CN105255892A - 蚜虫基因的dsRNA及其在降低蚜虫存活率中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种蚜虫基因的dsRNA及其在降低蚜虫存活率中的应用。所述蚜虫基因的dsRNA具体为由SEQ？ID？No：1所示序列的核苷酸和其反向互补序列的核苷酸组成的双链RNA。所述应用为将所述dsRNA导入蚜虫，从而实现防治蚜虫、降低蚜虫存活率或抑制蚜虫<i>SaUP</i>基因表达。本发明采用体外饲喂dsRNA方法，利用RNAi技术沉默麦长管蚜<i>SaUP</i>基因，导致麦长管蚜产生致死效应。对饲喂后蚜虫<i>SaUP</i>基因实时荧光定量PCR研究表明，<i>SaUP</i>基因的表达明显受到抑制。表明蚜虫<i>SaUP</i>基因的序列可应用于通过植物介导的RNAi技术提高小麦抗蚜性的研究。

Description

蚜虫基因的dsRNA及其在降低蚜虫存活率中的应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种蚜虫基因的dsRNA及其在降低蚜虫存活率中的应用。

背景技术

蚜虫是危害作物生产的主要害虫之一，近年来全球气候变暖、耕作制度变化等因素使蚜虫的繁殖能力和适应性显著增强，其危害日趋严重。据统计，2010～2011年间我国小麦、玉米、棉花、油菜、大豆等主要作物的蚜虫危害面积分别占当年种植面积的62.5%、14%、90%、32%和23%。以麦蚜为例，麦蚜以成若蚜聚集在小麦叶部、茎部、穗部等，吸食汁液造成叶片不规则皱缩、卷曲、失绿，严重时造成植株死亡。麦蚜分泌的蜜露附着在植株表面，降低植株的光合作用，并易诱发煤烟病等。同时，麦蚜还是黄矮病毒重要的传播载体，引起小麦黄矮病流行。据全国农作物病虫监测网预报，2013年我国麦蚜危害面积高达2.5亿亩，其中河南省麦蚜危害面积为5500万亩。目前，蚜虫防治以喷洒农药为主，但大量使用农药，不仅对人畜有害，而且造成了严重的环境污染。而培育抗虫作物品种是防止蚜虫为害的最有效途径之一，但由于农作物现有种质资源中缺乏有效的抗蚜基因，且抗性机制不明确，常规抗虫育种难以奏效。因此，利用转基因技术培育抗蚜新种质，对于保障我国粮食安全和环境安全具有重要意义。

植物介导的RNAi（RNA干扰）技术能特异抑制昆虫特定基因的表达，使昆虫的生长发育受阻或致死，进而有效控制害虫危害，已成为农作物抗虫基因工程研究的热点之一。RNAi现象是由dsRNA（double-strandedRNA）介导的一种序列特异性转录后基因沉默机制，dsRNA进入生物体后被宿主细胞中的Dicer酶切割成21～23nt的siRNA（smallinterferingRNA）；siRNA在RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，反义siRNA与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC），继之RISC以序列互补的方式与靶mRNA结合并使之降解，造成靶标基因表达量下降。利用dsRNA体外饲喂或注射来筛选RNA靶标基因，导致靶标基因表达和沉默，已经广泛应用于昆虫生长发育关键基因的鉴定和功能分析。孟山都公司通过植物介导的昆虫肠道特异基因RNAi技术成功获得了抗玉米根螟的转基因玉米，有效缓解了长期应用Bt转基因玉米诱发昆虫产生抗性等问题，目前已完成生产性试验。棉铃虫肠道中特异P450基因可提高棉铃虫幼虫对棉花次生代谢物质和棉酚的耐受性，试验表明，利用表达棉铃虫P450基因dsRNA的转基因烟草和棉花叶片饲喂棉铃虫幼虫，可导致幼虫体内P450基因的表达量下降，同时幼虫发育受阻，表现出抗棉铃虫性能。近年来，RNAi技术在蚜虫防治方面也展示出很好的应用前景。在烟草和拟南芥中表达蚜虫Mphb基因或丝氨酸蛋白酶MySP基因的dsRNA均可显著降低蚜虫的繁殖率，进而减轻蚜虫危害。

鉴于蚜虫对农业生产造成的巨大损失，且农作物现有种质资源中缺乏有效的抗蚜虫基因，常规抗蚜虫育种难以奏效；挖掘和鉴定新型抗蚜基因或蚜虫dsRNA，利用转基因技术培育抗蚜新种质，对于保障我国粮食安全和环境安全具有重要的意义。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种蚜虫基因的dsRNA，可利用RNAi技术沉默蚜虫SaUP基因，导致蚜虫产生致死效应。

为解决以上问题，本发明通过以下技术方案实现：

设计一种蚜虫基因的dsRNA，具体为由SEQIDNo：1所示序列的核苷酸和其反向互补序列的核苷酸组成的双链RNA。对应的，对该序列经简单缺失、修饰等变换后，使其能达到基本相同抑制效果的核苷酸序列，也应当是与该序列实质上相同的发明。

编码所述dsRNA的DNA分子也属于本发明的保护范围，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQIDNo：2所示。

含有所述DNA分子的表达盒、重组载体或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述dsRNA、或所述DNA分子、或所述表达盒、重组载体或重组菌，在如下（1）～（3）任一项中的应用也属于本发明的保护范围：

（1）防治蚜虫或制备防治蚜虫的产品；

（2）降低蚜虫存活率或制备降低蚜虫存活率的产品；

（3）抑制蚜虫SaUP基因表达或制备抑制蚜虫SaUP基因表达的产品。

所述应用为将所述dsRNA导入蚜虫，从而实现防治蚜虫、降低蚜虫存活率或抑制蚜虫SaUP基因表达。

在本发明中，所述导入的方式具体为饲喂。

更加具体的，所述饲喂方法为：将所述dsRNA混合于液体饲料中，得到混合液，用所述混合液饲喂蚜虫；所述dsRNA在所述混合液中的终浓度优选为10ng/μL；所述饲喂持续的时间为2天以上，优选2～8天。

活性成分为如下A～C中任一种的产品也属于本发明的保护范围：

A、所述dsRNA；

B、所述DNA分子；

C、所述表达盒、重组载体或重组菌；

所述产品具有如下（1）～（3）功能中的至少一种：

（1）防治蚜虫；

（2）降低蚜虫存活率；

（3）抑制蚜虫SaUP基因表达。

在本发明中，所述蚜虫可为麦蚜，所述麦蚜为麦长管蚜，具体为3龄麦长管蚜。

在本发明中，所述蚜虫SaUP基因的核苷酸含有如SEQIDNo：2所示序列。

本发明具有的积极有益的技术效果：

1.实验证明，本发明得到了麦长管蚜SaUPcDNA序列的dsRNA，采用体外饲喂dsRNA方法，进行了利用RNAi技术沉默麦长管蚜SaUP基因，导致麦长管蚜产生致死效应，并且随着饲喂时间延长，麦长管蚜的死亡率均逐渐增加；显然该dsRNA及其对应的表达盒、重组载体或重组菌等产品在蚜虫防治领域有着重要的应用价值。

2.众所周知的是，RNAi是根据序列特异性进行基因沉默的，而大多数已知蚜虫品种的SaUP基因序列和麦长管蚜SaUP相似性较高（例如只需要有3个21bp的相同序列），即可引起相关基因的沉默。因不同类型蚜虫的同源基因序列相似性较大，所以本发明dsRNA也可广泛用于其它种类蚜虫的防治。

3.对饲喂后蚜虫SaUP基因实时荧光定量PCR研究表明，SaUP基因的表达明显受到抑制；这表明蚜虫SaUP基因的序列可应用于通过植物介导的RNAi技术提高小麦抗蚜性的应用研究，从而为蚜虫的防治和杀灭提供了全新的且安全有效的途径。

附图说明

图1蚜虫SaUP基因和GFP的PCR扩增结果；

图中M：100bpmarker；1：GFP；2：麦长管蚜。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可市购。

下述实施例中所用蚜虫为麦长管蚜，由中国农业科学院植物保护研究所提供，饲养蚜虫的小麦品种为科农199，将蚜虫接种到小麦幼苗上，放入人工气候箱中（温度（20±2）℃，湿度60%～80%，光周期L∶D=16∶8）进行繁殖。

16318hGFP质粒：“倪志勇，徐兆师，刘丽，李连城，柴岩，陈明，马有志.小麦转录因子TaDREB6基因的克隆及鉴定.麦类作物学报，2008,28：357-363”，公众可从南阳师范学院生命科学与技术学院获得。

质粒提取试剂盒购自Biomega公司，内切酶BamHⅠ、EcoRⅤ及HiscribeT7体外转录试剂盒购自NEB公司，大肠杆菌菌株DH5α、反转录试剂盒购自北京全式金公司，rTaqDNA聚合酶购自TaKaRa公司，MinElutePCRCleaningKit、MinEluteGelExtractionKit、RNACleaningKit购自Qiagen公司，各种氨基酸及其它试剂均购自北京拜尔迪公司。

实施例1蚜虫基因的dsRNA的获得

（1）麦长管蚜总RNA的提取和cDNA的合成

分别取约20头麦长管蚜，按照北京全式金公司的Trizol试剂盒说明书提取总RNA，用RNACleaningKit进行纯化，反转录合成cDNA第一链，操作步骤均参考试剂盒说明书。

（2）引物设计与基因克隆

利用PrimerPrimer5.0软件设计引物P1-F和P1-R，由北京华大基因公司合成。绿色荧光蛋白基因（GFP）片段从南阳师范学院生命科学与技术学院实验室保存的16318hGFP质粒上扩增，利用PrimerPrimer5.0软件设计引物P2-F和P2-R。

P1-F：5’-TAATACGACTCACTATAGGGCAACAGTCAGCGGAAGTAC-3’（下划线后的序列为SEQIDNo：2的第1～19位）；

P1-R：5’-TAATACGACTCACTATAGGGGTCAACATAACGCCCAAC-3’（下划线后的序列为SEQIDNo：2的第225～242位的反向互补序列）。

P2-F：5’-TAATACGACTCACTATAGGGTGAAGTCAAGTTTGAAGGTG-3’（下划线后的序列为SEQIDNo：4的第1～20位）；

P2-R：5’-TAATACGACTCACTATAGGGTTTTGTTGATAATGGTCTGC-3’（下划线后的序列为SEQIDNo：4的第206～225位的反向互补序列）。

各引物序列中下划线处为T7RNA聚合酶启动子序列。

PCR反应体系为：5×PCRBuffer10μL、dNTP（2.5mmol·L^-1）4μL、Pfu0.5μL，正向引物（10μmol·L^-1）1μL、反向引物（10μmol·L^-1）1μL、cDNA/GFP质粒1μL，用ddH₂O补足至50μL。

PCR的反应程序为：94℃3min；94℃30s，52℃或55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min；4℃保存。（P1-F/P1-R的退火温度为52℃；P2-F/P2-R的退火温度为55℃）

以麦长管蚜的cDNA为模板，用P1-F/P1-R作为引物进行扩增，得到282bpPCR产物（含40bp的T7启动子序列），经过测序，该282bpPCR产物除去两端T7RNA聚合酶启动子序列外的序列为SEQIDNo：2（可人工合成）。

以16318hGFP质粒为模板，用P2-F/P2-R作为引物进行扩增，得到265bpPCR产物（含40bp的T7启动子序列），经过测序，该265bpPCR产物除去两端T7RNA聚合酶启动子序列外的序列为SEQIDNo：4（可人工合成）。

将上述PCR产物进行电泳，结果如图1所示，M：100bpmarker；1：GFP，可以看出得到目的片段；2：麦长管蚜Sitobionavenae。

将上述282bpPCR产物核苷酸序列去掉T7启动子序列提交到NCBI数据库（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）进行BLAST比对分析，BLAST结果表明，与蚜虫未知功能基因具有95%同源性。

（3）蚜虫SaUP基因和GFP的dsRNA的制备

分别回收由上述2得到的2种PCR产物，测定浓度，作为体外转录dsRNA的模板。dsRNA的体外转录体系为10×TranscriptionBuffer4μL、20×RibonucleotideSolutionMix2μL、模板（1μg）XμL、20×HMWMix2μL、T7RNAPolymerase（500units·μL^-1）2μL，RNase-FreeddH₂O补足至40μL。42℃过夜孵育。

反应结束后，取0.5μL反应产物琼脂糖凝胶电泳检测，加入DNaseI和RNaseA消化残留的模板DNA和单链RNA，用MinElutePCRCleaningKit纯化反应产物，操作过程参考试剂盒说明书，用无RNase水溶解dsRNA，分光光度计（波长260nm）定量，置于-20℃冰箱中保存，分别得到麦长管蚜SaUP和GFPdsRNA。

将蚜虫SaUPdsRNA和GFPdsRNA分别测序，结果如下：

蚜虫SaUPdsRNA为双链RNA，由正义链和反义链组成，其正义链的核苷酸序列为SEQIDNo：1，其反义链的核苷酸序列为SEQIDNo：1的反向互补序列。SaUP基因的核苷酸序列含有SEQIDNo：2所示序列；

GFPdsRNA为双链RNA，由正义链和反义链组成，其正义链的核苷酸序列为SEQIDNo：3，其反义链的核苷酸序列为SEQIDNo：3的反向互补序列。GFPdsRNA编码基因的核苷酸序列为SEQIDNo：4。

当然，也可以直接人工合成SEQIDNo：1所示的麦长管蚜SaUPdsRNA和SEQIDNo：3所示的GFP基因dsRNA用于下述实施例。

实施例2SaUPdsRNA在抑制蚜虫生长中的应用

（1）蚜虫人工饲料的配制和饲育器的准备

人工饲料配制和饲育器的准备过程参考文献（李彩霞,高丽锋,高玲玲,李润植.全纯人工营养液饲养蚜虫的研究.山西农业大学学报,1997,17(3):225-228.）进行，用0.2μm的细菌过滤器过滤人工饲料，分装到2.0mL灭菌的离心管保存于-20℃的冰箱中，避免反复冻融。

（2）dsRNA（SaUPdsRNA）在抑制蚜虫生长中的应用

蚜虫饲喂方法参照如下文献中记载：纠敏,刘树生.利用人工饲料饲养蚜虫的技术.华东昆虫学报,2004,13(2):102-109.。

麦长管蚜SaUPdsRNA喂养组：每个蚜虫饲育器中分别放入20头3龄麦长管蚜若蚜，按照每100μL人工饲料中依次分别加入0和1000ng的麦长管蚜SaUPdsRNA饲喂蚜虫；

麦长管蚜dsGFP组：每个蚜虫饲育器中分别放入20头3龄麦长管蚜若蚜，按照每100μL人工饲料中依次分别加入0和1000ng的GFPdsRNA饲喂蚜虫；

上述各组设置3个重复，每两天统计各饲育器中蚜虫的存活数，并更换新的饲料和对应的dsRNA，置于人工气候箱（温度（20±2）℃，湿度60%～80%，光周期L∶D=16∶8）。使用Excel2007软件对蚜虫死亡率进行统计学分析，计算每种处理的平均值与方差，并进行显著性差异的分析（t-test，n=3，P<0.01或0.05）。

统计各组每个饲育器中存活蚜虫的数目，计算死亡率，结果如表1所示。

表1为麦长管蚜SaUPdsRNA喂养组和麦长管蚜dsGFP组死亡率

。

从表1可以看出，麦长管蚜的死亡率均随着饲喂SaUPdsRNA的时间增加，麦长管蚜的平均死亡率随之增加，10ng·μL^-1 SaUPdsRNA饲喂2天、4天、6天和8天后，麦长管蚜的平均死亡率为35%、46.67%、65%和71.67%，其中饲喂4天、6天和8天后的处理与对照组（0ng/μL）相比均存在显著性差异（P<0.01），饲喂GFPdsRNA的试验组死亡率与对照组（0ng/μL）相比则没有显著性的差异。

（3）dsRNA（SaUPdsRNA）抑制蚜虫SaUP基因的表达

利用PrimerPrimer5.0软件设计扩增SaUP基因的引物P3-F和P3-R，扩增片段大小为242bp，合成内参基因（ACTIN）引物P4-F和P4-R。

P3-F：5’-CAACAGTCAGCGGAAGTAC-3’（SEQIDNo：2的第1～19位）；

P3-R：5’-GTCAACATAACGCCCAAC-3’（SEQIDNo：2的第225～242位的反向互补序列）。

P4-F：5’-CCGAAAAGCTGTCATAATGAAGACC-3’；

P4-R：5’-GGTGAAACCTTGTCTACTGTTACATCTTG-3’。

收集上述步骤2中各组10ng/μldsRNAs饲喂后存活的麦长管蚜（2、4、6和8d），提取蚜虫的RNA，反转录成cDNA稀释10⁰、10¹、10²、10³、10⁴、10⁵倍，作为荧光定量PCR的模板，以P3-F/P3-R作为引物进行相对定量RT-PCR分析。内参引物为P4-F/P4-R。

实时荧光定量PCR体系为：正向引物（10μmol·L^-1）0.5μL、反向引物（10μmol·L^-1）0.5μL、2×TransStart _TMGreenqPCRSuperMix12.5μL、PassiveReferenceDye0.5μL、模板cDNA1μL，用ddH₂O至25μL。

PCR循环程序为95℃30s，95℃5s，52℃或57℃15s，72℃10s，40个循环，每个样本3个重复。（P3-F/P3-R的退火温度为52℃；P4-F/P4-R的退火温度为57℃）

最终结果的计算采用2^-△△Ct法（Ct表示循环数）进行计算，即△△Ct=（Ct(SaUP)-Ct(actin)）_试验组-（Ct(SaUP)-Ct(actin)）_对照组，使用Excel2007软件进行统计学分析，计算每种处理的平均值与方差，并进行显著性差异的分析（t-test，n=3，P<0.01或0.05）。

统计在饲喂麦长管蚜SaUPdsRNA2、4、6和8d后，各组蚜虫体内SaUP表达量，结果如表2所示。

表2为饲喂SaUPdsRNA和GFPdsRNA后麦长管蚜SaUP基因相对表达量

。

可以看出，麦长管蚜SaUP在4、6和8d的表达量，与对照（0天的表达量）相比，依次降低了27%、61%和72%，在统计学上表现为差异显著（P<0.05或P<0.01）。饲喂GFPdsRNA的蚜虫体内SaUP表达水平则没有显著性的变化，进一步说明通过饲喂SaUPdsRNA能够在麦长管蚜体内引起SaUP基因的RNAi效应，致使蚜虫SaUP基因表达量明显降低甚至沉默，直至导致蚜虫死亡。

SEQUENCELISTING

<110>南阳师范学院

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Claims (8)

1.一种蚜虫基因的dsRNA，为由SEQIDNo：1所示序列的核苷酸和其反向互补序列的核苷酸组成的双链RNA。

2.编码权利要求1所述dsRNA的DNA分子，其核苷酸序列如SEQIDNo：2所示。

3.含有权利要求2所述DNA分子的表达盒、重组载体或重组菌。

4.权利要求1所述dsRNA、或权利要求2所述DNA分子、或权利要求3所述表达盒、重组载体或重组菌，在如下（1）～（3）任一项中的应用：

（1）防治蚜虫或制备防治蚜虫的产品；

（2）降低蚜虫存活率或制备降低蚜虫存活率的产品；

（3）抑制蚜虫SaUP基因表达或制备抑制蚜虫SaUP基因表达的产品。

5.权利要求4所述应用为将权利要求1所述dsRNA导入蚜虫，从而实现防治蚜虫、降低蚜虫存活率或抑制蚜虫SaUP基因表达。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述导入的方式为饲喂。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述饲喂为：将所述dsRNA混合于液体饲料中，得到混合液，用所述混合液饲喂蚜虫；所述dsRNA在所述混合液中的终浓度为10ng/μL；所述饲喂持续的时间为2～8天。

8.活性成分为如下A～C中任一种的产品：

A、权利要求1所述dsRNA；

B、权利要求2所述DNA分子；

C、权利要求3所述表达盒、重组载体或重组菌；

所述产品具有如下（1）～（3）功能中的至少一种：

（1）防治蚜虫；

（2）降低蚜虫存活率；

（3）抑制蚜虫SaUP基因表达。