CN114540350A - 靶向蚜虫AK、SOD和CHS基因并可致死蚜虫的dsRNA药剂的筛选、制备及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种靶向蚜虫AK、SOD和CHS基因并可致死蚜虫的dsRNA药剂的制备、筛选及其应用，所述蚜虫AK、SOD和CHS基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5，所述靶向蚜虫AK、SOD和CHS基因并可致死蚜虫的dsRNA的核苷酸序列为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6，本发明开发了一种可筛选高效致死蚜虫的dsRNA的“饲养浸泡法”。本发明还提供了一种dsRNA复配药剂的制备方法，该药剂通过诱导蚜虫靶标基因AK、SOD和CHS的沉默，导致橘蚜出现高致死率，从而实现对柑橘蚜虫的防治，减少柑橘衰退病的传播。

Description

靶向蚜虫AK、SOD和CHS基因并可致死蚜虫的dsRNA药剂的筛 选、制备及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及靶向蚜虫AK、SOD和CHS基因并可致死蚜虫的dsRNA药剂的筛选、制备方法及其应用。

背景技术

柑橘作为世界第一大类经济果树在世界各地都广泛种植。我国柑橘种植面积一直在不断扩大，自2007年以来，我国柑橘种植面积和产量双双位列世界第一。但是柑橘极易遭受柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)的侵袭，其被认为是柑橘最具破坏性的病毒病原体，可引起柑橘的根茎部凹陷，嫩梢叶片枯萎、卷曲和变黄。CTV已在全球导致数百万棵柑橘树死亡，造成巨大的经济损失。CTV可由多种蚜虫传播，如褐色橘蚜、棉蚜、豌豆蚜等。蚜虫通过在柑橘衰退病病株上取食来获取CTV，然后携带病毒的有翅成虫通过迁飞危害新植株并传播柑橘衰退病。蚜虫繁殖速度快，繁殖数量大，携毒有翅蚜虫迁飞距离远，因此蚜虫及其传播的CTV对柑橘产业威胁巨大。

双链核糖核酸(Double stranded RNA,dsRNA)可通过RNA干扰(RNAinterference,RNAi)效应，诱导同源mRNA发生特异性降解，从而特异诱导靶标基因的沉默。RNAi技术具有设计简单、沉默效率高、特异性强、绿色环保等特点，这项技术在农业病虫害的防治中的得到了大量的试验应用。

现有技术中递送dsRNA到昆虫体内的方式主要包括饲喂法、注射法和表皮渗透法。饲喂法操作简单，易于实现。但是在取食过程中dsRNA容易降解，一般需要大量dsRNA才能激发RNAi效应，容易受外界条件干扰，造成试验误差，影响数据准确性；注射法干扰效果最为直接和有效，但比较费时，同时对实验操作和仪器要求很高，对于体型较小的昆虫注射比较困难；浸泡法操作方便，节省劳力，但会受到昆虫外体壁的影响而导致干扰效率不稳定。

“RNAi杀虫农药”是一种体外制备和施用的，能够诱导昆虫生长发育相关基因沉默，通过使昆虫致死达到防治目的的dsRNA或者siRNA产品，有非常好的应用前景。现有技术控制柑橘蚜虫主要依赖化学农药等传统防治手段，但产业中化学农药乱用滥用的问题突出，蚜虫抗药性不断增长，环境农药残留超标时有报道，严重威胁人类、环境、产业的健康发展。因此，发展绿色、便捷、安全、高效的新型防控技术迫在眉睫。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明提供蚜虫生长发育相关基因，所述基因的dsRNA可特异诱导靶标基因进行沉默，并对蚜虫产生致死效应，所述的蚜虫生长发育相关基因为橘蚜AK基因或橘蚜SOD基因或橘蚜CHS基因中的任意一种，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5所示。

本发明所述蚜虫AK、SOD和CHS生长发育相关基因的dsRNA为橘蚜AK基因的dsRNA或橘蚜SOD基因的dsRNA或橘蚜CHS基因的dsRNA中的任意一种，其核苷酸序列分别如SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6所示。

本发明提供一种蚜虫生长发育相关基因AK、SOD和CHS的dsRNA的表达载体。

其中，所述dsRNA的表达载体的构建方法，包括如下步骤：

(1)从橘蚜细胞中提取蚜虫RNA，然后反转录成cDNA；

(2)以步骤(1)所获得的cDNA产物为模板，设计用于扩增蚜虫AK、SOD和CHS基因的dsRNA的引物对，分别以蚜虫AK基因，SOD基因和CHS基因的dsRNA序列的上下游引物进行PCR扩增；

(3)对PCR扩增产物进行切胶回收纯化与L4440载体过夜连接，得到表达载体，然后转入重组菌。

其中，用于扩增蚜虫AK、SOD和CHS基因的dsRNA的引物对为AK-F、AK-R，SOD-F、SOD-R，CHS-F、CHS-R，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12。

本发明所述蚜虫AK、SOD和CHS基因的dsRNA的诱导表达具体方法为：取出含有dsRNA表达载体的重组菌，加入到LB液体培养基中诱导后提取总RNA，提取后消化处理去除DNA和单链RNA，得到纯净的dsRNA。

本发明所述蚜虫AK、SOD和CHS基因的dsRNA的递送方法为饲养浸泡法。

其中，所述dsRNA的递送方法，所述饲养浸泡法的具体步骤如下：

(1)将培养皿放入DEPC水中浸泡取出后冲洗；

(2)将冲洗干净的培养皿烘干，将黄色滤纸灭菌后烘干放到消毒柜存储；

(3)裁剪灭菌黄色滤纸放入培养皿底部保证大小一致；

(4)选取蚜虫寄主叶片，对植物叶背注射并涂抹含有dsRNA的蚜虫人工饲养液并放于滤纸上。

(5)在培养皿的滤纸上中滴加含有dsRNA的蚜虫人工饲养液，再把蚜虫放置在寄主叶片上，然后把培养皿进行密封，放于培养箱中，每天更换滤纸、溶液和叶片。

其中，饲养浸泡法步骤(2)所述蚜虫人工饲养液配置方法具体如下：

(1)使用DEPC水溶解蔗糖作为材料A；

(2)取蚜虫寄主叶片，研磨破碎后离心取上清液，过滤除菌得到植物的汁液作为材料B；

(3)使用加热的DEPC水溶解抗生素药物，溶解后的液体作为材料C；

(4)将材料A、B、C以及引诱剂进行混合，加入DEPC水后震荡混匀，调节pH得到混合液。

作为优选，步骤(3)所述抗生素药物为孢氨苄或青霉素钠其中一种。

其中，步骤(4)所述引诱剂由40～60μL乙醇溶液、500～700μL蔗糖溶液和100～200μL冰醋酸溶液组成。

本发明所述的蚜虫AK、SOD和CHS基因的dsRNA或其表达载体在致死蚜虫或者制备致死蚜虫杀虫剂中的应用。

其中，致死蚜虫杀虫剂包括复配药剂ds-AK溶液、0.05～0.1％Triton X100和1-5U/μL的RNase抑制剂。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、本发明首次克隆到全新的双链核糖核酸dsRNA ds-AK、ds-SOD和ds-CHS，其中ds-AK效果最为显著，该dsRNA通过RNAi诱导标靶基因的沉默，从而致死蚜虫，实验室条件下施用400ng/μL ds-AK三天后，其效果可以达到基因沉默效率为51.82％，致死率为77.8％，四天后的致死率可以达到91.1±3.8％，在柑橘大棚中施用八天后，400ng/μL与800ng/μL的ds-AK复配药剂，蚜虫致死率分别为56.88％和69.38％，具有一定的杀虫效果，有望部分替代化学农药，减少化学农药对环境的污染。

2、本发明通过特异性靶向蚜虫AK基因的高致死率dsRNA触发基因沉默，抑制基因表达，干扰蚜虫正常能量代谢、肌肉收缩及生长发育等过程，进而实现对柑橘蚜虫的防治，从而减少柑橘衰退病的传播，本研究为蚜虫的dsRNA药剂防治提供了新靶点，并为进一步的相关开发和研究提供新的防治策略与手段。

3、不同方式递送dsRNA对昆虫生长发育相关基因干扰效果差异性大，同时由于昆虫的肠道核酸酶、肠道pH、dsRNA剪切形式等的不同，会影响dsRNA对昆虫的RNAi效应，从而产生差异。所以合适的沉默靶点和dsRNA递送方式尤为重要。本发明通过试验对比，筛选出一种新型饲养浸泡法来递送ds-AK，与现有技术相比，本发明所用方法的dsRNA递送方法更加高效，合成的dsRNA药剂成本低、利用率高、施药剂量精确，更加的科学合理。

附图说明

图1本发明靶向蚜虫AK、SOD和CHS基因并可致死蚜虫的dsRNA核苷酸序列的克隆和PCR验证。

图2本发明所述的重组大肠杆菌中dsRNA的诱导表达；A为诱导含有L4440-AK的HT115表达(+：添加IPTG-：无添加IPTG)，Lane M：DL5000标记；B为诱导含有L4440-SOD的HT115表达(+：添加IPTG-：无添加IPTG)，Lane M：DL5000标记；C为诱导含有L4440-CHS的HT115表达(+：添加IPTG-：无添加IPTG)，Lane M：DL5000标记。

图3本发明小RNA药剂处理后蚜虫形态。

图4本发明饲喂溶液与传统人工蚜虫饲喂液培养皿污染情况对比。

图5本发明饲喂浸泡法递送dsRNA示意图。

图6传统饲喂法递送dsRNA示意图。

图7传统浸泡法递送dsRNA示意图。

图8本发明AK基因的序列发育示意图。

图9本发明引诱剂吸引蚜虫操作示意图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

橘蚜基因的克隆与载体构建方法

从Gene Bank中选取调控昆虫生长发育和生理功能等方面的基因，并以蚜虫cDNA为模板，得到序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5所示的AK，SOD和CHS基因，选择序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5中的CDS区域400bp左右大小的片段，设计用于扩增的dsRNA的引物，上游引物：选择20bp左右的碱基，在其前面加入SacI的酶切位点和保护碱基，下游引物：选择20bp左右的碱基并反向互补，在其前面加入XhoI的酶切位点和保护碱基，最后使用Snap Gene软件检查GC含量和TM值大小。保证GC含量在40-60％之间，TM值58℃左右，上下游引物TM值相差不超过1℃；设计引物分别如SEQ ID NO.7-12所示。

(1)选取15只橘蚜，置于1.5mL RNA专用离心管，后将离心管放入液氮预冷，再使用研磨棒研磨成粉末。

(2)加入TRIzol试剂(Invitrogen)提取蚜虫RNA，然后反转录成cDNA作为模板，如表1所示，以蚜虫AK，SOD和CHS基因的dsRNA的上下游引物(AK-F、AK-R，SOD-F、SOD-R，CHS-F、CHS-R)进行PCR扩增，PCR反应条件为：95℃预变性3min，95℃变性15s、60℃退火15s、72℃延伸30-60s/kb，共35个循环，72℃条件下延伸5min；PCR扩增产物进行电泳后切胶回收产物。

(3)使用DNA凝胶回收试剂盒(Axygen)进行产物的纯化，用Sac Ⅰ和Xho Ⅰ(Takara)对纯化产物与L4440载体分别进行双酶切。使用PCR纯化试剂盒(Axygen)对酶切产物进行纯化，使用T4 DNA Ligase将靶标基因片段与L4440载体过夜连接，最后将连接产物转化到大肠杆菌HT115(DE3)中，经克隆筛选，单菌株测序正确后，保存甘油菌。

如图1所示，分别得到292bp(AK)，248bp(SOD)，360bp(CHS)左右的条带，跟预期结果一致。将回收产物的测序结果进行NCBI序列比对分析，其测序结果与原靶标序列片段相似性均大于90％，成功扩增得到蚜虫的靶标基因的dsRNA核苷酸片段，其序列分别如SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6所示。其中，AK基因的序列发育图如图8(AK基因在图中用黑框标识)。多序列比对发现，与半翅目(烟粉虱、甘蔗黄蚜、麦双尾蚜、棉蚜)同源性高于92％。系统进化树分析结果表明，与半翅目(烟粉虱、甘蔗黄蚜、麦双尾蚜、棉蚜)的亲缘关系最近，与鳞翅目(棉铃虫、草地贪夜蛾、斜纹夜蛾、玉米螟)、缨翅目(棕榈蓟马)、半翅目(褐飞虱、茶翅蝽)、鞘翅目(马铃薯叶甲、玉米根叶甲、米象)和膜翅目(小黄家蚁、小蜜蜂)的亲缘关系较远。

表1蚜虫AK，SOD和CHS基因dsRNA的上下游引物核苷酸序列表

实施例2

蚜虫靶标基因AK、SOD和CHS的dsRNA的诱导表达

取出实施例1制备的含有目标重组载体的甘油菌，按照体积比1：100加入到含有氨苄和四环素抗性(12.5μg/mL Tet+，50μg/mL Amp+)的LB液体培养基中，置于37℃恒温摇床，220rpm过夜培养。吸取初培液加入到含有体积比4：100氨苄和四环素抗性的LB液体培养基中，置于37℃恒温摇床，220rpm扩培3h，至OD600＝0.6-0.8后加入IPTG(0.5mmol/L)，置于摇床诱导4-5h。使用TRIzol试剂(Invitrogen)提取大肠杆菌HT115总RNA。提取后分别用DNaseⅠ和RNase A消化处理，去除DNA和单链RNA。处理结束后，在1％的琼脂糖凝胶上电泳检测，在目的条带位置有一条清晰明亮的条带。如图2中A图第一条电泳道、B图和C图第二条泳道可以看出，本发明对诱导时间，浓度等多个条件优化后，经消化处理可产生较高纯度dsRNA溶液。

实施例3

蚜虫人工饲养液的配方及配置方法

蚜虫人工饲养液的成分为每1mL药剂中含有蚜虫寄主植物的叶片汁液100μL(拟南芥叶片、本发明实施例中叶片均为拟南芥叶片)、蔗糖600μL、抗生素10μL，引诱剂10μL，余量用DEPC水补足。其中，蔗糖终浓度为0.32g/mL、抗生素是终浓度为0.2g/L头孢氨苄或终浓度为0.25g/L青霉素钠其中一种。其中，引诱剂为每1mL中含有50μL 30％乙醇、600μL 32％蔗糖和150μL 3％冰醋酸，余量用DEPC水补足。

蚜虫人工饲养液配置方法，具体步骤如下：

(1)在超净台中，称取蔗糖3.2g，使用10mL DEPC水溶解作为材料A。

(2)使用消毒后的剪刀剪取温室中培养的蚜虫寄主叶片，将叶片剪成宽度大约为3mm的小条，放入1.5mL离心管中使用灭菌过的研磨棒进行研磨破碎，使用4℃离心机12000rpm离心5min吸取上清，然后用45um水性过滤器过滤除菌得到植物的汁液作为材料B。

(3)在超净台中称取市售头孢氨苄(0.02g)或青霉素钠(0.025g)其中一种，倒入1.5mL离心管中，使用45um水性过滤器过滤除菌，使用100mL 40～50℃的无菌DEPC水溶解，溶解后液体作为材料C。

(4)按照材料A为600μL、B为100μL和C为10μL以及引诱剂10μL进行混合，最后加入200μL DEPC水，并在涡旋震荡机上震荡混匀，然后在室温下于70rpm摇床摇1h，使用NaOH调整pH为7.3得到混合液。

(5)将制备好的饲养液保存在-80℃冰箱。

操作中使用的所有材料均为无RNA酶的材料，后续实施例中采用的人工饲养液含有的抗生素是青霉素钠。

实施例4

dsRNA递送方法

如图5所示，本发明采用饲喂浸泡法向蚜虫递送dsRNA，对蚜虫有最高的致死率，具体步骤如下：

(1)将培养皿放入超净台中，打开紫外灯灭菌30～40min，然后将培养皿放入DEPC水(Sigma-Aldrich)中浸泡2～4h，取出后用灭菌水冲洗3～5次。

(2)将冲洗干净的培养皿放入灭菌过透明塑料袋中，再放入60℃烘箱烘干12～24h；将黄色滤纸在灭菌锅中进行灭菌，取出后放入60℃烘箱烘干12～24h，放到消毒后的柜子中进行存储。

(3)将提前准备好的培养皿、灭菌黄色滤纸和无菌注射器放入超净台紫外灯打开灭菌20～30min，灭菌结束后，裁剪灭菌黄色滤纸放入培养皿底部保证大小一致。

(4)选取蚜虫寄主植物的叶片，后使用无菌注射器对植物叶背注射并涂抹含有dsRNA的蚜虫人工饲养液(提前将-80℃冰箱中配置好的饲养液取出放于冰上融化)并放于滤纸上。

(5)在培养皿的滤纸上中滴加150～200μL含有dsRNA的蚜虫人工饲养液，再加入蚜虫倒置培养皿放于培养箱中，温度22±2℃；相对湿度75％左右；光照周期16h：8h(L：D)。每天更换滤纸、含有dsRNA的蚜虫人工饲养液和叶片。

实施例5

高致死率靶标基因的筛选

挑选相同龄期蚜虫，每组各15只。处理组在培养皿的滤纸中加入200μL溶液(其中包含实施例3的人工饲养液180μL，还包括目标基因AK或SOD或CHS的dsRNA 20μL)，dsRNA的终浓度为400ng/μL，然后在培养皿的滤纸上放上蚜虫寄主的叶片，接着使用无菌注射器对植物叶背注射并涂抹200μL含有dsRNA的蚜虫人工饲养液(其中包含实施例3的人工饲养液180μL，还包括目标基因的dsRNA 20μL，dsRNA的终浓度为400ng/μL)，最后将蚜虫置于叶片上。对照组1在培养皿的滤纸中加入200μL溶液，其中包含实施例3的人工饲养液180μL，还包括超纯水20μL，然后在培养皿的滤纸上加入蚜虫寄主的叶片，接着使用无菌注射器对植物叶背注射并涂抹200μL溶液(其中包含实施例3的人工饲养液180μL，还包括超纯水20μL)最后将蚜虫置于叶片上。对照组2在培养皿的滤纸中加入200μL溶液，其中包含实施例3的人工饲养液180μL，还包括ds-GFP溶液20μL(采用实施例1中引物SEQ ID NO.13-14扩增，并采用实施例2中方法制备)，ds-GFP的终浓度为400ng/μL，然后在培养皿的滤纸上加入蚜虫寄主的叶片，接着使用无菌注射器对植物叶背注射并涂抹200μL含有ds-GFP的蚜虫人工饲养液(其中包含实施例3的人工饲养液180μL，还包括ds-GFP 20μL，ds-GFP的终浓度为400ng/μL)。最后将蚜虫置于叶片上。再用保鲜膜封住培养皿，将培养皿放置于光照培养箱中，温度22±2℃，相对湿度75％左右；光照周期16h：8h(L：D)。每组设3个生物学重复，每天更换滤纸、含有dsRNA的蚜虫人工饲养液和叶片，记录死亡率。

表2不同靶标基因的dsRNA药剂对蚜虫死亡率的影响

注：图表中的不同字母表示在p-value<0.05条件下存在显著差异。(ANOVA)

如表2所示，在0天时，对照组之间以及与各处理组相比均无显著性差异。在1天、2天、3天和4天时，两个对照组无显著性差异。同时，第2天时，处理组ds-SOD和ds-CHS蚜虫死亡率与两个对照组相比开始出现差异性，但不显著，处理组ds-AK蚜虫死亡率与两个对照组以及处理组ds-SOD和ds-CHS相比，出现显著性差异(P<0.05)，说明处理组ds-AK蚜虫死亡率不仅高并且速度快。第3天时，处理组ds-AK蚜虫死亡率为77.8％，高于其他两组处理组，同时三个处理组均显著高于对照组。第4天时，处理组(ds-AK、ds-CHS和ds-SOD)与两个对照组之间均有显著差异，并且处理组ds-AK效果明显优于ds-CHS和ds-SOD。ds-AK处理组在第2天、第3天和第4天时对蚜虫均有显著且最高的致死率，因此筛选得到对蚜虫有相对最高致死率的蚜虫AK基因的dsRNA。

实施例6

ds-AK处理后靶标基因的表达量分析

从实施例5对照组1、对照组2和处理组ds-AK中选取9只处理后的蚜虫(3个重复中分别随机取3只)，置于预冷后的离心管中充分研磨成粉末。使用TRIzol试剂提取蚜虫RNA，反转录成cDNA。然后利用实时荧光定量PCR技术，反应条件：95℃5min，95℃10s，60℃34s，40个循环，使用ΔΔCt法分析靶标基因AK的抑制情况。荧光定量所用仪器为AppliedBiosystems 7500system。

表3 ds-AK处理后基因沉默效率

	0天	1天	2天	3天
					对照组1	1.00±0.01a	1.21±0.00a	1.11±0.01a	0.95±0.11a
对照组2	1.17±0.01a	0.96±0.01a	0.91±0.10a	0.85±0.02a
					处理组ds-AK	1.09±0.00a	0.76±0.01b	0.52±0.02b	0.48±0.00b

注：图表中的不同字母表示在p-value<0.05条件下存在显著差异。(ANOVA)

如表3所示，靶标基因AK的表达量在第1天、第2天和第3天时，ds-AK药剂可抑制靶标基因AK的表达，与对照组1和2均有显著性差异(P<0.05)。表明本发明筛选出的ds-AK药剂能抑制靶标基因AK的表达。

实施例7

ds-AK处理对蚜虫生长发育的影响

在Nikon SMZ25体式显微镜下，如图3中对照组CK、ds-GFP与处理组ds-AK所示蚜虫形态，观察蚜虫通过饲养浸泡法处理72h后形态变化，并且在对照组和处理组中挑选15只蚜虫(3个重复中分别随机取5只)使用ImageJ软件进行体长测量。

表4小RNA药剂处理后蚜虫体长

	对照组CK	对照组ds-GFP	处理组ds-AK
				体长(μm)	889.33±15.70a	873.82±13.73a	813.71±7.99b

注：图表中的不同字母表示在p-value<0.05条件下存在显著差异。(ANOVA)

如表4所示，两个对照组之间无显著差异，处理组ds-AK与对照组CK和对照组ds-GFP相比均有显著差异。处理组ds-AK蚜虫体长比对照组ds-GFP的短60.11μm。结果表明ds-AK处理组蚜虫生长发育受到抑制，发育减缓，身体蜷缩，个体变小，最终导致蚜虫死亡。

实施例8

小分子RNA复配药剂在柑橘大棚中对蚜虫的致死效果

在柑橘大棚内，用蚜虫ds-AK复配药剂和对照分别处理有蚜虫的柑橘枝条，每个处理选40只蚜虫进行实验，每隔2d统计死亡率情况，并在同一植株的相同位置再次施用相同药剂处理一次，实验期间共进行3次药剂处理，试验期为8d。对照组1：涂抹200μL无RNase纯水含0.05％体积分数的Triton X-100；对照组2：涂抹200μL ds-GFP溶液(400ng/μL)含0.05％体积分数的Triton X-100。对照组3：涂抹200μL ds-GFP溶液(800ng/μL)含0.05％体积分数的Triton X-100；处理组1：涂抹200μL ds-AK溶液(400ng/μL)含0.05％体积分数的Triton X100。处理组2：涂抹200μL ds-AK溶液(800ng/μL)含0.05％体积分数的Triton X-100。处理组和对照组均加入终浓度为2U/μL的RNase抑制剂。结果如表5所示。

表5柑橘大棚中蚜虫死亡率随时间的变化

注：图表中的不同字母表示在p-value<0.05条件下存在显著差异。(ANOVA)

如表5所示，0天时，各组之间均无显著性差异。第2天时，对照组1、2、3蚜虫死亡率组内无显著差异。处理组1、2蚜虫死亡率均显著高于对照组。处理组2的死亡率略高于处理组1，但两组之间的差异不显著；第4天、第6天和第8天时具有类似的情况。结果表明，本发明研制的ds-AK药剂，在400ng/μL与800ng/μL的ds-AK复配药剂，蚜虫致死率分别为56.88％和69.38％，在大棚条件下仍然对蚜虫有较高致死率。

实施例9

引诱剂对蚜虫的吸引作用

在90mm培养皿中放入滤纸和两个无盖开口的35mm培养皿，往滤纸上滴加1mL超纯水，选择其中一个35mm培养皿作为处理组添加2mL引诱剂(实施例3制备)，另一个35mm培养皿作为对照组添加2mL超纯水。最后在90mm培养皿的中央放入带有蚜虫的叶片(30只)。再用保鲜膜封住培养皿，将培养皿放置于光照培养箱中(如图9)。温度22±2℃；相对湿度75％左右；光照周期16h：8h(L：D)。每组设3个生物学重复，每24h记录35mm培养皿中蚜虫数目。

表6引诱剂吸引蚜虫数量对比

	0天	1天	2天	3天	4天
						处理组	0.00±0.00	4.00±0.47	10.00±0.94	14.00±1.41	15.67±0.54
对照组	0.00±0.00	1.67±0.54*	5.00±0.47*	6.33±0.72*	7.00±1.24*

注：图表中*表示在p-value<0.05条件下存在显著差异。(T-test)

如表6所示，第1天、2天、3天和4天时，处理组和对照组组具有显著性差异，结果表明，本发明所述引诱剂对蚜虫具有明显吸引作用。

对比例1

本发明蚜虫饲养液与传统饲养液的效果对比

1、传统人工蚜虫饲养液，主要成分包括：氨基酸，维生素，矿物质元素，蔗糖。其中，氨基酸为“L型”氨基酸，每100毫升中含有赖氨酸(LYS)200mg，色氨酸(TRP)80mg，苯丙氨酸(PHE)200mg，苏氨酸(THR)100mg，异亮氨酸(ISO)200mg，甲硫氨酸(MET)100mg，亮氨酸(LEU)200mg，缬氨酸(VAL)80mg，丙氨酸(ALA)100mg，天冬酰胺(ASN)300mg，天冬氨酸(ASP)100mg，半胱氨酸(CYS)40mg，谷氨酰胺(GLN)600mg，甘氨酸(GLY)20mg，谷氨酸(GLU)200mg，丝氨酸(SER)80mg，酪氨酸(TYR)80mg，脯氨酸(PRO)80mg，精氨酸(ARG)400mg，组氨酸(HIS)200mg。其中维生素为：每100毫升中含有生物素0.1mg、泛酸钙5mg、叶酸1mg、肌醇50mg、烟酸10mg、吡哆醇2.5mg、硫胺2.5mg、胆碱50mg；矿物质为：每100毫升中含有氯化铜0.2mg、氯化铁1.5mg、氯化锰0.55mg、硫酸锌85mg、硫酸镁100mg，氯化钠1.2mg；蔗糖为：每100mL中含有30～35g。

2、传统人工蚜虫饲养液配置方法，具体步骤如下：

(1)按照不同成分称取定量的氨基酸，维生素、矿物质和蔗糖，倒入100mL玻璃瓶中(提前在灭菌锅中灭菌)。

(2)倒入100mL DEPC水，放入润洗过的聚四氟磁力搅拌子，在搅拌器上搅拌2～4h保证溶液澄清。

(3)使用KOH或NaOH调整pH 7.2～7.7。

(4)使用45um水性过滤器过滤除菌得到混合营养液，分装到RNA专用1.5mL离心管中。

(5)放于-80℃冰箱保存。

3、本发明饲喂液与传统饲养液饲养蚜虫的死亡率对比

挑选相同龄期蚜虫，每组各15只。将蚜虫置于铺有黄色滤纸的35mm无菌培养皿中，处理组在培养皿中加入与实施例3方法相同的饲养液200μL，并加入预先注射并涂抹200μL含有相同溶液的蚜虫寄主植物叶片。对照组在培养皿中加入200μL传统人工饲养液，并加入预先注射并涂抹200μL含有相同溶液的蚜虫寄主植物叶片。再用保鲜膜封住培养皿，将培养皿放置于光照培养箱中，温度22±2℃；相对湿度75％左右；光照周期16h：8h(L：D)。每组设4个生物学重复，每天更换滤纸、饲养液和蚜虫寄主植物叶片，记录死亡率。结果见表7。

表7本发明饲喂液与传统饲养液死亡率对比

注：图表中*表示在p-value<0.05条件下存在显著差异。(T-test)

如表7所示，本发明饲养液比传统蚜虫人工饲养液的饲养效果更好，四个重复组误差小，同时能够很好的延长实验室条件下蚜虫的存活时间，方便进行后续试验。传统蚜虫人工饲养液需要几十种氨基酸，多种维生素和矿物质等。并且含量不同，需要试剂众多，成本较高，配置过于复杂，而本发明制备了蚜虫的寄主植物汁液、蔗糖和抗生素等的混合物，材料容易准备，与传统人工饲养液相比具有配方更加简单、成本较低，而饲养效果更好，重复组死亡率差异小、蚜虫存活率较高并能吸引蚜虫取食等优点。

对比例2

饲养溶液与传统人工蚜虫饲养液污染程度比较

挑选15只相同龄期蚜虫放在灭菌后的培养皿中，处理组加入与实施例3相同的饲养液200μL于滤纸，再加入注射并涂抹200μL实施例3饲养液的寄主植物叶片。对照组加入传统人工蚜虫饲养液200μL于滤纸，再加入含有传统人工蚜虫饲养液的寄主植物叶片。再用保鲜膜封住培养皿，将培养皿放置于光照培养箱中，温度22±2℃；相对湿度75％左右；光照周期16h：8h(L：D)。每组设3个生物学重复，48h后取出叶片和蚜虫，拍照观察滤纸污染情况(图4)，用ImageJ软件测量并计算每个培养皿污染面积(见表8)。

表8饲养液污染程度比较

	污染面积cm<sup>2</sup>
		处理组	0.048±0.0074
对照组	0.362±0.0419*

注：图表中*表示在p-value<0.05条件下存在显著差异。(T-test)

结果发现：本发明饲喂液处理培养皿48h后，对照组与处理组具有显著性差异，对照组比处理组污染更严重，说明本发明饲喂液不易污染变质。

对比例3

AK基因dsRNA的不同递送方法比较

挑选相同龄期蚜虫，每组各15只。处理组施用候选靶标基因的dsRNA与实施例3方法相同饲养液。设置三种不同的dsRNA递送方法：

(1)传统饲喂法，如图6所示将蚜虫放入一端开口一端封闭的50mL离心管中，先用第一层封口膜封住离心管并用移液枪在第一层封口膜上滴加dsRNA溶液，处理组(ds-AK)在膜上加200μL溶液(包含180μL实施例3饲养液，以及20μL靶标基因AK的dsRNA，ds-AK的终浓度为400ng/μL)，对照组1添加200μL溶液(包含180μL实施例3饲养液，以及20μL超纯水)，对照组2添加200μL溶液(包含180μL实施例3饲养液，以及20μL ds-GFP溶液，ds-GFP的终浓度为400ng/μL)。再用第二层封口膜包裹住溶液，形成“三明治”结构。将离心管用锡纸包裹，将封口膜一端向上放置于光照培养箱中，温度22±2℃；相对湿度75％左右；光照周期16h：8h(L：D)。每组设3个生物学重复，每24h更换溶液和封口膜(所用离心管已经过灭菌锅灭菌，封口膜在使用之前需要在超净台紫外灯下照射30min以上)，如表9所示，记录蚜虫死亡率。(2)传统浸泡法，如图7所示，将蚜虫置于提前在超净台紫外灯下灭菌30～60min并铺有滤纸的无菌培养皿(30～35mm)中，处理组(ds-AK)在培养皿中的滤纸上加入200μL溶液(包含180μL实施例3饲养液，以及20μL靶标基因AK的dsRNA，ds-AK的终浓度为400ng/μL)，对照组1在培养皿中的滤纸上添加200μL溶液(包含180μL实施例3饲养液，以及20μL超纯水)，对照组2在培养皿中的滤纸上添加200μL溶液(包含180μL实施例3饲养液，以及20μL ds-GFP溶液，ds-GFP的终浓度为400ng/μL)。再用保鲜膜封住培养皿，将保鲜膜一端向上竖直放置于光照培养箱中，温度22±2℃；相对湿度75％左右；光照周期16h：8h(L：D)。每组设3个生物学重复，每24h更换溶液、滤纸和保鲜膜，如表10所示，记录死亡率。(3)本发明饲养浸泡法，如图5所示，处理组(ds-AK)在培养皿的滤纸中加入200μL溶液(其中包含实施例3的人工饲养液180μL，还包括ds-AK 20μL，ds-AK的终浓度为400ng/μL)，然后在培养皿中加入蚜虫寄主的叶片，接着使用无菌注射器对植物叶背注射并涂抹200μL含有dsRNA的蚜虫人工饲养液(其中包含实施例3的人工饲养液180μL，还包括目标基因的ds-AK 20μL，ds-AK的终浓度为400ng/μL)。最后将蚜虫置于叶片上。对照组1在培养皿的滤纸中加入200μL溶液(其中包含实施例3的人工饲养液180μL，还包括超纯水20μL)，然后在培养皿中加入蚜虫寄主的叶片，接着使用无菌注射器对植物叶背注射并涂抹200μL溶液(其中包含实施例3的人工饲养液180μL，还包括超纯水20μL)最后将蚜虫置于叶片上。对照组2在培养皿的滤纸中加入200μL溶液，其中包含实施例3的人工饲养液180μL，还包括ds-GFP溶液20μL，ds-GFP的终浓度为400ng/μL，然后在培养皿中加入蚜虫寄主的叶片，接着使用无菌注射器对植物叶背注射并涂抹200μL含有ds-GFP的蚜虫人工饲养液(其中包含实施例3的人工饲养液180μL，还包括ds-GFP 20μL，ds-GFP的终浓度为400ng/μL)。最后将蚜虫置于叶片上。再用保鲜膜封住培养皿，将培养皿放置于光照培养箱中，温度22±2℃；相对湿度75％左右；光照周期16h：8h(L：D)。每组设3个生物学重复，每24h更换滤纸、叶片、保鲜膜和溶液，如表11所示，记录死亡率。

表9传统饲喂法蚜虫死亡率随时间的变化

表10传统浸泡法蚜虫死亡率随时间的变化

表11饲养浸泡法蚜虫死亡率随时间的变化

注：“*”表示同列数据差异显著(ANOVA)

如表9所示，传统饲喂法处理后，处理组与对照组1和2相比没有显著差异；如表10所示，传统浸泡法处理后，处理组在第2天、第3天、第4天和第5天时，均显著高于对照组1，但是与对照组2无显著差异；如表11所示，本发明饲养浸泡法处理后，处理组在第2天、第3天、第4天和第5天时，与两个对照组均有显著性差异，表明本发明小RNA递送方式更加科学合理，对蚜虫有最高的致死率。

对比发现，单一的浸泡法或饲喂法处理蚜虫吸收dsRNA效率并不高，对照组与处理组间的差异小或对照组之间具有显著性差异。相比之下，本发明浸泡饲喂的方法操作简单易行，通过吸引剂和黄色灭菌滤纸吸引蚜虫取食和浸泡，饲喂含有dsRNA药剂的植物叶片，相比单一的浸泡或饲喂，延长了对照组蚜虫存活时间，大大提高了蚜虫吸收dsRNA效率。虽然浸泡法处理组蚜虫死亡率达到了100％，但是由于对照组2死亡率也高达80％，不能说明该方法吸收效率高，反而说明实验误差大，而本发明的处理组与各对照组均有显著性差异。因此，可更加精准的筛选出对蚜虫有较好致死效果的dsRNA。

综上所述，本发明研制出了一种靶向蚜虫AK基因的高致死率dsRNA，并搭配了一套可高效筛选对蚜虫有致死效应的dsRNA的方法。施用ds-AK药剂，可以明显减缓蚜虫生长发育，并高效引起蚜虫死亡，从而减少柑橘衰退病的传播。ds-AK药剂具有高度特异性，不会影响非靶标生物。并且能通过天然途径降解，不会造成药剂残留污染环境，相比传统化学农药更加绿色安全，可以为开发和制备新型绿色杀虫剂提供新策略。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 靶向蚜虫AK、SOD和CHS基因并可致死蚜虫的dsRNA药剂的筛选、制备及其应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9170

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggctttgc cagacttcgc cgggaggaaa ctaaaggccg caggtctgtt ggcggcgata 60

aagctcccca atatcaaaat atatcgctta cggtacactt cacctgagcg agtgatacaa 120

atttgcaact atattaaaaa atctaaagaa ggcgtaagta aaatattcaa taaaacattg 180

tagtcattac ctattgattt tgattttaat attatttaga atattacact ctgaattaat 240

taatataatt tggatgctta atatagcgga cagtttaatt ttgtccaaaa ttaatattgt 300

agttaggaac atttaacttt tctttgaata actctgtgaa gtatttaaag gaatttagtt 360

caaattattt taaattagag ttattataaa agtaaatgtt ttttaaatac aatataatac 420

atttcagata aattgtaata ttttataggg atataatttt aatattataa tttacagtaa 480

attatgacca taataattta taacttatac ttctaataaa aaatactaaa atagtcaaaa 540

aacttttcat tgtttcaatt aacaattacc actatagtat ctaatacgat atttattttc 600

attattattt aactgtcctt aatgattagg tataatttcc atagtgattt taatttttat 660

ttgtgataaa tataaacaag aaggacttat tacgatattt tagtaaaaca aaagtactaa 720

gagaaaccaa taaacgtcaa acttttttaa taagtaagtt ttaatattta gctagtttaa 780

atcaggggcg tatttatatg tttccgcatg taggcctgtg gaaaattgtc gcccttaata 840

actaaaacaa taatacaata tactgcacta actaaattgt catttaatag cctattggct 900

attatattat tattatagta tacataacat attttacaat aacaaaaaaa aaacgtatat 960

gtataacctt aataaatttg acgcccctta caattttccg ctgcattagg cacgtaccta 1020

tagtgcctac atataaatac gtcactgagt ttaataatct gtaaatgctc aaatggataa 1080

ataataaata taaataaata ttataataaa tgtacttaat ttattaatct aataatattt 1140

aaaaataaat ccaaaataat ttgtatggga aaatattttt attgatagtt attttaattt 1200

ggaattaata aaatttgaaa agtacaaata aaacttatac aaataattaa taatttgttg 1260

atacattgag ctgaggatca cgatagttgt atgatttaaa agcgtattaa aacaatattt 1320

caatactttt actaggtata caaaaacttg agtattatat aaaggtacct atattttgat 1380

taaacaatat gggtaattta tatttcttta ggcgaaatta tattttaaaa taatacgagt 1440

cagtactttt tgataaataa tttgtgtgtt tcaaacataa ataataaaaa aatattattc 1500

tgatgacttg tgaaatgtta ttatactttt aggaaattaa tatattattt taaatttaaa 1560

tttcttaaaa ggttagtttg acatgtacat agatatttaa tcgtagtcca taaatatttg 1620

cttaaaaatt gaaatcgctt gtaaaattta atatataaaa ttcaggaact gctattttta 1680

atttatcaaa aatttagatt tttatcttta tacatcaaca tggatcctgc agtattagcc 1740

aaattggaag atggttggtg ttcattaaac tgctctgaca gcaaatcttt gctaaaaaaa 1800

tatttgacaa aagaggtact agatgactta aagaacaaaa agaccaaatt tggatccaca 1860

cttttggatt gtgtgcaatc tggtaagact acgcttaaat taatatataa aacataatat 1920

tatgacataa ttttaattat gaaatacgta gatataataa cgcgatacta aaataacaaa 1980

atgtaataac tttatgttaa gtatttaata atcatacgta tctatattga agtgacgatc 2040

ggtaggtata gaaatttaaa tgtacaaaaa tgaaaagtta aatacattta tattatatta 2100

tattaattgg aaaatgcaga atgatcgtag ttatgatgaa tatctacaca aataatagtt 2160

tgaaataaat aatataacct gcatgtaata actaggtacc tattaattag taattacaat 2220

aattttaaac aacgtttaag actcaatatt cttcattgct aaagtgtaaa ctgaaataaa 2280

tatttcacca cgattagtat atatatatat atatgctttc tacgtactaa ataaagaaga 2340

attaaaaaca aaattatagt catattattt taaaaagtag ttttttggtt ttataataat 2400

tcattttgtt taaaaaatta tttagaattg tatatgatat aagtataagt actatataca 2460

catatgaaat gtataataga aatgttttaa ttaacattat ttattgaaac atataatata 2520

atcgcatagc atttctttca actattatat ttgtttgcaa taaataatta tgtgttaact 2580

atggttattt aaaattgtat tcgactggta acccttcaaa taatatagta acattttatg 2640

tttttaatac tttagtaaaa aaatatattt tctacattcc atattataat ttgcatgacg 2700

cttttatctc tgttaaatgt attatacgaa ttgaagtatt gtatgatctt tagacatatc 2760

gtaaattcta tttttctaat aaacacatta atatattttt caactaaatt gtgcaacaat 2820

caaaagacgc agtgtagtag gtagttttta aaataaataa aaaaattgtg attgatcaca 2880

acatagacac atagttacct atataagtta ttaattatta atttaagtta caatattcta 2940

cggtttttta ttatataaga aatatttaca ggttataatt tttaattaat tttgttttta 3000

caaattggag ttaatataat ggtcgtttca aattaaatta aatatttttt ttgtgttcga 3060

cgcatttcag tctttcgatt atatttagaa catttgctgt caatcatgta tctgttagac 3120

accgttttgg caacgcccct gtcactaagg aaaatgaaaa aaaaaattta aaaataatat 3180

tattttccac caatgattaa tgacataagt aaataaatcg cataacaacg tttccattgt 3240

cggcactctc cgggcacgta tacacatttt ttgttgtcgg ggatgtcgcg cgttcaaaat 3300

gtaggtcact gggaattcga gctagactgc ttgacgcccc aggatcaata tcccggattc 3360

tgtacccagc atcactgcaa cctaaaacct cctcccacac actgcattac ttacctgcat 3420

taatcttcaa ggtcagcatt aacggatatg cattatatat atatatatag atttccaata 3480

attaaaagtt ttagattaag attaaataat tttaaaagaa ttattacaat ttaatgagag 3540

atgaatattg tttatattaa atgaatttaa ataaaccttt attttgaaat aagttaaaaa 3600

ctcaaaaccg gcaaaatgaa ggcatgtaac agtaaagtag tctgtagaca aaataaaaaa 3660

agtgtatcaa agtatatttt cagtttctct gtataattat ttttcgtttt attcattttt 3720

tgagctatat agtgggtata cttactgcta aaacagttct aagaagaagg tacctaccta 3780

aatggctata atattataat tatttatttt taatcaactg aagggaatat gttatatata 3840

gtacaatatt acaaaaggag agttgtttat atatgtgatt ttgtgcctta cgctcacgtt 3900

acgcagagtg ttactctgtg tgatagctat attattaatt aatagttatt attatcacgt 3960

acctaaaatg tcatcgttat tgatacgttt tgaatccgat gttatagtaa ggtgttcaat 4020

ataatattat gctttcgcac aagcaagtta gcagtagcac ccctaacatt tcgaacatga 4080

tatgaatctc attttaaatt taggtactga ttgatgattt gaatttatcg tgttctacaa 4140

acttgatata gccattctca catttttcta tcgtgtaaaa ttcatcaaac attaaatatt 4200

ctaattttca aattactatg tggcgcatgt tttttttaca aaaacgtaca gccgtcaatt 4260

gagaatgtta tgtttactaa taaataacaa gaaatagtaa ttttattaat tatttattta 4320

ttcagaaatt aatttaacga aaactataaa tatcaaattc aaatattcaa tgtaggtata 4380

taagaaaaca atatttaggt aaatagttgc tacaaataag ataattaata aatgattaac 4440

aataatgata aattcataat gatttatgca taataattta tggtatacat aactatcata 4500

aacagggttg ggatcttata gcatttgcat atttcttatg aaatgcttaa aaaataacag 4560

agtagctaaa aatgtgtttc gagatacaga gaactcaaat taaaaatttt atttagcttt 4620

ttttggattt tttgagattt tttacatttt tacctgtttt gaatcaaaat cggtcatatt 4680

ttatgaaatt atattttagt aaacgtgttt ttagattttt gtcaatcgta ttattacgat 4740

aatttcgtat taggtatttg gttctaactt ctaatttttg ttatctgctg attttgttgg 4800

gttttttgtc gatttctact gcaattatta atcgctgatt atcaacgaac gagcgttgaa 4860

tacgttgtat atagtcaatt catttggatt ctaatcaaag tgactaaatt atttcaaatc 4920

ttaagtaatt acctataata atttgtaagt gattaaaaaa ttattaatta ataaatttcc 4980

tttttttgca tattttgttg tttttattgc atatttttag cgcatattta gcgatattta 5040

aggtaatatt atagcgcata tttgtgcaac tttaagtgct ataaaatccc aaccctgatc 5100

ataaatatta tgatacaaag tattacagca catacaattt ggtactttag cataacaaaa 5160

caataattgt attataaaga tttaaaaaac atttttcatg caaaatgtac aaaaaagagt 5220

aatggtatat tttaacgaaa taaataggta tataaattaa gtagttattt gttgtagtga 5280

caaagtaacc caactataaa gcggtaagct tatatttata ataataagta cctacattaa 5340

aaaaaaaatt tagataaaaa tgagaccgtt tttattttga aacttacata tcattttccc 5400

gttttttaaa gtacctaaat ttattattat tatttattta cttaattata catatatata 5460

tatatattta aggatttgaa aaccatgatt cgggagttgg tatttatgct cccgacgctg 5520

acgcatacac agtgtttgcg ccaatattcg atcccatcat cgaggactat cataaaggat 5580

tcaagtccac ggacaaacat ccagaaaaaa attggggtga cgtgaacact cttggtgacc 5640

tggatccaga agtagtattt attcgttgac aaacttaaag tgaaaattca aaactttcgc 5700

gttttatcga cagtgcaagt acgtaatttc tacgagggta cgttgtggcc gttcactgga 5760

aggctatccg ttcaatccgt tgttgaccga acagcagtac aaggagatag agaaccaggt 5820

ttctagcaca ctcacgggac tatgcggcga attgaaagga gagtttatcc cttaactggc 5880

atgtctaaag atgtacagca aaacttgatt gatgaccatt ttctatttaa ggaaggtgac 5940

cgatttttac aggtttgtgc tattaagtag gtactgaatt cagtttgatg ctgatactta 6000

gttagcactt ttagccttcg attatatagg aaaatatagt taggatatgt tatgaactaa 6060

tgattgctta ttaaggtata agtaaataca agttgaaggt atttataaga cataaatcat 6120

atatccaaat acattataaa aaatcagtta caagactcaa attttgtaaa aaaaaatgac 6180

agaaaatgaa tatttttggt taaaatttaa aaataaattg attttcaaaa attacatatt 6240

tttgttggtt attactggtt tcgatgcatg ctttataata tgtgtaccta tgtacaacaa 6300

atctggtcgc attttacatt tatcgcaatt attgttattg tatggcacag ctatcgtaat 6360

cgataatcga tatataattt ataatttatg taagtacgtc agatatacat cgatgttaat 6420

aataaacaat gaaatacata acttaagttt taataattta gaataggtaa cggatttatt 6480

tatagatgta ttacaaatat tacaactact aattcaaata aactacctac aaatttctat 6540

tatttaattt ttgtgaaaat tatcttaata ttttgttaga atgttagtgt tatcagtgaa 6600

cactgttcat ttttaaaact tttatattgg atgtaattaa cttagattaa taaatgttat 6660

atataaattt aaaaaatatt agatatttaa aatttaaaaa catatattag ttattactag 6720

ttattaaatg taaatgttta tgtacattat aaattataat tataatataa ttatatatta 6780

taatttataa tatataatta taatataatt atatattata atttataata ttttactcgt 6840

atggctctaa acatacatat aaggttgcct atatttaacg tccattagta agcccagttg 6900

gttataagtt attaataata ataataataa taccaaacac tgaaatacct aaacctttat 6960

gtttattaaa atgaggattt gttttaaaca caattaaata cagtttgcgg tttttgtata 7020

tttaaaccaa ctgtgcatga tgttaaacat ataatataaa aggaaaatct tgaaaatcag 7080

aaacacatcc gaatttgtga atgtaaaact caatgtattt atgtatttat tataatacta 7140

tttacacatt taaattattt accaatataa aaaaataatt attcagatta gacaaatatt 7200

ggttcataat catattgaga ttcaccattt ttgttataca caaaaatatg ctctatatgc 7260

tctgtcctta taggaactgg gaggagaggt tgaggtataa tattaaacga atcctaaaca 7320

taaattataa tattaatatt gaaaaattgg tacgttattt ctaaccctaa tatttttctt 7380

ttaaattaaa aaccattcaa ctatattaga tgataatatt aaataaggta aacattttaa 7440

tataagtact gagaaatcct aagaattatg taattattat aaaaatgtaa tctaatattc 7500

gtgcaagttc aaaacaataa tactagatag ggtcaactat taaattatac ttcattaata 7560

taatattatt gatttttaaa taggctgcta acgcttcgcg attctggccg accggccgtg 7620

gtatattcca taacgagaac aaaacgtttc tggtttggtg caatgaggaa gatcatttaa 7680

ggctcatatc gatgcaacaa ggaggaaact tgggagaggt tattcattaa aatatataat 7740

tatataccta gttcttaaac gtgacaatta ttgttgatag gtgtatacaa ggctcgtaac 7800

agcggtaaac gatgtggaaa aacgacttcc attttcacat cacaaccgtt tgggattttt 7860

aacattttgt ccaacaaact tgggaacaac tatccgtgca tcagttcata ttcagctacc 7920

taaattagct gcggacaaag ctaaattgga agaaattgct ggaaaatata atttacaagt 7980

aatcatattt ttaaacgatt taataacatt tttcaaaata tttcaatagg tacctctact 8040

tacatatttt caagctgtat ttgctattgc atatttattc tacgaactta ttcacaccgt 8100

aatattaacc gtattgactc aaaagttaac aacaatgata tatgacatac atattatatt 8160

ataataacta ctaataatat aataaatgca atactttatc agaaaaaatt aattcaacct 8220

actgtattac taataattgt aaaacatatt aggtagtgaa atataaatat aaataataat 8280

attatgttga ttttaatatt attttctgtt cttaaatcat acactaatta cctggttatg 8340

agcaattgta tagattatta ttaacaagat taatcaaata tttaaatcta taagataaat 8400

aattgtgcgt tcaaaataat attcaaacga cattttatct ttaggttaga ggtactcgtg 8460

gagaacatac agatgcagaa ggcggaatct atgatatttc aaacaagagg agaatgggtt 8520

tgactgaata tcaagctgtt aaggaaatga atgatggtat aaaagagctc ataaagatcg 8580

aggaacagtt gtaaattttg atgttattac gtcttacatg cctctatagg tctttaaatt 8640

tcaacaaatc tagtcaaata aaaaaaatct agtcagatat tgcttctttt ttttaccatc 8700

gttactttat tttgctagag caaaatattg ttaacggggt tataaagctt gtaaagtaga 8760

catcaagtta gctacttaat acattttaat attattattc tattatacta atataggaac 8820

acacgtgaga ggataatatt ataatcacaa caactaccag atttttttcc attatttaaa 8880

attatcataa tacaccaaat actaactata aatttcctct taaatattat ttttttgttt 8940

tatattaact taacgtctag aatatcttaa atgctatttc aattttaaat acttttaaat 9000

atcttatgca atatgcaatc taaacatgat taatttaaat gtacgtaatt ttaaagctca 9060

ttcatttaat atgaagtatt aggtatattt tataatatac tgtgttattg tatgtttagg 9120

tattttaatt gttaacaaaa atattgttga ataaagttga ttgagttatt 9170

<210> 2

<211> 292

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggatttgaaa accatgattc gggagttggt atttatgctc ccgacgctga cgcatacaca 60

gtgtttgcgc caatattcga tcccatcatc gaggactatc ataaaggatt caagtccaca 120

gacaaacatc ccgccaaaaa ttggggtgac gtgaacactc ttggtgacct ggatccagaa 180

tgcaaataca tcatttctac gagggtacgt tgtggtcgtt cactggaagg ctatccgttc 240

aatccattgt tgaccgaaca gcagtacaag gagatagagg ataaggtttc tt 292

<210> 3

<211> 2281

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agacattaga taaaaccggc cgggagaata catatttcat catttcaatt tggtatattt 60

tttcgattct tccatagtta tattaataat tatcgtgtat tctgtttcct tgttttaact 120

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<210> 4

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

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actcgaggtg aggagaaggt ccatgcaggc ggagaggcgc aagtctcaga tgcagacgct 12000

gggcgcgagc cacgcgttca accagacgca gaggcagtca aacgcgggca tcagcgtcaa 12060

ggacatattc aagggcagcc aaaaccttgc atacgaacgt gacgacggtg acggagacga 12120

ccggctgccc atgcacgcca tcaactgaaa cggaaatgac ggcggacgag agggaaaacg 12180

agctcgactg acggggaaaa aaacgatccc ccgacggagc gtttctagtc aaaaaaaaat 12240

aaatctcagc acgaaacgct gtgtatcgta tactgcaaaa taataaaaca tcctttttat 12300

tattcctttt acccgtctgc ggtctctttt ctctccctca atcgcgtttt caaaccactc 12360

gaggccaacg acggaaaact gaaattcgaa attcgactct gaactgcgcc catacctatg 12420

atgacggccc ggacgagttt cttacgagta cccacttgtc gacgtggtac acttactcaa 12480

atacttaatt tttatatatt ttataaaatc gtttttagta ttatataata tatactttac 12540

catgacatga aaaatatgta cacaataaac actattgctc attttgtacc acag 12594

<210> 6

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgacgtcac gtttgtcgtt cgttccatcc gtgaataaca tgtctcacca aagacttcat 60

gacagtgacg agaataattc ttcggacgat gacgaaaatt cacctctaac ccaagactta 120

tacggtggaa gccaaagaac tttggcagat accaaagcat gggacgtttt tcgagattta 180

cctccgcgca gcgacagtgg atctatggcc aaccaagcat gtctcgaatt caccatacgt 240

gtgctgaaaa tcctagcata tttgaccaca ttcattgttg tcctgtgttg tggcgttata 300

tctaaaatta gtatgttctt catgacatcc caaatcagat ctgatcgcgt cgtcacattc 360

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgagctcggg atttgaaaac catgattcg 29

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cctcgaggcg tggaagaaac cttatcctct atc 33

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cgagctcgaa cgtgacattt atccaggcta a 31

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cctcgaggcg tgatcggatc aaggatt 27

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cgagctcgat gacgtcacgt ttgtcgtt 28

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cctcgaggga atgtgacgac gcgatca 27

<210> 13

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cgagctcgca acttgtctgg tgtcaaaaat aata 34

<210> 14

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cctcgaggcg cctgatgcgg tatttt 26

Claims (13)

1.蚜虫生长发育相关基因，其特征在于，所述基因的dsRNA可特异诱导靶标基因进行沉默，并对蚜虫产生致死效应，所述的蚜虫生长发育相关基因为橘蚜AK基因或橘蚜SOD基因或橘蚜CHS基因中的任意一种，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5所示。

2.一种权利要求1所述的蚜虫生长发育相关基因的dsRNA，其特征在于，所述dsRNA可靶向蚜虫基因并可致死蚜虫，所述dsRNA为橘蚜AK基因的dsRNA或橘蚜SOD基因的dsRNA或橘蚜CHS基因的dsRNA中的任意一种，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.6所示。

3.一种含权利要求2所述蚜虫生长发育相关基因的dsRNA的表达载体。

4.一种权利要求3所述的dsRNA表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)从橘蚜细胞中提取蚜虫RNA，然后反转录成cDNA；

(2)以步骤(1)所获得的cDNA产物为模板，设计用于扩增dsRNA的引物对，进行PCR扩增；

(3)对PCR扩增产物进行切胶回收纯化与L4440载体过夜连接，得到表达载体。

5.根据权利要求4所述的dsRNA表达载体的构建方法，其特征在于，用于扩增所述dsRNA的引物对为AK-F、AK-R，SOD-F、SOD–R，CHS-F、CHS-R，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.7、SEQID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12。

6.一种含有权利要求2所述蚜虫生长发育相关基因的dsRNA或权利要求3所述dsRNA表达载体的重组菌。

7.一种权利要求2所述的蚜虫生长发育相关基因的dsRNA的诱导方法，其特征在于，所述诱导方法具体为：取出权利要求6的重组菌加入到LB液体培养基中诱导后提取总RNA，提取后消化处理去除DNA和单链RNA，得到纯净的dsRNA溶液。

8.一种权利要求2所述的蚜虫生长发育相关基因的dsRNA的递送方法，其特征在于，所述递送方法为饲养浸泡法。

9.根据权利要求8所述的蚜虫生长发育相关基因的dsRNA的递送方法，其特征在于，所述饲养浸泡法的具体步骤如下：

(1)选取蚜虫寄主的叶片，对植物叶背注射并涂抹dsRNA溶液和蚜虫人工饲养液并放于培养皿的黄色滤纸上；

(2)在培养皿的滤纸中滴加dsRNA溶液和蚜虫人工饲养液，再把蚜虫放置在寄主叶片上，然后用封口膜封住培养皿，再放于培养箱中，每天更换滤纸、dsRNA溶液、蚜虫人工饲养液和叶片。

10.根据权利要求9所述的蚜虫生长发育相关基因的dsRNA的递送方法，其特征在于，步骤(2)所述蚜虫人工饲养液配置方法具体如下：

(1)使用DEPC水溶解蔗糖作为材料A；

(2)取蚜虫寄主的叶片，研磨破碎后离心取上清液，过滤除菌得到植物的汁液作为材料B；

(3)使用加热的DEPC水溶解抗生素药物，溶解后的液体作为材料C，抗生素为终浓度0.1-0.5g/L头孢氨苄或终浓度0.1-0.5g/L青霉素钠其中一种；

(4)将材料A、B、C以及引诱剂进行混合，加入DEPC水后震荡混匀，调节pH得到混合液。

11.根据权利要求10所述的蚜虫生长发育相关基因的dsRNA的递送方法，其特征在于，步骤(4)所述引诱剂由40～60μL乙醇溶液、500～700μL蔗糖溶液和100～200μL冰醋酸溶液组成。

12.一种权利要求2所述蚜虫生长发育相关基因的dsRNA或权利要求3所述的表达载体在致死蚜虫或者制备致死蚜虫杀虫剂中的应用。

13.根据权利要求12所述的在致死蚜虫或者制备致死蚜虫杀虫剂中的应用，其特征在于，所述致死蚜虫杀虫剂包括复配药剂ds-AK溶液、0.05～0.1％Triton X100和1-5U/μL的RNase抑制剂。

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