CN105255893B - 抑制蚜虫氯离子通道基因表达的dsRNA及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抑制蚜虫氯离子通道基因表达的dsRNA及其应用。所述抑制蚜虫氯离子通道基因表达的dsRNA具体为由SEQ ID No：1所示序列的核苷酸和其反向互补序列的核苷酸组成的双链RNA。所述应用为将所述dsRNA导入蚜虫，从而实现防治蚜虫、降低蚜虫存活率或抑制蚜虫氯离子通道基因表达。本发明采用体外饲喂dsRNA方法，利用RNAi技术沉默麦长管蚜氯离子通道基因，导致麦长管蚜产生致死效应。对饲喂后蚜虫氯离子通道基因实时荧光定量PCR研究表明，氯离子通道基因的表达明显受到抑制。表明蚜虫氯离子通道基因的序列可应用于通过植物介导的RNAi技术提高小麦抗蚜性的研究。

Description

抑制蚜虫氯离子通道基因表达的dsRNA及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种抑制蚜虫氯离子通道基因表达的dsRNA及其应用。

背景技术

蚜虫是危害作物生产的主要害虫之一，近年来全球气候变暖、耕作制度变化等因素使蚜虫的繁殖能力和适应性显著增强，其危害日趋严重，每年造成数以亿计的经济损失。以麦蚜为例，麦蚜以成若蚜聚集在小麦叶部、茎部、穗部等，吸食汁液造成叶片不规则皱缩、卷曲、失绿，严重时造成植株死亡。麦蚜分泌的蜜露附着在植株表面，降低植株的光合作用，并易诱发煤烟病等。同时，麦蚜还是黄矮病毒重要的传播载体，引起小麦黄矮病流行。据全国农作物病虫监测网预报，2013年我国麦蚜危害面积高达2.5亿亩。目前，蚜虫防治以喷洒农药为主，但大量使用农药，不仅对人畜有害，而且造成了严重的环境污染。培育抗虫作物品种是防止蚜虫为害的最有效途径，但由于农作物现有种质资源中缺乏有效的抗蚜基因，且抗性机制不明确，常规抗虫育种难以奏效。因此，利用转基因技术培育抗蚜新种质，对于保障我国粮食安全和环境安全具有重要意义。

植物介导的RNAi（RNA干扰）技术能特异抑制昆虫特定基因的表达，使昆虫的生长发育受阻或致死，进而有效控制害虫危害，已成为农作物抗虫基因工程的热点之一。RNAi现象是由dsRNA（double-stranded RNA）介导的一种序列特异性转录后基因沉默机制，dsRNA进入生物体后被宿主细胞中的Dicer酶切割成 21～23nt的siRNA（small interferingRNA）；siRNA在RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，反义siRNA与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencingcomplex，RISC），继之RISC以序列互补的方式与靶mRNA 结合并使之降解，造成靶标基因表达量下降。孟山都公司通过植物介导的昆虫肠道特异基因RNAi技术成功获得了抗玉米根螟的转基因玉米，有效缓解了长期应用Bt转基因玉米诱发昆虫产生抗性等问题，目前已完成生产性试验。近年来，RNAi技术在蚜虫防治方面也展示出很好的应用前景。Pitino等分别在烟草和拟南芥中表达桃蚜MpC002和Rack-1基因的dsRNA，桃蚜取食转基因植物后，导致桃蚜体内MPC002或 Rack-1基因的表达量降低60%，蚜虫的产仔数目减少。

氯离子通道是分布于细胞膜或细胞器质膜上的一类能够转运氯离子及其他阴离子的通道蛋白，广泛存在于各种生物体内。氯离子通道可调控生物体内的不同生理过程和细胞功能，如pH、细胞体积、电兴奋性、盐的运输和肌肉细胞的电压稳定性等。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种抑制蚜虫氯离子通道基因表达的dsRNA，可利用RNAi技术沉默蚜虫氯离子通道基因，使氯离子通道功能缺失而引起蚜虫生理紊乱，进而造成蚜虫死亡。

为解决以上问题，本发明通过以下技术方案实现：

设计一种抑制蚜虫氯离子通道基因表达（SaCIC4）的dsRNA，具体为由SEQ ID No：1所示序列的核苷酸和其反向互补序列的核苷酸组成的双链RNA。对应的，对该序列经简单缺失、修饰等变换后，使其能达到基本相同抑制效果的核苷酸序列，也应当是与该序列实质上相同的发明。

编码所述dsRNA的DNA分子也属于本发明的保护范围，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。

含有所述DNA分子的表达盒、重组载体或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述dsRNA、或所述DNA分子、或所述表达盒、重组载体或重组菌，在如下（1）～（3）任一项中的应用也属于本发明的保护范围：

（1）防治蚜虫或制备防治蚜虫的产品；

（2）降低蚜虫存活率或制备降低蚜虫存活率的产品；

（3）抑制蚜虫氯离子通道基因表达或制备抑制蚜虫氯离子通道基因表达的产品。

所述应用是将所述dsRNA导入蚜虫，从而实现防治蚜虫、降低蚜虫存活率或抑制蚜虫氯离子通道基因表达。

在本发明中，所述导入的方式具体为饲喂。

更加具体的，所述饲喂为：将所述dsRNA混合于液体饲料中，得到混合液，用所述混合液饲喂蚜虫；所述dsRNA在所述混合液中的终浓度优选为10 ng/μL；所述饲喂持续的时间为2天以上，优选2～8天。

活性成分为如下A～C中任一种的产品也属于本发明的保护范围：

A、所述dsRNA；

B、所述DNA分子；

C、所述表达盒、重组载体或重组菌；

所述产品具有如下（1）～（3）功能中的至少一种：

（1）防治蚜虫；

（2）降低蚜虫存活率；

（3）抑制蚜虫氯离子通道基因表达。

在本发明中，所述蚜虫可为麦蚜，所述麦蚜为麦长管蚜，具体为3龄麦长管蚜。

本发明具有积极有益的技术效果：

1.实验研究证明，本发明得到麦长管蚜SaCIC4 cDNA序列的dsRNA，采用体外饲喂dsRNA方法，进行了利用RNAi技术沉默麦长管蚜氯离子通道基因，导致麦长管蚜产生致死效应，并且随着饲喂时间延长，麦长管蚜的死亡率均逐渐增加；显然该dsRNA及其对应的表达盒、重组载体或重组菌等产品在蚜虫防治领域有着重要的应用价值。

2. 众所周知的是，RNAi是根据序列特异性进行基因沉默的，而大多数已知品种蚜虫的CIC4基因序列和麦长管蚜CIC4相似性较高（例如只需要有3个21bp的相同序列），即可引起相关基因的沉默。因不同类型蚜虫的同源基因序列相似性较大，所以本发明dsRNA也可广泛用于其它品种蚜虫的防治。

3.对饲喂后蚜虫氯离子通道基因实时荧光定量PCR研究表明，氯离子通道基因的表达明显受到抑制。这表明蚜虫氯离子通道基因的序列可应用于通过植物介导的RNAi技术提高小麦抗蚜性的应用研究，从而为蚜虫的防治和杀灭提供了一种全新的且安全有效的途径。

附图说明

图1蚜虫氯离子通道基因和GFP的PCR扩增结果；

图中 M：100 bp marker；1：GFP；2：麦长管蚜。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可市购。

下述实施例中所用蚜虫为麦长管蚜，由中国农业科学院植物保护研究所提供，饲养蚜虫的小麦品种为科农199，将蚜虫接种到小麦幼苗上，放入人工气候箱中（温度（20±2）℃，湿度60%～80%，光周期L∶D=16∶8）进行繁殖。

16318hGFP质粒：“倪志勇，徐兆师，刘丽，李连城，柴岩，陈明，马有志. 小麦转录因子TaDREB6基因的克隆及鉴定. 麦类作物学报，2008, 28：357-363”，公众可从南阳师范学院生命科学与技术学院获得。

质粒提取试剂盒购自Biomega公司，内切酶BamHⅠ、EcoRⅤ及Hiscribe T7体外转录试剂盒购自NEB公司，大肠杆菌菌株DH5α、反转录试剂盒购自北京全式金公司，rTaq DNA聚合酶购自TaKaRa公司，MinElute PCR Cleaning Kit、MinElute Gel Extraction Kit、RNACleaning Kit购自Qiagen公司，各种氨基酸及其它试剂均购自北京拜尔迪公司。

实施例1蚜虫SaCIC4基因的dsRNA的获得

（1）麦长管蚜总RNA的提取和cDNA的合成

分别取约20头麦长管蚜，按照北京全式金公司的Trizol试剂盒说明书提取总RNA，用RNA Cleaning Kit进行纯化，反转录合成cDNA第一链，操作步骤均参考试剂盒说明书。

（2）引物设计与基因克隆

利用Primer Primer5.0软件设计引物P1-F和P1-R，由北京华大基因公司合成。绿色荧光蛋白基因（GFP）片段从南阳师范学院生命科学与技术学院实验室保存的16318hGFP质粒上扩增，利用Primer Primer5.0软件设计引物 P2-F和P2-R。

P1-F：5’-TAATACGACTCACTATAGGGGAAAATGAAAAAATCGAAAG-3’（下划线后的序列为SEQ ID No：2的第1～20位）；

P1-R：5’-TAATACGACTCACTATAGGGCGCAAGTGAGACAACAGAC-3’（下划线后的序列为SEQ ID No：2的第152～170位的反向互补序列）。

P2-F：5’-TAATACGACTCACTATAGGGTGAAGTCAAGTTTGAAGGTG-3’（下划线后的序列为SEQ ID No：4的第1～20位）；

P2-R：5’-TAATACGACTCACTATAGGGTTTTGTTGATAATGGTCTGC-3’（下划线后的序列为SEQ ID No：4的第206～225位的反向互补序列）。

各引物序列中下划线处为T7 RNA聚合酶启动子序列。

PCR反应体系为：5×PCR Buffer 10 μL、dNTP（2.5 mmol·L^-1）4 μL、Pfu 0.5 μL，正向引物（10 μmol·L^-1）1 μL、反向引物（10 μmol·L^-1）1 μL、cDNA/GFP质粒 1 μL，用ddH₂O补足至50 μL。

PCR的反应程序为：94℃ 3 min；94℃ 30 s，51℃或55℃ 30 s，72℃ 30s，35个循环；72℃ 10 min；4℃保存。（P1-F/P1-R的退火温度为51℃；P2-F/P2-R的退火温度为55℃）

以麦长管蚜的cDNA为模板，用P1-F/P1-R作为引物进行扩增，得到210bp PCR产物（含40 bp的T7启动子序列），经过测序，该210bp PCR产物除去两端T7 RNA聚合酶启动子序列外的序列为SEQ ID No：2（可人工合成）。

以16318hGFP质粒为模板，用P2-F/P2-R作为引物进行扩增，得到265 bp PCR产物（含40 bp的T7启动子序列），经过测序，该265 bp PCR产物除去两端T7 RNA聚合酶启动子序列外的序列为SEQ ID No：4（可人工合成）。

将上述PCR产物进行电泳，结果如图1所示，M：100 bp marker；1：GFP，可以看出得到目的片段；2：麦长管蚜Sitobion avenae。

将上述210 bp PCR产物核苷酸序列去掉T7启动子序列提交到NCBI数据库（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）进行BLAST比对分析，BLAST结果表明，与蚜虫氯离子通道蛋白4基因具有97%同源性。

（3）蚜虫氯离子通道基因和GFP的dsRNA的制备

分别回收由上述2得到的2种PCR产物，测定浓度，作为体外转录dsRNA的模板。dsRNA的体外转录体系为10×Transcription Buffer 4 μL、20×RibonucleotideSolution Mix 2 μL、模板（1μg）X μL、20×HMW Mix 2 μL、T7 RNA Polymerase（500units·μL^-1）2 μL，RNase-Free ddH₂O补足至40 μL。42 ℃过夜孵育。

反应结束后，取0.5 μL反应产物琼脂糖凝胶电泳检测，加入DNaseI和RNaseA消化残留的模板DNA和单链RNA，用MinElute PCR Cleaning Kit纯化反应产物，操作过程参考试剂盒说明书，用无RNase水溶解dsRNA，分光光度计（波长260 nm）定量，置于-20℃冰箱中保存，分别得到麦长管蚜SaCIC4和GFP dsRNA。

将蚜虫SaCIC4 dsRNA和GFP dsRNA分别测序，结果如下：

蚜虫SaCIC4dsRNA为双链RNA，由正义链和反义链组成，其正义链的核苷酸序列为SEQ ID No：1，其反义链的核苷酸序列为SEQ ID No：1的反向互补序列。氯离子通道基因的核苷酸序列含有SEQ ID No：2所示序列；

GFP dsRNA为双链RNA，由正义链和反义链组成，其正义链的核苷酸序列为SEQ IDNo：3，其反义链的核苷酸序列为SEQ ID No：3的反向互补序列。GFP dsRNA编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No：4。

当然，也可以直接人工合成SEQ ID No：1所示的麦长管蚜SaCIC4 dsRNA和SEQ IDNo：3所示的GFP基因dsRNA用于下述实施例。

实施例2 SaCIC4 dsRNA在抑制蚜虫生长中的应用

（1）蚜虫人工饲料的配制和饲育器的准备

人工饲料配制和饲育器的准备过程参考文献（李彩霞, 高丽锋, 高玲玲, 李润植. 全纯人工营养液饲养蚜虫的研究. 山西农业大学学报, 1997, 17(3): 225-228.）进行，用0.2 μm的细菌过滤器过滤人工饲料，分装到2.0 mL灭菌的离心管保存于-20℃的冰箱中，避免反复冻融。

（2）dsRNA（SaCIC4dsRNA）在抑制蚜虫生长中的应用

蚜虫饲喂方法参照如下文献中记载：纠敏, 刘树生. 利用人工饲料饲养蚜虫的技术. 华东昆虫学报, 2004, 13(2): 102-109.。

麦长管蚜SaCIC4 dsRNA喂养组：每个蚜虫饲育器中分别放入20头3龄麦长管蚜若蚜，按照每100μL人工饲料中依次分别加入0和1000ng的麦长管蚜SaCIC4dsRNA饲喂蚜虫；

麦长管蚜dsGFP组：每个蚜虫饲育器中分别放入20头3龄麦长管蚜若蚜，按照每100μL人工饲料中依次分别加入0和1000 ng的GFP dsRNA饲喂蚜虫；

上述各组设置3个重复，每两天统计各饲育器中蚜虫的存活数，并更换新的饲料和对应的dsRNA，置于人工气候箱（温度（20±2）℃，湿度60%～80%，光周期L∶D=16∶8）。使用Excel 2007软件对蚜虫死亡率进行统计学分析，计算每种处理的平均值与方差，并进行显著性差异的分析（t-test，n=3，P<0.01或0.05）。

统计各组每个饲育器中存活蚜虫的数目，计算死亡率，结果如表1所示。

表1麦长管蚜喂养组死亡率对比表

。

从表1可以看出，麦长管蚜的死亡率均随着饲喂SaCIC4 dsRNA的时间增加，麦长管蚜的平均死亡率随之增加，10ng·μL^-1 SaCIC4 dsRNA饲喂2天、4天、6天和8天后，麦长管蚜的平均死亡率为31.67%、45%、63.33%和73.33%，其中饲喂2、4天、6天和8天后的处理与对照组（0 ng/μL）相比均存在显著性差异（P<0.01），饲喂GFP dsRNA的试验组死亡率与对照组（0ng/μL）相比则没有显著性的差异。

（3）dsRNA（SaCIC4 dsRNA）抑制蚜虫氯离子通道基因的表达

利用Primer Primer5.0软件设计扩增SaCIC4基因的引物P3-F和P3-R，扩增片段大小为242 bp，合成内参基因（ACTIN）引物P4-F和P4-R。

P3-F：5’-GAAAATGAAAAAATCGAAAG-3’（ SEQ ID No：2的第1～20位）；

P3-R：5’-CGCAAGTGAGACAACAGAC-3’（ SEQ ID No：2的第152～170位的反向互补序列）。

P4-F：5’-CCGAAAAGCTGTCATAATGAAGACC-3’；

P4-R：5’-GGTGAAACCTTGTCTACTGTTACATCTTG-3’。

收集上述步骤2中各组10 ng/μl dsRNAs饲喂后存活的麦长管蚜（2、4、6和8 d），提取蚜虫的RNA，反转录成cDNA稀释10⁰、10¹、10²、10³、10⁴、10⁵倍，作为荧光定量PCR的模板，以P3-F/P3-R作为引物进行相对定量RT-PCR分析。内参引物为P4-F/P4-R。

实时荧光定量PCR体系为：正向引物（10 μmol·L^-1）0.5 μL、反向引物（10 μmol·L^-1）0.5 μL、2×TransStart _TM Green qPCR SuperMix 12.5 μL、Passive Reference Dye0.5 μL、模板cDNA 1 μL，用ddH₂O至25 μL。

PCR循环程序为95℃ 30 s，95℃ 5 s，51℃或57℃ 15 s，72℃ 10 s，40个循环，每个样本3个重复。（P3-F/P3-R的退火温度为51℃；P4-F/P4-R的退火温度为57℃）

最终结果的计算采用2^-△△Ct法（Ct表示循环数）进行计算，即△△Ct=（Ct(SaCIC4)-Ct(actin)）_试验组-（Ct(SaCIC4)-Ct(actin)）_对照组，使用Excel 2007软件进行统计学分析，计算每种处理的平均值与方差，并进行显著性差异的分析（t-test，n=3，P<0.01或0.05）。

统计在饲喂麦长管蚜SaCIC4 dsRNA 2、4、6和8 d后，各组蚜虫体内氯离子通道表达量，结果如表2所示。

表2为饲喂组麦长管蚜氯离子通道基因相对表达量

。

可以看出，麦长管蚜氯离子通道基因在2、4、6和8 d的表达量，与对照（0天的表达量）相比，依次降低了27%、44%、70%和79%，在统计学上表现为差异显著（P<0.05或P<0.01）。饲喂GFP dsRNA的蚜虫体内SaCIC4表达水平则没有显著性的变化，进一步说明通过饲喂SaCIC4 dsRNA能够在麦长管蚜体内引起氯离子通道基因的RNAi效应，致使蚜虫氯离子通道基因表达量明显降低甚至沉默，导致蚜虫死亡。

SEQUENCE LISTING

<110> 南阳师范学院

<120> 抑制蚜虫氯离子通道基因表达的dsRNA及其应用

<130> /

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 170

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

gaaaaugaaa aaaucgaaag acauaucaug aagaacgugc cagguggaua caaucuauuu 60

guacaggaua aagaaguggc cacgcugauu gaaaacuugu acaguaagcu gaagcugaug 120

cuauuaaaaa aagacgaugu aagcauaaau agucuguugu cucacuugcg 170

<210> 2

<211> 170

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gaaaatgaaa aaatcgaaag acatatcatg aagaacgtgc caggtggata caatctattt 60

gtacaggata aagaagtggc cacgctgatt gaaaacttgt acagtaagct gaagctgatg 120

ctattaaaaa aagacgatgt aagcataaat agtctgttgt ctcacttgcg 170

<210> 3

<211> 225

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 3

ugaagucaag uuugaaggug auacccuugu uaauagaauc gaguuaaaag guauugauuu 60

uaaagaagau ggaaacauuc uuggacacaa aauggaauac aacuauaacu cacauaaugu 120

auacaucaug ggagacaaac caaagaaugg caucaaaguu aacuucaaaa uuagacacaa 180

cauuaaagau ggaagcguuc aauuagcaga ccauuaucaa caaaa 225

<210> 4

<211> 225

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgaagtcaag tttgaaggtg atacccttgt taatagaatc gagttaaaag gtattgattt 60

taaagaagat ggaaacattc ttggacacaa aatggaatac aactataact cacataatgt 120

atacatcatg ggagacaaac caaagaatgg catcaaagtt aacttcaaaa ttagacacaa 180

cattaaagat ggaagcgttc aattagcaga ccattatcaa caaaa 225

<210> 5

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

taatacgact cactataggg gaaaatgaaa aaatcgaaag 40

<210> 6

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

taatacgact cactataggg cgcaagtgag acaacagac 39

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<211> 40

<212> DNA

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<400> 7

taatacgact cactataggg tgaagtcaag tttgaaggtg 40

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<211> 40

<212> DNA

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<400> 8

taatacgact cactataggg ttttgttgat aatggtctgc 40

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gaaaatgaaa aaatcgaaag 20

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<212> DNA

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cgcaagtgag acaacagac 19

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<212> DNA

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<400> 11

ccgaaaagct gtcataatga agacc 25

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<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ggtgaaacct tgtctactgt tacatcttg 29

Claims (8)

1.一种抑制蚜虫氯离子通道基因表达的dsRNA，为由SEQ ID No：1所示序列的核苷酸和其反向互补序列的核苷酸组成的双链RNA。

2.编码权利要求1所述dsRNA的DNA分子，为由SEQ ID No：2所示序列的核苷酸和其反向互补序列的核苷酸组成的双链DNA。

3.含有权利要求2所述DNA分子的表达盒、重组载体或重组菌。

4.权利要求1所述dsRNA、或权利要求2所述DNA分子、或权利要求3所述表达盒、重组载体或重组菌在如下（1）～（3）任一项中的应用：

（1）防治麦长管蚜或制备防治麦长管蚜的产品；

（2）降低麦长管蚜存活率或制备降低麦长管蚜存活率的产品；

（3）抑制麦长管蚜氯离子通道基因表达或制备抑制麦长管蚜氯离子通道基因表达的产品。

5.权利要求4所述应用，其特征在于：将权利要求1所述dsRNA导入麦长管蚜，从而实现防治麦长管蚜、降低麦长管蚜存活率或抑制麦长管蚜氯离子通道基因表达。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述导入的方式为饲喂。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述饲喂为：将所述dsRNA混合于液体饲料中，得到混合液，用所述混合液饲喂麦长管蚜；所述dsRNA在所述混合液中的终浓度为10ng/μL；所述饲喂持续的时间为2～8天。

8.活性成分为如下A～C中任一种的产品：

A、权利要求1所述dsRNA；

B、权利要求2所述DNA分子；

C、权利要求3所述表达盒、重组载体或重组菌；

所述产品具有如下（1）～（3）功能中的至少一种：

（1）防治蚜虫；

（2）降低蚜虫存活率；

（3）抑制蚜虫氯离子通道基因表达。