CN114231551B - 蛋白在促进昆虫淋巴细胞凋亡和/或防治害虫中的应用 - Google Patents

蛋白在促进昆虫淋巴细胞凋亡和/或防治害虫中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及蛋白在促进昆虫淋巴细胞凋亡和/或防治害虫中的应用。所述蛋白为DHYS、DOHH和经羧腐胺赖氨酸修饰的eIF5A中的至少一种。

Description

蛋白在促进昆虫淋巴细胞凋亡和/或防治害虫中的应用
技术领域
本发明涉及DHYS、DOHH或经羧腐胺赖氨酸修饰的eIF5A在促进昆虫淋巴细胞凋亡和/或防治昆虫中的应用。
背景技术
斜纹夜蛾(Spodoptera litura Fabricius)属于鳞翅目夜蛾科(Noctuidae)夜蛾属(Spodoptera)，广泛分布在世界各地，在我国各地均有发生，是典型的杂食性昆虫。已知可以危害的植物达99科290多种，包括棉花、烟草和蔬菜等农作物。由于斜纹夜蛾繁殖能力强，且易对农药产生抗药性，近年来，对蔬菜和花卉的危害越来越严重，防治难度也越来越大。目前，主要依靠化学农药来防治，但化学农药大量和长期使用，一方面害虫已经产生了耐药性；另一方面，带来了环境污染、水质污染及人体健康等一系列问题。
发明内容
本发明之一提供了DHYS、DOHH和经羧腐胺赖氨酸修饰的eIF5A中的至少一种在促进昆虫淋巴细胞凋亡和/或防治昆虫(例如害虫)中的应用。
在一个具体实施方式中，通过促进昆虫淋巴细胞中的DHYS和/或DOHH的转录和/或表达来促进昆虫淋巴细胞凋亡。
在一个具体实施方式中，通过促进昆虫淋巴细胞中的eIF5A的羧腐胺赖氨酸修饰来促进昆虫淋巴细胞凋亡。
在一个具体实施方式中，通过促进昆虫淋巴细胞中的DHYS和/或DOHH的转录和/或表达来防治昆虫(例如害虫)。
在一个具体实施方式中，通过促进昆虫淋巴细胞中的eIF5A的羧腐胺赖氨酸修饰来防治昆虫(例如害虫)。
在一个具体实施方式中，所述DHYS的Genbank ID为1274128289。
在一个具体实施方式中，所述DOHH的Genbank ID为1274132632。
在一个具体实施方式中，所述eIF5A的Genbank ID为1274115148。
在一个具体实施方式中，编码所述DHYS的核酸的Genbank ID为111357978。可以将编码所述DHYS的核酸全长制备成dsRNA，通过DHYS dsRNA抑制DHYS的表达，从而促进昆虫淋巴细胞凋亡。
在一个具体实施方式中，编码所述DOHH的核酸的Genbank ID为111359607。可以将编码所述DOHH的核酸全长制备成dsRNA，通过DOHH dsRNA抑制DHYS的表达，从而促进昆虫淋巴细胞凋亡。
在一个具体实施方式中，编码所述eIF5A的核酸的Genbank ID为111353706。
在一个具体实施方式中，所述昆虫为夜蛾属(Spodoptera)昆虫中的至少一种。
在一个具体实施方式中，所述昆虫为斜纹夜蛾(Spodoptera litura Fabricius)。
本发明的有益效果：
(1)感染MbBV后的细胞中的DHYS和DOHH的转录水平显著升高，MbBV的感染(双斑侧沟茧蜂寄生)可以显著促进eIF5A的Hypusine修饰，同时，MbBV的感染(可以通过直接感染或通过双斑侧沟茧蜂寄生实现)可以显著促进血淋巴细胞的凋亡，说明DHYS和DOHH转录水平的升高可以显著促进eIF5A的Hypusine修饰，进而可以显著促进血淋巴细胞的凋亡；反之，DHYS和DOHH转录水平的下降可以显著降低eIF5A的Hypusine修饰，进而有利于血淋巴细胞的存活。
(2)Dip3蛋白可以对DHYS和DOHH的转录与表达起到抑制作用；DHYS dsRNA可以抑制DHYS的转录与表达；DOHH dsRNA可以抑制DOHH的转录与表达。
(3)DHYS、DOHH和经Hypusine修饰的eIF5A三种蛋白中的任意一种过表达均可促进昆虫淋巴细胞的凋亡，因此，可以基于这一发现通过过表达该三种蛋白中的任意一种达到有害昆虫生物防治的目的。
附图说明
图1显示了对纯化前和纯化后的Dip3蛋白进行SDS-PAGE。
图2显示了对纯化前和纯化后的Vank86蛋白进行SDS-PAGE。
图3显示了Dip3以及Vank86蛋白与DHYS部分启动子片段互作的凝胶阻滞(EMSA)结果图，其中Vank86为阴性对照。由图可知：Dip3与DHYS部分启动子存在相互作用关系，而Vank86不会与DHYS部分启动子相互作用。
图4显示了Dip3以及Vank86蛋白与DOHH部分启动子片段互作的凝胶阻滞(EMSA)结果图，其中Vank86为阴性对照。由图可知：Dip3与DOHH部分启动子存在相互作用关系，而Vank86不会与DHYS部分启动子相互作用。
图5显示了过表达eIF5A、DHYS和DOHH后羧腐胺赖氨酸(hypusine)修饰的eIF5A变化的蛋白质印迹法(Western bolt)检测结果图。
图6显示了图5中的Western bolt的灰度值进行量化分析统计的柱形图，由图可知：过表达DHYS和DOHH可以显著促进eIF5A的Hypusine修饰。
图7显示了实施例3不同处理的DHYS、DOHH转录水平的qRT-PCR检测图。
图8显示了饲喂斜纹夜蛾幼虫Dip3 dsRNA后，斜纹夜蛾幼虫血淋巴中的DHYS和DOHH转录水平的qRT-PCR检测图。
图9显示了双斑侧沟茧蜂寄生斜纹夜蛾二十四小时后对斜纹夜蛾血淋巴细胞中hypusine修饰的eIF5A变化的Western blot检测结果图。
图10显示了图9中Western blot的灰度值进行量化分析统计的柱形图，由图可知：双斑侧沟茧蜂寄生斜纹夜蛾可以显著促进斜纹夜蛾体内血淋巴细胞eIF5A的Hypusine的修饰。
图11显示了饲喂eIF5A dsRNA后对斜纹夜蛾血淋巴细胞中hypusine修饰的eIF5A变化的Western blot检测结果图。
图12显示了图11中Western blot的灰度值进行量化分析统计的柱形图，由图可知：饲喂eIF5A dsRNA无法改变eIF5A的Hypusine修饰的量。
图13显示了饲喂斜纹夜蛾幼虫eIF5A dsRNA、DHYS dsRNA、DOHH dsRNA和EGFPdsRNA后，斜纹夜蛾幼虫血淋巴细胞凋亡情况检测。
图14显示了图13中绿色荧光早期凋亡细胞数量的统计分析柱形图。
具体实施方式
以下通过优选的实施案例的形式对本发明的上述内容作进一步的详细说明，但其不构成对本发明的限制。
如无特别说明，本发明的实施例中的试剂均可通过商业途径购买。
实施例1
1.DHYS和DOHH启动子与Dip3蛋白myb/SANT结构域相结合碱基序列引物序列设计
从斜纹夜蛾转录组数据(Li M,Pang Z,Xiao W,Liu X,Zhang Y,et al.(2014)ATranscriptome Analysis Suggests Apoptosis-Related Signaling Pathways inHemocytes of Spodoptera litura After Parasitization by Microplitisbicoloratus.PLoS ONE9(10):e110967.doi:10.1371/journal.pone.0110967)中选取大小为539bp的脱氧羟腐胺赖氨酸合酶(DHYS)基因部分启动子(如SEQ ID No.1所示)，所用上游引物为promoter-DHYS-F(如SEQ ID No.2所示)，下游引物为promoter-DHYS-R(如SEQ IDNo.3所示)；以及大小为469bp的脱氧羟腐胺赖氨酸羟化酶(DOHH)基因部分启动子(如SEQID No.4所示)，所用上游引物为promoter-DOHH-F(如SEQ ID No.5所示)，下游引物为promoter-DOHH-R(如SEQ ID No.6所示)。
2.斜纹夜蛾全基因组基因提取
1)取孵出9天的幼虫虫体约90只，用75％乙醇进行消毒后，用注射器针头在斜纹夜蛾幼虫腹部戳取500μl血淋巴细胞，并迅速转入已加有10μl 5wt％谷胱甘肽水溶液的1.5mlEP管中，4℃，1000g离心5min。弃上清，用PBS缓冲液洗涤两次，加入200μl 4℃预冷的PBS缓冲液重悬，得到重悬的血淋巴细胞。
2)使用全基因组提取试剂盒对重悬的血淋巴细胞提取全基因组，其中，全基因组提取试剂盒购自OMEGA，试剂盒编号：D3396-00。
3.DHYS、DOHH部分启动子片段的克隆
1)以斜纹夜蛾幼虫的全基因组DNA为模板，以promoter-DHYS-F和promoter-DHYS-R为引物对进行DHYS部分启动子PCR扩增，得到DHYS部分启动子PCR产物。将DHYS部分启动子PCR产物检测后，连接到克隆载体pBM16A上，经测序确定正确，得到含有靶标片段的pBM16A-promoter-DHYS重组质粒。
2)斜纹夜蛾幼虫的全基因组DNA为模板，以promoter-DOHH-F和promoter-DOHH-R为引物对进行DOHH部分启动子PCR扩增，得到DOHH部分启动子PCR产物。将DOHH部分启动子PCR产物检测后，连接到克隆载体pBM16A上，经测序确定正确，得到含有靶标片段的pBM16A-promoter-DOHH重组质粒。
4.Dip3蛋白、Vank86蛋白的提取和纯化
1)将Dip3(CN2017113400307)连接到表达pET28a上，得到pET28a-Dip3重组质粒，将pET28a-Dip3重组质粒转化至BL21(DE3)大肠杆菌中，得到BL21(DE3)/pET28a-Dip3，然后培养BL21(DE3)/pET28a-Dip3并进行IPTG诱导，利用镍磁珠纯化法提取并纯化所表达的Dip3蛋白，得到溶于PBS缓冲液的Dip3蛋白溶液，对纯化前和纯化后的蛋白进行SDS-PAGE检测，结果见图1。从图1可知，所提取的Dip3的纯度符合后续实验要求。利用Bradford法测量Dip3的蛋白浓度为4μg/μL。
2)Vank86(CN2017113400307)连接到表达pET28a上，得到pET28a-Vank86重组质粒，将pET28a-Vank86重组质粒转化至BL21(DE3)大肠杆菌中，得到BL21(DE3)/pET28a-Vank86，然后培养BL21(DE3)/pET28a-Vank86并进行IPTG诱导，利用镍磁珠纯化法提取并纯化所表达的Vank86蛋白，得到溶于PBS缓冲液的Vank86蛋白溶液，对纯化前和纯化后的蛋白进行SDS-PAGE检测，结果见图2。从图2可知，所提取的Vank86的纯度符合后续实验要求，用于后续作为阴性对照使用。利用Bradford法测量Vank86的蛋白浓度为5.7μg/μL。
5.凝胶阻滞
1)分别取0μg、5μg、10μg、20μg四个梯度的Dip3蛋白溶液放入四个不同的EP管中；将pBM16A-promoter-DHYS重组质粒用EcoR V限制性内切酶进行切割，切割后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，利用胶回收试剂盒回收DHYS部分启动子片段得到含有DHYS部分启动子的DNA溶液，然后进行定量分析；向装有Dip3蛋白溶液的四个EP管中分别加入1μg含有DHYS部分启动子的DNA溶液，然后向四个EP管中分别加入1/10体积的10×结合缓冲液，轻轻混匀，37℃室温孵育30min，然后加入1/6体积的不含SDS的6×上样缓冲液，在电压100V下进行琼脂糖凝胶电泳30min。以0μg、5μg、10μg、20μg四个梯度的Vank86蛋白溶液替换相应的Dip3蛋白溶液进行Vank86蛋白与DHYS部分启动子的凝胶阻滞实验操作，以作为阴性对照。结果如图3所示。从图3可知，因DHYS部分启动子与Dip3进行了结合而产生了阻滞现象，即Dip3能够与DHYS启动子结合。
2)分别取0μg、5μg、10μg、20μg四个梯度的Dip3蛋白溶液放入四个不同的EP管中；将pBM16A-promoter-DOHH重组质粒用EcoR V限制性内切酶进行切割，切割后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，利用胶回收试剂盒回收DOHH部分启动子片段得到含有DOHH部分启动子的DNA溶液，然后进行定量分析；向装有Dip3蛋白溶液的四个EP管中分别加入1μg含有DOHH部分启动子的DNA溶液，然后向四个EP管中分别加入1/10体积的10×结合缓冲液，轻轻混匀，37℃室温孵育30min，然后加入1/6体积的不含SDS的6×上样缓冲液，在电压100V下进行琼脂糖凝胶电泳30min。以0μg、5μg、10μg、20μg四个梯度的Vank86蛋白溶液替换相应的Dip3蛋白溶液进行Vank86蛋白与DOHH部分启动子的凝胶阻滞实验操作，以作为阴性对照。结果如图4所示。从图4可知，因DOHH部分启动子与Dip3进行了结合而产生了阻滞现象，即Dip3能够与DOHH启动子结合。
实施例2
1.eIF5A、DHYS和DOHH全长的克隆
斜纹夜蛾eIF5A蛋白共161个氨基酸，其Genbank ID为1274115148，斜纹夜蛾eIF5A核酸共483bp，其Genbank ID为111353706。扩增eIF5A全长的特异引物为eIF5A-F(如SEQ IDNo.7所示)和eIF5A-R(如SEQ ID No.8所示)。
斜纹夜蛾DHYS蛋白共372个氨基酸，其Genbank ID为1274128289，斜纹夜蛾DHYS核酸共1116bp，其Genbank ID为111357978。扩增DHYS全长的特异引物为DHYS-F(如SEQ IDNo.9所示)和DHYS-R(如SEQ ID No.10所示)。
斜纹夜蛾DOHH蛋白共305个氨基酸，其Genbank ID为1274132632，斜纹夜蛾DOHH核酸共915bp，其Genbank ID为111359607。扩增DOHH全长的特异引物为DOHH-F(如SEQ IDNo.11所示)和DOHH-R(如SEQ ID No.12所示)。
提取斜纹夜蛾3日龄幼虫的总RNA，然后以Oligo dT为引物进行反转录，得到cDNA。
以所得的cDNA为模板，以eIF5A-F和eIF5A-R为引物对进行eIF5A PCR扩增，得到eIF5APCR产物。将eIF5A PCR产物检测后，连接到克隆载体pMD19-T(Takara)上，经测序确定正确，得到含有靶标片段的pMD19-eIF5A重组质粒。
以所得的cDNA为模板，以DHYS-F和DHYS-R为引物对进行DHYS PCR扩增，得到DHYSPCR产物。将DHYS PCR产物检测后，连接到克隆载体pMD19-T(Takara)上，经测序确定正确，得到含有靶标片段的pMD19-DHYS重组质粒。
以所得的cDNA为模板，以DOHH-F和DHYS-R为引物对进行DOHH PCR扩增，得到DOHHPCR产物。将DOHH PCR产物检测后，连接到克隆载体pMD19-T(Takara)上，经测序确定正确，得到含有靶标片段的pMD19-DOHH重组质粒。
将pMD19-eIF5A用EcoR I和Not I双酶切后回收eIF5A基因片段；将pIZT/V5-His质粒(Thermo fisher，包含6个组氨酸标签)用EcoR I和Not I双酶切后回收pIZT/V5-His载体线性片段。将回收的eIF5A基因片段与回收的pIZT/V5-His载体线性片段利用T4连接酶连接，得到阳性pIZT-eIF5A重组质粒。
将pMD19-DHYS用Kpn I和Xba I双酶切后回收DHYS基因片段；将pIZT/V5-His质粒(Thermo fisher，包含6个组氨酸标签)用Kpn I和Xba I双酶切后回收pIZT/V5-His载体线性片段。将回收的DHYS基因片段与回收的pIZT/V5-His载体线性片段利用T4连接酶连接，得到阳性pIZT-DHYS重组质粒。
将pMD19-DOHH用Sac I和Xba I双酶切后回收DOHH基因片段；将pIZT/V5-His质粒(Thermo fisher，包含6个组氨酸标签)用Sac I和Xba I双酶切后回收pIZT/V5-His载体线性片段。将回收的DOHH基因片段与回收的pIZT/V5-His载体线性片段利用T4连接酶连接，得到阳性pIZT-DOHH重组质粒。
2.pIZT-eIF5A转染HighFive与总蛋白的提取
使用25cm2培养瓶培养High Five细胞，当High Five细胞生长密度达到80％-90％时，移除旧培养基，加入5mL新的培养基，用枪头轻轻吹打悬浮细胞，随后取90μL细胞悬液加10μL台盼蓝，轻轻混匀，静置3min，用血细胞计数板计数；计数后，分别取2×105个细胞加入到五个直径为60mm的培养皿中，27℃贴壁培养2h以上直至细胞贴壁、状态良好。待细胞贴壁完全后用双无培养基饥饿处理细胞30min。配制转染试剂复合物：吸取100μL的双无培养基置于1500μL EP管中，然后向其中加入1μg的pIZT-eIF5A重组质粒，得到转染质粒；取100μL的双无培养基置于另一个1500μL EP管中，然后向其中加入5μl转染试剂Cell fection II，震荡混匀，得到转染试剂；转染质粒与转染试剂混合，混匀之后室温静置45min，且每15分钟震荡几下，从而得到转染试剂复合物。向转染试剂复合物中加入800μl双无培养基，混匀，将其逐滴加入到培养有饥饿处理30min的细胞的60mm培养皿中，放到摇床上轻轻晃动，使混合均匀，然后27℃继续培养5小时，弃去培养液，得到HighFive/pIZT-eIF5A重组细胞。随后向其中加入有血清培养基培养72h。然后采用RIPA粗提法提取含有过表达eIF5A的总蛋白。
3.pIZT-DHYS转染HighFive与总蛋白的提取
以本实施例第2小节相同的操作将pIZT-DHYS转染至HighFive细胞中，得到HighFive/pIZT-DHYS重组细胞。然后采用RIPA粗提法提取含有过表达DHYS的总蛋白。
4.pIZT-DOHH转染HighFive与总蛋白的提取
以本实施例第2小节相同的操作将pIZT-DOHH转染至HighFive细胞中，得到HighFive/pIZT-DOHH重组细胞。然后采用RIPA粗提法提取含有过表达DOHH的总蛋白。
5.pIZT转染HighFive与总蛋白的提取
以本实施例第2小节相同的操作将pIZT空载体转染至HighFive细胞中，得到HighFive/pIZT重组细胞。然后采用RIPA粗提法提取总蛋白，作为阴性对照组，因此将提取的总蛋白称为阴性对照总蛋白。
6.HighFive细胞总蛋白的提取
采用RIPA粗提法提取HighFive细胞的总蛋白，作为空白对照组(以“Ctrl”表示)，因此将提取的总蛋白称为空白对照总蛋白。
7.Western Blot
1)使用BCA蛋白浓度测定试剂盒分别对上述得到的空白对照总蛋白(以“Ctrl”表示)、阴性对照总蛋白、含有过表达eIF5A的总蛋白、含有过表达DHYS的总蛋白和含有过表达DOHH的总蛋白进行蛋白浓度测定之后进行SDS-PAGE。
2)SDS-PAGE之后进行PVDF转膜。依次使用作为一抗的Anti-V5(R960-25，购买于Invirotrogen，用于检测过表达的eIF5A、DHYS和DOHH蛋白)、Anti-Hypusine(ABS1064，购买于ABCAM，用于检测经羧腐胺赖氨酸修饰的eIF5A)、Anti-Tubulin(M1000130，购买于Solarbio，用于检测Tubulin内参)进行孵育，在完成上述所有一抗的孵育之后使用HRP标记山羊抗兔igG(H+L)(A0208、购买于Beyotime)作为二抗进行孵育，使用辣根过氧化物酶(HRP)化学发光底物进行化学发光，将PVDF膜在FluorChem EFE0511中曝光成像，见图5。
利用Image J软件对曝光的条带进行灰度分析后利用GraphPad Prism 8对灰度值数据进行统计，用Tubulin的数值进行校对，数据分析使用t检验，p<0.05，*表示差异显著，p<0.01，**表示差异极显著，结果见图6。
由图5和图6可知，在High Five细胞中，DHYS的过表达可以显著促进eIF5A的Hypusine修饰；DOHH的过表达也可以显著促进eIF5A的Hypusine修饰。
实施例3
使用25cm2培养瓶培养High Five细胞，当High Five细胞生长密度达到80％-90％时，移除旧培养基，加入5mL新的培养基，用枪头轻轻吹打悬浮细胞，随后取90μL细胞悬液加10μL台盼蓝，轻轻混匀，静置3min，用血细胞计数板计数；计数后，分别取2×105个细胞加入到四个60mm培养皿中，27℃贴壁培养2h以上直至细胞贴壁、状态良好。待细胞贴壁完全后分别作以下4个处理：
处理1：向一个直径为60mm的培养皿中加入双无培养基进行饥饿处理细胞30min，然后放入27℃用双无培养基继续培养5h，弃去培养液，然后加入完全培养基无处理培养，27℃培养72h后收集细胞，提取mRNA后以Oligo dT为引物进行反转录，得到cDNA，作为空白对照。
处理2：向一个直径为60mm的培养皿加入双无培养基饥饿处理细胞30min。配制转染试剂复合物：吸取100μL的双无培养基置于1500μL EP管中，然后向其中加入1μg的pIZT-Dip3重组质粒(见CN2017113400307)，得到转染质粒；取100μL的双无培养基置于另一个1500μL EP管中，然后向其中加入5μl转染试剂Cell fection II，震荡混匀，得到转染试剂；将转染质粒与转染试剂混合，混匀之后室温静置45min，且每15分钟震荡几下，从而得到转染试剂复合物。向转染试剂复合物中加入800μl双无培养基，混匀，将其逐滴加入到培养有饥饿处理30min的细胞的培养皿中，放到摇床上轻轻晃动，使混合均匀，然后27℃用双无培养基继续培养5h，弃去培养液，加入完全培养基培养72h。然后收集细胞，提取mRNA后以Oligo dT为引物进行反转录，得到cDNA。
处理3：解剖获取4只雌性茧蜂的卵巢放入1mL 1×PBS缓冲液中，然后用2.5mm的注射器反复研磨10min，最后用0.22μm的过滤器过滤研磨液，得到4当量的茧蜂病毒(MbBV)溶液。
向一个直径为60mm的培养皿中加入双无培养基饥饿处理细胞30min，然后放入用双无培养基27℃继续培养5h，弃去培养液，加入完全培养基的同时加入2当量的MbBV，放入27℃培养72h，随后弃去培养基，收集细胞，提取mRNA后以Oligo dT为引物进行反转录，得到cDNA。
处理4：以处理2相同的操作将pIZT-Dip3转染至High Five细胞中，得到HighFive/pIZT-Dip3重组细胞。然后加入2当量的MbBV，27℃培养72h后收集细胞提取mRNA后以OligodT为引物进行反转录，得到cDNA。
将上述得到的4组cDNA进行DHYS和DOHH的qRT-PCR检测，结果如图7所示。其中DHYSqRT-PCR所使用的引物为qPCR-DHYS-F(如SEQ ID No.13所示)和qPCR-DHYS-R(如SEQ IDNo.14所示)。DOHH qRT-PCR所使用的引物为qPCR-DOHH-F(如SEQ ID No.15所示)和qPCRDOHH-R(如SEQ ID No.16所示)。
从图7可以看出，相比于空白对照组，感染MbBV后的High Five细胞中的DHYS和DOHH的转录水平显著升高；而虽然感染MbBV，但过表达Dip3的High Five细胞中则显示出DHYS和DOHH转录的显著抑制。说明Dip3蛋白对DHYS和DOHH的转录与表达具有抑制作用。
实施例4
1.干扰载体L4440-Dip3、L4440-eIF5A、L4440-DHYS和L4440-DOHH的构建
干扰载体L4440-Dip3的获得见CN2017113400307，将L4440-Dip3转化至大肠杆菌HT115中得到HT115/L4440-Dip3重组菌株。
以构建L4440-Dip3相同的方式构建得到干扰载体L4440-eIF5A(eIF5A全长)、L4440-DHYS(DHYS全长)和、L4440-DOHH(DOHH全长)和L4440-EGFP。其中，构建L4440-eIF5A时使用的限制性内切酶为EcoR I和Not I，构建L4440-DHYS时使用的限制性内切酶为Xho I和Hind III，构建L4440-DOHH时使用的限制性内切酶为Xho I和Hind III，构建L4440-EGFP时使用的限制性内切酶为Xba I和Hind III。
将L4440-eIF5A转化至大肠杆菌HT115中得到HT115/L4440-eIF5A重组菌株，将L4440-DHYS转化至大肠杆菌HT115中得到HT115/L4440-DHYS重组菌株，将L4440-DOHH转化至大肠杆菌HT115中得到HT115/L4440-DOHH重组菌株。
将L4440-EGFP转化至大肠杆菌HT115中得到HT115/L4440-EGFP重组菌株，以用于对照。
2.Dip3、eIF5A、DHYS和DOHH dsRNA饲喂
1)dsRNA的制备
将HT115/L4440-Dip3、HT115/L4440-eIF5A、HT115/L4440-DHYS和HT115/L4440-DOHH干扰菌株分别在含A+浓度为100μg/mL和T+浓度为10μg/mL的液体培养基400ml中摇菌至OD值为0.8，加IPTG至终浓度为0.4mmol/mL，离心，分别得到HT115/L4440-Dip3、HT115/L4440-eIF5A、HT115/L4440-DHYS和HT115/L4440-DOHH菌体，分别加入5ml蒸馏水将菌体悬浮，分别得到eIF5A dsRNA、DHYS dsRNA、DOHH dsRNA和Dip3 dsRNA菌悬液；同时阴性对照HT115/L4440-EGFP也进行相同的处理，最后得到EGFP dsRNA菌悬液。
2)配制饲料
A.营养物质(1份的量)：黄豆粉5.0g、麦麸5.0g、酵母提取物2.0g、琼脂粉1.0g、干酪素1.0g。准确称量上述营养物，然后装入200mL的保鲜盒中。
B.混合粉末(1份的量)：尼泊金甲酯0.125g、山梨酸0.125g、抗坏血酸0.2g、胆固醇0.5g、氯化胆碱0.0425g、六合维生素丸(碾碎)半粒。准确称量上述试剂，装于1.5mL的离心管中。
向每一份A中的营养物质中加入45mL的蒸馏水，经过120℃ 30分钟高温灭菌后，降温至50℃后加入一份B中的混合粉末，制得45mL饲料。
向一份45mL的饲料中加入步骤1)所得的5mL eIF5A dsRNA菌悬液，得到eIF5AdsRNA混合饲料。
向一份45mL的饲料中加入步骤1)所得的5mL DHYS dsRNA菌悬液，得到DHYS dsRNA混合饲料。
向一份45mL的饲料中加入步骤1)所得的5mLDOHH dsRNA菌悬液，得到DOHH dsRNA混合饲料。
向一份45mL的饲料中加入步骤1)所得的5mL Dip3 dsRNA菌悬液，得到Dip3 dsRNA混合饲料。
向一份45mL的饲料中加入步骤1)所得的5mL EGFP dsRNA菌悬液，得到EGFP dsRNA混合饲料，以用作阴性对照。
3)Dip3 dsRNA(dsDip3)的饲喂
取适量已消毒的斜纹夜蛾的卵片，放入标记好的培养器具中，置于温度为27℃，湿度为60％的养虫室。幼虫一经孵出，便用Dip3 dsRNA混合饲料饲喂，每天进行新饲料与旧饲料的更换，且新饲料中含有相同浓度的菌悬液。以EGFP dsRNA混合饲料进行相同的处理作为阴性对照(dsEGFP)。
4)饲喂Dip3 dsRNA之后的qRT-PCR检测
在利用饲喂Dip3 dsRNA混合饲料六天后，分别提取阴性对照组和处理组的幼虫血淋巴的总RNA，然后逆转录得到cDNA。
以所得cDNA为模板，以qPCRDHYS-F和qPCRDHYS-R为引物进行qRT-PCR。
以所得cDNA为模板，以qPCRDOHH-F和qPCRDOHH-R为引物进行qRT-PCR。
结果如图8所示，与阴性对照组相比，Dip3基因被沉默后显著促进了DHYS和DOHH基因的转录水平。
5)双斑侧沟茧蜂寄生斜纹夜蛾后斜纹夜蛾血淋巴细中的hypusine修饰水平检测
取适量已消毒的斜纹夜蛾的卵片，放入标记好的培养器具中，置于温度为27℃，湿度为60％的养虫室。幼虫一经孵出，即用雌性双斑侧沟茧蜂成虫对其进行寄生24h，然后用不加入任何菌悬液的饲料进行饲喂，每天进行新饲料与旧饲料的更换。
六天后取幼虫虫体约90只，用75％乙醇进行消毒后，用注射器针头在斜纹夜蛾幼虫腹部戳取500μl血淋巴细胞，并迅速转入已加有10μl 5wt％谷胱甘肽水溶液的1.5ml EP管中，4℃，1000g离心5min。弃上清，用PBS缓冲液洗涤两次，加入200μl 4℃预冷的PBS缓冲液重悬，得到重悬的血淋巴细胞。
参照实施例2的方法对上述得到的血淋巴细胞进行总蛋白提取并进行Westernblot实验。其中，Anti-Hypusine(ABS1064，购买于ABCAM，用于检测经羧腐胺赖氨酸修饰的eIF5A)、Anti-GAPDH(M1000110，购买于Solarbio，用于检测GAPDH内参)，结果见图9。
利用Image J软件对曝光的条带进行灰度分析后利用GraphPad Prism 8对灰度值数据进行统计，用GAPDH的数值进行校对，数据分析使用t检验，p<0.05，*表示差异显著，p<0.01，**表示差异极显著，结果见图10。
由图9和图10可知，在斜纹夜蛾血淋巴细胞中，双斑侧沟茧蜂的寄生可以显著促进eIF5A的Hypusine修饰。
6)饲喂eIF5A dsRNA后的hypusine修饰检测
取适量已消毒的斜纹夜蛾的卵片，放入标记好的培养器具中，置于温度为27℃，湿度为60％的养虫室。幼虫一经孵出，即用eIF5A dsRNA混合饲料饲喂，每天进行新饲料与旧饲料的更换，且新饲料中含有相同浓度的相应的菌悬液。以EGFP dsRNA混合饲料进行相同的处理作为阴性对照(以“dsEGFP”表示)；以不加入任何菌悬液的饲料为空白对照(即无寄生空白对照，以“Ctrl”表示)。
六天后取幼虫虫体约90只，用75％乙醇进行消毒后，用注射器针头在斜纹夜蛾幼虫腹部戳取500μl血淋巴细胞，并迅速转入已加有10μl 5wt％谷胱甘肽水溶液的1.5ml EP管中，4℃，1000g离心5min。弃上清，用PBS缓冲液洗涤两次，加入200μl 4℃预冷的PBS缓冲液重悬，得到重悬的血淋巴细胞。
参照实施例2的方法对上述得到的血淋巴细胞进行总蛋白提取并进行Westernblot实验。其中，Anti-Hypusine(ABS1064，购买于ABCAM，用于检测经羧腐胺赖氨酸修饰的eIF5A)、Anti-GAPDH(M1000110，购买于Solarbio，用于检测GAPDH内参)，结果见图11。
利用Image J软件对曝光的条带进行灰度分析后利用GraphPad Prism 8对灰度值数据进行统计，用GAPDH的数值进行校对，数据分析使用t检验，p<0.05，*表示差异显著，p<0.01，**表示差异极显著，结果见图12。
由图11和图12可知，在斜纹夜蛾血淋巴细胞中，相比于空白以及阴性对照，饲喂eIF5AdsRNA无法改变eIF5A自身的Hypusine修饰的量。
6)eIF5A dsRNA(dseIF5A)、DHYS dsRNA(dsDHYS)和DOHH dsRNA(dsDOHH)的饲喂
取适量已消毒的斜纹夜蛾的卵片，放入标记好的培养器具中，置于温度为27℃，湿度为60％的养虫室。幼虫一经孵出，便分别用eIF5A dsRNA混合饲料、DHYS dsRNA混合饲料、DOHH dsRNA混合饲料饲喂，每天进行新饲料与旧饲料的更换，且新饲料中含有相同浓度的相应的菌悬液。以EGFP dsRNA混合饲料进行相同的处理作为阴性对照(以“dsEGFP”表示)；以不加入任何菌悬液的饲料为空白对照(即无寄生空白对照，以“Ctrl”表示)。
用雌性双斑侧沟茧蜂成虫对1龄斜纹夜蛾进行寄生24h，然后分别用eIF5A dsRNA混合饲料、DHYS dsRNA混合饲料、DOHH dsRNA混合饲料饲喂，每天进行新饲料与旧饲料的更换，且新饲料中含有相同浓度的相应的菌悬液。以EGFP dsRNA混合饲料进行相同的处理作为阴性对照(以“dsEGFP+寄生”表示)；以不加入任何菌悬液的饲料为空白对照(即寄生空白对照，以“寄生”表示)。
8)饲喂eIF5A dsRNA、DHYS dsRNA、DOHH dsRNA和EGFP dsRNA后的细胞凋亡检测
在利用EGFP dsRNA混合饲料饲喂无寄生的斜纹夜蛾幼虫六天后操作如下：取10μl(约1×104个细胞)血淋巴，加入100μl 1×结合缓冲液悬浮细胞；加入5μl Annexin V-FITC和5μlPI的染色液，轻轻混匀；避光、室温反应10min；加入400μl 1×结合缓冲液，混匀，加入24孔细胞培养板贴壁约15min，在1h内用荧光显微镜检测。在无寄生的斜纹夜蛾幼虫和寄生雌性双斑侧沟茧蜂的斜纹夜蛾幼虫分别饲喂eIF5A dsRNA混合饲料、DHYS dsRNA混合饲料和DOHH dsRNA混合饲料六天后进行如上同样的操作，在1h内用荧光显微镜检测。荧光显微镜检测的结果如图13所示。
通过ImageJ对拍摄图像进行计数：通过设定区分绿色荧光的阈值，对绿色荧光的细胞进行计数即为早期凋亡细胞的个数。利用GraphPad Prism 8对计数结果进行统计分析，结果如图14所示。
根据图13和图14可以得出如下结论：
(1)无寄生空白对照与寄生空白对照相比可知，随着eIF5A的Hypusine修饰的量的增加，血淋巴细胞的凋亡也成增加趋势，说明eIF5A的Hypusine修饰可以促进血淋巴细胞的凋亡。
(2)在无寄生条件下，即在斜纹夜蛾幼虫血淋巴中eIF5A的Hypusine修饰的量较少的情况下，与饲喂了EGFP dsRNA的阴性对照组相比，饲喂DHYS dsRNA和DOHH dsRNA的斜纹夜蛾的血淋巴早期凋亡细胞显著减少，而饲喂eIF5A dsRNA的斜纹夜蛾的血淋巴早期凋亡细胞无显著差异，说明在无寄生条件下DHYS或DOHH的敲降均可以有利于淋巴细胞的存活，反之，在无寄生条件下DHYS或DOHH蛋白水平的增加，则均有利于淋巴细胞的凋亡。
(3)在寄生条件下，与饲喂了EGFP dsRNA的阴性对照组相比，饲喂DHYS dsRNA、DOHH dsRNA和eIF5A dsRNA均可以显著降低斜纹夜蛾血淋巴细胞的早起凋亡，说明在寄生条件下DHYS、DOHH和eIF5A的敲降均有利于淋巴细胞的存活，反之，在寄生条件下DHYS、DOHH和eIF5A蛋白水平的增加，则均有利于淋巴细胞的凋亡。
序列表
<110> 云南大学
<120> 蛋白在促进昆虫淋巴细胞凋亡和/或防治害虫中的应用
<130> LHA2160756
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 539
<212> DNA
<213> 斜纹夜蛾(Spodoptera litura Fabricius)
<400> 1
tttatggcat agggcacggc aatgcgttgc cattctttta gggttgtttt tttatggaat 60
agaaggcaca cgagcagatg gacacccgca acaccagagg agtaacagat gcgttgccgg 120
ccatttaaaa agaaaaacgg tcttttcttg aaagattgaa ggttgtatcg gttccatcta 180
atgatgctaa acagtagaag atgataccta cagttcatct atttacattt cggaagaata 240
ggcagagtga ataataaata ggtacacgtt caattatttt aagtcactaa atacaagtcg 300
tggtggcccg gagggtcgga acctaccaac gacaagtacc aatgtgcctt tttccgaatt 360
atacaacatg taacttaaat aacgcacatc ctgaaaatag tttgttcaga atcgttaact 420
gaatcgataa tacttttaat ttttagtata ggtaattttt gatcccaaaa ataattaaaa 480
ctacggaaat tattgtcata ttaaccctgt attgttaaaa caaatcgaaa tgaaccgta 539
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tttatggcat agggcacg 18
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acaaatcgaa atgaaccgta 20
<210> 4
<211> 469
<212> DNA
<213> 斜纹夜蛾(Spodoptera litura Fabricius)
<400> 4
ttatagccag actgattgaa aactgcgtcg tatgagcaca ttaccaatga ttttttaaaa 60
cgacaaaaaa ttacaattgt attttggcgc gtttttgtcc gccattacgt accagtcata 120
ataaagactt tacgaatacg catgtaccta attgaaatca tgtaacttga cagtgtaact 180
tgttaaaatt aaataattta aacatatacc gtgactagtg aattgtaata ataaaaaagt 240
ccatacttta cctaaaaaac atcaggaatc cgtttccgtt ggagtttgca tttatgatag 300
cccaagattt ttgcacattg tacacatctc tcagtgacat gccagatact ttgtttctct 360
catcagggtc tccgccccac caccatcgtt tgattaagtc cccaacgccc atgttttcag 420
atattgaacg gagaagcctt tgcctcacag gtcttcggta ctcctttct 469
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttatagccag actgattga 19
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcttcggtac tcctttct 18
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gaattcatgg ctgatatcga gga 23
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcggccgcat ttgtcaa 17
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggtaccatgg atataacttc agcta 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tctagataaa cattcttttt attgc 25
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gagctcatgg caaaagctag 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tctagacagc cctcgacagt 20
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ctatcagtaa gccgaccaac ctc 23
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tgccactttc ccagtcgtaa cct 23
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gatggtgaga cacgaggcg 19
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ggacaactgg acgagggt 18

Claims (1)

1.DHYS、DOHH和经羧腐胺赖氨酸修饰的eIF5A中的至少一种在促进昆虫淋巴细胞凋亡和/或防治昆虫中的应用，所述昆虫为斜纹夜蛾（Spodoptera litura Fabricius），所述DHYS的Genbank ID为1274128289，所述DOHH的Genbank ID为1274132632，所述eIF5A的Genbank ID为1274115148；
通过促进昆虫淋巴细胞中的DHYS和/或DOHH的转录和/或表达来促进昆虫淋巴细胞凋亡；和/或通过促进昆虫淋巴细胞中的eIF5A的羧腐胺赖氨酸修饰来促进昆虫淋巴细胞凋亡；
通过促进昆虫淋巴细胞中的DHYS和/或DOHH的转录和/或表达来防治昆虫；和/或通过促进昆虫淋巴细胞中的eIF5A的羧腐胺赖氨酸修饰来防治昆虫。
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