CN104109672B - 一种蜕皮激素受体基因EcR dsRNA及其在控制蚜虫危害中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蜕皮激素受体相关基因EcR dsRNA在控制蚜虫危害中的应用。本发明提供的dsRNA，为由序列表中序列2所示的核苷酸和其反向互补序列所示的核苷酸组成的双链RNA。本发明的实验证明，本发明得到麦长管蚜蜕皮激素受体相关基因EcR cDNA的dsRNA，采用体外饲喂dsRNA方法，可抑制麦长管蚜体内EcR基因的表达，导致麦蚜生长发育受阻并产生致死效应。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种蜕皮激素受体基因EcR dsRNA及其在控制蚜虫危害中的应用。
背景技术
麦蚜(尤其是麦长管蚜)是危害中国小麦生产的主要害虫之一，据统计，中国每年小麦蚜虫危害面积可高达0.17亿公顷，占小麦总种植面积的62％，造成减产15％-30％，严重时可高达50％。近年来，由于全球气候变暖、耕作制度变化等因素，使蚜虫的繁殖能力和适应性显著增强，其危害日趋严重。目前，蚜虫防治以喷洒农药为主，但大量使用农药，不仅对人畜有害，而且造成了严重的环境污染。培育抗蚜虫小麦和蔬菜品种是防止蚜虫危害的最有效途径，但由于现有种质资源中缺乏有效的抗蚜基因，抗性机制尚不明确，常规育种难以奏效。挖掘和利用新型抗蚜基因并通过基因工程培育小麦抗蚜新种质具有重要意义。
植物介导的RNAi技术已成为农作物抗虫基因工程的热点之一，通过寄主植物表达相应昆虫特异基因的dsRNA，昆虫取食植物后沉默其相应的基因从而达到控制害虫危害的目的。RNAi现象其作用过程是双链RNA(dsRNA)进入生物体内，被Dicer酶切割成21-23nt的siRNA，siRNA与RNA诱导沉默复合物结合，与互补序列的靶mRNA结合，被Dicer识别，造成靶基因表达量的下降。近年来，利用dsRNA体外饲喂或注射来筛选RNA靶标基因，导致靶标基因表达和沉默，已经广泛应用于昆虫生长发育关键基因的鉴定和功能分析。孟山都公司通过植物介导的昆虫肠道特异基因RNAi技术成功获得了抗玉米根螟的转基因玉米，有效缓解了长期应用Bt转基因玉米诱发昆虫产生抗性等问题，目前已完成生产性试验。棉铃虫肠道中特异P450基因可提高棉铃虫幼虫对棉花次生代谢物质和棉酚的耐受性，试验表明，利用表达棉铃虫P450基因dsRNA的转基因烟草和棉花叶片饲喂棉铃虫幼虫，可导致幼虫体内P450基因的表达量下降，同时幼虫发育受阻，表现出抗棉铃虫性能；Zha等从褐飞虱中肠中克隆了3个高度表达的基因：NlHT1、Nlcar和Nltry，构建载体，转化水稻，褐飞虱取食转基因水稻后，体内3种基因的mRNA表达水平下降了40％到70％，并且在水稻的筛管部发现了dsRNA和siRNA的存在。Pitino等将桃蚜的MpC002(主要在唾液腺中表达)和Rack-1(主要在肠道中表达)2个基因分别导入烟草和拟南芥中，用转基因植物饲喂桃蚜，导致桃蚜体内的MPC002或Rack-1的表达量降低了高达60％，蚜虫的产仔数目减少。
小麦抗蚜虫种质资源缺乏，抗性机制尚不明确，常规育种难以奏效，每年给农业生产造成巨大经济损失。迫切需要挖掘和鉴定新型抗蚜基因并通过基因工程育种提高小麦抗蚜特性。
蚜虫是不完全变态发育，发育过程中要经历蜕皮。已知蜕皮激素与它的核受体EcR和异源二聚体配体USP在细胞核内形成转录复合体，调控EcR和USP激素接受子3(HR3),E75,Broad Complex(BR-C),E93,bFTZ-F1和E74等转录因子的表达，这些转录因子再进一步调控下游效应基因如蛋白酶的表达，进而调控蚜虫的蜕皮、生长发育和繁殖。
发明内容
本发明的一个目的是提供了dsRNA。
本发明提供的dsRNA，为由序列表中序列2所示的核苷酸和其反向互补序列所示的核苷酸组成的双链RNA。
上述dsRNA的编码基因或含有该编码基因的DNA片段也是本发明保护的范围，上述dsRNA的编码基因具体为序列表中序列1所示的核苷酸。
上述dsRNA或上述的编码基因在如下1)-4)中至少一种中的应用也是本发明保护的范围：
1)防治蚜虫或制备防治蚜虫产品；
2)促进蚜虫死亡或制备促进蚜虫死亡产品；
3)抑制蚜虫生长中或制备抑制蚜虫生长产品；
4)抑制蚜虫体内生长发育相关基因ECR的表达或在制备抑制蚜虫体内生长发育相关基因ECR的表达产品。
上述应用为将上述dsRNA导入蚜虫，实现防治蚜虫、促进蚜虫死亡、抑制蚜虫生长和/或抑制蚜虫体内生长发育相关基因ECR的表达；所述导入具体为饲喂；
所述蚜虫具体为麦长管蚜。
本发明的另一个目的是提供具有功能的产品，其活性成分为上述dsRNA或其编码基因；
所述功能为如下1)-4)中任意一种：1)防治蚜虫；2)促进蚜虫死亡；3)抑制蚜虫生长；4)抑制蚜虫体内生长发育相关基因EcR(序列1)表达。
所述蚜虫具体为麦长管蚜。
本发明的实验证明，本发明得到麦长管蚜蜕皮相关基因EcR的dsRNA，采用体外饲喂dsRNA方法，进行了利用RNAi技术沉默麦长管蚜体内EcR基因，导致麦长管蚜产生致死效应，并且随着dsRNA浓度增大和饲喂时间延长，麦长管蚜的死亡率均逐渐增加。结果表明蚜虫生长发育相关基因EcR的保守序列可应用于通过植物介导的RNAi技术提高小麦抗蚜性的研究。
附图说明
图1为基因EcR和GFP的PCR扩增情况
图2为目的基因和对照基因的dsRNA
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中麦长管蚜(钱幼亭，周广和，张淑香，张向才.麦长管蚜有性世代的研究.植物保护，1982,1：14-15。公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得)由中国农业科学院植物保护研究所提供，饲养蚜虫的小麦品种为科农199，将蚜虫接种到小麦幼苗上，放入人工气候箱中(温度(20±2)℃，湿度60％—80％，光周期L∶D＝16∶8)进行繁殖。
质粒提取试剂盒购自Biomega公司，内切酶BamHⅠ、EcoRⅤ及Hiscribe T7体外转录试剂盒购自NEB公司，大肠杆菌菌株DH5α、反转录试剂盒购自北京全式金公司，rTaq DNA聚合酶购自TaKaRa公司，MinElute PCR Cleaning Kit、MinElute Gel Extraction Kit、RNA Cleaning Kit购自Qiagen公司，各种氨基酸及其它试剂均购自北京拜尔迪公司。
实施例1、生长发育相关基因EcR dsRNA的获得
1、麦长管蚜总RNA的提取和cDNA的合成
分别取约20头麦长管蚜，按照北京全式金公司的Trizol试剂盒说明书提取总RNA，用RNA Cleaning Kit进行纯化，反转录合成cDNA第一链，操作步骤均参考试剂盒说明书。
2、引物设计与基因克隆
根据豌豆蚜和桃蚜EcR基因保守序列(genbank登录号分别为NM_001159360和EF174334，提交时间分别为2012年8月31日和2007年4月17日)，利用PrimerPrimer5.0软件设计引物P1(表1)，由北京华大基因公司合成，以麦长管蚜cDNA为模板扩增并测序得到麦长管蚜蜕皮相关基因EcR(序列1)。绿色荧光蛋白基因(GFP)片段从国家小麦改良中心实验室保存的GFP质粒上扩增，利用Primer Primer5.0软件设计引物P2(表1)。
PCR反应体系为10×PCR Buffer5μL、dNTP(2.5mmol·L-1)4μL、rTaq0.5μL，Forward primer(20μmol·L-1)1μL、Reverse primer(20μmol·L-1)1μL、cDNA/GFP质粒1μL，用ddH2O补足至50μL。PCR的反应条件为94℃4min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，39个循环；72℃10min；4℃保存。
以麦长管蚜的cDNA为模板，用P1作为引物进行扩增，得到472bp PCR产物(含40bp的T7启动子序列)，经过测序，该472bp PCR产物具有序列表中的序列1(可人工合成)所示的核苷酸。
以GFP质粒为模板，用P2作为引物进行扩增，得到360bp PCR产物(含40bp的T7启动子序列)，其具有序列表中的序列3(可人工合成)所示的核苷酸。
将上述PCR电泳结果如图1所示，M：Trans2K DNA marker；1：EcR基因；2：GFP，可以看出得到目的片段。
表1 为PCR扩增引物
下划线处是T7RNA聚合酶启动子。
3、EcR基因的dsRNA和GFP的dsRNA的制备
分别回收由上述2得到的2种PCR产物，测定浓度，作为体外转录dsRNA的模板。dsRNA的体外转录体系为10×Transcription Buffer4μL、20×Ribonucleotide Solution Mix2μL、模板(1μg)XμL、20×HMW Mix2μL、T7RNA Polymerase(500units·μL-1)2μL，RNase-Free ddH2O补足至40μL。42℃过夜孵育。反应结束后，取0.5μL反应产物琼脂糖凝胶电泳检测，加入DNaseI和RNaseA消化残留的模板DNA和单链RNA，用MinElute PCR Cleaning Kit纯化反应产物，操作过程参考试剂盒说明书，用无RNase水溶解dsRNA，分光光度计(波长260nm)定量，置于-20℃冰箱中保存，分别得到麦长管蚜EcR dsRNA和GFP dsRNA(图2，M:Trans2K Marker；1:EcR dsRNA(472bp)；2:GFP dsRNA(360bp))。
麦长管蚜EcR dsRNA和GFP dsRNA序列分别如下：
麦长管蚜EcR dsRNA为双链RNA，由正义链和反义链组成，其正义链的核苷酸序列为序列表中的序列2，其反义链的核苷酸序列为序列表中的序列2的反向互补序列，EcR dsRNA编码基因的核苷酸序列为序列表中序列1；
GFP dsRNA为双链RNA，由正义链和反义链组成，其正义链的核苷酸序列为序列表中的序列4，其反义链的核苷酸序列为序列表中的序列4的反向互补序列，GFPdsRNA编码基因的核苷酸序列为序列表中序列5。
也可以人工合成麦长管蚜EcR dsRNA和GFP dsRNA。
实施例2、dsRNA在抑制蚜虫生长中的应用
1、蚜虫人工饲料的配制和饲育器的准备
人工饲料配制和饲育器的准备过程参考文献(李彩霞,高丽锋,高玲玲,李润植.全纯人工营养液饲养蚜虫的研究.山西农业大学学报,1997,17(3):225-228.Li C X,GaoL F,Gao L L,Li R Z.Study on the rearing of aphids on a artificially holidic diets.Journal ofShanxi Agricultural University,1997,17(3):225-228.(in Chinese))进行，用0.2μm的细菌过滤器过滤人工饲料，分装到2.0mL灭菌的离心管保存于-20℃的冰箱中，避免反复冻融。
2、dsRNA(EcR dsRNA)在抑制蚜虫生长中的应用
蚜虫饲喂方法参照如下文献中记载：纠敏,刘树生.利用人工饲料饲养蚜虫的技术.华东昆虫学报,2004,13(2):102-109.Jiu M,Liu S S.Aphid rearing with artificial diets.Entomological Journal of East China,2004,13(2):102-109。
麦长管蚜EcR dsRNA喂养组(dsEcR)：每个蚜虫饲育器中分别放入15头3龄麦长管蚜若蚜，按照每100μL人工饲料中依次分别加入0和750ng的麦长管蚜EcRdsRNA饲喂蚜虫；
麦长管蚜dsGFP组：每个蚜虫饲育器中分别放入15头3龄麦长管蚜若蚜，按照每100μL人工饲料中依次分别加入0和750ng的GFP dsRNA饲喂蚜虫；
上述各组设置3个重复，每两天统计各饲育器中蚜虫的存活数，并更换新的饲料和对应的dsRNA，置于人工气候箱(温度(20±2)℃，湿度60％-80％，光周期L∶D＝16∶8)。使用Excel2003软件对蚜虫死亡率进行统计学分析，计算每种处理的平均值与方差，并进行显著性差异的分析(t-test，n＝3，P<0.01或0.05)。
统计各组每个饲育器中存活蚜虫的数目，计算死亡率，结果如表2所示：
表2 为麦长管蚜EcR dsRNA喂养组和麦长管蚜dsGFP组的死亡率
*表示与对照组(0ng/μL)相比，试验组结果差异显著(t-test,n＝3,P<0.05)，
**表示与对照组相比，试验组结果差异极显著(t-test,n＝3,P<0.01)。
从表2可以看出，麦长管蚜的死亡率均随着饲喂dsRNA的时间而不断升高；7.5ng·μL-1EcR dsRNA饲喂2天、4天、6天和8天后，麦长管蚜的平均死亡率为17.78％、42.22％、68.89％和77.78％，与对照相比，除了饲喂2天的处理其他处理均存在显著性差异，饲喂GFP dsRNA的试验组死亡率与对照相比则没有显著性的差异。
2、dsRNA(EcR dsRNA)饲喂蚜虫后，可抑制体内目标基因EcR的表达
去掉T7启动子序列合成荧光定量EcR引物P3(表1)，合成内参基因(ACTIN)引物P4(表1)。
收集上述2中7.5ng/μl dsRNAs饲喂后存活的麦长管蚜(2、4、6和8d)，提取蚜虫的RNA，反转录成cDNA稀释100、101、102、103、104、105倍，作为荧光定量PCR的模板，以P3和P4作为引物进行相对定量RT-PCR分析。内参引物为P4。
实时荧光定量PCR体系为Forward Primer(10μmol·L-1)0.5μL、Reverse Primer(10μmol·L-1)0.5μL、2×TransStartTM Green qPCR SuperMix12.5μL、Passive Reference Dye0.5μL、模板cDNA1μL，用ddH2O至25μL。
PCR循环程序为95℃30s，95℃5s，57℃15s，72℃10s，40个循环，每个样本3个重复。最终结果的计算采用2-△△Ct法(Ct表示循环数)进行计算，即△△Ct＝(Ct(dsRNA)－Ct(actin))试验组－(Ct(dsRNA)－Ct(actin))对照组，使用Excel2003软件进行统计学分析，计算每种处理的平均值与方差，并进行显著性差异的分析(t-test，n＝3，P<0.01或0.05)。
统计在饲喂EcR dsRNA的2、4、6和8d后，各组蚜虫体内EcR的表达量，以不饲喂为对照(第0d)，结果如表3：
表3 为单独饲喂不同dsRNA后麦长管蚜EcR相对表达量
*表示与对照组相比，试验组结果差异显著(t-test,n＝3,P<0.05)，
**表示与对照组相比，试验组结果差异极显著(t-test,n＝3,P<0.01)。
可以看出，麦长管蚜体内EcR(序列1)表达量依次降低了32％、64％、82％和98％,说明通过饲喂dsRNA能够在麦长管蚜体内引起相应基因的RNAi效应，导致蜕皮相关基因EcR的表达量明显降低，引起蚜虫死亡或生长受到抑制。
Claims (7)
1.dsRNA，为由序列表中序列2所示的核苷酸和其反向互补序列所示的核苷酸组成的双链RNA。
2.权利要求1中所述dsRNA的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述dsRNA的编码基因的核苷酸序列由序列表中序列1所示的核苷酸和其反向互补序列所示的核苷酸组成。
4.权利要求1所述dsRNA或权利要求2所述的编码基因在如下1)-3)中至少一种中的应用：
1)促进蚜虫死亡或制备促进蚜虫死亡产品；
2)抑制蚜虫生长或制备抑制蚜虫生长产品；
3)抑制蚜虫体内生长发育相关基因EcR的表达或在制备抑制蚜虫体内生长发育相关基因EcR的表达产品；
所述蚜虫为麦长管蚜。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述应用为将权利要求2所述dsRNA的编码基因或含有所述编码基因的DNA片段导入蚜虫，实现促进蚜虫死亡、抑制蚜虫生长和/或抑制蚜虫体内生长发育相关基因EcR的表达。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：
所述导入为饲喂。
7.一种具有功能的产品，其活性成分为权利要求1所述dsRNA或权利要求2所述的编码基因，所述功能为如下1)-3)中任意一种：1)促进蚜虫死亡；2)抑制蚜虫生长；3)抑制蚜虫体内生长发育相关基因EcR表达。
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