述的应用，其特征在于：
所述蚜虫为麦蚜。
8.一种具有功能的产品，其活性成分为权利要求1所述dsRNA或权利要求2所述的编码基因，所述功能为如下1)-4)中任意一种：1)防治蚜虫；2)促进蚜虫死亡；3)抑制蚜虫生长；4)抑制蚜虫体内共生菌Hamiltonella defensa28469基因表达。
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