CN107760682B - 一种可用于分子防治害虫的核酸序列及其应用 - Google Patents

一种可用于分子防治害虫的核酸序列及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107760682B
CN107760682B CN201710972602.7A CN201710972602A CN107760682B CN 107760682 B CN107760682 B CN 107760682B CN 201710972602 A CN201710972602 A CN 201710972602A CN 107760682 B CN107760682 B CN 107760682B
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
acid sequence
spodoptera
sequence
dsrna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201710972602.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107760682A (zh
Inventor
罗开珺
董树美
李明
崔继辉
张玮
张雪雯
寇田超
蔡秋宸
张力丹
何浩娟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yunnan University YNU
Original Assignee
Yunnan University YNU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yunnan University YNU filed Critical Yunnan University YNU
Priority to CN201710972602.7A priority Critical patent/CN107760682B/zh
Publication of CN107760682A publication Critical patent/CN107760682A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107760682B publication Critical patent/CN107760682B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N37/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids
    • A01N37/44—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids containing at least one carboxylic group or a thio analogue, or a derivative thereof, and a nitrogen atom attached to the same carbon skeleton by a single or double bond, this nitrogen atom not being a member of a derivative or of a thio analogue of a carboxylic group, e.g. amino-carboxylic acids
    • A01N37/46—N-acyl derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • A61B5/103—Detecting, measuring or recording devices for testing the shape, pattern, colour, size or movement of the body or parts thereof, for diagnostic purposes
    • A61B5/107—Measuring physical dimensions, e.g. size of the entire body or parts thereof
    • A61B5/1072—Measuring physical dimensions, e.g. size of the entire body or parts thereof measuring distances on the body, e.g. measuring length, height or thickness
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • A61B5/103—Detecting, measuring or recording devices for testing the shape, pattern, colour, size or movement of the body or parts thereof, for diagnostic purposes
    • A61B5/107—Measuring physical dimensions, e.g. size of the entire body or parts thereof
    • A61B5/1079—Measuring physical dimensions, e.g. size of the entire body or parts thereof using optical or photographic means
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B2503/00—Evaluating a particular growth phase or type of persons or animals
    • A61B2503/40—Animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B2503/00—Evaluating a particular growth phase or type of persons or animals
    • A61B2503/42—Evaluating a particular growth phase or type of persons or animals for laboratory research
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

本申请涉及一种可用于分子防治害虫的核酸序列及其应用。该核酸序列包含称之为核酸序列I的核苷酸序列，所述核酸序列I选自如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，和与如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列具有相同功能的除去斜纹夜蛾(Spodoptera litura Fabricius)之外的斜纹夜蛾属(Spodoptera)其他物种的核苷酸序列中的一种。其可用于防治斜纹夜蛾(Spodoptera litura Fabricius)。

Description

一种可用于分子防治害虫的核酸序列及其应用
技术领域
本申请涉及一种可用于分子防治害虫的核酸序列，特别涉及该核酸序列在防治斜纹夜蛾属(Spodoptera)害虫中的应用。
背景技术
斜纹夜蛾属于鳞翅目夜蛾科，广泛分布在世界各地，在我国各地均有发生，是典型的杂食性昆虫。已知可以危害的植物达99科290多种，包括棉花、烟草和蔬菜等农作物。由于斜纹夜蛾繁殖能力强，且易对农药产生抗药性，近年来，对蔬菜和花卉的危害越来越严重，防治难度也越来越大。目前，主要依靠化学农药来防治，但化学农药大量和长期使用，一方面害虫已经产生了耐药性；另一方面，带来了环境污染、水质污染及人体健康等一系列问题。需求有效的替代防治技术迫在眉睫。
伴随着分子生物学的高速发展，将分子生物学技术应用到害虫防治中成为可能。
分子防治具有如下优点：减少农药的使用，避免环境污染，维持生态平衡，提高农作物产品质量，并且不会产生抗药性。
但是，如何将分子生物学技术应用到害虫防治中，则需要确定具体可应用的DNA序列。
发明内容
本申请之一提供了一种核酸序列，其包含称之为核酸序列I的核苷酸序列，所述核酸序列I选自如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，和与如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列具有相同功能的除去斜纹夜蛾(Spodoptera litura Fabricius)之外的斜纹夜蛾属(Spodoptera)其他物种的核苷酸序列中的一种。
其中，如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列可以从斜纹夜蛾(Spodoptera lituraFabricius)中获得。
本领域的技术人员普遍认为，在相同属中，一般都会存在功能相同的DNA序列上有差异的序列，因此，在斜纹夜蛾属(Spodoptera)昆虫的其他物种中也会存在与来源于斜纹夜蛾(Spodoptera litura Fabricius)中的如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列相同功能的核酸序列。并且在需要的情况下，这些核酸序列可以根据本领域的常规技术获得。因此，所述核酸序列I还可以选自与如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列具有相同功能的除去斜纹夜蛾(Spodoptera litura Fabricius)之外的斜纹夜蛾属(Spodoptera)其他物种的核苷酸序列中的一种。
双链RNA(dsRNA)介导的基因沉默被称为RNA干扰(RNAi)，该技术能靶向抑制昆虫特异基因的表达，使昆虫的生长发育受阻或致死，进而有效控制害虫危害，已经成为农作物抗虫基因工程研究的热点之一。RNAi的过程主要包括起始阶段和效应阶段。起始时，dsRNA进入生物体内，被宿主细胞的Dicer酶特异识别，Dicer酶把dsRNA切割成21bp-25bp的小片段(small interference RNA,siRNA)；siRNA在RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，反义siRNA与一些内切酶、外切酶及解旋酶等结合形成RNA诱导的沉默复合(RNA-induced silencing complex，RISC)，接着RISC以系列互补的方式与靶mRNA结合使之降解，从而靶基因表达量下调，从而达到沉默基因的效果。
至少根据上述RNAi的特点，可以从所述核酸序列I中选取含有可以用作siRNA的序列用于使用。其中，选取的序列中可以含有一个siRNA，也可以含有多个siRNA。只是在仅含有一个siRNA的情况下，达到沉默基因的效率可能不如含有多个siRNA的情况下高。因此，本申请之二提供了一种核酸序列，其包含称之为核酸序列II的截取于如SEQ ID No.1所示的核酸序列，并且所述核酸序列II具有20-600bp的长度。
在一个具体实施方式中，所述核酸序列II具有300-600bp的长度。其中，核酸序列II越长，则其包含的siRNA序列的条数则越多，沉默基因的效果则会越好。另外，综合DNA片段克隆难易程度的考虑，可以使核酸序列II尽量长。当然，也可以直接使用全长，即本申请之一中的核酸序列I来使用。
在设计使用的DNA片段过程中，虽然与核酸序列I或包含在其中的核酸序列II100％一致可以降低操作难度，属于优选的情况。但是，并非一定要与核酸序列I或包含在其中的核酸序列II 100％一致，其中的原则便是只要保证包含在其中的siRNA功能的部分与核酸序列I或包含在其中的核酸序列II中相应的部分尽量100％一致外，其他部分可以存在碱基差异，并且这种碱基差异丝毫不会影响核酸序列的功能。本申请之三提供了一种核酸序列，其包含称之为核酸序列III的能够与如本申请之一所述的核酸序列中的所述核酸序列I，或如本申请之二所述的核酸序列中的所述核酸序列II具有95-99.9％的一致性的核酸序列。
在一个具体实施方式中，所述核酸序列III具有20-600bp的长度。
在一个具体实施方式中，所述核酸序列III具有300-600bp的长度。
在一个具体实施方式中，包含在所述核酸序列III中的siRNA功能部分与核酸序列I或包含在其中的核酸序列II中的相应的siRNA功能部分100％一致。
在一个具体实施方式中，本申请之一、本申请之二和本申请之三中任意一项的核酸序列为单链DNA序列、双链DNA序列、单链RNA序列和双链RNA序列中的至少一种。
本申请之四提供了本申请之一的核酸序列中的所述核酸序列I编码的氨基酸序列，或所述核酸序列I编码的氨基酸序列的截短氨基酸序列；优选所述氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示，或如SEQ ID No.2所示的截短氨基酸序列。
本申请之五提供了本申请之一、本申请之二和本申请之三中任意一项的核酸序列，或本申请之四中的氨基酸序列在用于防治斜纹夜蛾属(Spodoptera)害虫中的应用。
在一个具体实施方式中，使用如SEQ ID No.1所示的核酸序列、其截短序列(例如该截短序列可以为本申请之二相应的核酸序列II)或与前两者之一对应的本申请之三中的所述核酸序列III用于防治斜纹夜蛾(Spodoptera litura Fabricius)。
在一个具体实施方式中，使用如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或其截短氨基酸序列用于防治斜纹夜蛾(Spodoptera litura Fabricius)。
在RNAi研究中，合适的靶基因和合适的导入方法是有效沉默基因的关键。目前，dsRNA导入到昆虫体内主要有三种方式，即注射、浸泡或是饲喂，其中，饲喂法操作简单，成本低，是最常用的方法。直接注射siRNA是RNAi的另一种方法，需要合siRNA片段，配以微注射装置对幼虫进行单头注射，这样的方式成本过高，也不适合应用于害虫的生物防治。斜纹夜蛾核型多角体病毒是目前在田间广泛使用的一种生物杀虫剂。部分低毒、低残留的化学农药也用于防治斜纹夜蛾。
因此，在一个具体实施方式中，使用RNAi来防治斜纹夜蛾属(Spodoptera)害虫。
本申请之五提供了一种评价本申请之一、本申请之二和本申请之三中任意一项的核酸序列对斜纹夜蛾属(Spodoptera)昆虫发育影响的方法，其包括如下步骤：
步骤一：在细菌中转录本申请之一、本申请之二和本申请之三中任意一项的核酸序列得到目标dsRNA序列，用于处理组；在细菌中转录阴性核酸序列得到阴性dsRNA序列，用于阴性对照组；
步骤二：处理组：将所述目标dsRNA序列与饲料混合后饲喂1日龄-10日龄的所述斜纹夜蛾属昆虫的幼虫；
阴性对照组：将阴性dsRNA序列与饲料混合后饲喂1日龄-10日龄的所述斜纹夜蛾属昆虫的幼虫；
并且处理组和阴性对照组的所述斜纹夜蛾属昆虫的龄期相同；处理组和阴性对照组的饲喂时间相同；
步骤三：测定步骤二中的所述斜纹夜蛾属昆虫的头壳宽度，每天测量一次，持续测量的天数为至少8-12天；优选持续测量的天数为8-12天；通过分析所述头壳宽度来评价如申请之一、本申请之二和本申请之三中任意一项的核酸序列对斜纹夜蛾属昆虫发育影响。
在一个具体实施方式中，与饲料混合的目标dsRNA序列可以为包含于转录其的细菌中的形式，也可以为从转录其的细菌中提纯后的形式；优选为包含于转录其的细菌中的形式，这样既方便简单，又降低了dsRNA的降解速率。
在一个具体实施方式中，以所述细菌的湿重计，所述细菌与所述饲料以1:4至1:5的质量比混合。其中，所述细菌的湿重为收集OD值为1时的菌液离心后的沉淀的湿重。
在一个具体实施方式中，所述步骤一具体如下：
I：获得能够扩增如本申请之一、本申请之二和本申请之三中任意一项的核酸序列的上游引物和下游引物；
II：提取斜纹夜蛾属昆虫3-10日龄幼虫的RNA，然后逆转录合成cDNA；
III：利用所述上游引物和所述下游引物以及cDNA进行PCR扩增，获得目标片段，并将所述目标片段克隆到dsRNA的转录载体上，所述目标片段能够在细菌表达菌株中转录。
在一个具体实施方式中，步骤II的逆转录是在RT逆转录试剂盒和提取的RNA作用下合成cDNA的。
在一个具体实施方式中，所述转录载体为L4440(由Addgene，Andrew Fire提供)，所述细菌表达菌株为大肠杆菌(Escherichia coli)菌株HT115(DE3)。
在一个具体实施方式中，作为阴性dsRNA序列可以为在靶标物种中不存在的序列，例如可以为荧光蛋白的基因序列，进一步地，可以为绿色荧光蛋白(GFP)的基因序列或增强型的绿色荧光蛋白(eGFP)的基因序列。
在一个具体实施方式中，所述斜纹夜蛾属(Spodoptera)昆虫为斜纹夜蛾(Spodoptera litura Fabricius)，所述目标dsRNA序列如SEQ ID No.1所示。
在一个具体实施方式中，利用所述上游引物和所述下游引物以及cDNA进行PCR扩增，获得目标片段，并将所述目标片段克隆到克隆载体上，验证克隆正确后，再通过酶切连接的手段将克隆到克隆载体上的所述目标片段克隆到dsRNA的转录载体上，所述目标片段能够在细菌表达菌株中转录。
本申请的有益效果：
发明人在研究过程中首次发现了缺失或干扰例如斜纹夜蛾幼虫体内的SEQ IDNo.1，会导致血淋巴细胞凋亡。更重要的是，发明人首次发现了缺失或干扰该序列，会非常明显地抑制斜纹夜蛾幼虫的发育。可见SEQ ID No.1序列可以作为斜纹夜蛾在分子水平上的攻击靶标位点。如果将这一惊奇的发现与害虫的防治相结合，即将这一发现应用于害虫防治中，那么无疑会减少农药的使用，避免环境污染，维持生态平衡，提高农作物产品质量，并且害虫也不会产生抗药性。这将是一种非常有应用前景的害虫防治技术。
在本申请中，评估斜纹夜蛾幼虫发育的技术指标用斜纹夜蛾幼虫的头壳发育程度来表征，因为对于本领域的技术人员来讲，头壳发育程度指标表征比体重抑制率表征更准确。
附图说明
图1为斜纹夜蛾4E基因cDNA片段的PCR扩增。M为DNA Marker。由图可知：4E基因片段大小与633bp一致。
图2为体外IPTG诱导HT115(DE3)菌株表达dsRNA所得4E基因dsRNA的琼脂糖凝胶电泳结果。M为DNA Marker。由图可知：ds 4E有被诱导转录。
图3为RT-PCR检测4E dsRNA饲喂后干扰效果。M为DNA Marker，ds Ctrl为含有eGFPdsRNA(阴性对照，ds Ctrl)的虫体中4E的RT-PCR结果；ds 4E1为含有ds 4E的虫体中4E的RT-PCR结果，ds 4E2为另一含有ds 4E的虫体中4E的RT-PCR结果。由图可知：4E基因被有效沉默。
图4为Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒检测4E dsRNA(ds 4E)饲喂后斜纹夜蛾血淋巴细胞的凋亡情况。Annexin V-FITC检测早期凋亡细胞，呈现绿色；PI检测晚期凋亡细胞，呈现红色(Bar＝10μm)。图中，**表示p<0.01。由图可知：
比起对照组(eGFP dsRNA，ds Ctrl)饲喂实验组中，斜纹夜蛾血淋巴凋亡细胞显著增加，包括早期凋亡细胞及晚期凋亡细胞。
图5为斜纹夜蛾头壳宽度测量评估4E dsRNA(ds 4E)饲喂对斜纹夜蛾幼虫发育的影响，以eGFP dsRNA(ds Ctrl)为对照。图中，*表示p<0.05，**表示p<0.01，****表示p<0.0001。由图可知：在4E dsRNA饲喂第8日龄开始，斜纹夜蛾幼虫头壳发育受到抑制，发育较为缓慢。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但以下实施例并不够成对本申请的限制，凡包括在本申请的精神范围内的技术方案，均在本申请的保护范围内。
实施例1
1.4E特异引物设计
从斜纹夜蛾转录组数据(Li M,Pang Z,Xiao W,Liu X,Zhang Y,et al.(2014)ATranscriptome Analysis Suggests Apoptosis-Related Signaling Pathways inHemocytes of Spodoptera litura After Parasitization by Microplitisbicoloratus.PLoS ONE 9(10):e110967.doi:10.1371/journal.pone.0110967)中选取4E基因序列，4E基因序列(如SEQ ID No.1所示)大小为633bp，共编码210个氨基酸(SEQ IDNo.2)。采用引物设计软件Primer Premier 5设计特异引物。上游引物L4440-4E-F(SEQ IDNo.3)和下游引物L4440-4E-R(SEQ ID No.4)。
2.斜纹夜蛾幼虫总RNA的提取及cDNA的合成
本实验采用实验室方案提取斜纹夜蛾幼虫总RNA，具体步骤如下：
1)取10头3日龄幼虫，放置于加入少量RNAisoTM Plus裂解液的EP管中，充分捣碎研磨，继续加入RNAisoTM Plus裂解液至总体积达到1ml，涡旋混匀后，室温静置6min；
2)将上述处理好的样品，12000rpm，4℃离心5min；
3)取上清，转移至新的EP管中，加入氯仿200μL，剧烈振荡10-15s，充分混匀后，室温静置5min；
4)12000rpm，4℃离心15min；离心后的溶液分为三层：无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相,吸取上清液转移至另一新的离心管中；
5)向上清中加入等体积的异丙醇，混匀后室温静置10min；12000rpm，4℃离心10min；轻轻弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入75％的乙醇lml(0.1％DEPC水配制)；12000rpm，4℃离心5min；
6)弃去乙醇，室温干燥5min，加入50μL的RNase-free H2O溶解沉淀，标记好后，-80℃保存，取5μL马上进行琼脂糖凝胶电泳检测。
本实验用PrimeScriptTM RT reagent Kit反转录试剂盒(货号6210A)来反转录，具体步骤如下：
1)在离心管(EP管)中配置下列反应混合液(10μL)
Oligo dT primer 1μL
dNTP mixture 1μL
模板RNA 8μL
65℃，5min，冰上骤冷；
2)在上述EP管中加入下列反转录反应液：
5×PrimeScrip Buffer 4μL
PrimeScrip Reverse Transcriptase(200U/μL) 4μL
Ribonuclease Inhibitor(40U/μL) 2μL
总体积15μL，45℃保温45min。然后，95℃反应5min，冰上骤冷；-80℃保存。
3.4E基因片段的克隆
1)以上述所得的cDNA为模板，用4E特异引物进行PCR扩增。
扩增体系
Figure BDA0001437882140000071
Figure BDA0001437882140000081
总体积：15μL
2)PCR程序
Figure BDA0001437882140000082
3)将上述PCR产物进行电泳，结果如图1所示，M：2000bp Marker。由图可以看出：得到4E的基因片段为633bp。将PCR产物回收，并连接到克隆载体pMD19-T载体上，经测序确定正确，得到含有靶标片段的pMD19-4E质粒。
4.干扰质粒L4440-4E质粒构建及4E dsRNA的转录
1)干扰菌株HT115-L4440-4E的获取
取测序成功的pMD19-4E菌液，加A+过夜培养，用普通质粒提取试剂盒提取质粒，根据设计的相应酶切位点对质粒进行双酶切(Kpn I/Hind III)，用同样的限制性内切酶对L4440载体(Addgene，Andrew Fire提供)进行双酶切。将4E基因片段和L4440载体片段(Addgene，Andrew Fire提供)进行回收，T4连接酶连接。转化原核表达菌株HT115，鉴定成功，得到含有L4440-4E质粒的HT115-L4440-4E干扰菌株。
2)4E dsRNA的转录
HT115-L4440-4E干扰菌株在含A+浓度为100μg/mL和T+浓度为10μg/mL的液体培养基中摇菌至OD值为0.4，加IPTG至终浓度为0.4mM/mL，提取菌液RNA。结果如图2所示，M：2000bp Marker。由图可以看出：4E dsRNA有被诱导转录。
5.设置处理组和对照组，处理组：将转录4E dsRNA的大肠杆菌菌体与饲料以1∶4的质量比混合后饲喂斜纹夜蛾幼虫10日龄；对照组：将转录eGFPdsRNA(SEQ ID No.5)的大肠杆菌菌体与饲料以1∶4的质量比混合后饲喂斜纹夜蛾幼虫10日龄；并且处理组和对照组的饲喂时间相同，饲养条件也相同；
第一天，取适量已消毒的卵片，放入标记好的培养器具中，置于温度为27℃，湿度为60％的养虫室；第二天，虫卵出现黑点；第三天，有少量幼虫出现，加入混有转录4E dsRNA的大肠杆菌菌体的新鲜饲料(大肠杆菌菌体和饲料以1∶4的质量比混合。对照组加入混有表达eGFP dsRNA的大肠杆菌菌体的新鲜饲料)；第四天，每个培养器具中已有足够幼虫出现，取出卵片，更换饲料。拍照并测量幼虫头壳宽度，每组实验至少测30条；第五天，拍照并测量幼虫头壳宽度(标记为第一天)；第六天(标记为第二天)，拍照并测量幼虫头壳宽度；第七天(标记为第三天)，拍照并测量幼虫头壳宽度。
第八天(标记为第四天)，拍照并测量幼虫头壳宽度。然后进行虫体RNA提取，及cDNA的合成和RT-PCR检测干扰效果，结果如图3所示，M：2000bp Marker。由图可以看出：4E基因被有效沉默；
第九天(标记为第五天)，拍照并测量幼虫头壳宽度；第十天(标记为第六天)，拍照并测量幼虫头壳宽度。一部份幼虫用来凋亡细胞检测，具体操作：取10μl(约1×104个细胞)血淋巴，加入100μl 1×结合缓冲液悬浮细胞；加入5μl Annexin V-FITC和5μl PI的染色液，轻轻混匀；避光、室温反应10min；加入400μl 1×结合缓冲液，混匀，加入24孔细胞培养板贴壁约15min，样品在1h内用荧光显微镜检测。结果如图4所示，由图可以看出：比起对照组(eGFP dsRNA)4E dsRNA饲喂实验组中，斜纹夜蛾血淋巴凋亡细胞显著增加，包括早期凋亡细胞及晚期凋亡细胞；
第九天至第十四天(标记为第五天到第十天)，拍照并测量幼虫头壳宽度。最后对所有数据进行统计分析。结果如图5所示，由图可以看出：在4E dsRNA饲喂第8天开始，斜纹夜蛾幼虫头壳发育受到抑制，发育较为缓慢。
综上所述，说明4E dsRNA饲喂能够在斜纹夜蛾体内引起4E基因的RNAi效应，从而导致斜纹夜蛾幼虫血淋巴细胞凋亡，使其头壳发育受到抑制，不能正常生长发育。因此，利用该序列可用于防治斜纹夜蛾。
核 苷 酸 和 氨 基 酸 序 列 表
<110> 云南大学
<120> 一种可用于分子防治害虫的核酸序列及其应用
<130> LHA1760645
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 633
<212> DNA
<213> 斜纹夜蛾Spodoptera litura (Fabricius）
<220>
<223> 4E
<400> 1
ATGGCTGGTAATAATACTGAAGAAGTGGAGGGTTCTGCGACGACGGAAACAAAGGGTACTACCAATGCGGAGGTGCCGCCAGAGTTTTTAATAAAGCATCCTCTGCAAAACACCTGGAGTCTTTGGTTCTATGACAATGATAGAAACAAAACATGGGAGGAGAACCTGATAGAGCTGACCACTTTTGATACAGTGGAAGATTTCTGGAGACTGTACCACCACATTAAGCTACCTTCAGAACTGCGTCAAGGCCACGATTATGCAGTCTTCAAGCAAGGTATCCGTCCCATGTGGGAGGATGATGCTAACAAGATGGGCGGCAGATGGCTGATCAGTCTTGAGAAAAAACAACGGAACTCTGACTTGGATCGCTTCTGGTTAGATGTGGTTCTTCTCCTGATTGGTGAAAATTTTGACCATTCAGACGAAATCTGTGGTGCTGTGGTTAACGTTAGGGCGAAACTCGATAAAATTGGAGTCTGGACAGCTGATACTTCTAAGCAGCATGCTAACATTGAAATTGGAAGAAAAATCAAAGAGCAGCTCGGCATTCATGGGAAAATCGGCTTCCAAGTCCATCGCGACACCATGGTCAAACATAGTTCGGCAACTAAGAATCTGTACACTGTTTAG；
<210> 2
<211> 210
<212> PRT
<213> 斜纹夜蛾Spodoptera litura (Fabricius）
<220>
<223> 4E
<400> 2
MAGNNTEEVEGSATTETKGTTNAEVPPEFLIKHPLQNTWSLWFYDNDRNK TWEENLIELTTFDTVEDFWRLYHHIKLPSELRQGHDYAVFKQGIRPMWED DANKMGGRWLISLEKKQRNSDLDRFWLDVVLLLIGENFDHSDEICGAVVN VRAKLDKIGVWTADTSKQHANIEIGRKIKEQLGIHGKIGFQVHRDTMVKH SSATKNLYTV；
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L4440-4E-F，含HindIII酶切位点
<400> 3
AAGCTTATGGCTGGTAATAAT；
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L4440-4E-R，含Kpn I酶切位点
<400> 4
GGTACCCTAAACAGTGTACAGATTC；
<210> 5
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> eGFP基因序列
<400> 5
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCTTCGGCTACGGCCTGCAGTGCTTCGCCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCTACCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAG。

Claims (2)

1.一种核酸在用于使斜纹夜蛾（Spodoptera litura Fabricius）中的昆虫血淋巴细胞凋亡的应用，所述核酸的序列如SEQ ID No. 1所示，所述应用通过降低序列如SEQ ID No.1所示的核酸转录使所述昆虫血淋巴细胞凋亡。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过靶向序列如SEQ ID No. 1所示的核酸的dsRNA来使斜纹夜蛾（Spodoptera litura Fabricius）的昆虫血淋巴细胞凋亡。
CN201710972602.7A 2017-10-18 2017-10-18 一种可用于分子防治害虫的核酸序列及其应用 Active CN107760682B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710972602.7A CN107760682B (zh) 2017-10-18 2017-10-18 一种可用于分子防治害虫的核酸序列及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710972602.7A CN107760682B (zh) 2017-10-18 2017-10-18 一种可用于分子防治害虫的核酸序列及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107760682A CN107760682A (zh) 2018-03-06
CN107760682B true CN107760682B (zh) 2020-12-18

Family

ID=61268824

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710972602.7A Active CN107760682B (zh) 2017-10-18 2017-10-18 一种可用于分子防治害虫的核酸序列及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107760682B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114231551B (zh) * 2021-12-24 2023-09-29 云南大学 蛋白在促进昆虫淋巴细胞凋亡和/或防治害虫中的应用
CN114591959B (zh) * 2022-03-30 2023-10-27 云南大学 一种用于生物防治的dsRNA组合物

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107102154A (zh) * 2017-05-26 2017-08-29 广东南芯医疗科技有限公司 一种检测细胞应激反应中蛋白表达的微阵列芯片、制备方法、试剂盒及检测方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090186839A1 (en) * 2003-02-17 2009-07-23 Cold Spring Harbor Laboratory Model for studying the role of genes in chemoresistance
WO2005049841A1 (en) * 2003-11-17 2005-06-02 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Insect resistance using inhibition of gene expression
US10793873B2 (en) * 2003-11-21 2020-10-06 Revivicor, Inc. Use of interfering RNA in the production of transgenic animals
CN102586259B (zh) * 2012-03-08 2013-12-25 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 甘蔗条螟蜕皮调节转录因子cDNA及其克隆方法与重组应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107102154A (zh) * 2017-05-26 2017-08-29 广东南芯医疗科技有限公司 一种检测细胞应激反应中蛋白表达的微阵列芯片、制备方法、试剂盒及检测方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Pigment dispersing factor regulates ecdysone biosynthesis via bombyx neuropeptide G protein coupled receptor-B2 in the prothoracic glands of Bombyx mori;Masatoshi Iga 等;《PLoS One》;20140731;第1-8页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN107760682A (zh) 2018-03-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Tan et al. Gene silencing in root lesion nematodes (Pratylenchus spp.) significantly reduces reproduction in a plant host
CN110468137B (zh) 一种茄二十八星瓢虫高致死基因及其在防治瓢虫的应用
CN106754948B (zh) 褐飞虱NlMLP基因、编码蛋白及其应用
CN106661590A (zh) 赋予鞘翅目害虫抗性的dre4核酸分子
CN110592117B (zh) 高致死基因vATPase B及其防瓢虫应用
CN114957426B (zh) Sp6rars及其在防治蜚蠊目昆虫中的应用
CN107760682B (zh) 一种可用于分子防治害虫的核酸序列及其应用
CN110551730B (zh) 茄二十八星瓢虫rps18基因及其在防虫害中的应用
CN110616223B (zh) 一种防治茄二十八星瓢虫的靶基因及其应用
WO2016198852A1 (en) Pest control system
Jacobs et al. Immune function of the serosa in hemimetabolous insect eggs
CN107208097A (zh) 用于控制鞘翅目害虫kruppel基因亲代rnai抑制
CN108048467B (zh) 一种氨基酸序列、核酸序列及其应用
CN114058618B (zh) 谷氨酸脱氢酶作为靶点在防治害虫中的应用
CN108148841B (zh) 氨基酸序列在用于使昆虫Dip3蛋白失活中的应用
CN113122540B (zh) 一种对蛴螬高效致死的RNAi靶标基因及其应用
CN112522278B (zh) 基于美洲大蠊嗅觉受体基因OR3X设计的dsRNA、编码基因及其制备方法与应用
CN110511936B (zh) 茄二十八星瓢虫生长发育相关基因chs1及其应用
CN108949769B (zh) 一种棉铃虫蜕皮激素调控因子E78-C基因cDNA及其应用
CN107109412A (zh) 用于控制鞘翅目害虫hunchback基因亲代rnai抑制
CN117701567A (zh) miR-8545抑制剂在制备小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性治理药剂中的应用
CN112725345B (zh) 基于美洲大蠊性信息素受体基因OR5M设计的dsRNA、编码基因及其制备方法与应用
CN110628772B (zh) 基因gammaCOPI及其在防治酸浆瓢虫中的应用
CN110628774B (zh) 基因deltaCOPI及其在防治酸浆瓢虫中的应用
CN113481202B (zh) 美国白蛾Rop基因dsRNA及其细菌表达液和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant