CN105255892B - 蚜虫基因的dsRNA及其在降低蚜虫存活率中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种蚜虫基因的dsRNA及其在降低蚜虫存活率中的应用。所述蚜虫基因的dsRNA具体为由SEQ ID No：1所示序列的核苷酸和其反向互补序列的核苷酸组成的双链RNA。所述应用为将所述dsRNA导入蚜虫，从而实现防治蚜虫、降低蚜虫存活率或抑制蚜虫SaUP基因表达。本发明采用体外饲喂dsRNA方法，利用RNAi技术沉默麦长管蚜SaUP基因，导致麦长管蚜产生致死效应。对饲喂后蚜虫SaUP基因实时荧光定量PCR研究表明，SaUP基因的表达明显受到抑制。表明蚜虫SaUP基因的序列可应用于通过植物介导的RNAi技术提高小麦抗蚜性的研究。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种蚜虫基因的dsRNA及其在降低蚜虫存活率中的应用。
背景技术
蚜虫是危害作物生产的主要害虫之一，近年来全球气候变暖、耕作制度变化等因素使蚜虫的繁殖能力和适应性显著增强，其危害日趋严重。据统计，2010～2011年间我国小麦、玉米、棉花、油菜、大豆等主要作物的蚜虫危害面积分别占当年种植面积的62.5%、14%、90%、32%和23%。以麦蚜为例，麦蚜以成若蚜聚集在小麦叶部、茎部、穗部等，吸食汁液造成叶片不规则皱缩、卷曲、失绿，严重时造成植株死亡。麦蚜分泌的蜜露附着在植株表面，降低植株的光合作用，并易诱发煤烟病等。同时，麦蚜还是黄矮病毒重要的传播载体，引起小麦黄矮病流行。据全国农作物病虫监测网预报，2013年我国麦蚜危害面积高达2.5亿亩，其中河南省麦蚜危害面积为5500万亩。目前，蚜虫防治以喷洒农药为主，但大量使用农药，不仅对人畜有害，而且造成了严重的环境污染。而培育抗虫作物品种是防止蚜虫为害的最有效途径之一，但由于农作物现有种质资源中缺乏有效的抗蚜基因，且抗性机制不明确，常规抗虫育种难以奏效。因此，利用转基因技术培育抗蚜新种质，对于保障我国粮食安全和环境安全具有重要意义。
植物介导的RNAi（RNA干扰）技术能特异抑制昆虫特定基因的表达，使昆虫的生长发育受阻或致死，进而有效控制害虫危害，已成为农作物抗虫基因工程研究的热点之一。RNAi现象是由dsRNA（double-stranded RNA）介导的一种序列特异性转录后基因沉默机制，dsRNA进入生物体后被宿主细胞中的Dicer酶切割成 21～23nt的siRNA（smallinterfering RNA）；siRNA在RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，反义siRNA与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-inducedsilencing complex，RISC），继之RISC以序列互补的方式与靶mRNA 结合并使之降解，造成靶标基因表达量下降。利用dsRNA体外饲喂或注射来筛选RNA靶标基因，导致靶标基因表达和沉默，已经广泛应用于昆虫生长发育关键基因的鉴定和功能分析。孟山都公司通过植物介导的昆虫肠道特异基因RNAi技术成功获得了抗玉米根螟的转基因玉米，有效缓解了长期应用Bt转基因玉米诱发昆虫产生抗性等问题，目前已完成生产性试验。棉铃虫肠道中特异P450基因可提高棉铃虫幼虫对棉花次生代谢物质和棉酚的耐受性，试验表明，利用表达棉铃虫P450基因dsRNA的转基因烟草和棉花叶片饲喂棉铃虫幼虫，可导致幼虫体内P450基因的表达量下降，同时幼虫发育受阻，表现出抗棉铃虫性能。近年来，RNAi技术在蚜虫防治方面也展示出很好的应用前景。在烟草和拟南芥中表达蚜虫Mphb基因或丝氨酸蛋白酶MySP基因的dsRNA均可显著降低蚜虫的繁殖率，进而减轻蚜虫危害。
鉴于蚜虫对农业生产造成的巨大损失，且农作物现有种质资源中缺乏有效的抗蚜虫基因，常规抗蚜虫育种难以奏效；挖掘和鉴定新型抗蚜基因或蚜虫dsRNA，利用转基因技术培育抗蚜新种质，对于保障我国粮食安全和环境安全具有重要的意义。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种蚜虫基因的dsRNA，可利用RNAi技术沉默蚜虫SaUP基因，导致蚜虫产生致死效应。
为解决以上问题，本发明通过以下技术方案实现：
设计一种蚜虫基因的dsRNA，具体为由SEQ ID No：1所示序列的核苷酸和其反向互补序列的核苷酸组成的双链RNA。对应的，对该序列经简单缺失、修饰等变换后，使其能达到基本相同抑制效果的核苷酸序列，也应当是与该序列实质上相同的发明。
编码所述dsRNA的DNA分子也属于本发明的保护范围，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。
含有所述DNA分子的表达盒、重组载体或重组菌也属于本发明的保护范围。
所述dsRNA、或所述DNA分子、或所述表达盒、重组载体或重组菌，在如下（1）～（3）任一项中的应用也属于本发明的保护范围：
（1）防治蚜虫或制备防治蚜虫的产品；
（2）降低蚜虫存活率或制备降低蚜虫存活率的产品；
（3）抑制蚜虫SaUP基因表达或制备抑制蚜虫SaUP基因表达的产品。
所述应用为将所述dsRNA导入蚜虫，从而实现防治蚜虫、降低蚜虫存活率或抑制蚜虫SaUP基因表达。
在本发明中，所述导入的方式具体为饲喂。
更加具体的，所述饲喂方法为：将所述dsRNA混合于液体饲料中，得到混合液，用所述混合液饲喂蚜虫；所述dsRNA在所述混合液中的终浓度优选为10 ng/μL；所述饲喂持续的时间为2天以上，优选2～8天。
活性成分为如下A～C中任一种的产品也属于本发明的保护范围：
A、所述dsRNA；
B、所述DNA分子；
C、所述表达盒、重组载体或重组菌；
所述产品具有如下（1）～（3）功能中的至少一种：
（1）防治蚜虫；
（2）降低蚜虫存活率；
（3）抑制蚜虫SaUP基因表达。
在本发明中，所述蚜虫可为麦蚜，所述麦蚜为麦长管蚜，具体为3龄麦长管蚜。
在本发明中，所述蚜虫SaUP基因的核苷酸含有如SEQ ID No：2所示序列。
本发明具有的积极有益的技术效果：
1.实验证明，本发明得到了麦长管蚜SaUP cDNA序列的dsRNA，采用体外饲喂dsRNA方法，进行了利用RNAi技术沉默麦长管蚜SaUP基因，导致麦长管蚜产生致死效应，并且随着饲喂时间延长，麦长管蚜的死亡率均逐渐增加；显然该dsRNA及其对应的表达盒、重组载体或重组菌等产品在蚜虫防治领域有着重要的应用价值。
2.众所周知的是，RNAi是根据序列特异性进行基因沉默的，而大多数已知蚜虫品种的SaUP基因序列和麦长管蚜SaUP相似性较高（例如只需要有3个21bp的相同序列），即可引起相关基因的沉默。因不同类型蚜虫的同源基因序列相似性较大，所以本发明dsRNA也可广泛用于其它种类蚜虫的防治。
3.对饲喂后蚜虫SaUP基因实时荧光定量PCR研究表明，SaUP基因的表达明显受到抑制；这表明蚜虫SaUP基因的序列可应用于通过植物介导的RNAi技术提高小麦抗蚜性的应用研究，从而为蚜虫的防治和杀灭提供了全新的且安全有效的途径。
附图说明
图1蚜虫SaUP基因和GFP的PCR扩增结果；
图中 M：100 bp marker；1：GFP；2：麦长管蚜。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可市购。
下述实施例中所用蚜虫为麦长管蚜，由中国农业科学院植物保护研究所提供，饲养蚜虫的小麦品种为科农199，将蚜虫接种到小麦幼苗上，放入人工气候箱中（温度（20±2）℃，湿度60%～80%，光周期L∶D=16∶8）进行繁殖。
16318hGFP质粒：“倪志勇，徐兆师，刘丽，李连城，柴岩，陈明，马有志. 小麦转录因子TaDREB6基因的克隆及鉴定. 麦类作物学报，2008, 28：357-363”，公众可从南阳师范学院生命科学与技术学院获得。
质粒提取试剂盒购自Biomega公司，内切酶BamHⅠ、EcoRⅤ及Hiscribe T7体外转录试剂盒购自NEB公司，大肠杆菌菌株DH5α、反转录试剂盒购自北京全式金公司，rTaq DNA聚合酶购自TaKaRa公司，MinElute PCR Cleaning Kit、MinElute Gel Extraction Kit、RNACleaning Kit购自Qiagen公司，各种氨基酸及其它试剂均购自北京拜尔迪公司。
实施例1 蚜虫基因的dsRNA的获得
（1）麦长管蚜总RNA的提取和cDNA的合成
分别取约20头麦长管蚜，按照北京全式金公司的Trizol试剂盒说明书提取总RNA，用RNA Cleaning Kit进行纯化，反转录合成cDNA第一链，操作步骤均参考试剂盒说明书。
（2）引物设计与基因克隆
利用Primer Primer5.0软件设计引物P1-F和P1-R，由北京华大基因公司合成。绿色荧光蛋白基因（GFP）片段从南阳师范学院生命科学与技术学院实验室保存的16318hGFP质粒上扩增，利用Primer Primer5.0软件设计引物 P2-F和P2-R。
P1-F：5’-TAATACGACTCACTATAGGGCAACAGTCAGCGGAAGTAC-3’（下划线后的序列为SEQ ID No：2的第1～19位）；
P1-R：5’-TAATACGACTCACTATAGGGGTCAACATAACGCCCAAC-3’（下划线后的序列为SEQID No：2的第225～242位的反向互补序列）。
P2-F：5’-TAATACGACTCACTATAGGGTGAAGTCAAGTTTGAAGGTG-3’（下划线后的序列为SEQ ID No：4的第1～20位）；
P2-R：5’-TAATACGACTCACTATAGGGTTTTGTTGATAATGGTCTGC-3’（下划线后的序列为SEQ ID No：4的第206～225位的反向互补序列）。
各引物序列中下划线处为T7 RNA聚合酶启动子序列。
PCR反应体系为：5×PCR Buffer 10 μL、dNTP（2.5 mmol·L-1）4 μL、Pfu 0.5 μL，正向引物（10 μmol·L-1）1 μL、反向引物（10 μmol·L-1）1 μL、cDNA/GFP质粒 1 μL，用ddH2O补足至50 μL。
PCR的反应程序为：94℃ 3 min；94℃ 30 s，52℃或55℃ 30 s，72℃ 30s，35个循环；72℃ 10 min；4℃保存。（P1-F/P1-R的退火温度为52℃；P2-F/P2-R的退火温度为55℃）
以麦长管蚜的cDNA为模板，用P1-F/P1-R作为引物进行扩增，得到282 bp PCR产物（含40 bp的T7启动子序列），经过测序，该282 bp PCR产物除去两端T7 RNA聚合酶启动子序列外的序列为SEQ ID No：2（可人工合成）。
以16318hGFP质粒为模板，用P2-F/P2-R作为引物进行扩增，得到265 bp PCR产物（含40 bp的T7启动子序列），经过测序，该265 bp PCR产物除去两端T7 RNA聚合酶启动子序列外的序列为SEQ ID No：4（可人工合成）。
将上述PCR产物进行电泳，结果如图1所示，M：100 bp marker；1：GFP，可以看出得到目的片段；2：麦长管蚜Sitobion avenae。
将上述282 bp PCR产物核苷酸序列去掉T7启动子序列提交到NCBI数据库（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）进行BLAST比对分析，BLAST结果表明，与蚜虫未知功能基因具有95%同源性。
（3）蚜虫SaUP基因和GFP的dsRNA的制备
分别回收由上述2得到的2种PCR产物，测定浓度，作为体外转录dsRNA的模板。dsRNA的体外转录体系为10×Transcription Buffer 4 μL、20×RibonucleotideSolution Mix 2 μL、模板（1μg）X μL、20×HMW Mix 2 μL、T7 RNA Polymerase（500units·μL-1）2 μL，RNase-Free ddH2O补足至40 μL。42 ℃过夜孵育。
反应结束后，取0.5 μL反应产物琼脂糖凝胶电泳检测，加入DNaseI和RNaseA消化残留的模板DNA和单链RNA，用MinElute PCR Cleaning Kit纯化反应产物，操作过程参考试剂盒说明书，用无RNase水溶解dsRNA，分光光度计（波长260 nm）定量，置于-20℃冰箱中保存，分别得到麦长管蚜SaUP和GFP dsRNA。
将蚜虫SaUPdsRNA和GFP dsRNA分别测序，结果如下：
蚜虫SaUPdsRNA为双链RNA，由正义链和反义链组成，其正义链的核苷酸序列为SEQID No：1，其反义链的核苷酸序列为SEQ ID No：1的反向互补序列。SaUP基因的核苷酸序列含有SEQ ID No：2所示序列；
GFP dsRNA为双链RNA，由正义链和反义链组成，其正义链的核苷酸序列为SEQ IDNo：3，其反义链的核苷酸序列为SEQ ID No：3的反向互补序列。GFP dsRNA编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No：4。
当然，也可以直接人工合成SEQ ID No：1所示的麦长管蚜SaUPdsRNA和SEQ ID No：3所示的GFP基因dsRNA用于下述实施例。
实施例2 SaUP dsRNA在抑制蚜虫生长中的应用
（1）蚜虫人工饲料的配制和饲育器的准备
人工饲料配制和饲育器的准备过程参考文献（李彩霞, 高丽锋, 高玲玲, 李润植. 全纯人工营养液饲养蚜虫的研究. 山西农业大学学报, 1997, 17(3): 225-228.）进行，用0.2 μm的细菌过滤器过滤人工饲料，分装到2.0 mL灭菌的离心管保存于-20℃的冰箱中，避免反复冻融。
（2）dsRNA（SaUPdsRNA）在抑制蚜虫生长中的应用
蚜虫饲喂方法参照如下文献中记载：纠敏, 刘树生. 利用人工饲料饲养蚜虫的技术. 华东昆虫学报, 2004, 13(2): 102-109.。
麦长管蚜SaUP dsRNA喂养组：每个蚜虫饲育器中分别放入20头3龄麦长管蚜若蚜，按照每100μL人工饲料中依次分别加入0和1000ng的麦长管蚜SaUPdsRNA饲喂蚜虫；
麦长管蚜dsGFP组：每个蚜虫饲育器中分别放入20头3龄麦长管蚜若蚜，按照每100μL人工饲料中依次分别加入0和1000 ng的GFP dsRNA饲喂蚜虫；
上述各组设置3个重复，每两天统计各饲育器中蚜虫的存活数，并更换新的饲料和对应的dsRNA，置于人工气候箱（温度（20±2）℃，湿度60%～80%，光周期L∶D=16∶8）。使用Excel 2007软件对蚜虫死亡率进行统计学分析，计算每种处理的平均值与方差，并进行显著性差异的分析（t-test，n=3，P<0.01或0.05）。
统计各组每个饲育器中存活蚜虫的数目，计算死亡率，结果如表1所示。
表1为麦长管蚜SaUPdsRNA喂养组和麦长管蚜dsGFP组死亡率
。
从表1可以看出，麦长管蚜的死亡率均随着饲喂SaUP dsRNA的时间增加，麦长管蚜的平均死亡率随之增加，10 ng·μL-1 SaUPdsRNA饲喂2天、4天、6天和8天后，麦长管蚜的平均死亡率为35%、46.67%、65%和71.67%，其中饲喂4天、6天和8天后的处理与对照组（0 ng/μL）相比均存在显著性差异（P<0.01），饲喂GFP dsRNA的试验组死亡率与对照组（0 ng/μL）相比则没有显著性的差异。
（3）dsRNA（SaUPdsRNA）抑制蚜虫SaUP基因的表达
利用Primer Primer5.0软件设计扩增SaUP基因的引物P3-F和P3-R，扩增片段大小为242 bp，合成内参基因（ACTIN）引物P4-F和P4-R。
P3-F：5’-CAACAGTCAGCGGAAGTAC-3’（SEQ ID No：2的第1～19位）；
P3-R：5’-GTCAACATAACGCCCAAC-3’（SEQ ID No：2的第225～242位的反向互补序列）。
P4-F：5’-CCGAAAAGCTGTCATAATGAAGACC-3’；
P4-R：5’-GGTGAAACCTTGTCTACTGTTACATCTTG-3’。
收集上述步骤2中各组10 ng/μl dsRNAs饲喂后存活的麦长管蚜（2、4、6和8 d），提取蚜虫的RNA，反转录成cDNA稀释100、101、102、103、104、105倍，作为荧光定量PCR的模板，以P3-F/P3-R作为引物进行相对定量RT-PCR分析。内参引物为P4-F/P4-R。
实时荧光定量PCR体系为：正向引物（10 μmol·L-1）0.5 μL、反向引物（10 μmol·L-1）0.5 μL、2×TransStart TM Green qPCR SuperMix 12.5 μL、Passive Reference Dye0.5 μL、模板cDNA 1 μL，用ddH2O至25 μL。
PCR循环程序为95℃ 30 s，95℃ 5 s，52℃或57℃ 15 s，72℃ 10 s，40个循环，每个样本3个重复。（P3-F/P3-R的退火温度为52℃；P4-F/P4-R的退火温度为57℃）
最终结果的计算采用2-△△Ct法（Ct表示循环数）进行计算，即△△Ct=（Ct(SaUP)-Ct(actin)）试验组-（Ct(SaUP)-Ct(actin)）对照组，使用Excel 2007软件进行统计学分析，计算每种处理的平均值与方差，并进行显著性差异的分析（t-test，n=3，P<0.01或0.05）。
统计在饲喂麦长管蚜SaUP dsRNA 2、4、6和8 d后，各组蚜虫体内SaUP表达量，结果如表2所示。
表2为饲喂SaUPdsRNA 和GFP dsRNA后麦长管蚜SaUP基因相对表达量
。
可以看出，麦长管蚜SaUP在4、6和8 d的表达量，与对照（0天的表达量）相比，依次降低了27%、61%和72%，在统计学上表现为差异显著（P<0.05或P<0.01）。饲喂GFPdsRNA的蚜虫体内SaUP表达水平则没有显著性的变化，进一步说明通过饲喂SaUPdsRNA能够在麦长管蚜体内引起SaUP基因的RNAi效应，致使蚜虫SaUP基因表达量明显降低甚至沉默，直至导致蚜虫死亡。
SEQUENCE LISTING
<110> 南阳师范学院
<120> 蚜虫基因的dsRNA及其在降低蚜虫存活率中的应用
<130> /
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 242
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 1
caacagucag cggaaguacc ggaaacgaau guacugcagc aaaacgucgu ccaggacgac 60
gaagggauua aaaucaacgu gucugccauu gccgccaggu ucaucaaaga uuacgugacg 120
ccaacauuau gcucauacuc gccaggauuu ugugccaagc accaacuaga gagcagagau 180
auaaaaagcu auuuggccac ggccggaaca uuguucgcgg gaguguuggg cguuauguug 240
ac 242
<210> 2
<211> 242
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
caacagtcag cggaagtacc ggaaacgaat gtactgcagc aaaacgtcgt ccaggacgac 60
gaagggatta aaatcaacgt gtctgccatt gccgccaggt tcatcaaaga ttacgtgacg 120
ccaacattat gctcatactc gccaggattt tgtgccaagc accaactaga gagcagagat 180
ataaaaagct atttggccac ggccggaaca ttgttcgcgg gagtgttggg cgttatgttg 240
ac 242
<210> 3
<211> 225
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 3
ugaagucaag uuugaaggug auacccuugu uaauagaauc gaguuaaaag guauugauuu 60
uaaagaagau ggaaacauuc uuggacacaa aauggaauac aacuauaacu cacauaaugu 120
auacaucaug ggagacaaac caaagaaugg caucaaaguu aacuucaaaa uuagacacaa 180
cauuaaagau ggaagcguuc aauuagcaga ccauuaucaa caaaa 225
<210> 4
<211> 225
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tgaagtcaag tttgaaggtg atacccttgt taatagaatc gagttaaaag gtattgattt 60
taaagaagat ggaaacattc ttggacacaa aatggaatac aactataact cacataatgt 120
atacatcatg ggagacaaac caaagaatgg catcaaagtt aacttcaaaa ttagacacaa 180
cattaaagat ggaagcgttc aattagcaga ccattatcaa caaaa 225
<210> 5
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
taatacgact cactataggg caacagtcag cggaagtac 39
<210> 6
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
taatacgact cactataggg gtcaacataa cgcccaac 38
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
taatacgact cactataggg ttttgttgat aatggtctgc 40
<210> 9
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
caacagtcag cggaagtac 19
<210> 10
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gtcaacataa cgcccaac 18
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ccgaaaagct gtcataatga agacc 25
<210> 12
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ggtgaaacct tgtctactgt tacatcttg 29
Claims (10)
1.一种蚜虫的dsRNA，是由SEQ ID No：1所示序列的核苷酸和其反向互补序列的核苷酸组成的双链RNA。
2. 一种编码权利要求1所述dsRNA的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。
3.一种含有权利要求2所述DNA分子的表达盒。
4.一种含有权利要求2所述DNA分子的重组载体。
5.一种含有权利要求2所述DNA分子的重组菌。
6.权利要求1所述蚜虫的dsRNA、或权利要求2所述的DNA分子、或权利要求3所述的表达盒、或权利要求4所述的重组载体或权利要求5所述的重组菌在如下（1）～（3）任一项中的应用：
（1）防治麦长管蚜或制备防治麦长管蚜的产品；
（2）降低麦长管蚜存活率或制备降低麦长管蚜存活率的产品；
（3）抑制麦长管蚜SaUP基因表达或制备抑制麦长管蚜SaUP基因表达的产品。
7.依据权利要求6所述的应用，其特征在于：将权利要求1所述dsRNA导入麦长管蚜，从而实现防治麦长管蚜、降低麦长管蚜存活率或抑制麦长管蚜SaUP基因表达。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述导入的方式为饲喂。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述饲喂为：将所述dsRNA混合于液体饲料中，得到混合液，用所述混合液饲喂麦长管蚜；所述dsRNA在所述混合液中的终浓度为10ng/μL；所述饲喂持续的时间为2～8天。
10.活性成分为如下A～C中任一种的产品：
A、权利要求1所述dsRNA；
B、权利要求2所述DNA分子；
C、权利要求3所述表达盒、权利要求4所述重组载体或权利要求5所述重组菌；
所述产品具有如下（1）～（3）功能中的至少一种：
（1）防治麦长管蚜；
（2）降低麦长管蚜存活率；
（3）抑制麦长管蚜SaUP基因表达。
Priority Applications (1)
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