CN104263731B - 一种蚜虫共生菌基因的dsRNA及其在降低蚜虫存活率中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蚜虫共生菌基因的dsRNA及其在抑制蚜虫生长中的应用。本发明所提供的dsRNA，为由序列表中序列1所示的核苷酸和其反向互补序列所示的核苷酸组成的双链RNA。本发明所提供的dsRNA，采用体外饲喂dsRNA方法，进行了利用RNAi技术沉默麦长管蚜体内共生菌Pseudomonas putida 29698基因，导致麦长管蚜产生致死效应，并且随着饲喂时间延长，麦长管蚜的死亡率均逐渐增加。对饲喂后蚜虫体内共生菌Pseudomonas putida 29698基因实时荧光定量PCR研究表明，29698基因的表达明显受到抑制。表明蚜虫体内共生菌Pseudomonas putida 29698基因的保守序列可应用于通过植物介导的RNAi技术提高小麦抗蚜性的研究。

Description

一种蚜虫共生菌基因的dsRNA及其在降低蚜虫存活率中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种蚜虫共生菌基因的dsRNA及其在降低蚜虫存活率中的应用。

背景技术

蚜虫是危害作物生产的主要害虫之一，近年来全球气候变暖、耕作制度变化等因素使蚜虫的繁殖能力和适应性显著增强，其危害日趋严重。据统计，2010-2011年间我国小麦、玉米、棉花、油菜、大豆等主要作物的蚜虫危害面积分别占当年种植面积的62.5％、14％、90％、32％和23％。以麦蚜为例，麦蚜以成若蚜聚集在小麦叶部、茎部、穗部等，吸食汁液造成叶片不规则皱缩、卷曲、失绿，严重时造成植株死亡。麦蚜分泌的蜜露附着在植株表面，降低植株的光合作用，并易诱发煤烟病等。同时，麦蚜还是黄矮病毒重要的传播载体，引起小麦黄矮病流行。据全国农作物病虫监测网预报，2013年我国麦蚜危害面积高达2.5亿亩(http://www.agri.gov.cn/V20/bchqb/201301/t20130123_3206134.htm)。危害我国小麦的麦蚜主要有4种，即麦长管蚜、麦二叉蚜、禾谷缢管蚜和麦无网长管蚜；其中麦长管蚜在全国麦区均有发生，且是危害我国小麦生产的主要蚜虫类型。目前，蚜虫防治以喷洒农药为主，但大量使用农药，不仅对人畜有害，而且造成了严重环境污染。培育抗虫作物品种是防止蚜虫为害的最有效途径，但由于农作物现有种质资源中缺乏有效的抗蚜基因，且抗性机制不明确，常规抗虫育种难以奏效。因此，利用转基因技术培育抗蚜新种质，对于保障我国粮食安全和环境安全具有重要意义。

植物介导的RNAi技术能特异抑制昆虫特定基因的表达，使昆虫的生长发育受阻或致死，进而有效控制害虫危害，已成为农作物抗虫基因工程的热点之一。RNAi现象是由dsRNA(double-strandedRNA)介导的一种序列特异性转录后基因沉默机制，dsRNA进入生物体后被宿主细胞中的Dicer酶切割成21～23nt的siRNA(smallin-terferingRNA)；siRNA在RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，反义siRNA与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、解旋酶等)结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)，继之RISC以序列互补的方式与靶mRNA结合并使之降解，造成靶标基因表达量下降。利用dsRNA体外饲喂或注射来筛选RNA靶标基因，导致靶标基因表达和沉默，已经广泛应用于昆虫生长发育关键基因的鉴定和功能分析。孟山都公司通过植物介导的昆虫肠道特异基因RNAi技术成功获得了抗玉米根螟的转基因玉米，有效缓解了长期应用Bt转基因玉米诱发昆虫产生抗性等问题，目前已完成生产性试验。棉铃虫肠道中特异P450基因可提高棉铃虫幼虫对棉花次生代谢物质和棉酚的耐受性，试验表明，利用表达棉铃虫P450基因dsRNA的转基因烟草和棉花叶片饲喂棉铃虫幼虫，可导致幼虫体内P450基因的表达量下降，同时幼虫发育受阻，表现出抗棉铃虫性能。近年来，RNAi技术在蚜虫防治方面也展示出很好的应用前景。Pitino等分别在烟草和拟南芥中表达桃蚜MpC002和Rack-1基因的dsRNA，桃蚜取食转基因植物后，导致桃蚜体内MPC002或Rack-1基因的表达量降低60％，蚜虫的产仔数目减少。同样，烟草和拟南芥中表达蚜虫Mphb基因或丝氨酸蛋白酶MySP基因的dsRNA均可显著降低蚜虫的繁殖率，进而减轻蚜虫危害。

共生菌在昆虫体内的生长、繁殖过程中起着十分重要的作用，如营养功能、解毒作用、调控生殖及与寄主适应性等等。Pseudomonasputida是蚜虫体内存在的一种次级共生细菌，存在于含菌体、肠道等部位。通过寄主植物表达相应昆虫寄生菌特异基因的dsRNA，昆虫取食植物后沉默其体内相应的共生菌的基因，导致共生菌死亡或者数量下降，影响昆虫的正常生长，从而达到控制害虫危害的目的。通过RNAi技术沉默共生菌相关基因的方式，间接控制蚜虫的研究报道较少。此研究将为挖掘有效的RNAi靶标基因及利用其创制新型抗蚜转基因新种质奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种蚜虫共生菌基因的dsRNA及其在降低蚜虫存活率中的应用。

本发明提供的dsRNA，具体为由序列表中序列1所示的核苷酸和其反向互补序列所示的核苷酸组成的双链RNA。

编码所述dsRNA的DNA分子也属于本发明的保护范围。

所述DNA分子的核苷酸序列具体为序列表中序列2。

含有所述DNA分子的表达盒、重组载体或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述dsRNA、或所述DNA分子、或所述表达盒、重组载体或重组菌，在如下(a1)-(a4)任一中的应用也属于本发明的保护范围：

(a1)防治蚜虫或制备防治蚜虫的产品；

(a2)降低蚜虫存活率或制备降低蚜虫存活率的产品；

(a3)抑制蚜虫生长或制备抑制蚜虫生长的产品；

(a4)抑制蚜虫体内共生菌Pseudomonasputida29698基因的表达或在制备抑制蚜虫体内共生菌Pseudomonasputida29698基因的表达产品。

进一步，所述应用为将所述dsRNA导入蚜虫，从而实现防治蚜虫、降低蚜虫存活率、抑制蚜虫生长、或抑制蚜虫体内共生菌Pseudomonasputida29698基因表达。

在本发明中，所述导入的方式具体为饲喂。

更加具体的，所述饲喂为：将所述dsRNA混合于液体饲料中，得到混合液；用所述混合液饲喂蚜虫；所述dsRNA在所述混合液中的终浓度具体为7.5ng/μL；所述饲喂持续的时间为2天以上(具体如2-8天)。

在本发明中，所述蚜虫可为麦蚜，所述麦蚜为麦长管蚜，具体为3龄麦长管蚜。

活性成分为如下A-C中任一种的产品也属于本发明的保护范围：

A、所述dsRNA；

B、所述DNA分子；

C、所述表达盒、重组载体或重组菌；

所述产品具有如下(a1)-(a4)功能中的至少一种：

(a1)防治蚜虫；

(a2)降低蚜虫存活率；

(a3)抑制蚜虫生长；

(a4)抑制蚜虫体内共生菌Pseudomonasputida29698基因表达。

在本发明中，所述蚜虫可为麦蚜，所述麦蚜为麦长管蚜，具体为3龄麦长管蚜。

另外，抑制蚜虫体内共生菌Pseudomonasputida29698基因表达的物质，在如下(a1)-(a3)任一中的应用同样属于本发明的保护范围：

(a1)防治蚜虫或制备防治蚜虫的产品；

(a2)降低蚜虫存活率或制备降低蚜虫存活率的产品；

(a3)抑制蚜虫生长或制备抑制蚜虫生长的产品。

在本发明中，所述蚜虫可为麦蚜，所述麦蚜为麦长管蚜，具体为3龄麦长管蚜。

在本发明中，所述蚜虫体内共生菌Pseudomonasputida29698基因的核苷酸序列含有序列表中序列2。

实验证明，本发明得到麦长管蚜的共生菌Pseudomonasputida29698cDNA的保守序列的dsRNA，采用体外饲喂dsRNA方法，进行了利用RNAi技术沉默麦长管蚜体内共生菌Pseudomonasputida29698基因，导致麦长管蚜产生致死效应，并且随着饲喂时间延长，麦长管蚜的死亡率均逐渐增加。对饲喂后蚜虫体内共生菌Pseudomonasputida29698基因实时荧光定量PCR研究表明，29698基因的表达明显受到抑制。表明蚜虫体内共生菌Pseudomonasputida29698基因的保守序列可应用于通过植物介导的RNAi技术提高小麦抗蚜性的研究。

附图说明

图1蚜虫体内共生菌Pseudomonasputida29698基因和GFP的PCR扩增结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中麦长管蚜(钱幼亭，周广和，张淑香，张向才.麦蚜有性世代的研究.植物保护，1982,1：14-15。公众可从南阳师范学院生命科学与技术学院获得)由中国农业科学院植物保护研究所提供，饲养蚜虫的小麦品种为科农199，将蚜虫接种到小麦幼苗上，放入人工气候箱中(温度(20±2)℃，湿度60％-80％，光周期L∶D＝16∶8)进行繁殖。

16318hGFP质粒：“倪志勇，徐兆师，刘丽，李连城，柴岩，陈明，马有志.小麦转录因子TaDREB6基因的克隆及鉴定.麦类作物学报，2008,28：357-363”，公众可从南阳师范学院生命科学与技术学院获得。

质粒提取试剂盒购自Biomega公司，内切酶BamHⅠ、EcoRⅤ及HiscribeT7体外转录试剂盒购自NEB公司，大肠杆菌菌株DH5α、反转录试剂盒购自北京全式金公司，rTaqDNA聚合酶购自TaKaRa公司，MinElutePCRCleaningKit、MinEluteGelExtractionKit、RNACleaningKit购自Qiagen公司，各种氨基酸及其它试剂均购自北京拜尔迪公司。

实施例1、蚜虫体内共生菌Pseudomonasputida29698基因的dsRNA的获得

1、麦长管蚜总RNA的提取和cDNA的合成

分别取约20头麦长管蚜，按照北京全式金公司的Trizol试剂盒说明书提取总RNA，用RNACleaningKit进行纯化，反转录合成cDNA第一链，操作步骤均参考试剂盒说明书。

2、引物设计与基因克隆

根据麦长管蚜肠道转录组测序得到蚜虫共生菌相关基因29698，利用PrimerPri-mer5.0软件设计引物P1-F和P1-R，由北京华大基因公司合成。绿色荧光蛋白基因(GFP)片段从南阳师范学院生命科学与技术学院实验室保存的16318hGFP质粒上扩增，利用PrimerPrimer5.0软件设计引物P2-F和P2-R。

P1-F：5’-TAATACGACTCACTATAGGGATCGTCGCCTTGGTGAGCCTTTAC-3’(下划线后的序列为序列2的第1-24位)；

P1-R：5’-TAATACGACTCACTATAGGGCGGCGGACGGGTGAGTAATG-3’(下划线后的序列为序列2的第162-181位的反向互补序列)。

P2-F：5’-TAATACGACTCACTATAGGGACGGGAACTACAAGACACG-3’(下划线后的序列为序列4的第1-19位)；

P2-R：5’-TAATACGACTCACTATAGGGTTTGGAAAGGGCAGATT-3’(下划线后的序列为序列4的第304-320位的反向互补序列)。

各引物序列中下划线处为T7RNA聚合酶启动子序列。

PCR反应体系为：10×PCRBuffer5μL、dNTP(2.5mmol·L^-1)4μL、rTaq0.5μL，正向引物(20μmol·L^-1)1μL、反向引物(20μmol·L^-1)1μL、cDNA/GFP质粒1μL，用ddH₂O补足至50μL。

PCR的反应条件为：94℃4min；94℃30s，54℃或55℃30s，72℃30s，39个循环；72℃10min；4℃保存。(P1-F/P1-R的退火温度为54℃；P2-F/P2-R的退火温度为55℃)

以麦长管蚜的cDNA为模板，用P1-F/P1-R作为引物进行扩增，得到221bpPCR产物(含40bp的T7启动子序列)，经过测序，该221bpPCR产物除去两端T7RNA聚合酶启动子序列外的序列为序列表中的序列2(可人工合成)。

以16318hGFP质粒为模板，用P2-F/P2-R作为引物进行扩增，得到360bpPCR产物(含40bp的T7启动子序列)，经过测序，该360bpPCR产物除去两端T7RNA聚合酶启动子序列外的序列为序列表中的序列4(可人工合成)。

将上述PCR电泳结果如图1所示，M：100bpmarker；1：GFP，可以看出得到目的片段；2：麦长管蚜Sitobionavenae。

将上述221bpPCR产物核苷酸序列去掉T7启动子序列提交到NCBI数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)进行BLAST比对分析，BLAST结果表明，与蚜虫体内次级共生菌Pseudomonasputida16SrRNA基因具有100％同源性，可确定该核苷酸序列为保守序列。

3、蚜虫体内共生菌Pseudomonasputida29698基因和GFP的dsRNA的制备

分别回收由上述2得到的2种PCR产物，测定浓度，作为体外转录dsRNA的模板。dsRNA的体外转录体系为10×TranscriptionBuffer4μL、20×RibonucleotideSolutionMix2μL、模板(1μg)XμL、20×HMWMix2μL、T7RNAPolymerase(500units·μL^-1)2μL，RNase-FreeddH₂O补足至40μL。42℃过夜孵育。

反应结束后，取0.5μL反应产物琼脂糖凝胶电泳检测，加入DNaseI和RNaseA消化残留的模板DNA和单链RNA，用MinElutePCRCleaningKit纯化反应产物，操作过程参考试剂盒说明书，用无RNase水溶解dsRNA，分光光度计(波长260nm)定量，置于-20℃冰箱中保存，分别得到麦长管蚜蚜虫体内共生菌Pseudomonasputida基因29698和GFPdsRNA。

将蚜虫体内共生菌Pseudomonasputida29698dsRNA和GFPdsRNA分别测序，结果如下：

蚜虫体内共生菌Pseudomonasputida29698dsRNA为双链RNA，由正义链和反义链组成，其正义链的核苷酸序列为序列表中的序列1，其反义链的核苷酸序列为序列表中的序列1的反向互补序列。29698dsRNA编码基因的核苷酸序列含有序列表中序列2；

GFPdsRNA为双链RNA，由正义链和反义链组成，其正义链的核苷酸序列为序列表中的序列3，其反义链的核苷酸序列为序列表中的序列3的反向互补序列。GFPdsRNA编码基因的核苷酸序列为序列表中序列4。

当然，也可以直接人工合成序列1所示的麦长管蚜29698dsRNA和序列3所示的GFP基因dsRNA用于下述实施例。

实施例2、29698dsRNA在抑制蚜虫生长中的应用

1、蚜虫人工饲料的配制和饲育器的准备

人工饲料配制和饲育器的准备过程参考文献(李彩霞,高丽锋,高玲玲,李润植.全纯人工营养液饲养蚜虫的研究.山西农业大学学报,1997,17(3):225-228.LiCX,GaoLF,GaoLL,LiRZ.Studyontherearingofaphidsonaartificiallyholidicdiets.JournalofShanxiAgriculturalUniversity,1997,17(3):225-228.(inChinese))进行，用0.2μm的细菌过滤器过滤人工饲料，分装到2.0mL灭菌的离心管保存于-20℃的冰箱中，避免反复冻融。

2、dsRNA(29698dsRNA)在抑制蚜虫生长中的应用

蚜虫饲喂方法参照如下文献中记载：纠敏,刘树生.利用人工饲料饲养蚜虫的技术.华东昆虫学报,2004,13(2):102-109.。

麦长管蚜共生菌Hamiltonelladefensa29698dsRNA喂养组(29698)：每个蚜虫饲育器中分别放入15头3龄麦长管蚜若蚜，按照每100μL人工饲料中依次分别加入0和750ng的麦长管蚜共生菌Pseudomonasputida29698dsRNA饲喂蚜虫；

麦长管蚜dsGFP组：每个蚜虫饲育器中分别放入15头3龄麦长管蚜若蚜，按照每100μL人工饲料中依次分别加入0和750ng的GFPdsRNA饲喂蚜虫；

上述各组设置3个重复，每两天统计各饲育器中蚜虫的存活数，并更换新的饲料和对应的dsRNA，置于人工气候箱(温度为20±2℃，湿度为60％-80％，光周期为L:D＝16:8)。使用Excel2003软件对蚜虫死亡率进行统计学分析，计算每种处理的平均值与方差，并进行显著性差异的分析(t-test，n＝3，P<0.01或0.05)。

统计各组每个饲育器中存活蚜虫的数目，计算死亡率，结果如表1所示。

表1为麦长管蚜共生菌Pseudomonasputida29698dsRNA喂养组和麦长管蚜dsGFP组死亡率

注：^＊＊表示与对照组(0ng/μL)相比，试验组结果差异显著(t-test,n＝3,P<0.01)。

从表1可以看出，麦长管蚜的死亡率均随着饲喂29698dsRNA的时间增加，麦长管蚜的平均死亡率随之增加，7.5ng·μL^-129698dsRNA饲喂2天、4天、6天和8天后，麦长管蚜的平均死亡率为28.88％、44.44％、51.11％和53.33％，其中饲喂4天、6天和8天后的处理与对照组(0ng/μL)相比均存在显著性差异(P<0.05)，饲喂GFPdsRNA的试验组死亡率与对照组(0ng/μL)相比则没有显著性的差异。

3、dsRNA(29698dsRNA)抑制共生菌Pseudomonasputida29698基因的表达

利用PrimerPrimer5.0软件设计扩增共生菌Pseudomonasputida29698基因的引物P3-F和P3-R，扩增片段大小为181bp，合成内参基因(ACTIN)引物P4-F和P4-R。

P3-F：5’-ATCGTCGCCTTGGTGAGCCTTTAC-3’(序列2的第1-24位)；

P3-R：5’-CGGCGGACGGGTGAGTAATG-3’(序列2的第162-181位的反向互补序列)。

P4-F：5’-CCGAAAAGCTGTCATAATGAAGACC-3’；

P4-R：5’-GGTGAAACCTTGTCTACTGTTACATCTTG-3’。

收集上述步骤2中各组7.5ng/μldsRNAs饲喂后存活的麦长管蚜(2、4、6和8d)，提取蚜虫的RNA，反转录成cDNA稀释10⁰、10¹、10²、10³、10⁴、10⁵倍，作为荧光定量PCR的模板，以P3-F/P3-R作为引物进行相对定量RT-PCR分析。内参引物为P4-F/P4-R。

实时荧光定量PCR体系为：正向引物(10μmol·L^-1)0.5μL、反向引物(10μmol·L^-1)0.5μL、2×TransStart_TMGreenqPCRSuperMix12.5μL、PassiveReferenceDye0.5μL、模板cDNA1μL，用ddH₂O至25μL。

PCR循环程序为95℃30s，95℃5s，54℃或57℃15s，72℃10s，40个循环，每个样本3个重复。(P3-F/P3-R的退火温度为54℃；P4-F/P4-R的退火温度为57℃)

最终结果的计算采用2^-△△Ct法(Ct表示循环数)进行计算，即△△Ct＝(Ct(29698)-Ct(actin))_试验组-(Ct(29698)-Ct(actin))_对照组，使用Excel2003软件进行统计学分析，计算每种处理的平均值与方差，并进行显著性差异的分析(t-test，n＝3，P<0.01或0.05)。

统计在饲喂麦长管蚜共生菌Pseudomonasputida29698dsRNA2、4、6和8d后，各组蚜虫体内29698表达量，结果如表2所示。

表2为饲喂共生菌Pseudomonasputida29698dsRNA和GFPdsRNA后麦长管蚜共生菌Pseudomonasputida29698基因相对表达量

注：^＊表示与对照组(0d)相比，试验组结果差异显著(t-test,n＝3,P<0.05)，^＊＊表示与对照组(0d)相比，试验组结果差异极显著(t-test,n＝3,P<0.01)。

可以看出，麦长管蚜共生菌Pseudomonasputida29698在4、6和8d的表达量，与对照(0天的表达量)相比，依次降低了17.7％、29.2％和43.8％，在统计学上表现为差异显著(P<0.05或P<0.01)。饲喂GFPdsRNA的蚜虫体内共生菌Pseudomonasputida29698表达水平则没有显著性的变化，进一步说明通过饲喂29698dsRNA能够在麦长管蚜体内引起共生菌Pseudomonasputida29698的RNAi效应，致使共生菌Pseudomonasputida基因29698表达量明显降低甚至沉默，导致蚜虫死亡。

Claims (10)

1.一种dsRNA，为由序列表中序列1所示的核苷酸和其反向互补序列所示的核苷酸组成的双链RNA。

2.权利要求1所述的dsRNA在防治麦长管蚜或制备防治麦长管蚜的产品中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述应用为将权利要求1所述的dsRNA导入麦长管蚜，从而实现防治麦长管蚜。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述导入的方式为饲喂。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述饲喂为：将所述dsRNA混合于液体饲料中，得到混合液；用所述混合液饲喂麦长管蚜；

所述dsRNA在所述混合液中的终浓度为7.5ng/μL；

所述饲喂持续的时间为2天以上。

6.权利要求1所述的dsRNA在如下(a1)或(a2)中的应用：

(a1)降低麦长管蚜存活率或制备降低麦长管蚜存活率的产品；

(a2)抑制麦长管蚜生长或制备抑制麦长管蚜生长的产品。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述应用为将权利要求1所述的dsRNA导入麦长管蚜，从而实现降低麦长管蚜存活率或抑制麦长管蚜生长。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述导入的方式为饲喂。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述饲喂为：将所述dsRNA混合于液体饲料中，得到混合液；用所述混合液饲喂麦长管蚜；

所述dsRNA在所述混合液中的终浓度为7.5ng/μL；

所述饲喂持续的时间为2天以上。

10.具有防治麦长管蚜功能的产品，其活性成分为权利要求1所述的dsRNA。