CN101014708A - 反义寡核苷酸或siRNA在抑制eIF-5A1表达中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及被称为细胞凋亡因子5A1或简称为因子5A1的真核细胞凋亡特异性起始因子5A(eIF-5A),细胞凋亡因子5A1的核酸和多肽以及使用反义核苷酸或siRNA抑制因子5A1的表达,从而阻止或抑制细胞凋亡的方法。本发明还涉及通过抑制细胞凋亡因子5A的表达来抑制或阻止促炎因子的表达。
Description
相关申请
本申请是2003年3月10日提交的美国申请序列号10/383,614的部分继续申请,美国申请序列号10/383,614是2002年10月23日提交的美国申请序列号10/277,969的部分继续申请,美国申请序列号10/277,969是2002年7月23日提交的美国申请序列号10/200,148的部分继续申请,美国申请序列号10/200,148是2002年5月7日提交的美国申请序列号10/141,647的部分继续申请,美国申请序列号10/141,647是2001年7月23日提交的美国申请序列号9/909,796的部分继续申请,所有上述申请在此全文引入本申请。本申请还要求享有2003年3月5日提交的美国临时申请60/451,677、2003年6月6日提交的美国临时申请60/476,194、和2003年9月22日提交的美国临时申请60/504,731的优先权,上述临时申请在此也全文引入本申请。
发明的技术领域
本发明涉及真核细胞凋亡特异性起始因子-5A(eIF-5A),或称为细胞凋亡因子5A、因子5A1、细胞凋亡特异性eIF-5A和脱氧8-羟-2,7,10-三氨基癸酸合酶(deoxyhypusine synthase,DHS)。本发明涉及细胞凋亡因子5A和DHS的核酸和多肽以及抑制细胞凋亡因子5A和DHS表达的方法。
发明的技术背景
细胞凋亡属于基因程序性细胞事件,其特点是具有明确的形态学特征,如细胞皱缩、染色质凝聚、核断裂以及膜起泡。Kerr等(1972)Br.J.Cancer,26,239-257;Wyllie等(1989)Int.Rev.Cytol.,68,251-306。它在正常组织发育和内环境稳定方面起着重要的作用,细胞凋亡程序的缺陷被认为会导致从神经变性和自身免疫性疾病到肿瘤的多种人类疾病。Thompson(1995)Science,267,1456-1462;Mullauer等(2001)Mutat.Res,488,211-231。尽管对于凋亡细胞的形态学特征已经有了详细的描述,但对于调节这一过程的分子途径则刚刚开始阐述。
人们认为在细胞凋亡中发挥重要作用的一类蛋白是半胱氨酸蛋白酶家族,其也被称作天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase),它似乎是绝大多数细胞凋亡途径所必需的。Creagh &Martin(2001)Biochem.Soc.Trans,29,696-701;Dales等(2001)Leuk.Lymphoma,41,247-253。天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶引发细胞凋亡来应答由于切割各种细胞蛋白所产生的细胞凋亡刺激物,从而导致细胞凋亡的典型表现,包括细胞皱缩、膜起泡和DNA断裂。Chang & Yang(2000)Microbiol.Mol.Biol.Rev.,64,821-846。
促细胞凋亡蛋白,如Bax或Bak,也在细胞凋亡途径中起着关键性的作用,它可以释放天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶激活分子,如线粒体细胞色素c,并由此引发细胞凋亡来促进细胞的死亡。Martinou &Green(2001)Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.,2,63-67;Zou等(1997)Cell,90,405-413。抗细胞凋亡蛋白,如Bcl-2,通过拮抗促细胞凋亡蛋白Bax和Bak的活性而促进细胞存活。Tsujimoto(1998)GenesCells,3,697-707;Kroemer(1997)Nature Med.,3,614-620。人们认为Bax∶Bc1-2的比例是决定细胞命运的一种模式;Bax过量会促进细胞凋亡,而Bcl-2过量则促进细胞存活。Salomons等(1997)Int.J.Cancer,71,959-965;Wallace-Brodeur &Lowe(1999)Cell Mol.Life Sci.,55,64-75。
另外一种与细胞凋亡有关的关键性蛋白是由肿瘤抑制基因p53编码的蛋白。该蛋白是一种转录因子,能够调节细胞生长并能够诱导受损的和遗传上不稳定的细胞的凋亡,据推测这可能是通过上调Bax而达到的。Bole等91997)Surgical Oncology,6,133-142;Ronen等,1996;Schuler和Green(2001)Biochem.Soc.Trans.,29,684-688;Ryan等(2001)Curr.Opin.Cell Biol.,13,332-337;Zrnig等(2001)Biochem.Biophys.Acta,1551,F1-F37。
在分析细胞凋亡起始和进展的各种方法中,通常要用到表征细胞凋亡的独特的形态学特征。可以用于检测方法的其中一种凋亡细胞的特征是外转酶的活化,这可导致磷脂酰丝氨酸,一种通常位于质膜内小叶的磷脂的外在化。Fadok等(1992)J.Immunol.,149,4029-4035。可通过使用与荧光染料偶联的磷脂酰丝氨酸-结合蛋白,即膜联蛋白V进行染色,来检测携带外在化磷脂酰丝氨酸的凋亡细胞。在细胞凋亡过程中发生的特征性DNA断裂可通过使用带有荧光素-标记的脱氧核苷酸对DNA片段的3’羟基末端进行标记来加以检测。与核酸结合的荧光染料,如Hoescht 33258,可用于检测凋亡细胞中的染色质凝聚和核断裂。细胞群中细胞凋亡的程度还可以根据细胞提取物中天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的蛋白水解活性的程度来加以推断。
作为一种遗传过程,细胞凋亡像任何其它发育过程一样,同样可以被突变而破坏。确信细胞凋亡途径的改变在许多疾病过程,包括癌症中起着关键性的作用。Wyllie等(1980)Int.Rev.Cytol.,68,251-306;Thompson(1995)Science,267,1456-1462;Sen和D′Incalci(1992)FEBS Letters,307,122-127;McDonnell等(1995)Seminars in Cancer and Biobogy,6,53-60。对癌症发生和进展的研究在传统上集中在对细胞增殖的研究上。但是,最近人们才逐渐认识到细胞凋亡在肿瘤发生过程中所起的关键性作用。事实上,自从人们能够在肿瘤细胞中以某种方式对细胞凋亡的控制进行恒定的改变,现在很多有关细胞凋亡的知识已经通过使用肿瘤模型有所了解。Bole等(1997)Surgical Oncology,6,133-142。
在肿瘤发展过程中,可以通过各种信号引发细胞凋亡。胞外信号包括生长或存活因子缺失,低氧和电离辐射。可引发细胞凋亡的内部信号包括DNA损伤、端粒缩短和产生不适宜增殖信号的致癌突变。Lowe和Lin(2000)Carcinogenesis,21,485-495。人们认为用于治疗恶性肿瘤的电离辐射和几乎所有的细胞毒性化疗试剂就是通过引发内源性细胞凋亡机制诱导细胞死亡而起作用的。Rowan和Fisher(1997)Leukemia,11,457-465;Kerr等(1994)Cancer,73,2013-2026;Martin和Schwartz(1997)Oncology Reaearch,9,1-5。
有证据表明,在癌症进展的早期,肿瘤细胞对诱导细胞凋亡的试剂(如电离辐射或化疗药物)较为敏感。然而,随着肿瘤的进展,细胞逐渐形成了对细胞凋亡刺激物的抗性。Naik等(1996)Genes andDevelopment,10,2105-2116。这就可以解释为什么早期癌症对化疗的反应要比更晚期的病变好。晚期癌症所逐渐形成的对化疗和放疗抗性的能力似乎与细胞凋亡途径的改变有关,这种途径的改变能够限制肿瘤细胞对细胞凋亡刺激物应答的能力。Reed等(1996)Journal ofCelllular Biology,60,23-32;Meyn等(1996)Cancer MetastasisReviews,15,119-131;Hannun(1997)Blood,89,1845-1853;Reed(1995)Toxicology Letters,82-83,155-158;Hickman(1996)European Journal of Cancer,32A,921-926。在慢性淋巴细胞白血病和结肠癌中,对化疗的抗性分别与抗-细胞凋亡基因Bc1-2的过量表达和促细胞凋亡bax基因的缺失或突变有关。
肿瘤细胞成功建立播散性转移的能力似乎也与细胞凋亡途径的改变有关。Bold等(1997)Surgical Oncology,6,133-142。例如,人们认为在70%的肿瘤中,会发生肿瘤抑制基因p53的突变。Evan等(1995)Curr.Opin.Cell Biol.,7,825-834。使p53失活的突变限制了细胞应答DNA破坏而诱导细胞凋亡的能力,从而避免细胞遭受进一步的突变损害。Ko和Prives(1996)Genes and Development,10,1054-1072。
因此,细胞凋亡与肿瘤转化和转移的发生和进展密切相关,通过对细胞凋亡途径的更深入了解,可以使人们建立起新的治疗癌症的方法,即通过基因治疗方法来调节细胞凋亡途径。Bold等(1997)Surgical Oncology,6,133-142。
本发明涉及eIF-5A cDNA的克隆,其在诱导细胞凋亡之前即时上调。这种细胞凋亡-特异性eIF-5A很可能是一种合适的靶,可以用来干预细胞凋亡引发的疾病状态,这是因为该基因似乎在与细胞凋亡途径有关的下游效应物和转录因子的转录后调节水平上发挥着作用。具体而言,细胞凋亡-特异性eIF-5A似乎可选择性促进编码细胞凋亡下游效应物和转录因子的mRNA从核到胞质的转运,在胞质中它们随后即被翻译。对启动细胞凋亡的最终判断似乎是内部和外部促-和抗-细胞凋亡信号进行复杂的相互作用的结果。Lowe和Lin(2000)Carcinogenesis,21,485-495。通过其促进下游细胞凋亡效应物和转录因子翻译的能力,上述与细胞凋亡有关的eIF-5A似乎会打破这些信号之间的平衡,使之有利于细胞凋亡。
正如前面所述,人们已经认识到抗癌试剂能够诱发细胞凋亡,而同时细胞凋亡途径的改变又能消弱药物-诱导的细胞死亡。Schmitt和Lowe(1999)J.Pathol.,187,127-137。例如,很多抗癌药物都可上调p53,而同时已经丧失p53的肿瘤细胞则产生了对这些药物的抗性。然而,如果剂量充足,几乎所有的化疗试剂都可诱导不依赖p53的细胞凋亡,这表明即使在抗药性肿瘤中,细胞凋亡的途径也未被完全阻断。Wallace-Brodeur和Lowe(1999)Cell Mol.Life Sci.,55,64-75。这提示诱导细胞凋亡特异性eIF-5A,即使不能校正突变的基因,但也能够避开依赖p53的途径,通过促进替代途径而诱导细胞凋亡。
诱导细胞凋亡相关性eIF-5A能够选择性地靶向癌细胞,而对正常的相邻细胞具有很小的作用或没有作用。这是因为在肿瘤细胞中表达的促有丝分裂致癌基因能够提供一种特定种类mRNA形式的细胞凋亡信号,在正常细胞中则不存在这种凋亡信号。Lowe等(1993)Cell,74,954-967;Lowe和Lin(2000)Carcinogenesis,21,485-495。例如,野生型p53在p53突变肿瘤细胞中的恢复可直接诱导细胞凋亡,并增加肿瘤细胞系和异种移植物的药物敏感性(Spitz等,1996;Badie等1998)。
选择细胞凋亡-eIF-5A是因为它能够介导下游细胞凋亡效应物和转录因子mRNA从核到胞质的转运,从而能够选择性地促进上述mRNA的翻译。因此,要想使细胞凋亡eIF-5A起作用,必须先转录这些效应物和转录因子的mRNA。由于这些mRNA是在癌症细胞,而不是在相邻的正常细胞中被转录,因此预期细胞凋亡eIF-5A可以促进癌症细胞的凋亡,而对正常细胞则没有或有极小的影响。因此,使用细胞凋亡相关性eIF-5A恢复肿瘤细胞的凋亡可以降低对癌症患者所造成的毒性和副作用,这是因为它能够选择性地靶向肿瘤细胞。诱导细胞凋亡eIF-5A还能够增强肿瘤细胞对抗癌药物的应答,从而提高这些试剂对抗药物肿瘤的治疗效果。如此可减少抗癌药物的有效剂量,并降低对患者的毒性。
在视网膜神经节细胞退化导致青光眼而失明的过程中,细胞凋亡途径的改变在其中也起着关键性的作用。青光眼是一组眼部状况的总称,其中因为眼内压(IOP)升高而导致视神经损伤,进而发展为失明。虽然现在可以通过药物或手术来控制IOP以减少对视神经的损伤,或使用神经保护剂,来对青光眼加以控制,但仍然需要通过控制患有青光眼病变的眼剂中的细胞凋亡来避免视网膜神经节细胞的退化。
在细胞凋亡途径中还包含细胞因子。生物体系需要细胞相互作用来对其加以调控,细胞之间的相互干扰通常涉及大量的多种细胞因子。细胞因子是介质,在对多种刺激物产生应答时,由许多不同类型的细胞产生。细胞因子是多效分子,对许多不同类型的细胞发挥着许多不同的作用,但它对于免疫反应的调节和造血细胞的增殖和分化又有着尤为重要的作用。细胞因子在靶细胞中作用能够促进细胞存活、增殖、激活、分化或细胞凋亡,这依赖于特定的细胞因子类型、相对浓度和其它介质的存在情况。
抗细胞因子在治疗自身免疫病(牛皮癣、类风湿性关节炎、克隆氏病)中的应用正在普及。促炎细胞因子IL-1和TNF在上述慢性疾病的病理方面起着非常重要的作用,抗细胞因子治疗能够降低上述两种细胞因子的生物活性,从而提供有益的治疗效果(Dinarello和Abraham,2002)。
白介素1(IL-1)是一种介导局部和系统炎性反应的重要的细胞因子,其与TNF在许多疾病的发病机理中有着协同作用,这些疾病包括脉管炎、骨质疏松症、神经变性疾病、糖尿病、狼疮、肾炎和自身免疫病,如类风湿性关节炎。当给剔除了IL-1β的鼠注射黑素瘤细胞时,鼠表现出对肿瘤转移和血管生成的抗性,这表明IL-1β在肿瘤血管发生和侵入方面有着重要的作用(Voronov等,2003)。
白介素18(IL-18)是最近才发现的IL-1家族的一员,在结构、受体和功能上与IL-1相关。在炎性反应和自身免疫病方面,IL-18是一种主要的细胞因子,因为它能够诱导干扰素-gamma(IFN-γ)、TNF-α和IL-1。IL-18β和IL-18均能够诱导TNF-α的产生,已知TNF-α是一种在心肌局部缺血中导致心功能不全的细胞因子(Maekawa等,2002)。在过度灌注的人心房肌的局部缺血/再灌注模型中,用IL-18结合蛋白通过中和抑制IL-18,发现能够减少局部缺血诱导的心肌功能不全(Dinarello,2001)。在胶原蛋白诱导的关节炎鼠模型中,使用鼠IL-18结合蛋白中和1L-18也能够降低IFN-γ、TNF-α和IL-1β的转录水平,并减少关节损伤(Banda等,2003)。另外还证明,减少IL-18的产生或可获得性还有益于对转移性癌症的控制,如给鼠黑素瘤模型注射IL-18结合蛋白就成功地抑制了肿瘤的转移(Carrascal等,2003)。作为一种促炎细胞因子,IL-18还具有更进一步的重要性,在患有慢性肝病的患者中,其血浆中的IL-18水平有所提高,而且升高的水平与所患疾病的严重程度相关(Ludwiczek等,2002)。类似的,在患有肾病的糖尿病患者中,其血清中的IL-18和TNF-α也有所提高(Moriwaki等,2003)。脑创伤性损害所造成的神经炎也是由促炎细胞因子介导的,证据证明对脑创伤后的鼠使用IL-8结合蛋白来抑制IL-18,能够使神经损伤得到恢复(Yatsiv等,2002)。
TNF-α,细胞因子TNF家族的一员,是一种具有多效性的促炎细胞因子,其作用包括在造血细胞中协同促有丝分裂、诱导炎症反应、和诱导许多细胞类型的细胞死亡。TNF-α通常由细菌脂多糖、寄生虫、病毒、恶性细胞和细胞因子所诱导,其作用通常有益于保护细胞免受感染和癌。然而,TNF-α不合适的诱导是造成急性和慢性炎症,如自身免疫病的一个主要的因素,而且也会造成癌症、AIDS、心脏病和脓毒症(参见Aggarwal和Natarajan,1996,以及Sharma和Anker,2002的综述)。实验性动物疾病模型(即脓毒性休克和类风湿性关节炎)和人疾病症(即炎性肠病和急性移植物抗宿主病)均能产生阻断TNF-α有益的效果(Wallach等,1999)。抑制TNF-α还可有效为患有自身免疫病如克隆氏病(van Deventer,1999)和患有类风湿性关节炎(Richard-Miceli和Dougados,2001)的患者提供缓解。人们还认为TNF-α促进B淋巴细胞存活和生长的能力在B-细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)的发病机理中也起着作用,而且在B-CLL中T细胞表达TNF-α的水平与肿瘤大小和疾病所处的阶段呈正相关(Bojarska-Junak等,2002)。已知白介素-1β(IL-1β)是诱导TNF-α产生的细胞因子。
已知脱氧8-羟-2,7,10-三氨基癸酸合酶(DHS)以及含有8-羟-2,7,10-三氨基癸酸的真核生物翻译起始因子-5A(eIF-5A)在很多细胞过程,包括细胞生长和分化中起着重要的作用。8-羟-2,7,10-三氨基癸酸,一种独特的氨基酸,发现其存在于所有检测的真核生物和古细菌中,但在真细菌中则没有发现,eIF-5A是唯一已知的含有8-羟-2,7,10-三氨基癸酸的蛋白。Park(1998)J.Biol.Chem.,263,7447-7449;Schümann和Klink(1989)System.Appl.Microbiol.,11,103-107;Bartig等(1990)System.Appl.Microbiol.,13,112-116;Gordon等(1987a)J.Biol.Chem.,262,16585-16589。活性eIF-5A是经过两个翻译后步骤形成的:第一步是利用脱氧8-羟-2,7,10-三氨基癸酸合酶催化,将亚精胺的4-氨基丁基部分转移到前体eIF-5A的特定赖氨酸的α-氨基上,从而形成脱氧8-羟-2,7,10-三氨基癸酸残基;第二步涉及利用脱氧8-羟-2,7,10-三氨基癸酸羟化酶将4-氨基丁基部分羟化,形成8-羟-2,7,10-三氨基癸酸。
物种之间的eIF-5A的氨基酸序列较为保守,而且在eIF-5A中,8-羟-2,7,10-三氨基癸酸残基周围的氨基酸序列是严格保守的,这表明上述修饰对于存活而言可能是重要的。Park等(1993)Biofactors,4,95-104。这种假设可进一步由下列的观察结果支持,即迄今为止,在酵母中发现的eIF-5A同种型的失活,或DHS基因(催化活化过程的第一步)的失活,均可阻断细胞分裂。Schnier等(1991)Mol.Cell.Biol.,11,3105-3114;Sasaki等(1996)FEBS Lett.,384,151-154;Park等(1998)J.Biol.Chem.,273,1677-1683。然而,酵母中eIF-5A蛋白的缺失仅导致蛋白合成总量的很小的减少,这表明eIF-5A是特定亚型mRNA翻译所必需的,而不是全部蛋白合成所需的。Kang等(1993),″Effect of initiation factor eIF-5Adepletion on cell proliferation and protein synthesis″,Tuite,M.(ed.),Protein Synthesis and Targeting in Yeast,NATO SeriesH。进来发现结合eIF-5A的配体也具有高度保守的基元,这进一步支持了eIF-5A的重要性。Xu和Chen(2001)J.Biol.Chem.,276,2555-2561。另外,人们发现修饰的eIF-5A的8-羟-2,7,10-三氨基癸酸残基对于与RNA的序列特异性结合也是必需的,同时这种结合不能使其免受核糖核酸酶的降解。
此外,eIF-5A的胞内缺失导致了特定mRNAs在核中大量累积,这表明eIF-5A可能负责着特定种类的mRNAs从核到胞质的穿梭。Liu和Tartakoff(1997)Supplement to Molecular Biology of the Cell,8,426a。文摘号2476,37th American Society for Cell BiologyAnnual Meeting。eIF-5A在与核孔相连的核内丝上的累积,以及其与常用的核输出受体之间的相互作用,表明eIF-5A是一种核质穿梭蛋白,而不是多核糖体的组分。Rosorius等(1999)J.Cell Science,112,2369-2380。
Smit-McBrde等人于1989年首次从人中克隆得到eIF-5A的cDNA,从那之后,又从各种真核生物,包括酵母、大鼠、鸡胚、苜蓿和番茄中克隆出eIF-5A的cDNA或基因。Smit-McBride等(1989a)J.Biol.Chem.,264,1578-1583;Schnier等(1991)(酵母);Sano,A.(1995)Imahori,M.等(eds),Polyamines,Basic and ClinicalAspects,VNU Science Press,The Netherlands,81-88(大鼠);Rinaudo和Park(1992)FASEB J.,6,A453(鸡胚);Pay等(1991)Plant Mol.Biol.,17,927-929(苜蓿);Wang等(2001)J.Biol.Chem.,276,17541-17549(番茄)。
已经在各种人类组织和哺乳动物细胞系中研究过eIF-5A mRNA的表达。例如,在除去血清后加入血清之后,在人成纤维细胞中观察到eIF-5A的表达发生变化。Pang和Chen(1994)J.Cell Physiol.,160,531-538。在衰老的成纤维细胞中观察到,脱氧8-羟-2,7,10-三氨基癸酸合酶的活性随着年龄而降低,还观察到前体eIF-5A的富集,但是还不能确定这是否反应了同种型之间存在着不同的变化。Chen和Chen(1997b)J.Cell Physiol.,170,248-254。
研究表明,eIf-5A可能是病毒蛋白,如人免疫缺陷I型病毒Rev蛋白和人T细胞白血病I型病毒Rev蛋白的细胞靶。Ruhl等(19930J.Cell Biol.,123,1309-1320;Katahira等(1995)J.Virol.,69,3125-3133。初步研究表明eIF-5A可能通过与其它RNA-结合蛋白,如Rev相互作用而靶向于RNA,提示这些病毒蛋白可以募集eIF-5A,以用于加工病毒RNA。Liu等(1997)Biol.Signals,6,166-174。
因此,尽管eIF5A和DHS是已知的,但仍然需要进一步了解这些蛋白在细胞凋亡途径中有何作用,以及细胞因子刺激如何调节细胞凋亡和细胞因子的表达。本发明实现了上述需求。
发明简述
本发明涉及被称为细胞凋亡因子5A1或简称为因子5A1的真核细胞凋亡特异性起始因子5A(eIF-5A)。本发明还涉及细胞凋亡因子5A1的核酸和多肽以及使用反义核苷酸或siRNAs抑制因子5A1的表达,从而阻止或抑制细胞凋亡的方法。本发明还涉及通过抑制细胞凋亡因子5A1的表达来抑制或阻止促炎因子的表达。此外,本发明还涉及通过抑制细胞凋亡因子5A1的表达来阻止或抑制p53的表达。本发明还涉及一种通过使用反义核苷酸或siRNAs阻止或抑制细胞凋亡因子5A1的表达以提高Bcl-2表达的方法。本发明还提供了一种抑制细胞因子,特别是人上皮细胞中TNF-α因子产生的方法。在本发明的另外一个实施方式中,通过使用靶向细胞凋亡特异性因子eIF5A1的反义寡核苷酸来抑制细胞凋亡特异性eIF-5A1因子的表达,从而提供了预防青光眼中视网膜神经节细胞死亡的方法。本发明还提供了通过使用反义寡核苷酸或siRNAs来调控eIF-5A的表达,从而调控树突细胞成熟速度和PBMC激活的方法。
附图说明
图1:大鼠细胞凋亡特异性因子eIF-5A3’末端的核苷酸序列和由其推导的氨基酸序列。
图2:大鼠细胞凋亡特异性因子eIF-5A cDNA 5’末端的核苷酸序列和由其推导的氨基酸序列。
图3:大鼠黄体细胞凋亡特异性因子eIF-5A全长cDNA的核苷酸序列。
图4:大鼠细胞凋亡特异性DHS cDNA 3’末端的核苷酸序列和由其推导的氨基酸序列。
图5:大鼠黄体细胞凋亡特异性因子eIF-5A cDNA的全长核苷酸序列与人eIF-5A核苷酸序列(登记号BC000751或NM_001970,SEQIDNO:3)的比对。
图6:大鼠黄体细胞凋亡特异性因子eIF-5A cDNA的全长核苷酸序列与人eIF-5A核苷酸序列(登记号NM_020390,SEQ ID NO:4)的比对。
图7:大鼠黄体细胞凋亡特异性eIF-5A cDNA的全长核苷酸序列与小鼠eIF-5A核苷酸序列(登记号BC003889)的比对。小鼠的核苷酸序列(登记号BC003889)是SEQ ID NO:5。
图8:大鼠黄体细胞凋亡特异性因子eIF-5A的推导全长氨基酸序列与人eIF-5A的推导氨基酸序列(登记号BC000751或NM_001970)的比对。
图9:大鼠黄体细胞凋亡特异性因子eIF-5A的推导全长氨基酸序列与人eIF-5A的推导氨基酸序列(登记号NM_020390)的比对。
图10:大鼠黄体细胞凋亡特异性因子eIF-5A的推导全长氨基酸序列与小鼠eIF-5A的推导氨基酸序列(登记号BC003889)的比对。
图11:大鼠黄体细胞凋亡特异性因子DHS cDNA部分长度的核苷酸序列与DHS核苷酸序列(登记号BC000333,SEQ ID NO:8)的比对。
图12:大鼠黄体细胞凋亡特异性因子eIF-5A cDNA的限制性酶切图谱。
图13:大鼠细胞凋亡特异性DHS cDNA部分长度的限制性酶切图谱。
图14:以大鼠黄体细胞凋亡特异性eIF-5A cDNA的32P-dCTP-标记的3’末端探测的总RNA的RNA 印迹(图14A)和溴化乙锭染色的凝胶电泳结果(图14B)。
图15:以大鼠黄体细胞凋亡特异性DHS cDNA的32P-dCTP-标记的3’末端为探针探测的总RNA的RNA印迹(图15A)和溴化乙锭染色的凝胶电泳结果(图15B)。
图16:显示DNA分梯试验,在该试验中检测了超数排卵大鼠黄体在注射PGF-2α后细胞凋亡的程度。
图17:用PGF-2α对大鼠进行处理后,从凋亡大鼠黄体分离得到的基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳,显示为DNA序列梯。
图18:显示DNA分梯试验,在该试验中检测了超数排卵大鼠黄体分散细胞的凋亡程度,处理过程是在用PGF-2α处理前,先用亚精胺处理大鼠。
图19:显示DNA分梯试验,在该试验中检测了用亚精胺和/或PGF-2α处理大鼠后,超数排卵大鼠黄体的细胞凋亡程度。
图20:以大鼠黄体细胞凋亡特异性eIF-5A cDNA32P-dCTP-标记的部分片段为探针,与大鼠基因组DNA进行的DNA印迹。
图21:显示pHM6,一种哺乳动物附加表位表达载体(RocheMolecular Biochemicals)。
图22:以大鼠黄体细胞凋亡特异性DHS的cDNA32P-dCTP-标记的3’-非翻译区为探测的,在除去血清诱导细胞凋亡之后,从COS-7细胞分离得到的总RNA的RNA印迹(图22A)和用溴化乙锭染色的凝胶电泳结果(图22B)。
图23:显示瞬时转染COS-7细胞的流程图。
图24:显示COS-7细胞在用pHM6转染后,瞬时表达外源蛋白的蛋白质印迹。
图25:显示当COS-7细胞用包含有义取向的全长大鼠细胞凋亡特异性eIF-5A的pHM6瞬时转染时,通过提高了半胱氨酸天冬氨酸酶活性,而反映出的细胞凋亡增强。
图26:显示当COS-7细胞用包含有义取向的全长大鼠细胞凋亡特异性eIF-5A的pHM6瞬时转染时,通过提高了DNA的断裂程度,而反映出的细胞凋亡增强。
图27:显示当COS-7细胞用包含有义取向的全长大鼠细胞凋亡特异性eIF-5A的pHM6瞬时转染时,对通过提高了核断裂程度而反映出的细胞凋亡进行检测的结果。
图28:显示当COS-7细胞用包含有义取向的全长大鼠细胞凋亡特异性eIF-5A的pHM6瞬时转染时,通过提高了核断裂程度,而反映出的细胞凋亡增强。
图29:显示当COS-7细胞用包含有义取向的全长大鼠细胞凋亡特异性eIF-5A的pHM6瞬时转染时,对通过磷脂酰丝氨酸位点暴露反映出的细胞凋亡进行检测的结果。
图30:显示当COS-7细胞用包含有义取向的全长大鼠细胞凋亡特异性eIF-5A的pHM6瞬时转染时,通过提高了磷脂酰丝氨酸位点的暴露,而反映出的细胞凋亡增强。
图31:显示当COS-7细胞用包含有义取向的全长大鼠细胞凋亡特异性eIF-5A的pHM6瞬时转染时,通过提高了核断裂程度,而反映出的细胞凋亡增强。
图32:显示当COS-7细胞用包含有义取向的全长大鼠细胞凋亡特异性eIF-5A的pHM6瞬时转染时,细胞凋亡增强。
图33:显示当COS-7细胞用包含有义取向的全长大鼠细胞凋亡特异性eIF-5A的pHM6瞬时转染时,Bcl-2下调。图33A是用考马斯亮蓝染色的蛋白的印迹;图33B是相应的蛋白质印迹。
图34:显示考马斯亮蓝染色蛋白的印迹和相应的用包含反义取向的全长大鼠细胞凋亡特异性eIF-5A的pHM6瞬时转染的COS-7细胞,在使用Bcl-2作为探针的情况下进行的蛋白质印迹。
图35:显示考马斯亮蓝染色蛋白的印迹和相应的用包含有义取向的全长大鼠细胞凋亡特异性eIF-5A的pHM6瞬时转染的COS-7细胞,在以c-Mys作为探针的情况下进行的蛋白质印迹。
图36:显示考马斯亮蓝染色蛋白的印迹和相应的用包含有义取向的全长大鼠细胞凋亡特异性eIF-5A的pHM6瞬时转染的COS-7细胞,在以p53作为探针的情况下进行的蛋白质印迹。
图37:显示考马斯亮蓝染色蛋白的印迹和相应的以抗-[HA]-过氧化物酶为探针显示pHM6全长大鼠细胞凋亡特异性eIF-5A在COS-7细胞中表达情况的蛋白质印迹,以及考马斯亮蓝染色蛋白条带和相应的以p53为探针显示pHM6全长大鼠细胞凋亡特异性eIF-5A在COS-7细胞中表达情况的蛋白质印迹。
图38:分离自RKO细胞的人eIF5A2与人eIF5A2序列(Genbank登记号XM_113401)的比对。
图39:该图表显示在RKO和RKO-E6细胞瞬时转染后,所发生的细胞凋亡的百分率。RKO和RKO-E6细胞分别用pHM6-LacZ或pHM6-eIF5A1进行了瞬时转染。用放线菌素D处理并用pHM6-eIF5A1进行转染的RKO细胞,相对于用pHM6-LacZ转染同时没有经过放线菌素D处理的细胞,细胞凋亡升高了240%。用放线菌素D处理并用pHM6-eIF5A1进行转染的RKO-E6细胞,相对于用pHM6-LacZ转染同时没有经过放线菌素D处理的细胞,细胞凋亡升高了105%。
图40:该图表显示在瞬时转染RKO细胞后,所发生的细胞凋亡的百分率。分别用pHM6-LacZ、pHM6-eIF5A1、pHM6-eIF5A2或pHM6-截短的eIF5A1对RKO细胞进行了瞬时转染。用pHM6-eIF5A1进行转染的细胞,相对于用pHM6-LacZ转染的对照细胞,细胞凋亡升高了25%。在用pHM6-eIF5A2或pHM6-截短的eIF5A1转染的细胞中没有发现明显的升高。
图41:该图表显示在瞬时转染RKO细胞后,所发生的细胞凋亡的百分率。RKO细胞或者未被转染,或者被pHM6-LacZ或pHM6-eIF5A1瞬时转染。在对转染效率进行校正后,发现在被pHM6-eIF5A1转染的细胞中,有60%发生了细胞凋亡。
图42:提供瞬时转染后,RKO细胞凋亡的流式细胞计数分析结果。RKO细胞或者未被转染,或者被pHM6-LacZ、pHM6-eIF5A1、pHM6-eIF5A2或pHM6-截短的eIF5A1转染。该表描述了正在经历凋亡的细胞的百分率,它是根据每个通道下的峰面积计算出来的。用未转染细胞的背景凋亡和转染效率进行校正后,有80%用pHM6-eIF5A1转染的细胞显示凋亡。用pHM6-LacZ、pHM6-eIF5A2或pHM6-截短的eIF5A1转染的细胞仅显示背景水平的凋亡。
图43:提供蛋白的蛋白质印迹,所述蛋白是从用0.25μg/ml放线菌素D处理0、3、7、24和48小时的RKO细胞中提取出来的。上图显示使用抗-p53作为第一抗体进行的蛋白质印迹。中图显示使用抗-eIF5A1作为第一抗体进行的蛋白质印迹。下图显示用于抗-eIF5A1印迹的薄膜,所述印迹是在化学发光检测以证实等量加样后,用考马斯亮蓝染色的。结果表明在用放线菌素D处理后,p53和eIF5A1均表现出上调。
图44:是一个柱形图,显示在心脏组织中表达的细胞凋亡特异性eIF-5A(eIF5a)和增殖特异性eIF-5A(eIF5b)。心脏组织取自接受了冠状动脉旁路移植物(CABG)的患者。X轴是患者标识号。Y轴是信使RNA皮克数对核糖体RNA 18s纳克数的比值,单位为pg/ng。
图45:是一个柱形图,显示在心脏组织中表达的细胞凋亡特异性eIF-5A(eIF5a)和增殖特异性eIF-5A(eIF5b)。心脏组织取自接受了瓣膜置换的患者。亮灰色条带代表eIF5a的基因表达水平,黑灰色条带代表eIF5b的基因表达水平。X轴是患者标识号。Y轴是信使RNA皮克数对核糖体RNA 18s纳克数的比值,单位为pg/ng。
图46:是一个柱形图,显示在缺血前的心脏组织和缺血后的心脏组织中,利用实时PCR测定到的细胞凋亡特异性eIF-5A(eIF5a)和增殖eIF-5A(eIF5b)的基因表达水平。Y轴是信使RNA对核糖体RNA 18s的比值,单位为pg/ng。
图47:显示对心脏组织进行试验的流程图。
图48:显示在缺血前和缺血后,诱导的心脏组织EKGs。
图49:显示进行图47所示的试验所用的试验台。
图50A-F:显示患者数据,其中细胞凋亡因子eIF-5a(也表示为eIF-5a1或图表中的IF5a1)的水平与IL-1β和IL-18的水平相关。图50A的数据来自接受了冠状动脉旁路移植(CABG)的患者。图50B的数据来自接受了瓣膜置换的患者。图50C显示在CABG患者中,细胞凋亡因子eIF-5a(因子5a1)与IL-18的相关性。图50D显示在CABG患者中,增殖eIF-5a(因子a2)与IL-18的相关性。图50E显示在瓣膜置换的患者中,细胞凋亡因子eIF-5a(因子5a1)与IL-18的相关性。图50F显示在瓣膜置换的患者中,增殖eIF-5a(因子a2)与IL-18的相关性。
图51:是患者的数据表,图50A-F所使用的患者数据来自该数据表。
图52:显示在经过反义寡核苷酸1、2和3(是凋亡因子5A的反义寡核苷酸)处理后,RKO细胞产生的蛋白水平。RKO细胞在用反义细胞凋亡因子5A的核苷酸转染后,所产生的细胞凋亡因子5A以及p53的量均有所减少。
图53:显示摄取荧光标记的反义寡核苷酸的情况。
图54-58:显示与没有用反义细胞凋亡因子5A寡核苷酸转染的细胞相比,用反义细胞凋亡因子5A寡核苷酸转染的细胞,其细胞凋亡的百分率下降。
图59:显示用TNF-α和/或喜树碱处理筛板细胞造成细胞凋亡数量增加。
图60和61:显示用反义凋亡因子5A的寡核苷酸处理的细胞,与未用反义凋亡因子5A的寡核苷酸处理的细胞相比,凋亡细胞的百分率下降。
图62:显示在存在血清或没有血清的情况下,筛板(laminacribrosa)细胞摄取标记的siRNA的情况。
图63:显示用细胞凋亡因子5a的siRNA转染的细胞,细胞凋亡因子5a蛋白的产量降低,同时Bcl-2蛋白的产量增加。细胞凋亡因子5A表达量的降低与BCL-2表达量的增加相关。
图64:显示用细胞凋亡因子5a的siRNA转染的细胞,细胞凋亡因子5a蛋白的产量降低。
图65-67:显示用细胞凋亡因子5a的siRNA转染的细胞,在经过喜树碱和TNF-α处理后,凋亡细胞的百分率下降。
图68:是筛板细胞系#506在经过siRNA转染以及用喜树碱和TNF-α处理后,进行Hoescht染色的照片,处理过程记载在图67和实施例13中。比较明亮的染色细胞是正在凋亡的细胞。因为染色质发生了凝聚,所以它们的核较小,此外它们的尺寸较小并且形状不规则。
图69:显示在存在IL-1的情况下,用细胞凋亡因子5A转染HepG2细胞,细胞分泌的TNF-α的量比未转染细胞要少。
图70:显示人细胞凋亡因子5a(SEQ ID NO:*AA)的序列,以及本发明的5 siRNAs的序列(SEQ ID NO:*1、*2、*3、*4和*5)。
图71:显示人细胞凋亡因子5a(SEQ ID NO:*AA)的序列,以及本发明的5 siRNAs的序列(SEQ ID NO:*6、*7和*8)。
图72:显示靶向人eIF5A1的三个反义寡核苷酸的结合位点。
图73a和b:显示人eIF5A1(细胞凋亡因子5A)与人eIF5A2(增殖eIF5A)的核苷酸比对和氨基酸比对。
图74A:是蛋白质印迹图片,显示在转染的HT-29细胞中,抗eIF5A1的siRNA,即使没有抑制,也降低了TNF-α的产量。图74B是ELISA结果。
图75:是ELISA结果。显示用抗eIF5A1的siRNA处理的细胞与对照细胞相比,TNF-α的产量减少。
图76:显示U-937分化试验的时间进程。参见实施例16。
图77:是蛋白质印迹结果,显示在单核细胞分化过程中eIF-5A1的上调情况,以及随后的TNF-α分泌情况。
图78:显示干细胞分化情况,以及使用抗eIF-5A1的siRNA抑制细胞因子产生的情况。
图79:是一个柱形图,显示应答于TNF-α和干扰素而产生IL-8。该图表显示抗eIF5A的siRNA阻遏了几乎全部的对干扰素应答产生的IL-8,以及由干扰素和TNF联合处理产生的大量IL-8。
图80:是另外一个柱形图,显示应答于TNF-α和干扰素而产生IL-8。该图显示抗eIF5A的siRNA阻遏了几乎全部的对干扰素应答产生的IL-8,以及对干扰素和TNF联合处理产生的大量IL-8。
图81:是HT-29细胞在用IFNγ处理8小时和24小时的蛋白质印迹。该印迹显示在HT-29细胞中,对干扰素γ的应答导致细胞凋亡因子eIF5A1的上调(处理8小时上调了4倍)。
图82:是免疫荧光下筛板细胞的表征。分离自一位83岁男性视神经头的筛板细胞(#506),在免疫荧光下进行表征。第一抗体是a)肌动蛋白;b)纤连蛋白;c)层粘连蛋白;和d)GFAP。所有图片均是放大400倍。
图83:筛板细胞系#506在用喜树碱和TNF-α处理后,应答性细胞凋亡的情况。在8孔培养板上,每孔接种40,000个筛板细胞系#506的细胞。三天以后,将汇合的LC细胞分别用10ng/ml的TNf-α、50μM的喜树碱、或10ng/ml TNf-α和50μM喜树碱的组合进行处理。在未处理的对照细胞中,加入等体积的DMSO,作为喜树碱的赋形剂对照。在处理48小时后,细胞用Hoescht33258进行染色,并在带有UV过滤器的荧光显微镜下观察。对染色较亮发生核凝聚和核断裂的细胞进行计数,上述细胞即为凋亡的细胞。
图84:在用喜树碱处理或用TNF-α和喜树碱联合处理的过程中,eIF5A的表达情况。在24孔培养板上,每孔接种40,000个筛板细胞系#506的细胞。三天以后,将LC细胞分别用50μM的喜树碱、或10ng/ml TNf-α和50μM喜树碱的组合进行处理,在1、4、8和24小时后,分别收集蛋白裂解液。在对照细胞中,加入等体积的DMSO,作为赋形剂对照,并在1和24小时后收集细胞裂解液。从每个样品中取5μg蛋白在SDS-PAGE凝胶上分离,将上述蛋白转移到PVDF膜上,用抗-eIF5A的抗体进行蛋白质印迹分析。用化学发光法检测结合抗体,并曝光于x-射线胶片。然后,将上述薄膜剥离,用作为内部加载对照的抗-β-肌动蛋白进行再次印迹分析。
图85:在用siRNAs转染后,筛板细胞系#506和#517表达eIF5A的情况。在24孔培养板上,每孔接种10,000个筛板细胞系#506和#517的细胞。三天以后,将LC细胞分别用GAPDH siRNA、eIF5AsiRNAs#1-4或对照siRNA#5进行转染。转染三天后,收集蛋白裂解液,并从每个样品中取5μg的蛋白在SDS-PAGE凝胶上分离,将上述蛋白转移到PVDF膜上,用抗-eIF5A的抗体进行蛋白质印迹分析。用化学发光法检测结合抗体,并曝光于x-射线胶片。然后,将上述薄膜剥离,用作为内部加载对照的抗-β-肌动蛋白进行再次印迹分析。
图86:用eIF5A siRNAs转染并用TNF-α和喜树碱处理的筛板细胞系#506的细胞凋亡情况。在8孔培养板上,每孔接种7500个筛板细胞系#506的细胞。三天以后,将LC细胞分别用GAPDH siRNA、eIF5AsiRNAs#1-4或对照siRNA#5进行转染。转染72小时后,用10ng/mlTNF-α和50μM喜树碱的组合处理转染细胞。24小时后,用Hoescht33258对细胞进行染色,并在带有UV过滤器的荧光显微镜下观察。对染色较亮发生核凝聚和核断裂的细胞进行计数,上述细胞即为凋亡的细胞。该图是4次独立试验的平均值。
图87:用eIF5A siRNAs#1转染并用TNF-α和喜树碱处理的筛板细胞系#517的细胞凋亡情况。在8孔培养板上,每孔接种7500个筛板细胞系#517的细胞。三天以后,将LC细胞分别用eIF5A siRNAs#1或对照siRNA#5进行转染。转染72小时后,用10ng/mlTNF-α和50μM喜树碱的组合处理转染细胞。24小时后,用Hoescht33258对细胞进行染色,并在带有UV过滤器的荧光显微镜下观察。对染色较亮发生核凝聚和核断裂的细胞进行计数,上述细胞即为凋亡的细胞。在该图中显示了2次独立试验的结果。
图88:用eIF5A siRNAs#1转染并用TNF-α和喜树碱处理的筛板细胞系#506细胞进行TUNEL标记的情况。在8孔培养板上,每孔接种7500个筛板细胞系#506的细胞。三天以后,将LC细胞分别用eIF5A siRNAs#1或对照siRNA#5进行转染。转染72小时后,用10ng/mlTNF-α和50μM喜树碱的组合处理转染细胞。24小时后,用Hoescht33258对细胞进行染色,并使用末端脱氧核苷酰转移酶介导的dUTP-洋地黄毒苷切口末端标记(TUNEL)方法对DNA断裂情况进行原位评估。图A是培养板在带有荧光素过滤器的荧光显微镜下观察的情况,显现出凋亡细胞断裂的DNA的TUNEL标记情况。图B是通过UV过滤器观察到的同一块板情况,显现出Hoescht染色的核的情况。该图是两次重复试验的结果。所有的图片均是放大400倍。
图89:描述设计抗eIF5A1的siRNA的方案。
发明详述
本发明分离了几种真核细胞起始因子5a(eIF-5A)的同种型,并记载在已出版的数据库中。人们认为这些同种型在功能上是冗余的。本发明人发现其中一种同种型在诱导细胞凋亡之前即刻上调,其被命名为细胞凋亡因子5A,或细胞凋亡特异性eIF-5A,或因子5A1、或eIF5A1。本发明的主题是细胞凋亡因子5A以及与eIF-5A的活化有关的DHS。
细胞凋亡因子5A很可能是一种合适的靶,可以用来干预细胞凋亡引发的疾病,这是因为该因子似乎在与细胞凋亡途径有关的下游效应物和转录因子的转录后调节水平上发挥着作用。具体而言,细胞凋亡因子5A似乎可选择性促进编码细胞凋亡下游效应物和转录因子的mRNA从核到胞质的转运,在胞质中它们随后即被翻译。是否启动细胞凋亡似乎是内部和外部促-和抗-细胞凋亡信号进行复杂的相互作用的结果。Lowe和Lin(2000)Carcinogenesis,21,485-495。通过其促进下游细胞凋亡效应物和转录因子翻译的能力,细胞凋亡因子5A似乎会打破这些信号之间的平衡,使之有利于细胞凋亡。
因此,本发明通过施用一种能够抑制或降低细胞凋亡因子5A或DHS表达的试剂,从而提供了一种抑制或减少细胞凋亡的方法。能够抑制或降低细胞凋亡因子5A或DHS表达的其中一种试剂就是反义寡核苷酸。
反义寡核苷酸在体外以及体内均能成功实现基因-特异性抑制。反义寡核苷酸是反义于(或互补于)特定DNA或RNA靶的人工合成的DNA短链(或是DNA类似物)。反义寡核苷酸与DNA或RNA靶相结合,在转录、翻译或剪接水平上中断表达,从而阻遏了由上述DNA或RNA编码的蛋白的表达。通过使用抗降解的修饰主链(Blake等,1985),例如用硫代磷酸酯键置换寡核苷酸中的磷酸二酯键,以阻止核酸酶的降解(Matzura和Eckstein,1968),反义寡核苷酸已经成功地应用于细胞培养物和动物疾病模型中(Hogrefe,1999)。
优选的,本发明的反义寡核苷酸所具有的核苷酸序列是编码细胞凋亡因子5A多肽或细胞凋亡特异性DHS多肽的一部分的序列。如下所述,发明人用编码部分细胞凋亡因子5A多肽的反义核苷酸对不同的细胞系进行了转染,并测定了进行凋亡的细胞的数量。与未用反义寡核苷酸转染的同类细胞相比,用反义寡核苷酸转染的细胞,降低了细胞凋亡的数量。图54-58显示出,与未用反义细胞凋亡因子5A的寡核苷酸转染的细胞相比,用反义细胞凋亡因子5A的寡核苷酸处理的细胞,降低了凋亡细胞的百分率。
本发明使用许多合适的编码细胞凋亡因子5A多肽或DHS多肽的核酸序列。例如,SEQ ID NOS:1、3、4、5、11、15、19、20和21(细胞凋亡因子5A的核酸序列),SEQ ID NOS:6和8(细胞凋亡特异性DHS的核酸序列),SEQ ID NOS:12和16(细胞凋亡因子5A的序列),和SEQ ID NO:7(细胞凋亡特异性DHS多肽的序列),或上述序列的部分序列,均能提供合适的寡核苷酸序列。其它优选的细胞凋亡因子5A的序列包括SEQ ID NO:*6、*7和*8。另外的反义核苷酸包括与上述列举的序列基本上相同的序列(如具有90%的同一性),或者在高度严格条件下与上述列举的序列杂交的序列。此外,还可以用已知的序列作为探针根据本领域已知的方法找到其它的合适的序列。
本发明的反义寡核苷酸可以是单链的,双链的,DNA,RNA或是一种杂合体。可以用本领域已知的方法对寡核苷酸进行修饰,以提高其稳定性,提高其对核酸酶降解的抗性等等。本领域已知的上述修饰包括,但不限于,寡核苷酸主链的修饰,糖部分的修饰,或碱基的修饰。在这些修饰中,还包含各种DNA-RNA的杂合体或通常被称作“带空位的”寡核苷酸的构建体。
本发明还提供了其它能够抑制或减少细胞凋亡因子5A或DHS表达的试剂。其中一种就是siRNAs。小分子抑制性RNAs(siRNA)是反义寡核苷酸的一种行之有效的替代物,因为只要较低的浓度就能取得相当于或高于反义寡核苷酸的抑制水平(Thompson,2002)。人们已经在不同的生物如植物、线虫、和果蝇中,使用长的双链RNAs来沉默特定基因的表达。一种属于RNase-III家族称作Dicer的酶将这些长的双链RNAs加工成具有21-23个核苷酸的小的干扰RNAs,然后它们掺入到RNA-诱导的沉默复合体(RISC)中。siRNA的解旋活化了RISC,允许单链siRNA通过碱基配对将复合体引导到内源性mRNA。RISC对内源性mRNA的识别导致mRNA裂解,并随后使其不能用于翻译。将长的双链RNA导入哺乳动物细胞,会使哺乳动物细胞产生很强烈的抗病毒反应,但是使用siRNA则不会产生上述反应。(Elbashir等,2001)。SiRNA已经广泛应用于细胞培养物中,一般能够将特定基因的表达量降低90%或更多。
使用siRNA抑制基因表达,在动物疾病模型中也已经普及。最近的研究表明抗荧光素酶的siRNA能够阻遏共转染质粒在出生后小鼠的各种器官中对荧光素酶的表达,其中共转染使用的是流体注射输送技术(Lewis等,2002)。将一种抗Fas(TNF家族的一个受体)的siRNA流体注射到小鼠的尾部血管,其能够转染超过80%的肝细胞,并在最后一次注射后大约10天,可以将肝脏表达Fas的量降低90%(Song等,2003)。Fas的siRNA还能够帮助小鼠预防肝脏纤维化和急性重型肝炎。使用直接针对TNFα的siRNA也能够抑制由致死剂量脂多糖引起的小鼠脓毒症的发展(Sorensen等,2003)。SiRNA在抑制体内特定基因表达方面,有望成为一种非常有效的药物,这是因为它们在细胞培养物和体内具有持久的效果,在体内具有转染细胞的能力,而且它们在血清中具有抗降解能力(Bertrand等,2002)。
本发明人用细胞凋亡因子5A的siRNA转染了细胞,研究了其对细胞凋亡因子5A表达的影响。图64显示用细胞凋亡因子5asiRNA转染的细胞,产生细胞凋亡因子5a蛋白的量降低。图64-67显示用细胞凋亡因子5AsiRNAs转染的细胞,在经过喜树碱和TNF-α处理后,其细胞凋亡的百分率小于未被细胞凋亡因子5A siRNAs转染的细胞。
优选的siRNAs包括具有SEQ ID NO:*1、*2、*3、*4和*5的那些。其它的siRNA还包括与上述列举的序列基本上相同的序列(如具有90%的同源性),或与上述列举的序列在高度严格条件下杂交的序列。
很多重大的人类疾病都是由细胞凋亡控制中的异常而引起的。这些异常可导致细胞(如癌细胞)数量的病理性增加或细胞损失(如变性疾病)。作为非限制性的实例,本发明的方法和组合物能够用于预防或治疗下列与细胞凋亡有关的疾病和病症:神经疾病/神经变性疾病(如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏舞蹈病、肌萎缩性侧索硬化(Lou Gehrig氏病)、自身免疫病(如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化)、杜兴氏肌性营养不良(DMD)、运动神经元病、局部缺血、心脏缺血、慢性心力衰竭、中风、婴儿脊肌萎缩、心脏骤停、肾衰竭、过敏性皮炎、脓毒症和脓毒性休克、AIDS、肝炎、青光眼、糖尿病(1型和2型)、哮喘、色素性视网膜炎、骨质疏松症、异种移植排斥、和烧伤。
其中一种由于细胞凋亡调控异常引起的疾病是青光眼。细胞凋亡是导致青光眼患者失明的一个决定性因素,青光眼是一组眼部状况的总称,其起因于视神经损伤,导致进展性失明。已经表明细胞凋亡是造成视神经损伤的一个直接因素。
青光眼研究领域的早期工作表明,IOP的提高对筛板(一种带孔的胶原结缔组织)水平上的轴突转运造成了干扰,随后造成了视网膜神经节细胞的死亡。Quigley和Anderson(1976)Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.,15,606-16;Minckler,Bunt,和Klock,(1978)Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.,13,771-83;Quigley等,(1980)Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.,19,505-17。对青光眼动物模型和死后人组织的研究表明青光眼视网膜神经节细胞的死亡是由细胞凋亡造成的。Garcia-Valenzuela等,(1995)Exp.Eye.Res.,61,33-44;Quigley等,(1995)Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.,36,774-786;Monard,(1998)HaefligerIO,FlammerJ(eds)Nitric Oxide and Endo thelin in thePathogenesis of Glaucoma,New York,NY,Lippincott-Raven,213-220。IOP升高使轴突转运中断,造成营养因子的缺失,从而导致视网膜神经节细胞死亡。Quigley,(1995)Aust NZ J Ophthalmol,23(2),85-91。在患有青光眼的眼中发现视神经头星形细胞产生了更多的具有神经毒性的一些物质。例如,在患有青光眼的眼的视神经头中已经发现产生了更多的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)(Yan等,(2000)Arch.Ophthalmol.,118,666-673),和氧化氮合酶(Neufeld等,(1997)Arch.Ophthalmol.,115,497-503),该酶能够产生氧化氮。此外,在大鼠遗传性视网膜疾病模型中观察到,活化的视网膜胶质细胞使得可诱导形式的氧化氮合酶(iNOS)和TNF-α的表达增加。Cotinet等,(1997)Glia,20,59-69;de Kozak等,(1997)Ocul.Immunol.Inflamm.,5,85-94;Goureau等,(1999)J.Neurochem.,72,2506-2515。在青光眼视神经头中,氧化氮的过量是与视网膜神经节细胞的轴突变性相联系的。Arthur和Neufeld,(1999)Surv Ophthalmol,43)(Suppl 1),S129-S135。最后,已经表明,视网膜胶质细胞在应答模拟缺血或流体静力压升高时导致的TNf-α产量的增加诱导了共培养视网膜神经节细胞的凋亡。Tezel和Wax,(2000)J.Neurosci.,20(23),8693-8700。
使视网膜神经节细胞避免因细胞凋亡而引起的变性,该技术还处于研究之中,这可以作为一种新的治疗青光眼失明的方法。为了使视网膜神经节细胞避免细胞凋亡性死亡,人们已经使用了几组反义寡核苷酸来靶向细胞凋亡进程中的关键性蛋白。反义寡核苷酸是反义于(或互补于)特定DNA或RNA靶的人工合成的DNA短链(或是DNA类似物)。反义寡核苷酸与DNA或RNA靶相结合,在转录、翻译或剪接水平上中断表达,从而阻遏了由上述DNA或RNA编码的蛋白的表达。将反义寡核苷酸作为治疗药物使用时,所遇到的一个难题就是寡核苷酸在血液和细胞中会被核酸酶快速降解。该问题可以通过使用抗降解的修饰主链来加以解决(Blake等,(1985)Biochemistry,24,6139-6145),如用硫代磷酸酯键置换寡核苷酸中的磷酸二酯键,以阻止核酸酶的降解。Matzura和Eckstein,(1968)Eur.J.Biochem.,3,448-452。
在动物眼疾病模型中,已经成功使用了反义寡核苷酸。在暂时性全面视网膜缺血模型中,发现在缺血过程中,天冬氨酸特异性半胱氨酸酶2的表达升高,该酶主要存在于视网膜的内核层和神经节细胞层。通过视网膜电流图可以检测到,用反义寡核苷酸抑制天冬氨酸特异性半胱氨酸酶,可以在组织病理和功能上取得显著的改善。Singh等,(2001)J.Neurochem.,77(2),446-75。另外的研究表明,在视神经的横切面上,视神经节细胞上调了促细胞凋亡蛋白Bax的水平,并经历着细胞凋亡。将Bax反义寡核苷酸重复注射到大鼠颞上部视网膜,发现能够抑制局部Bax的表达,并在与视神经交互作用后,提高了视网膜神经节细胞的存活数量。Isenmann等,(1999)Cell DeathDiffer.,6(7),673-82。
将寡核苷酸包裹在脂质体中,然后通过融合用失活日本血凝病毒(HYJ;仙台病毒)的包膜包被(HYJ脂质体),这样可以将反义寡核苷酸送递到视网膜神经节细胞。将包裹在HVJ脂质体内FITC-标记的反义寡核苷酸注射到鼠的玻璃体内,发现在神经节细胞层有44%的细胞发射出高强度的荧光,能够持续3天的时间,之后荧光随裸露的FITC-标记的反义寡核苷酸在一天后消失。Hangai等,(1998)ArchOphthalmol,116(7),976。
本发明预防或调节细胞凋亡的方法涉及调节眼部细胞的细胞凋亡,例如但不限于,星形细胞、视网膜神经节细胞、视网膜胶质细胞、和筛板细胞。青光眼中视网膜神经节细胞的死亡是由细胞凋亡引起的。因此,本发明通过提供一种抑制视网膜神经节细胞凋亡的方法,或通过预防视网膜神经节细胞由于凋亡而引起的变性,从而提供了一种新的用于预防因青光眼而导致的失明的治疗方法。
本发明提供了一种通过抑制细胞凋亡-特异性eIF5A1的表达,预防患有青光眼的眼中视网膜神经节细胞死亡的方法。抑制细胞凋亡-特异性eIF5A1的表达能够减少细胞凋亡。细胞凋亡-特异性eIF5A1在整个细胞凋亡过程中似乎是一个非常重要的基因。因此,控制视神经头细胞的凋亡就意味着需要阻遏细胞凋亡-特异性eIF5A1的表达,这也为治疗青光眼提供了一种途径。
抑制细胞凋亡-特异性eIF5A1的表达,可以通过向眼部细胞,例如但不限于,筛板细胞、星形细胞、视网膜神经节细胞或视网膜胶质细胞,施用靶向人细胞凋亡-特异性eIF5A1的反义寡核苷酸或siRNA。反义寡核苷酸如上所定义,即具有编码至少部分细胞凋亡-特异性eIF5A1多肽的核苷酸序列。靶向人细胞凋亡-特异性eIf5A1的反义寡核苷酸具有编码至少部分人细胞凋亡-特异性eIF5A1多肽的核苷酸序列。优选的反义寡核苷酸包含SEQ ID NO:26或27,或是在高度严格条件下,与SEQ ID NO:26或27的互补序列杂交的寡核苷酸。
在本发明的另外一个实施方式中,提供了一种在筛板细胞、星形细胞、视网膜神经节细胞或视网膜胶质细胞中,抑制细胞凋亡-特异性eIf5A1表达的方法。将靶向人细胞凋亡-特异性eIf5A1的反义寡核苷酸,例如但不限于SEQ ID NO:26和27,施用到筛板细胞、星形细胞、视网膜神经节细胞和视网膜胶质细胞。上述细胞可以是人的细胞。
除了在细胞凋亡中发挥作用外,eIF5A还在免疫应答中发挥着作用。本发明人发现在缺血的心脏组织中,细胞凋亡因子5A的水平与两种细胞因子(白介素1-β,即“IL-1β”,和白介素18,即“IL-18”)水平的升高相关,这进一步证明细胞凋亡因子5A与细胞死亡相关,这是因为在缺血的心脏组织中存在该因子。此外,在未缺血的心脏组织中,则观察不到细胞凋亡因子5A与白介素的相关性。参见图50A-F和51。使用PCR检测方法,检测了细胞凋亡因子5A、增殖性eIF5a(即eIf-5A2,是另外一个已知的同种型,在一些图中用eIf5b表示)、IL-1β和IL-18在不同的缺血心脏组织(来自接受了冠状动脉旁路移植物和瓣膜(二尖瓣膜和心房瓣膜)置换手术的患者)中的水平,并进行了比较。
细胞凋亡eIF-5a与上述有效的白介素的相关性进一步提示,在缺血组织中,炎性反应和细胞凋亡途径可能是通过调控细胞凋亡因子5A的水平来加以调控。细胞凋亡因子5A与免疫应答相关的进一步证据是,人外周血单核细胞(PBMCs)在正常情况下表达eIF5A的量很低,但在用T-淋巴细胞-特异性刺激物刺激的情况下,表达eIF5A的量则显著升高(Bevec等,1994)。这提示细胞凋亡因子5A在T-细胞增殖和/或活化中发挥着作用。因为活化的T细胞能够产生多种细胞因子,因此有可能在细胞因子mRNAs进行核质穿梭时需要细胞凋亡因子5A。
另外一个研究着眼于eIF-5A mRNA和细胞表面标记在人外周血单核细胞(PBMCs)和用不同的成熟刺激试剂处理过的血细胞系中的表达(Bevec等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:10829-10833,(1994))。在PBMCs中,大多数能够诱导T-细胞活化的刺激物都能够诱导eIF-5AmRNA的表达(Bevec等,1994)。还发现在HIV-1患者中,PBMC表达eIF-5AmRNA的水平比健康供体要高。此项研究的研究者认为上述结果表明,eIF-5AmRNA之所以被诱导,目的是为了使之促进重要mRNAs的核质穿梭,这对于T-细胞的活化和HIV-1的复制均是必需的(Bevec等,1994)。eIF5A曾经被描述为是一种HIV Rev蛋白的细胞结合因子,并对于HIV复制来说是必需的(Ruhl等,1993)。
本发明人使用了一个已知在应答某种特定刺激物时能够产生预期细胞因子的细胞系,在体外研究了eIF5A1在促进细胞因子mRNAs进行核质穿梭,从而促进细胞因子翻译方面的能力。近期的一些研究发现,人肝脏细胞系能够通过诱导产生其它的细胞因子而对细胞因子刺激作出应答。HepG2是一个充分表征的人肝细胞癌细胞系,其对细胞因子非常敏感。在应答IL-1β时,HepG2细胞很快以剂量依赖性方式产生了TNF-αmRNA和蛋白(Frede等,1996;Rowell等,1997;Wordemann等,1998)。因此本发明使用HepG2细胞作为研究TNF-α调控过程的模型系统。本发明人已经表明,用靶向细胞凋亡因子5A的反义寡核苷酸转染HepG2细胞,由于抑制了eIF5A1在HepG2细胞中的表达,使细胞产生TNF-α的量降低。
因此在本发明的一个实施方式中,提供了一种降低细胞中细胞因子水平的方法。该方法涉及给细胞施用一种能够降低细胞凋亡因子5A1表达水平的试剂。降低细胞凋亡因子5A1的表达导致上述细胞因子表达的下降,从而减少细胞产生上述细胞因子的量。上述细胞因子优选是促炎细胞因子,包括但不限于,IL-1、TL-18、IL-6和TNF-α。
能够降低细胞凋亡因子5A表达的试剂可以是其序列互补于细胞凋亡因子5A的反义核苷酸。优选的反义核苷酸序列选自SEQ ID NO:*6、*7和*8,或者是在高度严格条件下与上述序列杂交的反义核苷酸序列。
试剂还包含其序列互补于细胞凋亡因子5A的siRNA序列。优选的siRNA的序列选自SEQ ID NO:*1、*2、*3、*4和*5,或者是在高度严格条件下与上述序列杂交的序列。图65-67表明用细胞凋亡因子5AsiRNAs转染的细胞,在经过喜树碱和TNF-α处理后,细胞凋亡的百分率低于未转染的细胞。试剂还包含反义DHS核苷酸。
本发明还提供了具有下列序列的多核苷酸,序列选自SEQ ID NO:*6、*7和*8,或者是在高度严格条件下与上述序列杂交的反义核苷酸。
本发明还提供了具有下列序列的siRNA,序列选自SEQ ID NO:*1、*2、*3、*4和*5,或者是在高度严格条件下与上述序列杂交的siRNA序列。
本发明还提供了一种降低p53表达水平的方法。该方法涉及施用一种能够降低细胞凋亡因子5A表达的试剂,如上面所述的反义寡核苷酸或siRNAs。通过降低细胞凋亡因子5A1的表达,从而降低p53的表达的结果显示在图52和实施例11中。
本发明还提供了一种提高Bcl-2表达水平的方法。该方法涉及施用一种能够降低细胞凋亡因子5A表达的试剂。优选的试剂包括上面所述的反义寡核苷酸和siRNAs。通过降低细胞凋亡因子5A1的表达,从而提高Bcl-2的表达的结果显示在图63和实施例13中。图63显示用细胞凋亡因子5a siRNA转染的细胞,所产生的细胞凋亡因子5A1蛋白的量低于未转染的细胞,但产生了更多的Bcl-2蛋白。这表明细胞凋亡因子5A1表达水平的降低与Bcl-2表达水平的升高是相关的。
本发明还提供了一种降低有需要的患者体内TNF-α水平的方法,该方法包含给所述患者施用上面所述的反义多核苷酸或siRNAs。正如图69和实施例14所阐述的,用本发明因子5A反义寡核苷酸转染的细胞,在经过IL-1诱导后,所产生的TNF-α的量低于未用上述反义寡核苷酸转染的细胞。
本发明提供了一种降低人上皮细胞TNF-α水平的方法。正如图74A和B以及图75和实施例15所描述的,降低或抑制eIF5A1的表达,尽管不是完全抑制,但确实降低了人上皮细胞系中TNF-α的产生。使用了抗eIF5A1的siRNAs来抑制eIF5A1的表达。抑制eIF5A1的表达不仅降低或抑制了TNF-α的产生,还使细胞避免了细胞因子诱导的细胞凋亡。通过降低eIF5A1的表达,来减少TNF-α的产生。该双重效果从而提供了一种治疗患有炎性肠病,如克罗恩病和溃疡性结肠炎的患者的方法,其中上述疾病的发生与由TNF-α引起的炎性增加有关。
因此,本发明提供了一种治疗以IL-1、TNF-α、IL-6或IL-18水平的增加为特征的病理状况的方法,该方法包含给患有上述病理状况的哺乳动物施用一种能够降低细胞凋亡因子5A表达的试剂。
已知的以IL-1、TNF-α、IL-6或IL-18水平的增加为特征的病理状况包括,但不限于,类风湿性关节炎和骨关节炎、哮喘、过敏、动脉炎、克罗恩病、炎性肠病(ibd)、溃疡性结肠炎、冠心病、囊性纤维化、糖尿病、狼疮、多发性硬化、格雷夫斯病、牙周炎、青光眼和视网膜黄斑变性、包括圆锥形角膜在内的眼表疾病、器官缺血性心脏病、肾病、再灌注损伤、脓毒症、多发性骨髓瘤、器官移植排斥反应、牛皮癣和湿疹。
最近的研究表明eIF-5A在细胞分化和活化过程中也起着重要作用。当诱导未成熟树突细胞进行分化和成熟时,在eIF-5A mRNA水平诱导的同时,CD83蛋白的表达也升高(Kruse等,J.Exp.Med.,191(9):1581-1589(2000))。树突细胞是抗原呈递细胞,它使辅助T细胞和杀伤T细胞敏化,进而诱导由T细胞介导的免疫反应(Steinman,1991)。未成熟树突细胞缺乏刺激T细胞的能力,因此需要合适的刺激物(即炎性细胞因子和/或微生物产物)使之成熟,成为能够活化T细胞的成熟细胞。CD83在成熟树突细胞上合成和表面表达,与敏化辅助T细胞和杀伤T细胞以及诱导由T细胞介导的免疫反应有着重大的关联。当未成熟树突细胞用抑制8-羟-2,7,10-三氨基癸酸合成(hypusination)的抑制剂(GC7),由此也是eIF-5A活化抑制剂,进行预处理时,CD83在细胞的表面表达受到了抑制(Kruse等,2002)。该项研究的研究者认为上述结果表明,eIF-5A对于CD83mRNA的核质转运来说是必需,阻遏8-羟-2,7,10-三氨基癸酸合成(hypusination),进而阻遏了eIF-5A,由此进一步阻遏了CD83的表达和树突细胞的成熟(Kruse等,2000)。
在Bevec等,1994和Kruse等,2000的研究中,虽然也涉及了eIF5A在免疫系统中的作用,但上述研究者没有详细说明、也没有鉴定出他们所研究的是何种eIF5A同种型,当然也没有给出合理的解释。正如上面所提到的,已知人具有两种eIF5A同种型,即eIF5A1(细胞凋亡因子5A1)和eIF5A2,它们由不同的染色体编码。在本发明之前,人们一直认为上述两种同种型在功能上是冗余的。Bevec等在检测刺激后的PBMCs细胞中的eIF5A mRNA时,所使用的寡核苷酸与人eIF5A1具有100%同源性,此项研究早于对eIF5A2的克隆。类似的,Kruse等利用反转录聚合酶链式反应检测树突细胞成熟过程中的eIF5A时,所使用的引物同样与人eIF5A具有100%同源性。
本发明涉及通过调控eIF-5A1的表达来调控树突细胞成熟和PBMC活化的速度,进而调控由T细胞介导的免疫反应的速度。本发明人使用U-937细胞系,研究了eIF-5A1在单核细胞分化为贴壁巨噬细胞过程中所起的作用,其中已知U-937能够表达eIF-5AmRNA(Bevec等,1994)。U-937是人的单核细胞系,能够悬浮培养,并在用PMA刺激时,开始贴壁并分化为巨噬细胞。当通过更换培养基去除PMA时,上述细胞开始变得静止,然后又开始能够产生细胞因子(Barrios-Rodiles等,J.Immunol.163:963-969(1999))。在应答脂多糖(LPS),在多种细菌的外膜上发现存在一种因子,已知该因子能够诱导全面的炎性应答,巨噬细胞能够产生TNF-α和IL-1β(Barrios-Rodiles等,1999)。参见图78所示的干细胞分化和所产生的细胞因子的图表。U-937细胞在LPS刺激后,也产生IL-6和IL-10(Izeboud等,J.Receptor&Signal Transduction Research,19(1-4):191-202,(1999))。
使用U-937细胞时,显示eIF-5A1在单核细胞分化和TNF-α分泌过程中上调。参见图77。因而,本发明的一个方面提供了一种抑制或延迟巨噬细胞成熟,进而抑制或减少细胞因子产生的方法。该方法涉及提供一种能够减少DHS或eIF-5A1表达的试剂。通过减少或消除DHS的表达,能够减少或消除eIF-5A1的活化。因为eIF-5A1在单核细胞分化和TNF-α分泌过程中表达上调,因此认为eIF-5A1对于上述过程的发生来说是必需的。因此,通过减少或消除eIF-5A1的活化或通过直接减少或消除eIF-5A1的表达,能够减少或消除单核细胞的分化和TNF-α的分泌。可以使用任一能够减少DHS或eIF-5A1表达的试剂,包括但不限于,上面所述的反义寡核苷酸或siRNA。
这里所使用的术语“序列基本相同”或“基本同源”是指与另外一个序列具有基本相同的结构或在功能上相同的序列。在序列基本相同或基本同源的序列之间,所存在的结构或功能上的差异应当是极其微小的(deminimus),也就是说,上述差异不会影响序列行使本申请所述的功能。例如,由在不同物种之间使用不同的密码子而导致的遗传性变化引起的差异。两个或多个不同序列之间如果存在大量的序列重叠或相似性,或不同的序列如果表现出相似的物理特性,则即使序列长度或结构不同,也均被认为具有极其微小的结构差异。上述物理特性包括,例如,在规定条件下杂交的能力,或蛋白的免疫交叉反应性、相似的酶活性等。技术人员可利用本领域已知的方法很容易地测定上述各种特性。
此外,如果两个核苷酸序列之间具有至少大约70%或更高、更优选80%或更高、更加优选约90%或更高、最优选约95%或更高的序列相似性,则认为上述两个核苷酸序列是“基本互补”。两个氨基酸序列,如果在其多肽活性部位或功能相关部分具有至少50%、优选至少70%、更优选至少80%、更加优选至少90%、最优选至少95%的相似性,则认为上述两个氨基酸序列是基本同源的。
为了测定两个序列的同一性百分比,将序列进行最佳化比较的比对(如,在第一和第二氨基酸或核酸序列中,向其中一个或两个引入空位进行最佳化比对,并且为了进行比较,可忽略非同源性序列)。在一个优选的实施方式中,为了比较,将参比序列的至少30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%或更长部分进行了比对。并比较了相应氨基酸位点、核苷酸位点的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列的其中一个位点与第二序列的与之相应的位点具有相同的氨基酸残基或核苷酸时,则认为上述分子在该位点是相同的(在此所使用的氨基酸或核酸的“同一性”等同于氨基酸或核酸的“同源性”)。两个序列之间的同一性百分比是序列共有相同位置数的函数,考虑到空位数量和每一空位的长度,在对两个序列进行最佳化比对时,需要考虑上述两种情况。
在两个序列之间进行序列比较和同一性及相似性百分比测定可使用数学算法来完成(Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1998;Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,AcademicPress,New York,1993;Computer Analysis of Sequence Data,Part 1,Griffin,A.M.,和Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,NewJersey,1994;Seqeence Analysis in Molecular Biology,vonHeinje,G.,Academic Press,1987;和Sequence Analysis Primer,Gribskov M.和Devereux,J.,eds.,M Stockton Press,New York,1991)。
本发明的核酸序列和蛋白序列可进一步用作“查询序列”,在序列数据库中进行检索,从而鉴定其它家族成员或相关序列。这种检索可使用Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)进行。BLAST核苷酸检索可使用NBLAST程序进行。BLAST蛋白检索可使用XBLAST程序进行,从而获得与本发明蛋白同源的氨基酸序列。对于为了比较而获得带有空位的比对,可按照Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402中所描述的,使用有空位的BLAST。当使用BALST和有空位的BALST程序时,可使用各自程序(如XBLAST和NBLAST)的缺省参数,
在此所使用的术语,核酸“功能性衍生物”是指基因或核苷酸序列的同源物或类似物。功能性衍生物应当保留至少部分给定基因的功能,以保证其能够用于本发明目的。这里所述细胞凋亡因子5A多肽的“功能性衍生物”是指保留至少部分细胞凋亡因子5A活性,或能够与细胞凋亡因子5A的特异性抗体发生免疫交叉反应的细胞凋亡因子5A的片段、变体、类似物或化学衍生物。细胞凋亡因子5A多肽的片段是指分子的任何亚型。
功能性变体还包含不会造成功能改变或仅造成无关紧要改变的相似氨基酸的取代。对于功能而言较为重要的氨基酸可以通过本领域已知的方法鉴定,如定点诱变或丙氨酸-扫描诱变(Cunningham等(1989)Science 244:1081-1085)。后一个过程是在分子的每个残基上引入单丙氨酸突变。然后测试所得突变分子的生物活性,如激酶活性,或分析其体外增殖活性。对于结合配体/底物结合较为重要的位点还可以通过结构分析,如结晶、核磁共振或光亲和标记来测定(Smith等(1992)J.Mol.Biol.,224;899-904;de Vos等(1992)Science255:306-312)。
“变体”表示与完整的基因或它的片段基本上相似的分子,如具有一个或多个取代的核苷酸的核苷酸取代变体,不过,它保留了与特定基因杂交或编码能与天然DNA杂交的mRNA转录物的能力。“同源物”表示来自不同的动物属或种的片段或变体序列。“类似物”表示基本上类似于或相对整个分子或它的变体或片段起作用的非天然分子。
变体肽包括天然存在的变体,以及通过本领域众所周知的方法生产的变体。所述变体可以利用分子技术和本文所披露的序列信息方便地鉴定/制备。另外,可以根据与本发明的eIF-5A或DHS蛋白的序列和/或结构同源性,方便地从其他蛋白中区分所述变体。所存在的同源性/同一性程度主要取决于该蛋白是功能性变体或是非功能性变体,存在于共生同源物家族中的趋异量,以及直向同源物之间的进化距离。
本发明的eIF-5A或DHS蛋白的非天然存在的变体,可以利用重组技术方便地制备。所述变体包括,但不局限于所述蛋白的氨基酸序列上的缺失,添加和取代。例如,一种类型的取代是保守性氨基酸取代。所述取代是通过具有类似特征的另一种氨基酸取代蛋白上的特定氨基酸。通常被认为是保守性取代的是脂族氨基酸Ala,Val,Leu和Ile之间的彼此取代;羟基残基Ser和Thr的相互交换;酸性残基Asp和Glu的交换;酰胺残基Asn和Gln之间的取代;碱性残基Lys和Arg之间的交换;以及芳族残基Phe和Tyr之间的取代。有关哪一种氨基酸改变可能在表型上是沉默的指导,披露于以下文献中:Bowie等,Science 247:1306-1310(1990)。
本文所使用的术语“杂交”通常被用于表示在适当严格条件下的核酸杂交,这种条件是本领域技术人员根据探针序列和靶序列的性质很容易得出的。杂交和洗涤条件为本领域技术人员所熟知,并且条件的调整取决于需要的严格性,可以通过改变温育时间,温度,和/或溶液的离子强度方便地实现。例如,参见Sambrook,J.等,MolecularCloning:A Laboratory Manual,2ndedition,ColdSpring HarbourPress,Cold Spring Harbor,New York,1989。
条件的选择是通过被杂交的序列的长度,特别是探针序列的长度,核酸的相对G-C含量以及允许的错配量决定的。当需要在具有较低程度的互补性的两条链之间具有部分杂交时,低严格性条件是优选的。当需要完美的或接近完美的互补性时,高严格性条件是优选的。对典型的高严格性条件来说,所述杂交溶液含有6×S.S.C.,0.01MEDTA,1×Denhardt′s溶液和0.5%SDS。对于克隆DNA的片段来说,杂交大约在68℃下进行大约3-4小时,而对于总的真核DNA来说,杂交进行大约12-16小时。对于较低严格性来说,将杂交温度降低到低于双链体的解链温度(Tm)大约42℃。已知Tm是G-C含量和双链体长度以及溶液的离子强度的函数。
在本文中,短语“与相应部分杂交的”DNA或RNA分子表示杂交的分子,例如,寡核苷酸,多核苷酸或任何分子序列(有义或反义方向)能够识别另一个核酸分子上的具有大致相同的大小并且具有能够在合适条件下实现杂交的与其足够的序列相似性的序列,并且与其杂交。例如,长度为100个核苷酸的有义分子能够识别核苷酸序列的大约100个核苷酸的部分,并且与其杂交,只要在两个序列之间存在大约70%或更高的序列相似性就行。应当理解的是,“相应部分”的大小,允许在杂交中存在某些错配,因此,“相应部分”可能小于或大于与它杂交的分子,例如,大或者小20-30%,优选大或小不超过大约12-15%。
另外,多肽的功能性变体,还可以包括类似氨基酸的取代,它不会导致功能上的改变或导致不明显的改变。对功能重要的氨基酸可以通过本领域所公知的方法鉴定,如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham等,Science 244:1081-1085(1989))。后一种方法在分子的每一个残基上引入一个丙氨酸突变。然后检测所得到的突变分子的生物学活性或用于分析。
例如,细胞凋亡特异性因子5A的类似物表示基本上类似于完整蛋白或它的片段的非天然存在的蛋白或肽模拟物。细胞凋亡特异性因子5A的化学衍生物,包括正常情况下不是所述肽或肽片段的一部分的其他化学部分。可以通过让所述肽的靶定的氨基酸残基与有机衍生化试剂起反应,将修饰导入肽或它的片段,所述有机衍生化试剂能够与选定的侧链或末端残基起反应。
应当理解的是,当本发明的核酸和多肽用于动物的预防或治疗目的时,应当以还包括可以药用的载体的组合物形式施用。例如,合适的可以药用的载体包括下列成分中一种或多种:水,盐水,磷酸缓冲的盐溶液,葡萄糖,甘油和乙醇等,以及它们的组合。可以药用的载体还可以包括微量的辅助物质,如湿润剂或乳化剂,防腐剂或缓冲物,它们能增加所述结合蛋白的保质期或效果。正如本领域所熟知的,可以配制注射的组合物,以便在给动物施用之后提供所述活性成分的快速,持续或延迟的释放。
本发明的组合物可以是多种形式的。其中包括,例如,固体,半固体和液体剂型,如片剂,药丸,粉末,液体溶液,分散液或悬浮液,脂质体,栓剂,可注射的和可输液的溶液。优选的剂型取决于预期的施用方式和治疗用途。
所述组合物能够以药物学领域所熟知的方式制备。在制备所述组合物时,所述活性成分通常与载体混合,或用载体稀释,和/或包在载体内,例如,所述载体可以是胶囊,药袋,纸或其他溶剂形式的。在所述载体被用作稀释剂时,它可以是固体,半固体,或液体材料,它起着活性成分的媒介物,赋形剂或介质的作用。因此,所述组合物可以是片剂,锭剂,药袋,扁胶囊,酏剂,悬浮液,气溶胶(固体或存在于液体介质中),例如,含有重量百分比为多达10%的活性化合物的软膏,软的和硬的明胶胶囊,栓剂,注射液,悬浮液,无菌包装的粉末以及外用膏贴。
现在已经对本发明进行了总体上的说明,通过参考以下实施例可以更好地理解本发明,这些实施例是以说明形式提供的。提供这些实施例是为了帮助理解本发明,而不是要,并且不应当被理解成以任何方式限定本发明的范围。这些实施例不包括对常规方法的详细说明。这些方法为本领域普通技术人员所熟知,并且披露于多种文献中。常规方法,如用于构建载体和质粒的方法,将编码多肽的核酸插入所述载体和质粒的方法,将质粒导入宿主细胞的方法,以及表达和测定基因和基因产物的方法的详细说明,可以从多种文献中获得,包括Sambrook,J.等,(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2 ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press。本文中所提到的所有文献都以它们的整体形式收作本文参考。
实施例
实施例1
利用DNA分梯技术观察大鼠黄体的细胞凋亡
利用DNA分梯技术检测细胞凋亡的程度。使用QIAamp DNA血液试剂盒(Qiagen),按照制造商的说明,从分散的黄体细胞或从离体的黄体组织中分离基因组DNA。对于黄体组织来说,首先切除黄体组织,之后用PGF-2α进行处理,诱导细胞凋亡,然后取诱导细胞凋亡后1小时和24小时的样品提取基因组DNA。将500ng的DNA与0.2μCi[α-32P]dCTP、1mM Tris、0.5mM EDTA、3单位的Klenow酶和0.2pM的dATP、dGTP、dTTP在室温下温育30分钟,从而对分离的DNA进行末端标记。按照Sambrook等所述,将样品通过1ml Sepadex G-50柱,去除未掺入的核苷酸。然后利用Tris-醋酸盐-EDTA(1.8%)凝胶电泳分离样品。将凝胶在室温下真空干燥30分钟,然后在-80℃下曝光24小时,得到X-射线胶片。
在其中一个试验中,超数排卵大鼠黄体中细胞凋亡的程度是在注射PGF-2α后0、1、24小时检测的。在0小时的对照组中,切除没有注射PGF-2α的卵巢。在PGF-2α处理前切除的对照黄体组织中,反映细胞凋亡相关核酸酶活性的低分子量DNA片段梯度不是很明显,但在诱导细胞凋亡后的1小时内就可以辨认出来,并在诱导细胞凋亡24小时后更显著,上述结果显示在图16中。在该图中,上图是用大鼠黄体细胞凋亡特异性DHS cDNA的32P-dCTP标记的3’-非翻译区为探针,进行的RNA印迹放射自显影图片。下面的图是总RNA的溴化乙锭染色的凝胶。每个泳道含有10μg RNA。数据表明在血清剥夺后,eIF-5A转录水平出现了下调。
在另外一个试验中,用盐水代替PGF-2α处理相应的对照组动物。用盐水或PGF-2α处理15分钟后,切除动物的黄体。在切除动物组织3和6小时后,从黄体中分离基因组DNA。在PGF-2α处理的动物中,切除组织在6小时后,可以很明显地观察到DNA分梯以及基因组DNA末端标记的增加,但在3小时后,则观察不到上述结果。参见图17。在用PGF-2α处理后15分钟切除,并体外保存在EBSS(Gibco)中6小时的黄体,同样也观察到明显的反映细胞凋亡的DNA分梯。另外从基因组DNA更密集的末端标记也可以看出细胞凋亡相关性核酸酶活性的水平。
在另外一个试验中,皮下注射500μg PGF-2α诱导超数排卵。用相等体积的盐水溶液处理对照组大鼠。15-30分钟后,切除卵巢,并用胶原酶使之破碎。将用PGF-2α处理过的大鼠分散细胞在10mm谷氨酰胺+10mm亚精胺中温育1小时,之后在没有亚精胺的10mm谷氨酰胺中继续温育5小时(第2泳道),或者在10mm谷氨酰胺+10mm亚精胺中温育1小时,之后在10mm谷氨酰胺+1mm亚精胺中继续温育5小时(第3泳道)。用盐水处理的大鼠对照细胞用胶原酶分散后温育1小时,然后仅在谷氨酰胺中继续温育5小时(第1泳道)。每个样品取500ngDNA,用Klenow酶进行[α-32P]-dCTP标记,然后用1.8%琼脂糖凝胶进行分离,并曝光24小时。结果显示在图18中。
在另一个试验中,在皮下注射500μg PGF-2α之前,给超数排卵的大鼠皮下注射亚精胺,注射量为1mg/100g体重,分三次注射,每次剂量为0.333mg/100g体重,给药时间分别是注射PGF-2α之前的24、12和2小时。将对照大鼠分成3组:没有注射、注射3次亚精胺但没有注射PGF-2α、以及在PGF-2α处理之前注射3次相同体积的盐水。在用前列腺素处理后1小时35分或3小时45分钟,切除大鼠卵巢,用于分离DNA。每个样品取500ng DNA,用Klenow酶进行[α-32P]-dCTP标记,然后用1.8%琼脂糖凝胶进行分离,并曝光24小时:泳道1,未注射(处死动物的时间与3-5泳道相同);泳道2,注射3次亚精胺(处死动物的时间与3-5泳道相同);泳道3,注射3次盐水,之后注射PGF-2α(在用PGF-2α处理后1小时35分钟时,处死动物);泳道4,注射3次亚精胺,之后注射PGF-2α(在用PGF-2α处理后1小时35分钟时,处死动物);泳道5,注射3次亚精胺,之后注射PGF-2α(在用PGF-2α处理后1小时35分钟时,处死动物);泳道6,注射3次亚精胺,之后注射PGF-2α(在用PGF-2α处理后3小时45分钟时,处死动物);泳道7,注射3次亚精胺,之后注射PGF-2α(在用PGF-2α处理后3小时45分钟时,处死动物)。结果显示在图19中。
分离RNA
在用PGF-2α诱导细胞凋亡后的不同时间,从分离自大鼠的黄体组织中分离总RNA。首先将所述组织(5g)在液氮中研碎。将研碎的粉末与30ml胍缓冲液(4M异硫氰酸胍、2.5mM NaOAc pH8.5、0.8%β-巯基乙醇)混合。将混合物通过4层Miracloth过滤,并于4℃10,000g离心30分钟。然后将上清液进行11,200g氯化铯密度梯度离心20个小时。用75%的乙醇洗涤颗粒状的RNA,并将其重悬浮于600ml的EDPC处理过的水中,然后用1.5m l95%的乙醇和60ml NaOAc在-70℃沉淀RNA。
分离基因组DNA和DNA分梯试验
使用QIAamp DNA血液试剂盒(Qiagen),按照制造商的说明,从提取的黄体组织或分散的黄体细胞中分离提取基因组DNA。将500ng的DNA与0.2μCi[α-32P]dCTP、1mM Tris、0.5mM EDTA、3单位的Klenow酶和0.2pM的dATP、dGTP、dTTP在室温下温育30分钟,从而对分离的DNA进行末端标记。按照Maniatis等所描述的方法,将样品通过1-ml Sepadex G-50柱,去除未掺入的核苷酸。然后利用Tris-醋酸盐-EDTA(1.8%)凝胶电泳分离样品。将凝胶在室温下真空干燥30分钟,然后在-80℃下曝光24小时,得到X-射线胶片。
质粒DNA的分离,DNA测序
按照Sambrook等所描述的碱裂解法,分离质粒DNA。然后使用双脱氧测序法对全长阳性cDNA克隆进行测序。Sanger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74:5463-5467。利用BLAST检索技术(GenBank,Bethesda,MD)编辑并分析可读框,并使用BCM SearchLauncher:Multiple Sequence Alignments Pattern-InducedMultiple Alignment Method(参见F.Corpet,Nuc.AcidsRes.,16:10881-10890,(1987))进行序列比对。测序和序列比对结果显示在图5-11中。
大鼠黄体RNA的RNA印迹杂交结果
将20毫克总RNA在1%变性甲醛琼脂糖凝胶上分离,并固定在尼龙薄膜上,其中总RNA分离自处于不同细胞凋亡阶段的大鼠黄体。使用随机引物试剂盒(Boehringer)标记全长大鼠细胞凋亡特异性eIF-5A的cDNA(SEQ ID NO:1),使之带上32P-dCTP标记,并将其用作探针探测薄膜7×107。可选择的,使用随机引物试剂盒(Boehringer)标记全长大鼠细胞凋亡特性DHS的cDNA(SEQ ID NO:6),使之带上使之带上32P-dCTP标记,并将其用作探针探测薄膜(7×107cpm)。将薄膜用1×SSC、1%SDS室温下冲洗一次,并用0.2×SSC、0.1%SDS在65℃下冲洗3次。将薄膜干燥,并在-70℃下曝光过夜,得到X-射线胶片。
从中看出,在凋亡的黄体组织中,eIF-5A和DHS均出现了上调。用PGF-2α处理诱导细胞凋亡,能够显著增强细胞凋亡-特异性eIF-5A的表达:在0时间时表达量很低,在处理的1小时后内大大增加,在处理的8小时内仍然增加,在处理的24小时内稍稍增加(图14)。DHA的表达在0时间时较低,在处理的1小时内大大增加,在处理的8小时内仍然增加,在处理的24小时内稍稍增加(图15)。
使用酵母、真菌和人的eIF-5A序列设计引物,生产凋亡大鼠黄体的RT-PCR产物
以酵母、真菌和人的eIF-5A序列设计一对寡核苷酸引物,以大鼠凋亡黄体的RNA为模板进行RT-PCR,生产出细胞凋亡特异性eIF-5A基因3’末端的部分序列(SEQ ID NO:11)。用于分离大鼠eIF-5A基因3’末端的上游引物是具有20个核苷酸的简并引物:5’TCSAARACHGGNAAGCAYGG 3′(SEQ ID NO:9),其中S选自C和G;R选自A和G;H选自A、T和C;Y选自C和T;N是任意的核苷酸。用于分离大鼠eIF-5A基因的下游引物包含42个核苷酸:5′GCGAAGCTTCCATGGCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 3′(SEQ IDNO:10)。进行反转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)。首先使用5mg的下游引物,合成cDNA的第一链。然后将上述第一链作为RT-PCR的模板,在RT-PCR中同时使用上游和下游引物。
随后在琼脂糖凝胶上分离RT-PCR产物,显示存在一个900bp的片段,利用平端连接将其亚克隆到pBluescriptTM(Stratagene CloningSystems,LaJolla,CA),并测序(SEQ ID NO:11)。3’末端的cDNA序列是SEQ ID NO:11,3’末端的氨基酸序列是SEQ ID NO:12。参见图1-2。
以细胞凋亡大鼠黄体的RNA为模板进行RT-PCR,生产出对应于细胞凋亡特异性eIF-5A基因的5’末端,并与3’末端重叠的部分序列(SEQ ID NO:15)。5’端引物为24聚体,序列为5’CAGGTCTAGAGTTGGAATCGAAGC3’(SEQ ID NO:13),是根据人eIF-5A的序列设计的。3’端引物为30聚体,序列为5’ATATCTCGAGCCTTGATTGCAACAGCTGCC3’(SEQ ID NO:14),是根据上述RT-PCR片段的3’末端设计的。进行反转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)。首先使用5mg的下游引物,合成cDNA的第一链。然后将上述第一链作为RT-PCR的模板,在RT-PCR中同时使用上游和下游引物。
随后在琼脂糖凝胶上分离RT-PCR产物,显示存在一个500bp的片段,然后使用分别存在于上游和下游引物中的XbaI和XhoI克隆位点将其亚克隆到pBluescriptTM(Stratagene Cloning Systems,LaJolla,CA),并测序(SEQ ID NO:15)。5’末端的cDNA序列是SEQID NO:15,5’末端的氨基酸序列是SEQ ID NO:16。参见图2。
将大鼠细胞凋亡-特异性eIF-5A的3’端序列和5’端序列(分别是SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:15)重叠,得到全长cDNA序列(SEQID NO:1)。将上述全长序列与GenBank数据库中的序列进行比对。参见图1-2。该cDNA克隆编码具有154个氨基酸的多肽(SEQ ID NO:2),预计分子量为16.8KDa。通过RT-PCR获得的大鼠细胞凋亡特异性黄体eIF-5A基因的全长cDNA的核苷酸序列,即SEQ ID NO:1,显示在图3中,其相应的衍生氨基酸序列是SEQ ID NO:9。将eIF-5A的衍生全长氨基酸序列与人和小鼠的eIF-5a序列进行了比对。参见图7-9。
以人的DHS序列设计引物,生产凋亡大鼠黄体的RT-PCR产物
以人的DHS序列设计一对寡核苷酸引物,以大鼠凋亡黄体的RNA为模板进行RT-PCR,生产出相应于细胞凋亡特异性DHS基因3’末端的部分序列(SEQ ID NO:6)。5’引物为20聚体,序列为5’GTCTGTGTATTATTGGGCCC 3’(SEQ ID NO:17);3’引物为42聚体,序列是5’GCGAAGCTTCCATGGCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 3’(SEQID NO:18)。进行反转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)。首先使用5mg的下游引物,合成cDNA的第一链。然后将上述第一链作为RT-PCR的模板,在RT-PCR中同时使用上游和下游引物。
随后在琼脂糖凝胶上分离RT-PCR产物,显示存在一个606bp的片段,利用平端连接将其亚克隆到pBluescriptTM(StratageneCloning Systems,LaJolla,CA),并测序(SEQ ID NO:6)。通过RT-PCR获得的大鼠细胞凋亡特异性黄体DHS基因的部分cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO:6),显示在图4中,其相应的衍生氨基酸序列是SEQ IDNO:7。
基因组DNA的分离和DNA印迹分析
用于DNA印迹的基因组DNA分离自离体的大鼠卵巢。将大约100mg的卵巢组织分割成小块,置于15ml的试管中。用1ml的PBS轻轻振摇组织悬浮物,将组织洗涤两次,然后用移液管吸出PBS。将组织重悬浮在2.06ml的DNA缓冲液中(0.2M Tris-HCl pH8.0和0.1mM EDTA),并加入240μl的10%SDS和100μl的蛋白酶K(BoehringerManheim;10mg/ml)。将组织置于45℃水浴中,并振摇过夜。第二天,再加入100μl蛋白酶K(10mg/ml),然后将组织悬浮液在45℃的水浴中继续温育4小时。温育后,用等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提悬浮液一次,然后用等体积的氯仿∶异戊醇((24∶1)再抽提一次。抽提后,加入1/10体积的3M醋酸钠(pH5.2)和2倍体积的乙醇。用Bunsen灯将玻璃移液管密封,并弯成钩状,用于从溶液中拉出DNA丝,并将DNA转移到干净的微量离心管中。用70%的乙醇将DNA洗涤1次,风干10分钟。将DNA颗粒溶解在500μl的10mMTris-HCl(pH8.0)中,加入10μl RNA酶A(10mg/ml),然后将DNA在37℃温育1小时。用苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提上述DNA一次,加入1/10体积的3M醋酸钠(pH5.2)和2倍体积的乙醇,使DNA沉淀。13,000g 4℃离心10分钟,得到颗粒状DNA。将上述DNA颗粒用70%乙醇洗涤一次,然后溶解在200μl 10mM Tris-HCl(pH8.0)中,在4℃振摇过夜。
为了进行DNA印迹分析,将分离自大鼠卵巢的基因组DNA用各种限制性酶消化,所述限制性酶不切割内源性基因,或者仅切割一次。为了实现这一点,在200μl的总反应体系中,将10μg的基因组DNA、20μl的10x反应缓冲液和100U限制性酶共同反应5-6小时。将消化后的DNA加样到0.7%琼脂糖凝胶上,40伏电泳6小时,或者15伏电泳过夜。电泳后,将凝胶在0.2N HCl中脱嘌呤10分钟,接着在变性溶液(0.5M NaOH,1.5M NaCl)中洗涤两次,每次15分钟,然后在中性缓冲液(1.5M NaCl,0.5M Tris-HCl pH 7.4)中洗涤两次,每次15分钟。将上述DNA转移到尼龙薄膜上,薄膜在杂交溶液(40%甲酰胺,6×SSC,5× Denhart′s溶液(1× Denhart′s溶液是0.02%Ficoll、0.02%PVP、和0.02%BSA),0.5%SDS和1.5mg变性鲑鱼精子DNA)中预杂交。利用随机引物,使用[α-32p]-dCTP标记大鼠eIF-5A cDNA 3′UTR 700bp的PCR片段(650bp的3’UTR和50bp的编码区),然后以1×106cpm/ml加到薄膜上。
同样,利用随机引物,使用[α-32P]-dCTP标记大鼠DHS cDNA 606bp的PCR片段(450bp的编码区和156bp的3’UTR),然后以1×106cpm/ml加到第二张相同的薄膜上。印迹在42℃杂交过夜,然后用2×SSC和0.1%SDS在42℃洗涤两次,最后用1×SSC和0.1%SDS在42℃再洗涤两次。然后将杂交印迹曝光3-10天。
按照图20的描述,用限制性酶酶切大鼠黄体基因组DNA,并用32P-dCTP标记的全长eIF-5A的cDNA作为探针进行探测。在高度严格条件下进行杂交,结果显示对于每个限制性酶切DNA样品来说,全长cDNA探针均能与几个限制性酶切片段杂交,这表明存在几种同种型eIF-5A。特别值得注意的是,当使用EcoRV(它在细胞凋亡特异性eIF-5A的可读框内具有一个限制性位点)消化大鼠基因组DNA时,在DNA印迹中可检测到细胞凋亡特异性eIF-5A同种型的两个限制性片段。这两个片段在图20中用双箭头示出。用RcoR1和BamH1酶切的、对应于细胞凋亡特异性eIF-5A同种型的限制性片段,在泳道中用单箭头示出,其中上述限制性酶在可读框中没有酶切位点。上述结果表明细胞凋亡特异性eIF-5A在大鼠中是单拷贝基因。正如图5-13所示,物种间的eIF-5A基因是高度保守的,因此预期在任一物种的同种型间,也是非常保守的。
图21显示用32P-dCTP标记的部分大鼠黄体细胞凋亡特异性DHScDNA为探针,探测到的DNA印迹结果。用EcoRV酶切基因组DNA,其中该酶不能酶切用作探针的上述部分cDNA。其中有两个限制性片段非常明显,这表明基因有两个拷贝,或者表明该基因包含带有EcoRV位点的内含子。
实施例2
本实施例证明细胞凋亡因子5A和DHS对细胞凋亡的调节作用
COS-7细胞的培养和RNA的分离
COS-7,是用能够编码野生型T抗原的SV40突变体转化的一种非洲绿猴肾成纤维细胞样细胞系,可用于所有以转染为基础的试验。在Dulbecco′s改良型Eagle′s培养基(DMEM)上培养COS-7细胞,每升培养基中含有0.584克L-谷氨酰胺、4.5g葡萄糖,并含有0.37%的碳酸氢钠。培养基中还补充了10%的胎牛血清(FBS)和100个单位的青霉素/链霉素。细胞在37℃、5%CO2和95%空气的湿润环境下生长。每3-4天,用0.25胰蛋白酶和1mM EDTA溶液将贴壁的细胞分散开来,进行次培养。将分散开来的细胞以1∶10的比例分散在含有新鲜培养基的新的培养皿中。
在150-mm的组织培养皿(Corning)中培养COS-7细胞,用于提取RNA。用胰蛋白酶-EDTA溶液将细胞分散,并收集细胞。将分散细胞收集在离心试管中,然后在3000rpm下离心5分钟,得到细胞团。除去上清液,将细胞团在液氮中瞬间冷冻。按照制造商的说明,使用GenElute哺乳动物总RNA微量制备试剂盒(Sigma)分离冷冻细胞的RNA。
重组质粒的构建和COS-7细胞的转染
使用哺乳动物表位标记表达载体,pHM6(Roche MolecularBiochemicals),如图21所示,构建携带有义取向大鼠细胞凋亡eIF-5A的全长编码序列,和反义取向大鼠细胞凋亡eIF-5A的3’非翻译区(UTR)的重组质粒。所述载体含有:CMV启动子-人巨细胞病毒立即早期启动子/增强子;来源于流感血细胞凝集素的HA-九肽表位标记;BGH pA-牛生长激素聚腺苷酸化信号;flori-f1起点;SV40ori-SV40早期启动子和起点;新霉素-新霉素抗性(G418)基因;SV40pA-SV40聚腺苷酸化信号;Col E1-Col E1起点;氨卞西林-氨卞西林抗性基因。利用PCR,从起始pBluescript扩增大鼠eIF-5A RT-PCR片段(SEQID NO:1),得到大鼠细胞凋亡eIF-5A的全长编码序列和大鼠细胞凋亡eIF-5A的3’UTR。扩增全长eIF-5A所使用的引物序列如下:正向引物5’GCC
AAGCTTAATGGCAGATGATTTGG 3’(Hind3),反向引物5’CT
GAATTCCAGTTATTTTGCCATGG 3’(EcoR1)。扩增大鼠eIF-5A3’UTR所使用的引物如下:正向引物5’AAT
GAATTCCGCCATGACAGAGGAGGC 3’(EcoR1),反向引物5’GCG
AAGCTTCCATGG
CTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 3’(Hind3)。
进行琼脂糖凝胶电泳,分离到的全长大鼠eIF-5A PCR产物的长度为430bp,大鼠eIF-5A3’UTR PCR产物的长度为697bp。将上述两个PCR产物亚克隆到pHM6的Hind3和EcoR1位点,得到pHM-6-全长eIF-5A和pHM6-反义3’UTR eIF-5A。将全长大鼠eIF-5A的PCR产物亚克隆到带有流感血细胞凝集素(HA)九肽表位标记的阅读框中,从而使抗-[HA]-过氧化物酶抗体能够检测上述重组蛋白,其中该阅读框位于多克隆位点的上游。表达是由人巨细胞病毒立即早期启动子/增强子驱动的,从而确保在哺乳动物细胞系中高水平表达。所述质粒还包含用于选择稳定转染子的新霉素抗性(G418)基因,以及在表达SV40大型T抗原细胞,如COS-7细胞中进行附加型复制的SV40早期启动子和起点。
转染试验中所使用的COS-7细胞,或者在24孔细胞培养平板(Corning)中培养,用于提取细胞的蛋白,或者在4室培养载玻片(Falcon)中培养,用于细胞染色。细胞在补充了10%FBS,但没有青霉素/链霉素的DMEM培养基中生长至丰度为50%-70%。将0.32μg质粒DNA用无血清的DMEM稀释到42.5μl,并将上述混合物在室温下温育15分钟,从而制得24孔平板或培养载玻片所需的转染培养基。将转染试剂,LipofectAMINE(Gibco,BRL)用无血清的DMEM稀释到42.5μl,并在室温下温育5分钟。5分钟之后,将LipofectAMINE混合物加入到上述DNA混合物中,并在室温下共同温育30分钟。在覆盖转染培养基之前,用无血清的DMEM将即将被转染的细胞洗涤-次,然后将细胞放回到生长室中放置4小时。温育后,向细胞中加入0.17ml的DMEM和20%的FBS。将细胞继续培养40个小时,之后诱导其经历细胞凋亡,进而染色,或者将其收集起来用于蛋白质印迹分析。作为对照,还进行了模拟转染,在模拟转染中转染培养基不含质粒DNA。
蛋白提取和蛋白质印迹
将细胞用PBS(8g/L NaCl、0.2g/L KCl、1.44g/L Na2HPO4和0.24g/L KH2PO4)洗涤两次,然后加入150μl的热SDS凝胶加样缓冲液(50mM Tris-HCl pH6.8,100mM二硫苏糖醇,2%SDS,0.1%溴酚蓝,和10%甘油),从而从转染细胞中分离蛋白,用于蛋白质印迹分析。将细胞裂解液收集在微量离心管中,在95℃加热10分钟,然后在13,000xg下离心10分钟。将上清液转移到另外的微量离心管中,-20℃贮存备用。
为了进行蛋白质印迹,在12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离2.5或5μg的总蛋白。将分离的蛋白转移到聚偏二氟乙烯薄膜上。然后将薄膜在封闭溶液(5%脱脂奶粉末,0.02%叠氮化钠的PBS溶液)中温育1小时,并用PBS-T(PBS+0.05%吐温-20)中清洗3次,每次15分钟。将薄膜在4℃的PBS-T中贮存过夜。第二天温热到室温后,将薄膜在1μg/ml的聚乙烯醇中封闭30秒。将薄膜在去离子水中清洗5次,然后在含5%乳汁的PBS溶液中封闭30分钟。在与薄膜温育前,将第一抗体在含5%乳汁的PBS溶液中预温育30分钟。
可使用多种第一抗体。使用1∶5000稀释的抗-[HA]-过氧化物酶抗体(Roche Molecular Biochemicals)检测重组蛋白的表达。因为这种抗体是与过氧化物酶缀合的,因此不需要次级抗体,清洗印迹,并利用化学发光显色。还可以使用其它的第一抗体,如来源于致癌基因(Oncogene)的单克隆抗体,它能够识别p53(Ab-6)、Bcl-2(Ab-1)和c-Myc(Ab-2)。用于识别p53时,单克隆抗体的稀释度是0.1μg/ml,识别Bcl-2和c-Myc时,稀释度是0.83μg/ml。在与第一抗体温育60-90分钟后,将薄膜在PBS-T中清洗3次,每次15分钟。将次级抗体用含1%牛奶的PBS稀释,然后与薄膜温育60-90分钟。当使用p53(Ab-6)作为第一抗体时,所使用的次级抗体是与碱性磷酸酶缀合的山羊抗-小鼠IgG(Rockland),稀释倍数是1∶1000。当使用Bc1-2(Ab-2)和c-Myc(Ab-2)作为第一抗体时,所使用的次级抗体是与过氧化物酶缀合的兔抗-小鼠IgG,稀释倍数是1∶5000。在与次级抗体温育后,将薄膜在PBS-T溶液中清洗3次。
用于使印迹显色的两种检测方法是:比色法和化学发光法。比色法仅用于以p53(Ab-6)作为第一抗体,并联合使用与碱性磷酸酶缀合的次级抗体的情况。将印迹在黑暗中,与溶液0.33mg/mL硝基蓝四唑、0.165mg/mL 5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐、100mM NaCl、5mM MgCl2和100mM Tris-HCl(pH9.5)一起温育,可以目测观察到结合蛋白。将印迹与含2mM EDTA的PBS溶液一起温育,使显色反应终止。化学发光法可用于所有其它的第一抗体,包括抗-[HA]-过氧化物酶、Bcl-2(Ab-1)和c-Myc(Ab-2)。使用ECL Plus蛋白质印迹检测试剂盒(AmershamPharmacia Biotech)检测过氧化物酶缀合的结合抗体。简单说,将薄膜轻轻吸干,然后在黑暗中,与试剂A和试剂B以40∶1的比例组成的混合物温育5分钟。将薄膜吸干,放在醋酸盐层之间,曝光为X射线胶片,曝光时间为10秒到10分钟不等。
在COS7细胞中诱导细胞凋亡
诱导转染COS-7细胞凋亡可以使用两种方法,血清剥夺法和放线菌素D,链霉素(Calbiochem)处理法。为了实施上述两种处理,在转染40小时后,除去培养基。在血清饥锇试验中,用无血清和无抗生性的DMEM作为培养基。用在添加了10%FBS的无抗生性DMEM上生长的细胞作为对照。在用放线菌素D诱导细胞凋亡的试验中,培养基是无抗生性的DMEM,其中添加了10%FBS和含有1μg/ml放线菌素D的甲醇溶液。对照细胞的培养基是添加了10%FBS和等体积甲醇的无抗生性DMEM。在上述两种方法中,用Hoescht或膜联蛋白(Annexin)V-Cy3染色48小时后,检测细胞凋亡的百分率。细胞凋亡的诱导还可以通过RNA印迹分析加以证实,如图22所示。
Hoescht染色
使用核染料Hoescht来标记转染COS-7细胞的核,从而鉴定基于形态学特征,如核断裂和核凝聚的凋亡细胞。使用前,即时制备由无水甲醇和冰醋酸以3∶1的比例组成的混合物,作为固定剂。然后向生长有COS-7细胞的培养载玻片的细胞培养基中加入相同体积的固定剂,并温育2分钟。将培养基/固定剂混合物与细胞分离并弃去,向细胞中加入1ml的固定剂。5分钟后,弃去固定剂,然后向细胞中加入另外1ml固定剂,并温育5分钟。弃去固定剂,在加入1ml的Hoescht染色剂(0.5μg/ml Hoescht 33258 的PBS溶液)前,将细胞风干4分钟。在黑暗中温育10分钟后,弃去染色溶液,用去离子水清洗载玻片3次,每次1分钟。清洗后,向细胞中加入1ml的McIlvain′s缓冲液(0.021M柠檬酸,0.058M Na2HPO4·7H2O,pH5.6),并在黑暗中温育20分钟。弃去缓冲液,将细胞在黑暗中风干5分钟,并去掉培养载玻片各孔之间的间隔。在载玻片上加几滴荧光Vectashield封固剂(Vector Laboratories),并盖上盖玻片。在带有UV滤光器的荧光显微镜下可观察到染色的细胞。将染色鲜明或核断裂的细胞记录为凋亡细胞。
膜联蛋白V-Cy3染色
使用膜联蛋白V-Cy3细胞凋亡检测试剂盒(Sigma)来荧光标记凋亡细胞上外在化的磷脂酰丝氨酸。按照制造商的说明使用该试剂盒,并进行了下列改进。简要地说,将在四室培养载玻片上生长的转染COS-7细胞用PBS清洗两次,然后用1x结合缓冲液清洗3次。加入150μl染色溶液(溶解在1x结合缓冲液中的1μg/ml AnnCy3),在黑暗中温育细胞10分钟。然后去除染色溶液,用1x结合缓冲液清洗细胞5次。去掉培养载玻片上的室壁,并在细胞上滴几滴1x结合缓冲液,盖上盖玻片。使用绿色滤光器,通过荧光显微镜检查分析染色的细胞,可以观察到发出红色荧光的阳性染色(凋亡)细胞。细胞群总量是在可见光下计算细胞数而得到的结果。
实施例3
本实施例证明使用细胞凋亡因子5A和DHS能够调节细胞凋亡
在本实施例中使用了前面实施例所描述的方法和常规流程,图23是COS-7细胞瞬时转染的流程图,其中将无血清培养基中的细胞与质粒DNA在存在脂转染胺(lipofectAMINE)的条件下,温育4小时,之后加入血清,继续温育细胞40个小时。在分析前,对上述细胞作如下处理:在含有血清的常规培养基上继续温育48小时(即没有作进一步的处理);血清剥夺48小时,诱导细胞凋亡;用放线菌素D处理48小时,诱导细胞凋亡。
图22是蛋白质印迹结果,显示COS-7细胞在用pHM6转染后,外源蛋白的瞬时表达情况。从模拟转染、或用pHM6-LacZ、pHM6-反义3’rF5A(pHM6-反义3’UTR大鼠细胞凋亡eIF-5A)、pHM6-有义rF5A(pHM6-全长大鼠细胞凋亡eIF-5A)转染后48小时的COS-7细胞中,提取蛋白。使用SDS-PAGE分离蛋白,每个样品5μg,然后转移到PVDF薄膜上,使用抗-[HA]-过氧化物酶进行蛋白质印迹分析。使用化学发光法检测结合抗体,并曝光30秒,得到X射线胶片。LacZ(泳道2)和有义大鼠细胞凋亡eIF-5A(泳道4)的表达清晰可见。
如上所述,对于模拟转染的COS-7细胞或者用pHM6-有义rF5A(pHM6-全长大鼠eIF-5A)转染的COS-7细胞。转染40小时后,通过剥夺血清48小时,来诱导细胞经历凋亡。使用荧光同源性天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶分析试剂盒(Roche Diagnostics)测定转染细胞提取物中天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的蛋白水解活性。还可使用FragEL DNA断裂细胞凋亡检测试剂盒(Oncogene)测定DNA的断裂情况,该试剂盒能够在DNA片段的暴露3’-OH末端标记上荧光标记的脱氧核苷酸。
另外,对于模拟转染或用pHM6-有义rF5A(pHM6-全长大鼠eIF-5A)转染的COS-7细胞。转染40小时后,将细胞在含有血清的常规培养基上再生长48小时(没有进一步的处理);或血清剥夺48小时,诱导细胞经历凋亡;或用0.5μg/ml的放线菌素D处理48小时,诱导细胞经历凋亡。然后将细胞用Hoescht33258染色,它可显示伴随细胞凋亡的核断裂情况,或者用膜联蛋白V-Cy3染色,它可显示伴随细胞凋亡的磷脂酰丝氨酸暴露情况。此外,可以使用带有绿色滤光器的荧光显微镜,观察染色细胞,并计算细胞凋亡的百分率。细胞群总量是在可见光下计数的结果。
图25显示当COS-7细胞用包含有义取向的全长大鼠细胞凋亡特异性因子eIF-5A的pHM6瞬时转染时,由于提高了半胱氨酸天冬氨酸酶活性,而表现出的细胞凋亡增强。大鼠细胞凋亡-诱导eIF-5A的表达使天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的活性增加了60%。
图26显示当COS-7细胞用包含有义取向的全长大鼠细胞凋亡-诱导eIF-5A的pHM6瞬时转染时,由于提高了DNA的断裂程度,而表现出的细胞凋亡增强。大鼠细胞凋亡-诱导eIF-5A的表达使DNA的断裂程度增加了237%。图27显示当COS-7细胞用包含有义取向的全长大鼠细胞凋亡-诱导eIF-5A的pHM6瞬时转染时,对由于提高了核的断裂程度而造成的细胞凋亡进行检测的结果。大鼠细胞凋亡-诱导eIF-5A的表达对细胞的核断裂产生了重大的影响。图28显示当COS-7细胞用包含有义取向的全长大鼠细胞凋亡-诱导eIF-5A的pHM6瞬时转染时,由于提高了核的断裂程度,而表现出的细胞凋亡增强。大鼠细胞凋亡-诱导eIF-5A的表达导致非-血清饥饿样品和血清饥饿样品的核断裂程度比对照分别增加了27%和63%。
图29显示当COS-7细胞用包含有义取向的全长大鼠细胞凋亡-诱导eIF-5A的pHM6瞬时转染时,对由于磷脂酰丝氨酸位点暴露而造成的细胞凋亡进行检测的结果。图30显示当COS-7细胞用包含有义取向的全长大鼠细胞凋亡-诱导eIF-5A的pHM6瞬时转染时,由于提高了磷脂酰丝氨酸位点的暴露,而表现出的细胞凋亡增强。大鼠细胞凋亡-诱导eIF-5A的表达导致非-血清饥饿样品和血清饥饿样品的磷脂酰丝氨酸位点暴露比对照分别增加了140%和198%。
图31显示当COS-7细胞用包含有义取向的全长大鼠细胞凋亡-诱导eIF-5A的pHM6瞬时转染时,由于提高了核断裂程度,而表现出的细胞凋亡增强。大鼠细胞凋亡-诱导eIF-5A的表达使未处理样品和处理样品的核断裂程度比对照分别增加了115%和62%。图32显示用包含有义取向的全长大鼠细胞凋亡-诱导eIF-5A的pHM6瞬时转染的COS-7细胞,在未进一步处理和进行了诱导细胞凋亡处理的情况下,细胞凋亡增加情况的结果比较。
实施例4
本实施例描述给予细胞凋亡因子5A和DHS后,对细胞凋亡活性的调节。
模拟转染COS-7细胞,或用pHM6-LacZ、pHM6-有义rF5A(pHM6-全长大鼠eIF-5A)转染COS-7细胞,温育40个小时。从提取的每个样品蛋白中,取5μg蛋白样品,用SDS-PAGE分离,然后转移到PVDF薄膜上,用识别Bcl-2的单克隆抗体进行蛋白质印迹分析。次级抗体使用的是缀合有过氧化物酶的兔抗-小鼠IgG,利用化学发光法检测结合抗体,并曝光为X射线胶片。结果显示在图32中。在使用pHM-6有义rF5A转染的细胞中,检测到的Bcl-2的量少于用pHM6-LacZ转染的细胞,因此说在使用pHM-6有义rF5A转染的细胞中,Bcl-2的表达是下调的。
另外,模拟转染COS-7细胞,或用pHM6-反义3’rF5A(pHM6-反义大鼠细胞凋亡-特异性eIF-5A的3’UTR),或用pHM6-有义rF5A(pHM6-全长大鼠细胞凋亡-特异性eIF-5A)转染COS-7细胞。转染40小时后,进行血清剥夺48小时,从而诱导细胞经历。从提取的每个样品蛋白中,取5μg蛋白样品,用SDS-PAGE分离,然后转移到PVDF薄膜上,用识别Bcl-2的单克隆抗体进行蛋白质印迹分析。次级抗体使用的是缀合有过氧化物酶的兔抗-小鼠IgG,利用化学发光法检测结合抗体,并曝光为X射线胶片。
此外,模拟转染COS-7细胞,或用pHM6-LacZ、或用pHM6-有义rF5A(pHM6-全长大鼠eIF-5A)转染COS-7细胞,温育40个小时。从提取的每个样品蛋白中,取5μg蛋白样品,用SDS-PAGE分离,然后转移到PVDF薄膜上,用识别p53的单克隆抗体进行蛋白质印迹分析。次级抗体使用的是缀合有碱性磷酸酶的山羊抗-小鼠IgG,利用比色法检测结合抗体。
最后,模拟转染COS-7细胞,或用pHM6-LacZ、或用pHM6-有义rF5A(pHM6-全长大鼠eIF-5A)转染COS-7细胞,并温育40个小时。从提取的每个样品蛋白中,取5μg蛋白样品,用SDS-PAGE分离,然后转移到PVDF薄膜上,用识别p53的单克隆抗体作为探针进行探测。同时用抗-[HA]-过氧化物酶作为探针进行相应的蛋白质印迹分析,来测定大鼠细胞凋亡-特异性eIF-5A的表达水平。次级抗体使用的是缀合有碱性磷酸酶的山羊抗-小鼠IgG,然后利用化学发光法检测结合抗体。
图33显示当COS-7细胞用包含有义取向的全长大鼠细胞凋亡-诱导eIF-5A的pHM6瞬时转染时,Bcl-2表达的下调。上图是用考马斯亮蓝染色的蛋白条带;下图是相应的蛋白质印迹结果。在用pHM6-有义rF5A转染的细胞中,检测到的Bcl-2的量小于用pHM6-LacZ转染的细胞。
图34显示当COS-7细胞用包含反义取向的全长大鼠细胞凋亡-诱导eIF-5A的pHM6瞬时转染时,Bcl-2表达上调的情况。上图显示考马斯亮蓝染色的蛋白条带;下图是相应的蛋白质印迹结果。在用pHM6-反义3’rF5A转染的细胞中,检测到的Bcl-2的量大于模拟转染的细胞和用pHM6-有义rF5A转染的细胞。
图35显示当COS-7细胞用包含有义取向的全长大鼠细胞凋亡-诱导eIF-5A的pHM6瞬时转染时,c-Myc表达上调的情况。上图显示考马斯亮蓝染色的蛋白条带;下图是相应的蛋白质印迹结果。在用pHM6-有义rF5A转染的细胞中,检测到的c-Myc的量大于用pHM6-LacZ转染或模拟对照的细胞。
图36显示当COS-7细胞用包含有义取向的全长大鼠细胞凋亡-诱导eIF-5A的pHM6瞬时转染时,p53表达上调的情况。上图显示考马斯亮蓝染色的蛋白条带;下图是相应的蛋白质印迹结果。在用pHM6-有义rF5A转染的细胞中,检测到的p53的量大于用pHM6-LacZ转染或模拟对照的细胞。
图37显示在COS-7细胞中,p53表达的上调依赖于pHM6-全长大鼠细胞凋亡-诱导eIF-5A的表达。在蛋白质印迹中,使用的抗-[HA]-过氧化物酶作为探针探测的,上图是考马斯亮蓝染色的蛋白质条带,下图是相应的蛋白质印迹结果。与第二次转染相比,在第一次转染中检测到更多的大鼠细胞凋亡-诱导eIF-5A。在使用抗-p53作为探针探测的蛋白质印迹中,37A的上图是考马斯亮蓝染色的蛋白质条带,下图是以p53作为探针的蛋白质印迹结果。在第一次转染中,与用pHM6-LacZ或模拟对照转染的细胞相比,在用pHM6-有义rF5A转染的细胞中检测到更多的p53。在第二次转染中,大鼠细胞凋亡-诱导eIF-5A的表达水平较低,在用pHM6-有义rF5A、pHM6-LacZ或模拟对照转染的细胞之间,没有检测到p53表达水平的差异。
实施例5
图47描述以心脏组织为样品模拟人心脏搏动和随后诱导心脏休克的试验过程。图49显示实验室的试验台。在瓣膜移植手术中,取下一片人心脏组织,用钩子钩到电极上。在心脏组织上连接一个小砝码,以便于测量心脏搏动的强度。电极所提供的电刺激使上述组织开始搏动。在诱导缺血之前,检测细胞凋亡-特异性eIF-5A(eIF-5a)和增殖性eIF-5A(eIF5b)在心脏组织中的基因表达水平。参见图46。在缺血前的心脏组织中,eIF5a和eIF5b的表达水平都很低,而且两者的表达水平相对平衡。期间,给予心脏含氧量为92.5%、含二氧化碳量7.5%的缓冲液。因此对细胞凋亡-特异性eIF-5A(eIF5a)和增殖性eIF-5A(eIF5b)的表达水平进行检测时,心脏组织是暴露在正常氧含量条件下。此后,降低氧含量,提高氮含量,来诱导缺氧和缺血,最后导致“心脏休克”。心脏组织停止搏动。然后将氧含量恢复到正常水平,使用电刺激再次使心脏组织产生脉搏,使心脏再次开始搏动。在“心脏休克”以后,再次测定细胞凋亡-特异性eIF-5a和增值性eIF-5A(eIF-5b)的表达水平。在该次试验中,细胞凋亡-特异性eIF-5A的表达水平显著提高,而增值性eIF-5A(eIF5b)表达水平的提高显著低于细胞凋亡-特异性eIF-5A。参见图46。
在“心脏休克”以后,心脏搏动不再强烈,这从所连接的砝码压缩/运动强度减弱上可以看出,因此表明细胞凋亡-特异性eIF-5A的存在,导致心脏组织细胞快速死亡。
EKG结果显示在图48中。在左图中显示正常的心脏搏动(缺血前的心脏组织)。在“心脏休克”(直线)并重新启动心脏搏动以后,EKG显示出由于肌肉细胞死亡而导致活力降低。同时EKG还显示出心脏搏动强度相对降低。
实施例6:人细胞系培养条件
人筛板和单核细胞的培养
试验所用的成对人眼来自于加拿大(Ontario Division)的眼库,是死后48小时内的人眼。取下视神经头(带有附着极),将其置于Dulbecco′s改良Eagle′s培养基(EMEM)中3小时,其中该培养基中添加了抗生剂/抗真菌剂、谷氨酰胺、和10%的FBS。从每个组织样品中,找到视神经头扣状体,用细小的解剖剪将其剪成四小块。将外植体置于盛有DMEM培养基的12.5cm2塑料培养瓶中培养。在一个月内就能够看到存活外植体的生长。当细胞丰度为95%时,用胰蛋白酶消化,并进行分化传代培养,产生筛板(LC)和单核细胞群。具体来说,将LC细胞在带有DMEM培养基的25cm2培养瓶中进行传代培养,其中在培养基中添加了庆大霉素、谷氨酰胺和10%的FBS,同时将单核细胞铺板到含有EBM完全培养基(Clonetics)的25cm2培养瓶中,其中该培养基中不含FBS。在传代培养10天以后,向单核细胞培养物中加入FBS。根据上述方案保存细胞和进行传代培养。
从分化传代培养体系中获取细胞群,然后在8孔培养板上使用不同的荧光抗体进行染色,用于鉴别上述细胞群的种类,以及细胞群的纯度。将细胞在10%福尔马林溶液中固定,并用Dulbecco′s磷酸盐缓冲液(DPBS)冲洗三次。用2%的脱脂牛奶DPBS溶液进行封闭,将抗体用1%的BSA DPBS溶液稀释,并加到其中6个孔的细胞上。剩余的两个孔仅用1%的牛血清白蛋白(BSA)溶液进行处理,不含第一抗体,作为对照。将细胞和第一抗体在室温下温育1小时,然后用DPBS洗涤三次。将合适的次级抗体用1%BSA的DPBS溶液稀释,加到每个孔中,并温育1小时。在用DPBS洗涤后,将培养板各孔之间的隔板去掉,然后将培养板浸入双蒸水中,然后使之风干。向每个培养板上加入荧光封固剂(fluoromount,Vector Laboratories),并盖上22×60cm的盖玻片。
在带有合适滤光器的荧光显微镜下观察免疫荧光染色,并与没有用第一抗体处理的对照孔相比较。除非另有说明,所有的第一抗体均购自Sigma公司。所有的次级抗体均购自Molecular Probes。用于鉴别LC细胞的第一抗体是:抗-胶原蛋白I、抗-胶原蛋白IV、抗-层粘连蛋白、抗-细胞纤连蛋白。用于鉴别单核细胞的第一抗体是:抗-半乳糖脑苷脂(Chemicon International)、抗-A2BS(ChemiconInternational)、抗-NCAM、抗-人Von willebrand因子。两个细胞群均能使用的其它抗体包括:抗-胶质细胞原纤维蛋白(GFAP)和抗-α-平滑肌动蛋白。如果胶原蛋白I、胶原蛋白IV、层粘连蛋白、细胞纤连蛋白、α-平滑肌动蛋白染色呈阳性,和胶质细胞原纤维蛋白(GFAP)染色呈阴性,则该细胞群鉴定为包含LC细胞。如果NCAM、胶质细胞原纤维蛋白(GFAP)染色呈阳性,半乳糖脑苷脂、A2BS、人Von willebrand因子和α-平滑肌动蛋白染色呈阴性,则该细胞群鉴定为包含单核细胞。
在上述预备试验中,培养了三组人眼。从视神经头建立了LC细胞系#506、#507和#524,其中视神经头分别来自一位83岁男性、一位17岁男性、和一位26岁女性的人眼。对上述三个LC细胞系进行了鉴定,发现其所包含的LC细胞的数量高于90%。
RKO细胞的培养
RKO(American Type Culture Collection CRL-2577),一种能够表达野生型p53的人结肠癌细胞系,用之来测试反义寡核苷酸抑制eIF5A1蛋白表达的能力。在含有非必需氨基酸、Earle′s盐和1-谷氨酰胺的最低必需培养基Eagle(MEM)上培养RKO细胞。在培养基中添加了10%的胎牛血清(FBS)和100单位的青霉素/链霉素。细胞生长在37℃、包含5%CO2和95%空气的湿润环境中。每3-4天,将粘连的细胞用0.25%胰蛋白酶和1mM的EDTA使之分散开来,进行传代培养。将分散的细胞以1∶10到1∶20的比例分配到带有新鲜培养基的新的培养皿上。
HepG2细胞的培养
HepG2,一种人肝细胞癌细胞系,用之来测试反义寡核苷酸拮抗人eIF5A1进而阻遏应答IL-1时产生TNF-α的能力。将HepG2细胞在DMEM培养基上培养,其中DMEM培养基中添加了庆大霉素、谷氨酰胺和10%的FBS,生长环境为37℃、包含5%CO2和95%空气的湿润环境。
实施例7
细胞凋亡的诱导
分别使用放线菌素D(一种RNA聚合酶抑制剂)和喜树碱(一种拓补异构酶抑制剂)来诱导RKO和筛板细胞的凋亡。所使用的放线菌素D的浓度是0.25μg/ml,喜树碱的浓度是20、40或50μM。同时还使用了喜树碱(50μM)和TNF-α(10ng/ml)的组合诱导筛板细胞的凋亡。发现喜树碱和TNF-α的组合在诱导细胞凋亡方面比单独使用喜树碱或TNF-α更加有效。
反义寡核苷酸
三个靶向人eIF5A1的反义寡核苷酸,通过自行设计或从MoleculaResearch Labs购买。第一个靶向人eIF5A1的反义寡核苷酸的序列(#1)是5’CCT GTC TCG AAG TCC AAG TC 3’。第二个靶向人eIF5A1的反义寡核苷酸的序列(#2)是5’GGA CCT TGG CGT GGC CGT GC 3’。第三个靶向人eIF5A1的反义寡核苷酸的序列(#3)是5’CTC GTA CCTCCC CGC TCT CC 3’。对照寡核苷酸的序列是5’CGT ACC GGT ACG GTTCCA GC 3’。使用荧光素异硫氰酸盐(FITC)标记的反义寡核苷酸(Molecula Research Labs)来监测转染效率,序列为5’GGA CCT TGGCGT GGC CGT GCX 3’,其中X是FITC标记。所有的反义寡核苷酸都是完全偶磷硫代化的。
反义寡核苷酸的转染
在RKO细胞中测试了eIF5A1反义寡核苷酸阻遏eIF5A1蛋白表达能力。使用转染试剂,寡聚转染胺(Oligofectamine,Invitrogen),用反义寡核苷酸对RKO细胞进行了转染。在转染前24小时,将细胞分到24孔板上,每孔157,000个,使用的是添加了10%FBS但不含青霉素/链霉素的MEM培养基。24小时后,细胞一般会达到大约50%的丰度。将RKO细胞进行模拟转染,或者用100nM或200nM的反义寡核苷酸进行转染。制备足够24孔板使用的转染培养基,制备过程如下:用无血清的MEM将0、1.25或2.5μl浓度为20μM的反义寡核苷酸储备液稀释到42.5μl,将混合物在室温下温育15分钟。将1.5μl的寡聚转染胺用无血清的MEM稀释到6μl,并在室温下温育7.5分钟。5分钟之后,将稀释的寡聚胺加到上述DNA混合物中,并在室温下共同温育20分钟。用无血清的MEM将细胞洗涤一次,然后向细胞中加入200μl的MEM,并覆盖上50μl的转染培养基。将细胞放回到生长室中4小时。温育后,向细胞中加入125μl的MEM+30%FBS。然后将细胞继续培养48小时,用0.25μg/ml的放线菌素D处理24小时,然后收集细胞提取物用于蛋白质印迹分析。
在转染筛板细胞的试验中,同样使用100和200nM的反义寡核苷酸以及寡聚转染胺,过程与RKO细胞的转染过程相同。但是,在筛板细胞中,仅通过加入反义寡核苷酸就能有效实现转染,其中反义寡核苷酸是从1μM用无血清的培养基稀释到10μM,将稀释后的反义寡核苷酸加到细胞中24小时,之后将培养基替换为含有血清并稀释有反义寡核苷酸的培养基,以后每隔24小时替换一次,一直维持2-5天。
通过用FITC-标记的反义寡核苷酸实施转染来优化反义寡核苷酸的转染效率,并对转染效率进行监测,其中上述寡核苷酸的序列与eIF5A1反义寡核苷酸#2相同,不同之处在于在3’末端缀合了FITC。培养板上有8个孔中的RKO和筛板细胞用FITC-标记的反义寡核苷酸进行了转染。48小时后,将细胞用PBS洗涤,并在3.7%的甲醛PBS溶液中固定10分钟。之后拿开培养板,加入封固剂(Vectashield),然后盖上盖玻片。在UV灯下,使用带有荧光滤光器(Green H546,型号48915)的荧光显微镜观察细胞,发出绿色荧光的细胞即为摄入了寡核苷酸的细胞。
细胞凋亡的检测
用反义寡核苷酸转染筛板细胞并用喜树碱诱导细胞凋亡之后,检测用对照反义寡核苷酸、或反义寡核苷酸eIF5A1 SEQ ID NO:26处理的细胞,其经历细胞凋亡的百分率。使用两种方法来检测凋亡的筛板细胞,Hoescht染色法和DeadEndTMFluorometric TUNEL法。使用核染料,Hoescht,来标记筛板细胞的核,从而鉴定基于形态学特征,如核断裂和核凝聚的凋亡细胞。使用前,即时制备由无水甲醇和冰醋酸以3∶1的比例组成的混合物,作为固定剂。然后向生长在培养板上的细胞培养基中加入相同体积的固定剂,并温育2分钟。将培养基/固定剂混合物与细胞分离并弃去,之后向细胞中加入1ml的固定剂。5分钟后,弃去固定剂,然后向细胞中加入另外1ml固定剂,并温育5分钟。弃去固定剂,在加入1ml的Hoescht染色剂(0.5μg/ml Hoescht 33258的PBS溶液)前,将细胞风干4分钟。在黑暗中温育10分钟后,弃去染色溶液,去掉培养板各孔之间的隔板,并用去离子水清洗载玻片3次,每次1分钟。清洗后,向细胞中加入几滴McIlvain′s缓冲液(0.021M柠檬酸,0.058M Na2HPO4·7H2O,pH5.6),并盖上盖玻片。在带有UV滤光器的荧光显微镜下观察染色的细胞。将染色鲜明或核断裂的细胞记录为凋亡细胞。每孔检查最少200个细胞。
使用DeadEndTMFluorometric TUNEL(Promega)检测DNA的断裂程度,其中DNA断裂是凋亡细胞的特征之一。在Hoescht染色之后,首先将培养板用重蒸水洗涤,然后将板浸入PBS溶液(137mM NaCl,2.68mM KCl,1.47mM KH2PO4,8.1mM Na2HPO4)中继续洗涤两次,每次5分钟,在两次洗涤之间,用纸巾将板吸干。然后将细胞浸入0.2%Triton X-100的PBS溶液中5分钟,使之渗透化。然后将板浸入PBS溶液中再次洗涤两次,每次5分钟,在两次洗涤之间用纸巾吸干。向每孔中加入25μl的平衡缓冲液[200mM二甲胂酸钾(pH6.6)、25mMTris-HCl(pH6.6)、0.2mM二硫苏糖醇、0.25mg/ml的牛血清白蛋白、和2.5mM的氯化钴],并温育5到10分钟。在平衡过程中,以每孔30μl的量制备反应混合物,反应混合物是由平衡缓冲液、核苷酸混合物[50μM荧光素-12-dUTP、100μM dATP、10μM Tris-HCl(pH7.6)和1mM的EDTA],以及末端脱氧核苷酸转移酶(Tdt,25U/μl)以45∶5∶1的比例组成的。在平衡缓冲液中温育后,每孔加入30μl的反应混合物,并盖上盖玻片。使反应在37℃下进行1小时。将板浸入2×SSC[0.3M NaCl和30mM柠檬酸钠(pH7.0)]中终止反应,并温育15分钟。然后将板浸入PBS溶液中洗涤三次,每次5分钟。用Kim海绵擦拭孔的周围去除PBS,向每孔中加入一滴封固剂(Oncogene researchproject,Ja1750-4ML),在板上盖上盖玻片。在带有UV滤光器(UV-G365,组别487902)的荧光显微镜下观察细胞,并对Hoescht染色的核进行计数。所有染色明亮或核断裂的细胞记录为凋亡细胞。然后在相同的视野下,使用荧光素滤光器(Green H546,组别48915)观察细胞,将所有带有发出绿色荧光的核的细胞记录为凋亡细胞。细胞凋亡的百分率是将在使用荧光素滤光器的情况下发出绿色荧光的核的数量除以在UV滤光器下记录的核的总数。
图54-57描述了上述研究的结果。在用细胞凋亡-特异性eIF5A1转染的样品中,细胞凋亡的百分率明显大大低于用对照寡核苷酸转染的细胞。
蛋白的提取和蛋白质印迹分析
将转染后的RKO细胞用PBS洗涤,每孔加入40μl热的裂解缓冲液[0.5%SDS、1mM二硫苏糖醇、50mM Tris-HCl(pH8.0)],并收集蛋白用于蛋白质印迹分析。刮下细胞,并将所得提取物转移到微量离心管中,煮沸5分钟,并在20℃下贮存。使用Bio-Rad蛋白分析仪(Bio-Rad),根据制造商的说明对蛋白进行定量。
为了进行蛋白质印迹分析,将5μg的总蛋白在12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离。将分离后的蛋白转移到聚偏二氟乙烯薄膜上。然后将薄膜在封闭溶液(5%脱脂奶粉末的PBS溶液)中温育1小时,并在0.05%Tween-20/PBS溶液中清洗3次,每次15分钟。将薄膜在4℃的PBS-T溶液中贮存过夜。第二天温热到室温后,将薄膜在1μg/ml的聚乙烯醇中封闭30秒。将薄膜在去离子水中清洗5次,然后在含5%乳汁的0.025%Tween-20/PBS溶液中封闭30分钟。在与薄膜温育前,将第一抗体在含5%乳汁的0.025%Tween-20/PBS溶液中预温育30分钟。
可以使用几种第一抗体。如来源于致癌基因(Oncogene)能够识别p53(Ab-6)的单克隆抗体,和在鸡中制备的抗合成肽(氨基-CRLPEGDLGKEIDQKYD-羧基)(SEQ ID NO:33)的多克隆抗体(GallusImmunotech),其中上述合成肽与人eIF5A1的c-末端同源。还可以使用一种抗-β-肌动蛋白(Oncogene)来验证蛋白的加样量是否相同。识别p53的单克隆抗体在使用时浓度为0.05μg/ml,抗eIF5A1的抗体在使用时稀释倍数为1∶1000,抗肌动蛋白的抗体在使用时稀释倍数为1∶20,000。与第一抗体温育60到90分钟后,将薄膜在0.05%Tween-20/PBS中清洗3次,每次15分钟。将次级抗体用含1%牛奶的0.025%Tween-20/PBS稀释,然后与薄膜温育60-90分钟。当使用p53(Ab-6)作为第一抗体时,所使用的次级抗体是与碱性磷酸酶缀合的兔抗-小鼠IgG(Sigma),稀释倍数是1∶5000。当使用抗-eIF5A1作为第一抗体时,所使用的次级抗体是与过氧化物酶缀合的兔抗-鸡IgY(Gallus Immunotech),稀释倍数是1∶5000。与肌动蛋白抗体联用的次级抗体是与过氧化物酶缀合的山羊抗-小鼠IgM(Calbiochem),稀释倍数是1∶5000。与次级抗体温育后,将薄膜在PBS-T溶液中清洗3次。
使用ECL Plus蛋白质印迹检测试剂盒(Amersham PharmaciaBiotech)检测缀合过氧化物酶的结合抗体。简述如下,将薄膜轻轻吸干,在黑暗中与由试剂A和试剂B以40∶1的比例组成的混合溶液温育5分钟。将薄膜吸干,放在醋酸盐层之间,曝光为X射线胶片,曝光时间为10秒到30分钟不等。将薄膜浸入剥离缓冲液中[100mM2-巯基乙醇、2%SDS和62.5mM Tris-HCl(pH6.7)],并在50℃温育30分钟,从而使薄膜剥离。将薄膜用去离子水冲洗,并用大量的0.05%Tween-20/PBS溶液洗涤两次,每次10分钟。将薄膜剥离,将印迹分析重复三次。
实施例8
siRNA的构建
使用抗人eIF5A1的小的抑制RNAs(siRNAs)来抑制eIF5A1在RKO和筛板细胞中的表达。使用SilencerTmsiRNA构建试剂盒(AmbionInc.),通过体外转录生成了六个siRNAs。其中四个siRNAs是抗人eIF5A的(siRNAs#1到#4)。另外两个siRNAs用作对照;其中一个siRNA抗试剂盒中的GAPDH,另外一个siRNA(siRNA#5)是eIF5A1-特异性siRNA#1的反向序列,但是它不能靶向eIF5A1。根据制造商的说明生成上述siRNAs。简单地说,将编码预期siRNA链的DNA寡核苷酸用作模板,使用T7 RNA聚合酶,在经过T7启动子引物退火和Klenow片段补平反应之后,生成了siRNA单链。在转录反应之后,生成了有义链和反义链,这两个反应是同时进行的,将上述两种链退火,用DNA酶和RNA酶进行处理,然后进行柱纯化。用于生成siRNAs的DNA寡核苷酸(下划线部分是T7引物退火位点)的序列是:siRNA#1反义5’AAAGGAATGACTTCCAGCTGA
CCTGTCTC3’和siRNA#i有义5’AATCAGCTGGAAGTCATTCCT
CCTGTCTC3’;siRNA#2反义5’AAGATCGTCGAGATGTCTACT
CCTGTCTC3’和siRNa#2有义5’AAAGTAGACATCTCGACGATC
CCTGTCTC3’;siRNA#3反义5’AAGGTCCATCTGGTTGGTATT
CCTGTCTC3’和siRNA#3有义5’AAAATACCAACCAGATGGACC
CCTGTCTC3’;siRNA#4反义5’AATGTGTAGGAGGAGTCCAGC
CCTGTCTC3’和siRNA#4有义5’AATGTGTAGGAGGAGTCCAGC
CCTGTCTC3’;siRNA#5反义5’AAAGTCGACCTTCAGTAAGGA
CCTGTCTC3’和siRNA#5有义5’AATCCTTACTGAAGGTCGACT
CCTGTCTC3’。
使用SilencerTM siRNA标记试剂盒-FAM(Ambion)将GAPDH siRNA标记上FAM,目的是为了监测RKO和筛板细胞摄入siRNA的量。在8孔培养板上进行转染后,用PBS冲洗细胞,并用3.7%甲醛的PBS溶液固定10分钟。之后拿开培养板,加入封固剂(Vectashield),然后盖上盖玻片。在UV灯下,使用带有荧光滤光器的荧光显微镜观察摄入FAM标记的siRNA的情况。根据制造商的说明对GAPDH siRNA进行标记。
SiRNA的转染
使用与上述相同的转染方法,用siRNA转染RKO细胞和筛板细胞。在转染前一天,将RKO细胞植入8孔培养板或24孔培养板上,密度分别为每孔46,000个和105,800个。对于筛板细胞,在细胞丰度达到40-70%时实施转染,一般在实施转染前三天将筛板细胞植入8孔培养板上,每孔7500个到10,000个。将25.5皮摩尔的siRNA储备液用Opti-Mem(Sigma)稀释到终体积21.2μ1,从而制备出足够8孔培养板使用的转染培养基。将0.425μl的脂转染胺2000(Lipofectamine 2000)用Opti-Mem稀释到终体积21.2μl,并在室温下温育7到10分钟。将稀释后的脂转染胺2000混合物加入到稀释后的siRNA混合物中,并在室温下共同温育20到30分钟。用无血清的培养基将细胞冲洗一次,之后向细胞中加入135μl的无血清培养基,并覆盖上42.4μl的转染培养基。将细胞放回到生长室中4小时。温育后,向细胞中加入65μl的无血清培养基+30%FBS。在与8孔培养板上进行转染相同的条件下,在24孔板上将siRNA转染到细胞中,用于蛋白质印迹分析,不同之处仅在于将相应溶液的体积提高2.3倍。
转染后,将RKO和筛板细胞温育72小时,之后收集细胞提取物用于蛋白质印迹分析。为了检测siRNAs拮抗eIF5A1进一步阻遏细胞凋亡的有效性,将筛板细胞用50μM的喜树碱(Sigma)和10ng/ml的TNF-α(Leinco Technologies)进行处理,在转染后诱导细胞凋亡48小时或72小时。在24小时或48小时后,用Hoescht对细胞进行染色,测定经历凋亡的细胞的百分率。
实施例9
细胞凋亡的测定
在用反义寡核苷酸对筛板细胞进行转染,并用喜树碱诱导细胞凋亡之后,测定用对照反义寡核苷酸或反义寡核苷酸eIF5A1#2处理的细胞的凋亡百分率。使用两种方法来检测凋亡的筛板细胞,Hoescht染色法和DeadEndTMFluorometric TUNEL法。使用核染料,Hoescht,来标记筛板细胞的核,从而鉴定基于形态学特征,如核断裂和核凝聚的凋亡细胞。使用前,即时制备由无水甲醇和冰醋酸以3∶1的比例组成的混合物,作为固定剂。然后向生长在培养板上的细胞培养基中加入相同体积的固定剂,并温育2分钟。将培养基/固定剂混合物与细胞分离并弃去,之后向细胞中加入1ml的固定剂。5分钟后,弃去固定剂,然后向细胞中加入另外1ml固定剂,并温育5分钟。弃去固定剂,在加入1ml的Hoescht染色剂(0.5μg/ml Hoescht 33258的PBS溶液)前,将细胞风干4分钟。在黑暗中温育10分钟后,弃去染色溶液,去掉培养板各孔之间的隔板,并用去离子水清洗载玻片3次,每次1分钟。清洗后,向细胞中加入几滴McIlvain′s缓冲液(0.021M柠檬酸,0.058M Na2HPO4·7H2O;pH5.6),并盖上盖玻片。在带有UV滤光器的荧光显微镜下观察染色的细胞。将染色鲜亮或核断裂的细胞记录为凋亡细胞。每孔检查最少200个细胞。
使用DeadEndTMFluorometric TUNEL(Promega)检测DNA的断裂程度,其中DNA断裂是凋亡细胞的特征之一。在Hoescht染色之后,首先将培养板用重蒸水洗涤,然后将板浸入PBS溶液(137mM NaCl,2.68mM KCl,1.47mM KH2PO4,8.1mM Na2HPO4)中继续洗涤两次,每次5分钟,在两次洗涤之间,用纸巾将板吸干。然后将细胞浸入0.2%Triton X-100的PBS溶液中5分钟,使之渗透化。然后将板浸入PBS溶液中再次洗涤两次,每次5分钟,在两次洗涤之间用纸巾吸干。向每孔中加入25μl的平衡缓冲液[200mM二甲胂酸钾(pH6.6)、25mMTris-HCl(pH6.6)、0.2mM二硫苏糖醇、0.25mg/ml的牛血清白蛋白、和2.5mM的氯化钴],并温育5到10分钟。在平衡过程中,以每孔30μl的量制备反应混合物,反应混合物是由平衡缓冲液、核苷酸混合物[50μM荧光素-12-dUTP、100μM dATP、10μM Tris-HCl(pH7.6)和1mM的EDTA],以及末端脱氧核苷酸转移酶(Tdt,25U/μl)以45∶5∶1的比例组成的。在平衡缓冲液中温育后,每孔加入30μl的反应混合物,并盖上盖玻片。使反应在37℃下进行1小时。将板浸入2XSSC[0.3M NaCl和30mM柠檬酸钠(pH7.0)]中终止反应,并温育15分钟。然后将板浸入PBS溶液中洗涤三次,每次5分钟。用Kim海绵擦拭孔的周围去除PBS,向每孔中加入一滴封固剂(Oncogene researchproject,Ja1750-4ML),在板上盖上盖玻片。在带有UV滤光器(UV-G365,组别487902)的荧光显微镜下观察细胞,并对Hoescht染色的核进行计数。所有染色明亮或核断裂的细胞记录为凋亡细胞。然后在相同的视野下,使用荧光素滤光器(Green H546,组别48915)观察细胞,将所有带有发出绿色荧光的核的细胞记录为凋亡细胞。细胞凋亡的百分率是将在使用荧光素滤光器的情况下发出绿色荧光的核的数量除以在UV滤光器下记录的核的总数。每孔至少检查200个细胞。
蛋白的提取和蛋白质印迹分析
将转染后的RKO细胞用PBS洗涤,每孔加入40μl热的裂解缓冲液[0.5%SDS、1mM二硫苏糖醇、50mM Tris-HCl(pH8.0)],并收集蛋白用于蛋白质印迹分析。刮下细胞,并将所得提取物转移到微量离心管中,煮沸5分钟,并在20℃下贮存。使用Bio-Rad蛋白分析仪(Bio-Rad),根据制造商的说明对蛋白进行定量。
为了进行蛋白质印迹分析,将5μg的总蛋白在12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离。将分离后的蛋白转移到聚偏二氟乙烯薄膜上。然后将薄膜在封闭溶液(5%脱脂奶粉末的PBS溶液)中温育1小时,并在0.05%Tween-20/PBS溶液中清洗3次,每次15分钟。将薄膜在4℃的PBS-T溶液中贮存过夜。第二天温热到室温后,将薄膜在1μg/ml的聚乙烯醇中封闭30秒。将薄膜在去离子水中清洗5次,然后在含5%乳汁的0.025%Tween-20/PBS溶液中封闭30分钟。在与薄膜温育前,将第一抗体在含5%乳汁的0.025%Tween-20/PBS溶液中预温育30分钟。
可以使用几种第一抗体。如来源于致癌基因(Oncogene)能够识别p53(Ab-6;Oncogene)的单克隆抗体,识别人bcl-2(Oncogene)的单克隆抗体,和在鸡中制备的抗合成肽(氨基-CRLPEGDLGKEIDQKYD-羧基)的多克隆抗体(Gallus Immunotech),其中上述合成肽与人eIF5A1的c-末端同源。还可以使用一种抗-β-肌动蛋白(Oncogene)来验证蛋白的加样量是否相同。识别p53的单克隆抗体在使用时浓度为0.05μg/ml,抗bcl-2的抗体在使用时稀释倍数为1∶3500,抗eIF5A1的抗体在使用时稀释倍数为1∶1000,抗肌动蛋白的抗体在使用时稀释倍数为1∶20,000。在与第一抗体温育60到90分钟后,将薄膜在0.05%Tween-20/PBS中清洗3次,每次15分钟。将次级抗体用含1%牛奶的0.025%Tween-20/PBS稀释,然后与薄膜温育60-90分钟。当使用p53(Ab-6)作为第一抗体时,所使用的次级抗体是与碱性磷酸酶缀合的兔抗-小鼠IgG(Sigma),稀释倍数是1∶5000。当使用抗-eIF5A1作为第一抗体时,所使用的次级抗体是与过氧化物酶缀合的兔抗-鸡IgY(Gallus Immunotech),稀释倍数是1∶5000。与肌动蛋白抗体联用的次级抗体是与过氧化物酶缀合的山羊抗-小鼠IgM(Calbiochem),稀释倍数是1∶5000。与次级抗体温育后,将薄膜在PBS-T溶液中清洗3次。
使用ECL Plus蛋白质印迹检测试剂盒(Amersham PharmaciaBiotech)检测缀合过氧化物酶的结合抗体。简述如下,将薄膜轻轻吸干,在黑暗中与由试剂A和试剂B以40∶1的比例组成的混合溶液温育5分钟。将薄膜吸干,放在醋酸盐层之间,曝光为X射线胶片,曝光时间为10秒到30分钟不等。将薄膜浸入剥离缓冲液中[100mM 2-巯基乙醇、2%SDS和62.5mM Tris-HCl(pH6.7)],并在50℃温育30分钟,从而使薄膜剥离。将薄膜用去离子水冲洗,并用大量的0.05%Tween-20/PBS溶液洗涤两次,每次10分钟。将薄膜剥离,重复探测分析三次。
实施例10
HepG2 TNF-α产生的定量分析
将HepG2细胞平铺到48孔板上,每孔20,000个细胞。72小时之后,去掉上述培养基,加入新鲜的包含2.5μM对照反义寡核苷酸或包含2.5μM反义寡核苷酸eIF5A1#2的培养基。24小时之后再次加入新鲜的包含反义寡核苷酸的培养基。与寡核苷酸总共温育48小时后,用包含白介素1β(IL-β,1000pg/ml;Leinco Technologies)的培养基置换上述培养基,并温育6小时。收集培养基,冷冻(-20℃),用于TNF-α定量分析。将未处理的细胞(没有反义寡核苷酸和IL-β)和仅用IL-β处理的细胞进行平行温育,用作对照。所有处理均设定两个重复。利用ELISA分析装置(Assay Designs Inc.)根据制造商的说明,测定分泌到培养基中的TNF-α。
实施例11
下面的试验表明反义细胞凋亡因子5A核苷酸能够抑制细胞凋亡因子5A以及p53的表达。
将RKO细胞作如下处理:未转染、模拟转染、或用200nM的反义寡核苷酸eIF5A1#1、#2或#3进行转染。另外还用100nM的反义寡核苷酸eIF5A1#2对RKO细胞进行了转染。转染48小时后,将细胞用0.25μg/ml的放线菌素D进行处理。24小时后,收集细胞提取物,从每个样品中取5μg蛋白在SDS-PAGE凝胶上分离,然后转移到PVDF薄膜上,用抗eIF5A1的抗体进行蛋白质印迹分析。在用化学发光法检测之后,将薄膜剥离,再次用抗p53的抗体进行探测。在用化学发光法检测之后,再次将薄膜剥离,用抗肌动蛋白的抗体再次进行探测。参见图52,该图显示RKO细胞在用反义寡核苷酸1、2、和3(针对细胞凋亡因子5A)处理后,其产生的蛋白的水平。RKO细胞在用反义细胞凋亡因子5A核苷酸转染后,产生细胞凋亡因子5A以及p53的水平均降低。
实施例12
下面的试验表明反义细胞凋亡因子5A核苷酸能够减少细胞凋亡。
在其中一个试验中,将筛板细胞系#506作了如下处理:(A)使用寡聚转染胺转染试剂,用100nM的FITC-标记的反义寡核苷酸进行转染,或(B)将FITC-标记的反义寡核苷酸直接用无血清的培养基稀释到10μM,然后对上述细胞进行转染。24小时后,向细胞中加入新鲜的包含10%FBS和新鲜的稀释到10μM反义寡核苷酸的培养基。48小时后,将(A)和(B)处理的细胞固定,并在UV灯下,使用带有荧光滤光器的荧光显微镜进行观察。图53显示了细胞摄入荧光标记的反义寡核苷酸的情况。
在另外一个试验中,用10μM的对照反义寡核苷酸或反义寡核苷酸eIF5A1#2对筛板细胞系#506进行了转染,该试验总共进行了4天时间。从开始用反义寡核苷酸处理算起,经过48小时后,用20μM或40μM的喜树碱处理细胞48小时。每天更换反义寡核苷酸和含有喜树碱的培养基。用Hoescht和TUNEL标记细胞,测定细胞凋亡的百分率。参见图54。
在另外一个试验中,用10μM的对照反义寡核苷酸或反义寡核苷酸eIF5A1#2对筛板细胞系#506进行了转染。24小时后,更换培养基,并加入新鲜的反义寡核苷酸。从开始用反义寡核苷酸处理算起,经过48小时后,去掉反义-寡核苷酸,并用20μM的喜树碱处理细胞3天。每天更换含有喜树碱的培养基。用Hoescht和TUNEL标记细胞,测定细胞凋亡的百分率。参见图55。
在另外一个试验中,用1μM的对照反义寡核苷酸或反义寡核苷酸eIF5A1#2对筛板细胞系#517进行了转染,该试验总共进行了5天时间。从开始用反义寡核苷酸处理算起,经过48小时后,用20μM的喜树碱处理细胞3天或4天。每天更换反义寡核苷酸和含有喜树碱的培养基。用Hoescht和TUNEL标记细胞,测定细胞凋亡的百分率。参见图56。
在另外一个试验中,用2.5μM的对照反义寡核苷酸或反义寡核苷酸eIF5A1#2对筛板细胞系#517进行了转染,该试验总共进行了5天时间。从开始用反义寡核苷酸处理算起,经过48小时后,用40μM的喜树碱处理细胞3天。每天更换反义寡核苷酸和含有喜树碱的培养基。用Hoescht和TUNEL标记细胞,测定细胞凋亡的百分率。参见图57。
在另外一个试验中,用1μM或2.5μM的对照反义寡核苷酸或反义寡核苷酸eIF5A1#2对筛板细胞系#517进行了转染,该试验总共进行了5天时间。从开始用反义寡核苷酸处理算起,经过48小时后,用40μM的喜树碱处理细胞3天。每天更换反义寡核苷酸和包含喜树碱的培养基。用Hoescht和TUNEL标记细胞,测定细胞凋亡的百分率。参见图58。
在另外一个试验中,对筛板细胞系#517作如下处理:未处理、用10ng/ml的TNF-α处理、用50μM的喜树碱处理、用10ng/ml TNF-α和50μM喜树碱的组合处理。用Hoescht标记细胞,测定细胞凋亡的百分率。参见图59。
在另外一个试验中,用2.5μM或5μM的对照反义寡核苷酸或反义寡核苷酸eIF5A1#2对筛板细胞系#506和#517进行了转染,该试验总共进行了2天的时间。在24小时后,加入新鲜的含有反义寡核苷酸的培养基。从开始用反义寡核苷酸处理算起,经过48小时后,用50μM的喜树碱和10ng/ml的TNF-α处理细胞2天。用Hoescht标记细胞,测定细胞凋亡的百分率。参见图60。
在另外一个试验中,用2.5μM的对照反义寡核苷酸或反义寡核苷酸eIF5A1#2对筛板细胞系#506、#517和#524进行了转染,该试验总共进行了2天的时间。在24小时后,加入新鲜的含有反义寡核苷酸的培养基。从开始用反义寡核苷酸处理算起,经过48小时后,用50μM的喜树碱和10ng/ml的TNF-α处理细胞2天。用Hoescht标记细胞,测定细胞凋亡的百分率。参见图61。
实施例13
下面的试验表明,用靶向细胞凋亡因子5A的siRNAs转染的细胞,其表达细胞凋亡因子5A的量降低。该试验还表明靶向细胞凋亡因子5A的siRNAs能够减少细胞凋亡。
在其中一个试验中,使用脂转染胺2000转染试剂,分别在存在血清(A)或不存在血清(B)的转染条件下,用100nM的FAM-标记siRNA对筛板细胞系#517进行了转染。24小时后,将(A)和(B)处理的细胞固定,并在UV灯下,用带有荧光滤光器的荧光显微镜观察。参见图62。
在另外一个试验中,在存在血清或不存在血清的转染条件下,用100nm的siRNA转染RKO细胞。转染了六个siRNNs,其中两个是对照siRNAs(一个是siRNA#5,另一个是靶向GAPDH的siRNA),另外四个是靶向eIF5A1(siRNA#1到#4)的siRNAs。转染72小时后,收集细胞提取物,并从每个样品中,取5μg的蛋白在SDS-PAGE凝胶上分离,然后转移到PVDF薄膜上,并用抗eIF5A1的抗体进行蛋白质印迹分析。在进行了化学发光检测之后,将薄膜剥离,并用抗bcl-2的抗体再次进行探测。在经过了再次化学发光检测之后,将薄膜再次剥离,并用抗肌动蛋白的抗体进行再次探测。参见图63。
在另外一个试验中,用100nM的siRNA转染筛板细胞系#506和#517。共转染了六个siRNAs,其中两个是对照siRNAs(一个是siRNA#5,另一个是靶向GAPDH的siRNA),另外四个是靶向eIF5A1(siRNA#1到#4)的siRNAs。转染72小时后,收集细胞提取物,并从每个样品中,取5μg的蛋白在SDS-PAGE凝胶上分离,然后转移到PVDF薄膜上,并用抗eIF5A1的抗体进行蛋白质印迹分析。在进行了化学发光检测之后,将薄膜剥离,并用抗肌动蛋白的抗体进行再次探测。参见图64。
在另外一个试验中,用100nM的siRNA转染筛板细胞系#506。共转染了六个siRNAs,其中两个是对照siRNAs(一个是siRNA#5,另一个是靶向GAPDH的siRNA),另外四个是靶向eIF5A1(siRNA#1到#4)的siRNAs。转染48小时后,用含有50μM喜树碱和10ng/ml TNF-α的培养基置换原有的培养基。24小时后,用Hoescht标记细胞,测定细胞凋亡的百分率。参见图65。
在另外一个试验中,用100nM的siRNA转染筛板细胞系#506。共转染了六个siRNAs,其中两个是对照siRNAs(一个是siRNA#5,另一个是靶向GAPDH的siRNA),另外四个是靶向eIF5A1(siRNA#1到#4)的siRNAs。转染72小时后,用含有50μM喜树碱和10ng/mlTNF-α的培养基置换原有的培养基。24小时后,用Hoescht标记细胞,测定细胞凋亡的百分率。参见图66。
在另一试验中,对筛板细胞系#506未处理,或用100nm的siRNA转染。共转染了六个siRNAs,其中两个是对照siRNAs(一个是siRNA#5,另一个是靶向GAPDH的siRNA),另外四个是靶向eIF5A1(siRNA#1到#4)的siRNAs。转染72小时后,用含有50μM喜树碱和10ng/ml TNF-α的培养基置换原有的培养基。在未转染、未处理的对照细胞中也加入新鲜的培养基。48小时后,用Hoescht标记细胞,测定细胞凋亡的百分率。参见图67。
来自本试验的,用siRNA转染并用喜树碱和TNF-c处理的筛板细胞系#506的Hoescht染色图片记载在图67和实施例13中。参见图68。
实施例14
本实施例表明用抗细胞凋亡因子5A的反义寡核苷酸处理人细胞系能够使细胞产生更少的TNF-α。
用2.5μM的对照反义寡核苷酸或反义寡核苷酸eIF5A1#2处理HepG2细胞,该试验进行了总共2天的时间。24小时后,加入新鲜的含有反义寡核苷酸的培养基。一部分细胞在2天内未作处理。从开始处理算起,经过48小时后,将细胞用含有IL-β(1000pg/ml)的新鲜培养基处理6小时。最后,收集培养基,并冷冻(-20℃),用于TNF-α定量分析。使用购买自Assay Designs Inc.的ELISA分析仪测定分泌到培养基中的TNF-α。参见图69。
实施例15
用抗eIF5A1的siRNA或用具有反向序列的对照siRNA转染HT-29细胞(人结肠腺癌)。所使用的siRNA如下:
位点690(3’UTR)%G/C=48
5’AAGCUGGACUCCUCCUACACA 3’
所使用的对照siRNA如下:
%G/C=39
5’AAACACAUCCUCCUCAGGUCG 3’
48小时后,用干扰素-γ(IFN-γ)处理细胞16小时。16小时后,用新鲜的培养基洗涤细胞,并用脂多糖(LPS)处理8或24小时。在上述每一时间点上(8或24小时),将细胞培养基与细胞分离,冷冻培养基,并用ELISA定量测定存在于培养基中的TNF-α。同时收集细胞裂解液,定量蛋白,将TNF-α的值校正为pg/mg蛋白(校正不同孔中由于细胞数目的不同而造成的差异)。蛋白质印迹和ELISA结果显示在图74A和B中。图75是同类试验的结果,不同之处在于细胞的密度较大。
实施例16
U-937细胞系的组织培养条件
U-937是一种人单细胞系,能够悬浮培养,并在PMA的刺激下能够贴壁,并分化为巨噬细胞(该细胞系的ATCC保藏号为CRL-1593.2)(细胞不是直接从ATCC获得的)。在37℃CO2(5%)培养箱中,将细胞用RPMI1640培养基保存,其中上述培养基中添加了2mM的L-谷氨酰胺、1.5g/L的碳酸氢钠、4.5g/L的葡萄糖、10mM的HEPES、1.0mM的丙酮酸钠和10%的胎牛血清。每周两次将细胞分散到新鲜的培养基中(1∶4或1∶5的分散比例),使细胞密度一直保持在105到2×106细胞/ml之间。细胞悬浮培养使用的是组织培养塑料T-25瓶,进行试验使用的是24孔板。
试验的时间进程
在开始试验前两天,将细胞密度调整到3×105细胞/ml培养基。在试验的当天,收集对数生长期的细胞。将细胞悬浮液转移到15ml的试管中,室温下400xg离心10分钟。吸去上清液,用新鲜的培养基将细胞团进行洗涤并重悬浮。将细胞再次400xg离心10分钟,吸去上清液,最后将细胞团重悬浮在新鲜的培养基中。将等体积的细胞悬浮液和锥虫蓝溶液(0.4%锥虫蓝的PBS溶液)混合,使用血细胞计数器和显微镜对活细胞进行计数。将细胞稀释到4×105细胞/ml。
向24孔板的每个孔加入PMA或DMSO(溶剂对照)。向每个孔中加入1ml细胞悬浮液,使每个孔含有400,000个细胞、0.1%DMSO+/-162nMPMA。将细胞保存在37℃ CO2培养箱中。在不同的时间点,0、24、48、72、96、99和102小时,分别收集各孔中的细胞。参见图76,该图显示了该试验各时间点的综合结果以及加成结果。
在72小时时,更换培养基。因为有些细胞是贴壁的,有些是悬浮的,因此要小心不要使贴壁细胞破裂。小心将每个孔中的培养基转移到相应的微量离心管中,在14,000xg离心3分钟。吸出上清液,将细胞团重悬浮在新鲜的培养基中(1ml,(-)DMSO,(-)PNA),并放回到原来的孔中。在不含PMA的新鲜培养基中,细胞进入静止状态。在96小时时,加入LPS(100ng/ml),并在3小时和6小时后(即99小时时和102小时时),收集细胞。
在不同的时间点上,将每个孔中悬浮的细胞和培养基转移到微量离心管中。在14,000xg离心3分钟,得到细胞团。将培养基(上清液)转移到洁净的试管中,并在-20℃下贮存,用于ELISA/细胞因子分析。将每孔中剩余的细胞(即贴壁细胞)用PBS(1ml,37℃)洗涤,并使用上述PBS溶液洗涤相应微量离心管中的细胞团。在14,000xg下离心3分钟,重新得到细胞团。用煮沸的裂解缓冲液(50mN TrispH7.4和2%的SDS)将细胞裂解。将每孔中的贴壁细胞和悬浮细胞合到一起。将样品煮沸,然后在-20℃贮存。
蛋白质印迹分析
使用BCA(bicinchoninic acid)方法,以BSA(牛血清白蛋白)为标准蛋白,测定每孔样品的蛋白浓度。将蛋白样品(5μg总蛋白)经过12%的SDS-PAGE电泳进行分离,并转移到PVDF薄膜上。将薄膜用聚乙烯醇(1μg/ml,30秒)和5%脱脂牛奶的PBS-t溶液进行封闭(1小时)。以小鼠抗-人eIF-5A的单克隆抗体(BD Biosciencescat#611976;以1∶20,000的比例用5%的脱脂牛奶稀释,1小时)为探针探测薄膜。将薄膜用PBS-t溶液洗涤3次,每次10分钟。所使用的次级抗体是山葵过氧化物酶缀合的抗-鼠抗体(Sigma,以1∶5000的比例用1%的脱脂牛奶稀释,1小时)。将薄膜在PBS-t溶液中清洗3次,每次10分钟。利用化学发光法观察蛋白条带(ECL检测系统,Amersham Pharmacia Biotech)。
为了验证每个凝胶泳道的蛋白加样量相同,将薄膜剥离,探测肌动蛋白的含量。如上所述对薄膜进行剥离(100mM 2-巯基乙醇、2%SDS、62.5 mM Tris-HCl pH6.7;50℃30分钟)、洗涤和封闭。用肌动蛋白第一抗体(肌动蛋白单克隆抗体是在小鼠中制备的;Oncogene,Ab-1;以1∶20,000的比例用5%的脱脂牛奶稀释)对薄膜进行探测。次级抗体、洗涤和检测的过程与上述相同。
图77显示eIF5A在单核细胞(U-397)分化过程中表达上调,并随后分泌出TNF-α。
实施例17:eIF5A的siRNA抑制了IL-8对干扰素-γ的应答。
用抗细胞凋亡eIF5A的siRNA转染HT-29(人结肠腺癌)细胞。转染大约48小时后,更换培养基,使一些测试样品的培养基含有干扰素-γ,一些样品的培养基不含干扰素-γ。在加入干扰素-γ后16小时,洗涤细胞,将含有TNF-α或不含TNF-α的培养基放置在细胞上。8或24小时后,收集培养基(用于IL-8的ELISA检测)和细胞裂解液。
图79和80表明细胞在应答TNF-α和干扰素时,产生了IL-8。在TNF处理前,用干扰素-γ引导细胞,导致细胞比单独用TNF处理产生更多的IL-8。这可以是因为TNF受体1在应答干扰素时表达上调,因此用干扰素“引导”细胞能够使细胞对TNF的应答更为强烈,因为细胞有了更多受体。然而抗eIF5A的siRNA并不能影响IL-8对单独TNF的应答(以前的试验),但是siRNA却阻遏了几乎所有IL-8对干扰素的应答,以及大部分的IL-8对干扰素和TNF组合的应答。上述结果表明通过使用抗细胞凋亡eIF-5A的siRNAs,本发明人发现存在通向IL-8的干扰素信号途径,而不存在TNF途径。图81是蛋白质印迹结果,表明HT-29细胞在应答干扰素-γ时,细胞凋亡eIF5A的表达上调。
实施例18
人筛板细胞的培养
试验所用的成对人眼来自于加拿大(Ontario Division)的眼库,是死后48小时内的人眼。取下视神经头(带有附着极),将其置于Dulbecco′s改良Eagle′s培养基(EMEM)中3小时,其中该培养基中添加了抗生剂/抗真菌剂、谷氨酰胺、和10%的FBS。从每个组织样品中,找到视神经头(ONH)扣状体,用细小的解剖剪将其剪成四小块。将外植体置于盛有DMEM培养基的12.5cm2塑料培养瓶中培养。在一个月内就能够看到存活外植体的生长。当细胞丰度达到95%时,用胰蛋白酶消化,并进行分化传代培养,产生筛板(LC)和单核细胞群。将LC细胞在带有DMEM培养基的25cm2培养瓶中进行传代培养,其中在培养基中添加了庆大霉素、谷氨酰胺和10%的FBS。根据上述方案保存细胞和进行传代培养。
从分化传代培养体系中获取细胞群,然后在8孔培养板上使用不同的荧光抗体进行染色,用于鉴别上述细胞群的种类,以及细胞群的纯度。将细胞在10%福尔马林溶液中固定,并用Dulbecco′s磷酸盐缓冲液(DPBS)冲洗三次。用2%的脱脂牛奶DPBS溶液进行封闭,将抗体用1%的BSA DPBS溶液稀释,并加到其中6个孔的细胞中。剩余的两个孔仅用1%的牛血清白蛋白(BSA)溶液和次级抗体进行处理,作为对照。将细胞和第一抗体在室温下温育1小时,然后用DPBS洗涤三次。将合适的次级抗体用1%BSA的DPBS溶液稀释,加到每个孔中,并温育1小时。在用DPBS洗涤后,将培养板用水洗涤,然后使之风干,并覆盖上荧光封固剂(Fluoromount,Vector Laboratories)。在带有合适滤光器的荧光显微镜下观察免疫荧光染色,并与没有用第一抗体处理的对照孔相比较。除非另有说明,所有的第一抗体均购自Sigma公司。所有的次级抗体均购自Molecular Probes。用于鉴别LC细胞的第一抗体是:抗-胶原蛋白I、抗-胶原蛋白IV、抗-层粘连蛋白、抗-细胞纤连蛋白、抗-胶质细胞原纤维蛋白(GFAP)和抗-α-平滑肌动蛋白。如果胶原蛋白I、胶原蛋白IV、层粘连蛋白、细胞纤连蛋白、α-平滑肌动蛋白染色呈阳性,和胶质细胞原纤维蛋白(GFAP)染色呈阴性,则该细胞群鉴定为包含LC细胞。在此项研究中,培养了两组人眼。从视神经头建立了LC细胞系#506和#507,其中视神经头分别来自一位83岁男性和一位17岁男性。对上述所有LC细胞系进行了鉴定,发现其所包含的LC细胞的数量高于90%。
LC细胞的处理
使用50μM喜树碱(Sigma)和10ng/ml TNF-α的组合诱导筛板细胞凋亡。发现50μM喜树碱(Sigma)和10ng/ml TNF-α的组合在诱导细胞凋亡方面比单独使用喜树碱或TNF-α更加有效。
SiRNAs的构建和转染
使用抗人eIF5A1的小的抑制RNAs(siRNAs)来抑制eIF5A1在筛板细胞中的表达。使用SilencerTmsiRNA构建试剂盒(Ambion Inc.),通过体外转录生成了六个siRNAs。其中四个siRNAs是抗人eIF5A1的(siRNAs#1到#4)。另外两个siRNAs用作对照;其中一个siRNA抗试剂盒中的GAPDH,另外一个siRNA(siRNA#5)是eIF5A1-特异性siRNA#1的反向序列,但是它不能靶向eIF5A1。根据制造商的说明生成上述siRNAs。eIF5A和对照siRNA的序列如下:siRNA#15’AAAGGAATGACTTCCAGCTGA 3’;siRNA#2 5’AAGATCGTCGAGATGTCTACT3’;siRNA#3 5’AAGGTCCATCTGGTTGGTATT 3’;siRNA#4 5’AAGCTGGACTCCGCCGACACA 3’;siRNA#5 5’AAAGTCGACCTTCAGTAAGGA3’。使用脂转染胺2000,用siRNA转染筛板细胞。在细胞丰度达到40-70%时,对筛板细胞实施转染,一般在实施转染前三天将筛板细胞植入8孔培养板上,每孔7500个。将25.5皮摩尔的siRNA储备液用Opti-Mem(Sigma)稀释到终体积21.2μl,从而制备出足够8孔培养板使用的转染培养基。将0.425μl的脂转染胺2000(Lipofectamine2000)用Opti-Mem稀释到终体积21.2μl,并在室温下温育7到10分钟。将稀释后的脂转染胺2000混合物加入到稀释后的siRNA混合物中,并在室温下共同温育20到30分钟。用无血清的培养基将细胞冲洗一次,之后向细胞中加入135μl的无血清培养基,并覆盖上42.4μl的转染培养基。将细胞放回到生长室中4小时。温育后,向细胞中加入65μl的无血清培养基+30%FBS。在与8孔培养板上进行转染相同的条件下,在24孔板上将siRNA转染到细胞中,用于蛋白质印迹分析,不同之处仅在于将相应溶液的体积提高2.3倍。
转染后,将筛板细胞温育72小时,之后用50μM喜树碱(Sigma)和10ng/ml TNF-α(Leinco Technologies)进行处理,诱导细胞凋亡。然后,收集细胞裂解液用于蛋白质印迹分析,或检测细胞的凋亡情况。
凋亡细胞的检测
在用TNF-α和喜树碱处理24小时后,用Hoescht33258对转染细胞进行染色,以测定细胞的凋亡百分率。首先,以无水甲醇和冰醋酸以3∶1的比例组成的混合物作为固定剂,固定细胞,然后与Hoescht染料(0.5μg/ml Hoescht33258的PBS溶液)温育。在黑暗中温育10分钟后,弃去染色溶液,去掉培养板各孔之间的隔板,并用去离子水清洗载玻片3次,每次1分钟。清洗后,向细胞中加入几滴McIlvain′s缓冲液(0.021M柠檬酸,0.058M Na2HPO4·7H2O;pH5.6),并盖上盖玻片。在带有UV滤光器的荧光显微镜下观察染色的细胞。将染色鲜亮或核断裂的细胞记录为凋亡细胞。每孔检查最少200个细胞。同时还使用DeadEndTMFluorometric TUNEL(Promega)来检测DNA的断裂程度,其中DNA断裂是凋亡细胞的特征之一。在Hoescht染色之后,首先将培养板用重蒸水洗涤,然后将板浸入PBS溶液(137mM NaCl,2.68mM KCl,1.47mM KH2PO4,8.1mM Na2HPO4)中继续洗涤两次,每次5分钟,在两次洗涤之间,用纸巾将板吸干。然后将细胞浸入0.2%Triton X-100的PBS溶液中5分钟,使之渗透化。然后将板浸入PBS溶液中再次洗涤两次,每次5分钟,在两次洗涤之间用纸巾吸干。向每孔中加入25μl的平衡缓冲液[200mM二甲胂酸钾(pH6.6)、25mMTris-HCl(pH6.6)、0.2mM二硫苏糖醇、0.25mg/ml的牛血清白蛋白、和2.5mM的氯化钴],并温育5到10分钟。在平衡过程中,以每孔30μl的量制备反应混合物,反应混合物是由平衡缓冲液、核苷酸混合物[50μM荧光素-12-dUTP、100μM dATP、10μM Tris-HCl(pH7.6)和1mM的EDTA],以及末端脱氧核苷酸转移酶(Tdt,25U/μl)以45∶5∶1的比例组成的。在平衡缓冲液中温育后,每孔加入30μl的反应混合物,并盖上盖玻片。使反应在37℃黑暗中进行1小时。将板浸入2×SSC[0.3M NaCl和30mM柠檬酸钠(pH7.0)]中终止反应,并温育15分钟。然后将板浸入PBS溶液中洗涤三次,每次5分钟。用Kim海绵擦拭孔的周围去除PBS,向每孔中加入一滴封固剂(Oncogeneresearch project,Ja1750-4ML),在板上盖上盖玻片。在带有UV滤光器(UV-G365,组别487902)的荧光显微镜下观察细胞,并对Hoescht染色的核进行计数。所有染色明亮或核断裂的细胞记录为凋亡细胞。然后在相同的视野下,使用荧光素滤光器(Green H546,组别48915)观察细胞,将所有带有绿色荧光的核的细胞记录为凋亡细胞。细胞凋亡的百分率是将在使用荧光素滤光器的情况下发出绿色荧光的核的数量除以在UV滤光器下记录的核的总数。每孔至少检查200个细胞。
蛋白提取和蛋白质印迹分析
将生长在24孔板上的筛板细胞用PBS(8g/L NaCl、0.2g/LKCl、1.44g/L Na2HPO4和0.24g/L KH2PO4)洗涤,然后加入50μl的裂解缓冲液[0.5%SDS、50mM Tris-HCl(pH8.0)],并收集蛋白用于蛋白质印迹分析。将细胞裂解液收集到微量离心管中,煮沸5分钟,并在20℃下贮存备用。为了进行蛋白质印迹分析,将5μg的总蛋白在12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离。将分离后的蛋白转移到聚偏二氟乙烯薄膜上。然后将薄膜在封闭溶液(5%脱脂奶粉末、0.02%叠氮化钠的PBS溶液)中温育1小时,并在PBS-T(PBS+0.05%Tween-20)溶液中清洗3次,每次15分钟。将薄膜在4℃的PBS-T溶液中贮存过夜。第二天温热到室温后,将薄膜在1μg/ml的聚乙烯醇中封闭30秒。将薄膜在去离子水中清洗5次,然后在含5%乳汁的PBS溶液中封闭30分钟。在与薄膜温育前,将第一抗体在含5%乳汁的PBS溶液中预温育30分钟。所使用的第一抗体是抗-eIF5A(BD TransductionLaboratories)的抗体(稀释比例是1∶20,000)和抗-β-肌动蛋白的抗体(Oncogene)。将薄膜在PBS-T溶液中清洗三次,然后与合适的HRP缀合的次级抗体温育1小时,其中次级抗体预先用含1%牛奶的PBS溶液稀释。清洗印迹,然后使用ECL Plus蛋白质印迹检测试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech)检测过氧化酶缀合的结合抗体。
结果
从年龄为83岁(#506)到17岁(#517)的男性志愿者中,获取视神经头,由此建立了两个筛板(LC)细胞系。从人筛板分离得到的细胞与其它研究所观察到的细胞(Lamber等,2000)形态相同,即细胞宽而平,且具有明显的细胞核。此外表现出与其它细胞群一致的特征,即LC细胞能够对α平滑肌动蛋白(图82a)以及多个胞外基质蛋白,包括细胞纤连蛋白(图82b)、层粘连蛋白(图82c)、胶原蛋白I、和胶原蛋白IV(数据未示出)表现出免疫反应性(Clark等,1995;Hernandez等,1998;Hernandez和Yang,2000;Lambert等,2001)。同时还观察到LC细胞能够与抗-胶质细胞原纤维蛋白(GFAP)表现出阴性免疫反应性,这与以前的发现也是一致的(图82d)(Lambert等,2001)。上述发现证明所分离的细胞是LC细胞,而不是视神经头单核细胞。
因为人们认为TNF-α在青光眼发生过程中起着重要的作用,因此检测了LC细胞对TNF-α细胞毒性的敏感性。将融合的LC细胞用喜树碱、TNF-α、或喜树碱和TNF-α的组合处理48小时(图83)。Hoescht染色结果显示单独使用TNF-α时,表现不出对LC细胞的毒性。用喜树碱处理导致大约30%的LC细胞死亡。然而,当用喜树碱和TNF-α的组合处理LC细胞时,发现其对于细胞凋亡具有协同增加的作用,在48小时内导致45%的LC细胞死亡。上述结果显示LC细胞在用喜树碱引发细胞凋亡的情况下,能够对TNF-α的细胞毒性作出应答。
EIF5A是一种核质穿梭蛋白,已知其对于细胞分裂来说是必需的,另外最近的研究表明其还与细胞凋亡有关。发明人使用喜树碱或喜树碱与TNF-α的组合诱导LC细胞经历细胞凋亡,检测了eIF5A蛋白在凋亡的LC细胞中的表达。用喜树碱处理不能显著改变eIF5A的表达,或许只有微量的减少(图84A)。但是在用喜树碱和TNF-α的组合处理细胞8和24小时后,发现eIF5A蛋白的表达显著上调(图84B)。上述结果表明eIF5A的表达尤其是受TNF-α的诱导,而且该表达与细胞凋亡的诱导有关。这表明在细胞凋亡途径中,eIF5A所起的作用位于TNF-α受体结合的下游。
为了检测eIF5A的表达在TNF-α诱导LC细胞凋亡过程中的重要性,设计并在体外转录合成了四个靶向eIF5A的siRNAs(siRNAs#1到#4)。为了检测siRNAs在抑制eIF5A蛋白表达方面的效果,将LC细胞系#506和#517用每个siRNAs进行了转染,并在72小时后检测了细胞裂解液中eIF5A蛋白的表达(图85)。作为比较,还用抗GAPDH的siRNA和/或对照siRNA(siRNA#5)对细胞进行了转染,其中对照siRNA与siRNA#1具有相同的化学成分,只是不能识别eIF5A而已。在上述两个细胞系中,所有的抗eIF5A的siRNAs均能显著抑制eIF5A的表达(图85)。用GAPDH的siRNA作为另外一个对照的原因是:它不象siRNA#5一样,仅仅具有siRNA#1的反向序列而没有细胞靶位,GAPDH的siRNA是一种活性siRNA,其能够抑制相应靶蛋白即GAPDH的表达(数据未示出)。所有四个抗eIF5A的siRNAs还能够使转染的LC细胞(#506)避免用TNF-α和喜树碱处理24小时而诱导的细胞凋亡(图86)。使用Hoescht染色方法检测细胞死亡情况,发现上述四个siRNAs(siRNAs#1到#4)减少LC细胞凋亡的程度分别为59%(siRNA#1)、35%(siRNA#2)、50%(siRNA#3)、和69%(siRNA#4)。有趣的是,抗GAPDH的siRNA也能够将LC细胞凋亡的程度降低42%(图86)。已知GAPDH除了作为一种糖酵解酶外,还具有细胞功能,包括在小脑神经元凋亡过程中的提呈功能(Ishitani和Chuang;1996;Ishitani等,1996a;Ishitani等,1996b)。在一个类似试验中,发明人还证明siRNA#1能够减少LC细胞系#517在应答TNF-α和喜树碱时的细胞凋亡53%,这表明eIF5A的siRNAs对分离自不同视神经头的LC细胞均具有保护作用(图87)。上述结果表明eIF5A确实在LC细胞凋亡过程中起着作用,有可能是通向TNF-α-诱导的细胞凋亡途径的重要中间体。
为了确定在用TNF-α和喜树碱处理时LC细胞的死亡是典型的细胞凋亡,发明人使用脱氧核苷酸末端转移酶介导的dUTP-洋地黄毒苷切口端标记(TUNEL)方法对DNA断裂情况进行了原位评估。用eIF5AsiRNA(siRNA#1)或对照siRNA(siRNA#5)对LC细胞(#506)进行转染,3天后,将LC细胞(#506)用TNF-α和喜树碱处理24小时。另外使用Hoescht对细胞进行染色,以使核更加清晰。在用对照siRNA转染的LC细胞中,有46%的细胞在用TUNEL染色时呈现阳性,而用eIF5A siRNA#1转染的LC细胞中,仅有8%的细胞呈现阳性标记,这表明eIF5A siRNA能够使细胞避免大于80%的细胞凋亡(图88)。用eIF5A siRNA#4转染也取得了相似的结果,其相对于对照siRNA来说,能够使细胞避免大于60%的细胞凋亡(数据未示出)。
Claims (36)
1.一种降低细胞内细胞因子水平的方法,包含施用一种能够降低细胞凋亡因子5A1表达的试剂,其中细胞凋亡因子5A1表达的降低使所述细胞因子的表达降低,从而降低了细胞内该细胞因子的水平。
2.权利要求1的方法,其中所述细胞因子是促炎细胞因子。
3.权利要求2的方法,其中所述细胞因子是IL-1、IL-18、IL-6或TNF-α。
4.权利要求1的方法,其中所述试剂包含其序列互补于细胞凋亡因子5A1的反义核苷酸。
5.权利要求1的方法,其中所述试剂包含其序列互补于细胞凋亡因子5A1的siRNA。
6.权利要求4的方法,其中所述反义核苷酸具有选自SEQ IDNO:*6、*7和*8的序列。
7.权利要求4的方法,其中所述反义核苷酸能够在高度严格条件下与选自SEQ ID NO:*6、*7和*8的序列杂交。
8.权利要求5的方法,其中所述siRNA具有选自SEQ ID NO:*1、*2、*3、*4和*5的序列。
9.权利要求5的方法,其中所述siRNA能够在高度严格条件下与选自SEQ ID NO:*1、*2、*3、*4和*5的序列杂交。
10.具有选自SEQ ID NO:*6、*7和*8的序列的多核苷酸。
11.具有选自SEQ ID NO:*1、*2、*3、*4和*5的序列的siRNA。
12.一种降低p53表达的方法,包含施用一种能够降低细胞凋亡因子5A表达的试剂,其中细胞凋亡因子5A1表达的下降使p53的表达降低。
13.一种提高Bc1-2表达的方法,包含施用一种能够降低细胞凋亡因子5A表达的试剂,其中细胞凋亡因子5A1表达的下降使p53的表达提高。
14.一种对于需要降低TNF-α水平的患者,降低其体内TNF-α水平的方法,包含给所述患者施用权利要求6或7所述的反义多核苷酸。
15.一种对于需要降低TNF-α水平的患者,降低其TNF-α水平的方法,包含给所述患者施用权利要求8或9所述的siRNA。
16.一种治疗特征在于IL-1、TNF-α或IL-6水平升高的病理状况的方法,包含给具有上述病理状况的哺乳动物施用一种试剂,以降低因子5A1的表达。
17.权利要求16的方法,其中所述病理状况选自类风湿性关节炎和骨关节炎、哮喘、过敏、动脉炎、克罗恩病、炎性肠病、溃疡性结肠炎、冠心病、囊性纤维化病、糖尿病、狼疮、多发性硬化、格雷夫斯病、牙周炎、青光眼和视网膜黄斑变性、包括圆锥形角膜在内的眼表疾病、器官缺血性心脏病、肾病、再灌注损伤、脓毒症、多发性骨髓瘤、器官移植排斥反应、牛皮癣和湿疹。
18.权利要求1的方法,其中所述细胞是上皮细胞。
19.一种抑制或消除单核细胞分化的方法,该方法包含施用一种能够降低细胞凋亡因子5A1表达的试剂,其中上述细胞凋亡因子5A1表达的降低能够抑制或消除单核细胞的分化。
20.权利要求19的方法,其中所述试剂包含其序列互补于细胞凋亡因子5a1的反义核苷酸。
21.权利要求19的方法,其中所述试剂包含其序列互补于细胞凋亡因子5a1的siRNA。
22.权利要求20的方法,其中所述反义核苷酸具有选自SEQ IDNO:*6、*7和*8的序列。
23.权利要求20的方法,其中所述反义核苷酸能够在高度严格条件下与选自SEQ ID NO:*6、*7和*8的序列杂交。
24.权利要求21的方法,其中所述siRNA具有选自SEQ ID NO:*1、*2、*3、*4和*5的序列。
25.权利要求21的方法,其中所述siRNA能够在高度严格条件下与选自SEQ ID NO:*1、*2、*3、*4和*5的序列杂交。
26.一种预防患青光眼的眼中视网膜神经节细胞死亡的方法,所述方法包含抑制细胞凋亡-特异性eIF-5A1在视网膜神经节细胞中的表达。
27.权利要求26的方法,其中抑制细胞凋亡-特异性eIF5A1的表达包含给所述视网膜神经节细胞施用反义寡核苷酸,其中所述反义寡核苷酸靶向人细胞凋亡-特异性eIF5A1。
28.权利要求27的方法,其中所述反义寡核苷酸是SEQ ID NO:26或27。
29.权利要求28的方法,其中所述反义寡核苷酸是SEQ ID NO:26或是在严格条件下与SEQ ID NO:26的互补序列杂交的寡核苷酸。
30.权利要求28的方法,其中所述反义寡核苷酸是SEQ ID NO:27或是在严格条件下与SEQ ID NO:27的互补序列杂交的寡核苷酸。
31.一种抑制细胞凋亡-特异性eIF5A1在筛板细胞中表达的方法,该方法包含用靶向人细胞凋亡-特异性eIF5A1的反义寡核苷酸转染筛板细胞,其中所述反义寡核苷酸能够抑制细胞凋亡-特异性eIF5A1在所述细胞中的表达。
32.权利要求31的方法,其中所述筛板细胞是人的筛板细胞。
33.权利要求31的方法,其中所述反义寡核苷酸是SEQ ID NO:26或是在严格条件下与SEQ ID NO:26的互补序列杂交的寡核苷酸。
34.权利要求31的方法,其中所述反义寡核苷酸是SEQ ID NO:27或是在严格条件下与SEQ ID NO:27的互补序列杂交的寡核苷酸。
35.一种抑制细胞凋亡-特异性eIF5A1在星形细胞中表达的方法,该方法包含用靶向人细胞凋亡-特异性eIF5A1的反义寡核苷酸转染星形细胞,其中所述反义寡核苷酸能够抑制细胞凋亡-特异性eIF5A1在所述细胞中的表达。
36.权利要求35的方法,其中所述星形细胞是人的星形细胞。
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