JP5666074B2 - 抗炎症療法としての、アンチセンス・オリゴヌクレオチドとsiRNAを用いてアポトーシス特異的eIF−5A(“eIF−5A”)の阻害 - Google Patents
抗炎症療法としての、アンチセンス・オリゴヌクレオチドとsiRNAを用いてアポトーシス特異的eIF−5A(“eIF−5A”)の阻害 Download PDFInfo
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Description
本発明は、アポトーシス特異的真核生物開始因子(“eIF-5A”)(“アポトーシス特異的eIF-5A”または“eIF-5A1”とも呼ばれる)と、デオキシハイプシン・シンターゼ(DHS)に関する。本発明は、アポトーシス特異的eIF-5AとDHSの核酸およびポリペプチド、ならびにアポトーシス特異的eIF-5AとDHSの発現を阻止する方法に関する。
アポトーシスは遺伝的にプログラムされた細胞イベントであり、明確な形態的特徴(例えば細胞の収縮、クロマチンの凝縮、核の断片化、膜の泡状突起化)を有する。Kerr他(1972年)、Br. J. Cancer、第26巻、239〜257ページ;Wyllie他(1980年)、Int. Rev. Cytol.、第68巻、251〜306ページ。アポトーシスは、正常な組織の増殖とホメオスタシスに関する重要な役割を担っており、アポトーシス・プログラムの欠陥は、ヒトのさまざまな疾患(神経変性疾患や自己免疫疾患から腫瘍まで)に関係していると考えられている。Thompson(1995年)、Science、第267巻、1456〜1462ページ;Mullauer他(2001年)、Mutat. Res.、第488巻、211〜231ページ。アポトーシス細胞の形態的特徴はよくわかっているが、そのプロセスを調節する分子経路は解明され始めたばかりである。
本発明は、アポトーシス特異的真核生物開始因子5A(eIF-5A)(“アポトーシス特異的eIF-5A”または“eIF-5A1”とも呼ばれる)に関する。本発明は、アポトーシス特異的eIF-5Aの核酸およびポリペプチドと、アポトーシス特異的eIF-5Aの発現を阻止するためのアンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはsiRNAを用いて細胞内アポトーシスを阻止または抑制する方法にも関する。本発明は、siRNAをin vivoで哺乳動物の肺細胞に送達する方法に関する。本発明は、アポトーシス特異的eIF-5Aの発現を阻止することによる炎症性サイトカインの発現の抑制または阻止にも関する。本発明はさらに、アポトーシス特異的eIF-5Aの発現を阻止することによるp53の発現の阻止または抑制にも関する。本発明は、アンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはsiRNAを用いてアポトーシス因子5Aの発現を阻止または抑制することによってBcl-2の発現を増大させる方法にも関する。本発明により、サイトカイン(特にヒト上皮細胞におけるTNF-α)の産生を阻止する方法も提供される。本発明の別の一実施態様では、アポトーシス特異的eIF-5Aを標的としたアンチセンス・オリゴヌクレオチドを用いてアポトーシス特異的eIF-5Aの発現を抑制することにより、緑内障になった目における網膜神経節細胞の細胞死を阻止する方法が提供される。
真核生物開始因子5A(“eIF-5A”)のアイソフォームがいくつかこれまでに単離されており、公開データバンクに存在している。そのアイソフォームは機能が互いに重複していると考えられていた。本発明者らは、アポトーシスが誘導される直前に1つのアイソフォームがアップレギュレートされることを見いだし、そのアイソフォームをアポトーシス特異的eIF-5AまたはeIF-5A1と名づけた。本発明の目的は、アポトーシス特異的eIF-5Aと、eIF-5Aの活性化に関与するDHSである。
DNAラダーリングによるラットの黄体におけるアポトーシスの可視化
アポトーシスの程度をDNAラダーリングによって調べた。QIAamp DNA血液キット(キアジェン社)を製造会社の指示に従って使用し、分散させた黄体細胞、または切除した黄体組織からゲノムDNAを単離した。黄体組織は、PGF-2αを用いた処理によってアポトーシスを誘導する前と、アポトーシスを誘導してから1時間後および24時間後に切除した。単離した500ngのDNAの末端への標識を、0.2μCiの[α-32P]dCTP、1mMのトリス、0.5mMのEDTA、3単位のクレノウ酵素、0.2pMのdATP、0.2pMのdGTP、0.2pMのdTTPとともに室温にて30分間にわたってインキュベートすることによって実現した。組み込まれなかったヌクレオチドは、Sambrookらに従ってサンプルを1mlのセパデックスG-50カラムを通過させることによって除去した。次に、トリス-酢酸塩-EDTA(1.8%)ゲル電気泳動によってサンプルを分離した。ゲルを室温にて真空下で30分間にわたって乾燥させ、-80℃にて24時間にわたってX線フィルムに露出した。
PGF-2αでアポトーシスを誘導した後のさまざまな時期にラットから取り出した黄体組織から、全RNAを単離した。簡単に説明すると、組織(5g)を液体窒素の中ですりつぶした。すりつぶした粉末を30mlのグアニジニウム緩衝液(4Mのイソチオシアン酸グアニジニウム、2.5mMのNaOAc(pH8.5)、0.8%のβ-メルカプトエタノール)と混合した。この混合物を4層のミラクロースで濾過し、4℃にて30分間にわたって10,000×gで遠心分離した。次いで上清に対して11,200×gで20時間にわたって塩化セシウム勾配遠心分離を行なった。ペレット化したRNAを75%エタノールで洗浄し、DEPC処理した水600mlの中に再び懸濁させ、95%エタノールを1.5mlと、3MのNaOAcを60ml用いて-70℃でRNAを沈澱させた。
QIAamp DNA血液キット(キアジェン社)を製造会社の指示に従って使用し、分散させた黄体細胞、または切除した黄体組織からゲノムDNAを単離した。500ngのDNAの末端への標識を、0.2μCiの[α-32P]dCTP、1mMのトリス、0.5mMのEDTA、3単位のクレノウ酵素、0.2pMのdATP、0.2pMのdGTP、0.2pMのdTTPとともに室温にて30分間にわたってインキュベートすることによって実現した。組み込まれなかったヌクレオチドは、Maniatisらが記載している方法に従ってサンプルを1mlのセパデックスG-50カラムを通過させることによって除去した。次に、トリス-酢酸塩-EDTA(2%)ゲル電気泳動によってサンプルを分離した。ゲルを室温にて真空下で30分間にわたって乾燥させ、-80℃にて24時間にわたってX線フィルムに露出した。
Sambrookら(上記文献)が記載しているアルカリ溶解法を利用し、プラスミドDNAを単離した。ジデオキシ配列決定法を利用して完全長ポジティブcDNAクローンのシークエンシングを行なった。Sanger他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第74巻、5463〜5467ページ。オープン・リーディング・フレームをコンパイルし、BLAST検索により分析し(GenBank、ベセスダ、メリーランド州)、BCM検索ランチャー(多重配列アラインメント・パターン誘導式多重アラインメント法(F. Corpet、Nuc. Acids Res.、第16巻、10881〜10890ページ、1987年を参照のこと))を用いて配列のアラインメントを実現した。配列と、配列のアラインメントを図5〜図11に示してある。
1%非変性ホルムアルデヒド・アガロース・ゲル上で、さまざまな段階のアポトーシス状態にあるラットの黄体から全RNAを20mg分離し、ナイロン膜上に固定化した。ランダム・プライマー・キット(ベーリンガー社)を用いて32P-dCTPで標識したラット・アポトーシス特異的eIF-5Aの完全長cDNA(配列番号1)を用い、膜を調べた(7×107cpm)。あるいはランダム・プライマー・キット(ベーリンガー社)を使用して32P-dCTPで標識したラットDHSの完全長cDNA(配列番号6)を用い、膜を調べた(7×107cpm)。膜を、1×SSC、0.1%SDSを用いて室温にて1回洗浄し、0.2×SSC、0.1%SDSを用いて65℃にて3回洗浄した。膜を乾燥させ、-70℃にて一晩にわたってX線フィルムに露出した。
遺伝子の3'末端に対応する部分長アポトーシス特異的eIF-5A配列(配列番号11)を、アポトーシスするラット黄体RNA鋳型から、RT-PCRによって作製した。そのとき、酵母、真菌、ヒトのアポトーシス特異的eIF-5Aの配列から設計したオリゴヌクレオチド・プライマーを用いた。ラット・アポトーシス特異的eIF-5A遺伝子の3'末端を単離するのに用いた上流プライマーは、20ヌクレオチド縮重プライマー:5'TCSAARACHGGNAAGCAYGG3'(配列番号9)である。ただしSは、CまたはGであり、RはAまたはGであり、HはA、T、Cのいずれかであり、YはCまたはTであり、Nは任意の核酸である。ラットeIF-5A遺伝子の3'末端を単離するのに用いた下流プライマーは、ヌクレオチドを42個含んでいる:5GCGAAGCTTCCATGG CTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT3'(配列番号10)。逆転写酵素連鎖反応(RT-PCR)を実施した。簡単に説明すると、5mgの下流プライマーを使用し、cDNAの第1の鎖を合成した。次に、上流プライマーと下流プライマーの両方を用いたRT-PCRにおいて、この第1の鎖を鋳型として利用した。
遺伝子の3'末端に対応する部分長DHS配列(配列番号6)を、アポトーシスするラット黄体RNA鋳型から、RT-PCRによって作製した。そのとき、ヒトDHS配列から設計した一対のオリゴヌクレオチド・プライマーを用いた。5'プライマーは、5'GTCTGTGTATTATTGGGCCC3'(配列番号17)という配列を持つ20量体であり;3'プライマーは、5'GCGAAGCTTCCATGGC TCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT3'(配列番号18)という配列を持つ42量体である。逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を実施した。簡単に説明すると、5mgの下流プライマーを使用し、cDNAの第1の鎖を合成した。次に、上流プライマーと下流プライマーの両方を用いたRT-PCRにおいて、この第1の鎖を鋳型として利用した。
サザン・ブロッティングを行なうため、ラットから切除した卵巣からゲノムDNAを単離した。約100mgの卵巣組織を小さな断片に分割し、15mlの試験管に入れた。その組織懸濁液を軽く揺すりながら組織を1mlのPBSで2回洗浄した後、ピペットを用いてPBSから取り出した。組織を2.06mlのDNA緩衝液(0.2Mのトリス-HCl(pH8.0)と0.1mMのEDTA)の中に再び懸濁させ、240μlの10%SDSと100μlのプロテイナーゼK(ベーリンガー・マンハイム社;10mg/ml)を添加した。振盪している水浴の中に組織を入れ、一晩にわたって45℃にした。翌日、プロテイナーゼK(10mg/ml)をさらに100μl添加し、組織懸濁液を45℃の水浴の中でさらに4時間にわたってインキュベートした。インキュベーションの後、組織懸濁液を、一度は同量のフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)で、一度は同量のクロロホルム:イソアミルアルコール(24:1)で抽出した。抽出後、1/10の体積の3M酢酸ナトリウム(pH5.2)と2倍の体積のエタノールを添加した。ブンゼン・バーナーを用いて密封してフックの形態にしたガラス製ピペットを使用し、溶液からDNAの紐を引っ張り出し、そのDNAを清潔な遠心分離管に移した。DNAを70%エタノールの中で1回洗浄し、大気中で10分間にわたって乾燥させた。DNAペレットを10mMのトリス-HCl(pH8.0)500μlの中に溶かし、10μlのRNアーゼA(10mg/ml)を添加し、37℃にて1時間にわたってインキュベートした。フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)用いてDNAを1回抽出し、1/10の体積の3M酢酸ナトリウム(pH5.2)と2倍の体積のエタノールを添加してDNAを沈澱させた。4℃にて13,000×gで10分間にわたって遠心分離することにより、DNAをペレット化した。このDNAペレットを70%エタノールの中で1回洗浄し、4℃にて一晩にわたってDNAを撹拌することにより、10mMのトリス-HCl(pH8.0)200μlの中にDNAを溶かした。
この実施例では、アポトーシス特異的eIF-5Aを投与した後の変化を示す(センス方向のアポトーシス特異的eIF-5Aを用いたアポトーシスの増大)。
トランスフェクションに基づくすべての実験で、COS-7細胞(野生型T抗原をコードしているSV40の突然変異体で形質転換した、アフリカミドリザルの腎臓線維芽細胞様細胞系)を使用した。0.584g/lのL-グルタミンと、4.5g/lのグルコースと、0.37%の炭酸水素ナトリウムを含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)の中で、COS-7細胞を培養した。この培地に、10%ウシ胎仔血清(FBS)と、100単位のペニシリン/ストレプトマイシンとを補足した。細胞は、CO2が5%で空気が95%の湿潤な環境の中で37℃にて増殖させた。接着する細胞を0.25%のトリプシンと1mMのEDTAを含む溶液を用いて剥がすことにより、細胞を3〜4日ごとに継代培養した。剥がした細胞は、新鮮な培地を含む新しい培養皿の中に分離比1:10で入れた。
ラットのアポトーシス特異的eIF-5Aの完全長コード配列をセンス方向で含み、ラットのアポトーシス特異的eIF-5Aの3'非翻訳領域(UTR)をアンチセンス方向で含む組み換えプラスミドを、哺乳動物のエピトープ・タグ発現ベクターであるpHM6(ロッシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ社)を用いて構成した。このベクターを図21に示してある。このベクターは、CMVプロモータ(ヒト・サイトメガロウイルス極初期プロモータ/エンハンサー)と、HA(インフルエンザのヘマグルチニンに由来するノナペプチド・エピトープ・タグ)と、BGH pA(ウシ成長ホルモン・ポリアデニル化シグナル)と、f1 ori(f1起点)と、SV40 ori(SV40の初期プロモータと起点)と、ネオマイシン(ネオマイシン抵抗(G418)遺伝子)と、SV40 pA(SV40ポリアデニル化シグナル)と、Col E1(ColE1起点)と、アンピシリン(アンピシリン抵抗遺伝子)とを含んでいる。ラットのアポトーシス特異的eIF-5Aの完全長コード配列と、ラットのアポトーシス特異的eIF-5Aの3'UTRは、pBluescript(配列番号1)に含まれる元のラットeIF-5A RT-PCR断片からPCRによって増幅した。完全長eIF-5Aを増幅するため、以下のプライマーを使用した:フォワードプライマー5'GCCAAGCTTAATGGCAGATGATTT GG3'(配列番号59)(Hind3)とリバースプライマー5'CTGAATTCCAGT TATTTTGCCATGG3'(配列番号60)(EcoR1)。3'UTRラット・アポトーシス特異的eIF-5Aを増幅するため、以下のプライマーを使用した:フォワードプライマー5'AATGAATTCCGCCATGACAGAGGAGGC3'(配列番号61)(EcoR1)とリバースプライマー5'GCGAAGCTTCCATGGCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT(配列番号62)(Hind3)。
ウエスタン・ブロッティングを行なうため、トランスフェクトされた細胞をPBS(8g/lのNaCl、0.2g/lのKCl、1.44g/lのNa2HPO4、0.24g/lのKH2PO4)の中で2回洗浄した後、150μlの温かいSDSゲル-ローディング用緩衝液(50mMのトリス-HCl(pH6.8)、100mMのジチオトレイトール、2%SDS、0.1%ブロモフェノール・ブルー、10%グリセリン)を添加することにより、その細胞からタンパク質を分離した。細胞ライセートをマイクロ遠心管に入れ、10分間にわたって95℃に加熱した後、13,000×gで10分間にわたって遠心分離した。上清を新しいマイクロ遠心管に移し、使用する準備が整うまで-20℃で保管した。
2通りの方法を利用し、トランスフェクトされたCOS-7細胞でアポトーシスを誘導した。それは、血清の欠乏と、アクチノマイシンD(ストレプトミセス属、カルバイオケム社)での処理である。どちらの方法で処理する場合にも、トランスフェクションから40時間後に培地を除去した。血清欠乏実験を行なうときには、培地を無血清かつ無抗生物質のDMEMと交換した。10%FBSを補足した無抗生物質DMEMの中で増殖した細胞を対照として使用した。アクチノマイシンDでアポトーシスを誘導するときには、培地を、10%FBSと、1μg/mlのアクチノマイシンDが溶けたメタノールとを補足した無抗生物質DMEMと交換した。対照細胞は、10%FBSと、上と同量のメタノールとを補足した無抗生物質DMEMの中で増殖させた。両方の方法において、ヘキストまたはアネクシンV-Cy3で染色することにより、アポトーシスを起こした細胞の割合を48時間後に測定した。アポトーシスの誘導は、図22に示したようにノーザン・ブロット分析でも確認した。
トランスフェクトされたCOS-7細胞の核に核染料ヘキストを使用して標識し、形態的特徴(例えば核の断片化や凝縮)に基づいてアポトーシスを起こした細胞を同定した。定着剤として、無水メタノールと氷酢酸が3:1になった混合物を使用の直前に調製した。培養スライド上で増殖しているCOS-7細胞の培地に同量の定着剤を添加し、2分間にわたってインキュベートした。培地/定着剤の混合物を細胞から取り出して廃棄し、定着剤1mlを細胞に添加した。5分後、定着剤を廃棄し、新鮮な定着剤1mlを細胞に添加し、5分間にわたってインキュベートした。定着剤を廃棄し、細胞を大気中で4分間乾燥させた後、ヘキスト染色剤(0.5μg/mlのヘキスト33258を含むPBS)を1ml添加した。暗所で10分間にわたってインキュベートした後、染色溶液を廃棄し、スライドを脱イオン水で1分間ずつ3回洗浄した。洗浄後、1mlのマッキルベン緩衝液(0.021Mのクエン酸、0.058MのNa2HPO4・7H2O;pH5.6)を細胞に添加し、暗所で20分間にわたってインキュベートした。緩衝液を廃棄し、細胞を暗所で大気中にて5分間乾燥させ、培養スライドのウエルを隔てているチェンバーを除去した。蛍光のためのベクタシールド・マウンティング媒体(ヴェクター・ラボラトリーズ社)を数滴スライドに添加し、カバーガラスを上から被せた。染色された細胞を、UVフィルタを使用して蛍光顕微鏡で観察した。明るく染色された細胞または断片化された核をアポトーシスとした。
アネクシンV-Cy3アポトーシス検出キット(シグマ社)を使用し、アポトーシスを起こした細胞上の外部化したホスファチジルセリンに蛍光標識した。このキットを製造会社のプロトコルに従って使用したが、以下の変更を行なった。簡単に説明すると、4枚のチェンバー培養スライド上で増殖しているトランスフェクトされたCOS-7細胞をPBSで2回洗浄し、1×結合緩衝液で3回洗浄した。150μlの染色溶液(1μg/mlのAnnCy3を含む1×結合緩衝液)を添加し、細胞を暗所で10分間にわたってインキュベートした。次に染色溶液を除去し、細胞を1×結合緩衝液で5回洗浄した。チェンバーの壁を培養スライドから除去し、1×結合緩衝液を数滴細胞の上に載せ、カバーガラスを上から被せた。染色された細胞を、緑色のフィルタを使用して蛍光顕微鏡で観察し、ポジティブ染色された(アポトーシス)細胞の赤い蛍光を視覚化した。全細胞数は、可視光下で細胞の数をカウントすることによって測定した。
この実施例では、アポトーシス特異的eIF-5Aを投与した後の変化を明らかにする。
この実施例では、アポトーシス特異的eIF-5Aを投与した後の変化を明らかにする。
図47は、心臓組織でヒトの心臓の鼓動を模倣し、次いで心筋梗塞を誘導する実験を示している。図49は、実験室の様子である。弁置換手術の間に取り出したヒト心臓組織の切片を電極に引っかけた。その心臓組織に小さな重りを取り付け、心拍の強度測定が容易になるようにした。電極から電気的な刺激を与え、その組織に拍動を開始させた。アポトーシス特異的eIF-5Aと増殖eIF-5Aの両方の遺伝子発現レベルを心臓組織で測定した後、虚血を誘導した。図46を参照のこと。虚血前の心臓組織では、アポトーシス特異的eIF-5Aと増殖eIF-5Aの両方の産生が低レベルであり、両者はほぼ同程度であった。この間、酸素と二酸化炭素をそれぞれ92.5%と7.5%の割合で含む緩衝液を心臓に供給した。その後、酸素レベルを下げて窒素レベルを上昇させることによって虚血を誘導し、最終的に“心筋梗塞”に至らせた。心臓組織は拍動を停止した。そこで酸素レベルを通常の状態に回復させて電気的刺激を与えると、心臓組織は再び拍動し始めた。“心筋梗塞”後、アポトーシス特異的eIF-5Aと増殖eIF-5Aの発現レベルを再度測定した。今度は、アポトーシス特異的eIF-5Aのレベルが顕著な上昇を示したのに対し、増殖eIF-5Aの発現レベルの上昇はそれよりもはるかに少なかった。図46を参照のこと。
以下の実施例で細胞培養条件を示す。
ヒトの篩板細胞と星状細胞の培養
ヒトの一対の眼球をカナダのアイ・バンク(オンタリオ分室)から死後48時間以内に取得した。(極の付いた)視神経頭部を取り出し、抗生物質/抗真菌剤と、グルタミンと、10%FBSとを補足したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)の中に3時間入れた。視神経頭部(ONH)のボタンを各組織サンプルから回収し、細断用のハサミで小片にした。移植片を、12.5cm2のプラスチック製培養フラスコに入れたDMEMの中で培養した。1ヶ月以内の期間、生きている移植片の増殖を観察した。細胞の集密度が90%に達したとき、トリプシンで処理し、分別継代培養を行なって篩板(LC)細胞と星状細胞の集団を生成させた。具体的に説明すると、LC細胞は、ゲンタマイシンと、グルタミンと、10%FBSとを補足したDMEMを入れた25cm2のプラスチック製培養フラスコの中で継代培養したのに対し、星状細胞は、FBSを含まないEBM完全培地(クロネティックス社)を入れた25cm2のフラスコの中で増殖させた。継代培養の10日後、星状細胞培養物の中にFBSを添加した。このプロトコルに従って細胞を維持し、継代培養した。
野生型p53を発現するヒト大腸がん細胞系RKO(アメリカ基準培養物コレクションCRL-2577)を用い、アンチセンス・オリゴヌクレオチドがアポトーシス特異的eIF-5Aタンパク質の発現を抑制する能力を調べた。RKOを、最少必須イーグル培地(MEM)の中で、非必須アミノ酸、アール塩、L-グルタミンとともに培養した。この培地に10%ウシ胎仔血清(FBS)と100単位のペニシリン/ストレプトマイシンを補足した。細胞は、5%のCO2と95%の空気からなる湿潤な環境の中で37℃にて増殖させた。細胞を3〜4日ごとに継代培養し、接着する細胞を0.25%のトリプシンと1mMのEDTAを含む溶液を用いて剥がした。剥がした細胞は、新鮮な培地を含む新しい培養皿の中に分割比1:10〜1:12で入れた。
ヒト肝細胞がん細胞系であるHepG2を使用し、ヒトのアポトーシス特異的eIF-5Aに対するアンチセンス・オリゴヌクレオチドが、IL-1βを用いた処理に応答してTNF-αの産生を阻止する能力を調べた。HepG2細胞は、ゲンタマイシンと、グルタミンと、10%FBSとを補足したDMEMの中で培養し、5%のCO2と95%の空気からなる湿潤な環境の中で37℃にて増殖させた。
アポトーシスの誘導
RKO細胞にはアクチノマイシンDとRNAポリメラーゼ阻害剤を用いてアポトーシスを誘導し、篩板細胞にはカンプトテシンとトポイソメラーゼ阻害剤を用いてアポトーシスを誘導した。アクチノマイシンDは0.25μg/mlの濃度で使用し、カンプトテシンは、20、40、50μMの濃度で使用した。篩板細胞ではカンプトテシン(50μM)とTNF-α(10ng/ml)の組み合わせも用いてアポトーシスを誘導した。カンプトテシンとTNF-αの組み合わせは、カンプトテシンまたはTNF-αを単独で用いるよりもアポトーシスを誘導するのにより効果的であることがわかった。
ヒトのアポトーシス特異的eIF-5Aを標的とする3組のアンチセンス・オリゴヌクレオチドをモレキュラー・リサーチ・ラブズ社が設計したので、同社から購入した。ヒトのアポトーシス特異的eIF-5Aを標的とする第1のアンチセンス・オリゴヌクレオチドの配列(#1)は、5'CCT GTC TCG AAG TCC AAG TC3'(配列番号63)であった。ヒトのアポトーシス特異的eIF-5Aを標的とする第2のアンチセンス・オリゴヌクレオチドの配列(#2)は、5'GGA CCT TGG CGT GGC CGT GC3'(配列番号64)であった。ヒトのアポトーシス特異的eIF-5Aを標的とする第3のアンチセンス・オリゴヌクレオチドの配列(#3)は、5'CTC GTA CCT CCC CGC TCT CC3'(配列番号65)であった。対照オリゴヌクレオチドの配列は、5'CGT ACC GGT ACG GTT CCA GG3'(配列番号66)であった。イソチオシアン酸フルオレセイン(FITC)で標識したアンチセンス・オリゴヌクレオチド(モレキュラー・リサーチ・ラブズ社)を用いてトランスフェクション効率を調べた。そのアンチセンス・オリゴヌクレオチドの配列は、5'GGA CCT TGG CGT GGC CGT GCX3'(配列番号67)であった(XはFITC標識)。すべてのアンチセンス・オリゴヌクレオチドを完全にホスホロチオ化した。
アポトーシス特異的eIF-5Aアンチセンス・オリゴヌクレオチドがアポトーシス特異的eIF-5Aタンパク質の発現を阻止する能力をRKO細胞で調べた。オリゴフェクタミン(インヴィトロジェン社)というトランスフェクション試薬を用い、RKO細胞にアンチセンス・オリゴヌクレオチドをトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間前に、細胞を24ウエルのプレートに分配した。そのとき、ウエル1つにつき、10%FBSを補足したがペニシリン/ストレプトマイシンは欠いているMEM培地の中に細胞が157,000個含まれるようにした。24時間後、細胞は多くの場合約50%の集密度に達していた。RKO細胞に対し、モック・トランスフェクションを行なうか、100nMまたは200nMのアンチセンス・オリゴヌクレオチドをトランスフェクトした。アンチセンス・オリゴヌクレオチドの20μMのストック0μl、または1.25μl、または2.5μlを無血清MEMの中に希釈して最終体積を42.5μlにし、この混合物を室温にて15分間にわたってインキュベートすることにより、24ウエルのプレートの1つのウエルにとって十分なトランスフェクション培地を調製した。1.5μlのオリゴフェクタミンを6μlの無血清MEMの中に希釈し、室温にて7.5分間にわたってインキュベートした。5分後、希釈したオリゴフェクタミン混合物をDNA混合物に添加し、室温にて20分間にわたってインキュベートした。細胞を無血清MEMで1回洗浄した後、200μlのMEMを細胞に添加し、その上から50μlのトランスフェクション培地を添加した。細胞を増殖チェンバーの中に戻して4時間にわたってインキュベートした。インキュベーションの後、125μlのMEM+30%FBSを細胞に添加した。細胞をその後さらに48時間にわたって培養し、0.25μg/mlのアクチノマイシンDで24時間にわたって処理した後、細胞抽出液を回収してウエスタン・ブロット分析を行なった。
篩板細胞にいろいろなアンチセンス・オリゴヌクレオチドをトランスフェクトし、カンプトテシンでアポトーシスを誘導した後、対照アンチセンス・オリゴヌクレオチドで処理した細胞、またはアポトーシス特異的eIF-5Aアンチセンス・オリゴヌクレオチド(配列番号26)で処理した細胞のうちで、アポトーシスを起こした細胞の割合を調べた。アポトーシスを起こした篩板細胞を検出するのに2つの方法を利用した。すなわち、ヘキスト染色法と、デッドエンド(登録商標)蛍光測定TUNEL法である。核染料ヘキストを使用して篩板細胞の核に標識し、形態的特徴(例えば核の断片化や凝縮)に基づいてアポトーシスを起こした細胞を同定した。定着剤として、無水メタノールと氷酢酸が3:1になった混合物を使用の直前に調製した。培養スライド上で増殖しているCOS-7細胞の培地に同量の定着剤を添加し、2分間にわたってインキュベートした。培地/定着剤の混合物を細胞から取り出して廃棄し、定着剤1mlを細胞に添加した。5分後、定着剤を廃棄し、新鮮な定着剤1mlを細胞に添加し、5分間にわたってインキュベートした。定着剤を廃棄し、細胞を大気中で4分間乾燥させた後、ヘキスト染色剤を1ml(0.5μg/mlのヘキスト33258を含むPBS)添加した。暗所で10分間にわたってインキュベートした後、染色溶液を廃棄し、スライドを脱イオン水で1分間ずつ3回洗浄した。洗浄後、数滴のマッキルベン緩衝液(0.021Mのクエン酸、0.058MのNa2HPO4・7H2O;pH5.6)を細胞に添加し、カバーガラスを上から被せた。染色された細胞を、UVフィルタを使用して蛍光顕微鏡で観察した。明るく染色された細胞または断片化された核をアポトーシスとした。ウエル1つにつき最低で200個の細胞がカウントされた。
トランスフェクトされたRKO細胞をPBSで洗浄し、ウエル1つにつき40μlの温かい溶解用緩衝液(0.5%SDS、1mMのジチオトレイトール、50mMのトリス-HCl(pH8.0))を添加することによってその細胞からタンパク質を回収し、ウエスタン・ブロット分析を行なった。細胞を剥がし、得られた抽出液をマイクロ遠心管に移し、5分間にわたって煮沸し、-20℃で保管した。バイオ-ラド・タンパク質アッセイ(バイオ-ラド社)を製造会社の指示に従って使用し、タンパク質を定量した。
siRNAの構成
ヒトのアポトーシス特異的eIF-5Aに対する短い阻害RNA(siRNA)を用い、RKO細胞と篩板細胞におけるアポトーシス特異的eIF-5Aの発現を特異的に抑制した。サイレンサー(登録商標)siRNA構成キット(アンビオン社)を用いて試験管内で転写を行なうことにより、6つのsiRNAを作った。ヒトのアポトーシス特異的eIF-5Aに対するsiRNAを4つ作った(siRNA #1〜#4)(配列番号30〜33)。2つのsiRNAを対照として使用した。1つは、キットに含まれているGAPDHに対するsiRNAであり、もう1つは、アポトーシス特異的eIF-5A siRNA #1(配列番号30)の逆配列を持つが、それ自身はアポトーシス特異的eIF-5Aを標的としないsiRNA(siRNA #5)(配列番号34)である。これらのsiRNAは、製造会社のプロトコルに従って作った。簡単に説明すると、望むsiRNA鎖をコードしているDNAオリゴヌクレオチドをT7 RNAポリメラーゼの鋳型として用いてT7プロモータ・プライマーをアニーリングし、クレノウ・フラグメントとフィル-イン(fill-in)反応させることにより、siRNAの個々の鎖を作製した。センス鎖とアンチセンス鎖の両方について転写反応を行なわせた後、反応物をまとめ、2本のsiRNA鎖をアニールし、DNアーゼとRNアーゼで処理し、カラムで精製した。siRNAを作るのに使用したDNAオリゴヌクレオチド(T7プライマーのアニーリング部位に下線)の配列は以下の通りであった。siRNA #1アンチセンス5'AAAGGAATGACTTCCAGCTGACCTGTCTC3'(配列番号69)とsiRNA #1センス5'AATCAGCTGGAAGTCATTCCTCCTGTCTC3'(配列番号70);siRNA #2アンチセンス5'AAGATCGTCGAGATGTCTACTCCTGTCTC3'(配列番号71)とsiRNA #2センス5'AAAGTAGACATCTCGACGATCCCTGTCTC3'(配列番号72);siRNA #3アンチセンス5'AAGGTCCATCTGGTTGGTATTCCTGTCTC3'(配列番号73)とsiRNA #3センス5'AAAATACCAACCAGATGGACCCCTGTCTC3'(配列番号74);siRNA #4アンチセンス5'AAGCTGGACTCCTCCTACACACCTGTCTC3'(配列番号75)とsiRNA #4センス5'AATGTGTAGGAGGAGTCCAGCCCTGTCTC3'(配列番号76);siRNA #5アンチセンス5'AAAGTCGACCTTCAGTAAGGACCTGTCTC3'(配列番号77)とsiRNA #5センス5'AATCCTTACTGAAGGTCGACTCCTGTCTC3'(配列番号78)。
同じトランスフェクション・プロトコルに従い、RKO細胞と篩板細胞にsiRNAをトランスフェクトした。8ウエルの培養スライドまたは24ウエルのプレートに、RKO細胞をウエル1つにつきそれぞれ46,000個と105,800個の割合で植え、その翌日にトランスフェクションを行なった。篩板細胞には、細胞の集密度が40〜70%になったときにトランスフェクションを行なった。篩板細胞は、一般に、8ウエルの培養スライド上に、ウエル1つにつき7500〜10,000個の割合で植え、その3日後にトランスフェクションを行なった。8ウエルの培養スライドの1つのウエルにとって十分なトランスフェクション培地を調製するため、25.5ピコモルのsiRNAストックをオプティ-メム(シグマ社)で希釈して最終体積を21.2μlにした。0.425μlのリポフェクタミン2000をオプティ-メムで希釈して最終体積を21.2μlにした後、室温にて7〜10分間にわたってインキュベートした。次に、希釈したリポフェクタミン2000混合物を希釈したsiRNA混合物に添加し、室温にて20〜30分間にわたってインキュベートした。細胞を無血清培地で1回洗浄した後、無血清培地135μlを細胞に添加し、トランスフェクション培地42.4μlをその上から添加した。細胞を増殖チェンバーに戻して4時間にわたってインキュベートした。インキュベーションの後、65μlの無血清培地+30%FBSを細胞に添加した。ウエスタン・ブロット分析に用いる細胞へのsiRNAのトランスフェクションを、24ウエルのプレートで実施した。そのとき、体積を2.3倍にした以外は8ウエルのスライドにおけるトランスフェクションと同じ条件にした。
HepG2細胞によって産生されるTNF-αの定量
48ウエルのプレートに、HepG2細胞をウエル1つにつき20,000個の割合で植えた。72時間後、培地を除去し、2.5μMの対照アンチセンス・オリゴヌクレオチドを含むか、2.5μMのアポトーシス特異的eIF-5Aアンチセンス・オリゴヌクレオチド#2を含む新鮮な培地を細胞に添加した。アンチセンス・オリゴヌクレオチドを含む新鮮な培地は、24時間後に添加した。オリゴヌクレオチドとともに合計で48時間インキュベートした後、培地を、インターロイキン1β(IL-1β、1000pg/ml;レインコ・テクノロジーズ社)を含む培地と交換し、6時間にわたってインキュベートした。培地を回収して凍結させ(-20℃)、TNF-αの定量を行なった。処理していない細胞(アンチセンス・オリゴヌクレオチドもIL-1βもなし)と、IL-1βだけで処理した細胞のインキュベーションを並行して行ない、対照として利用した。どの処理も2回実施した。ELISAアッセイ(アッセイ・デザイン社)を製造会社のプロトコルに従って利用し、培地に放出されたTNF-αを測定した。
以下の実験は、アポトーシス特異的eIF-5Aアンチセンス・オリゴヌクレオチドが、アポトーシス特異的eIF-5Aの発現をp53と同様に阻止できたことを示している。
以下の実験は、アポトーシス特異的eIF-5Aヌクレオチドがアポトーシスを減らせることを示している。
以下の実験は、アポトーシス特異的eIF-5Aを標的とするsiRNAをトランスフェクトした細胞ではアポトーシス特異的eIF-5Aの発現がより少ないことを示している。この実験は、アポトーシス特異的eIF-5Aを標的とするsiRNAがアポトーシスを減らせることも示している。
この実施例は、アポトーシス特異的eIF-5Aに対するアンチセンス・オリゴヌクレオチドでヒト細胞系を処理すると、細胞が産生するTNF-αが少なくなることを示している。
HT-29細胞(ヒト大腸腺がん)に、アポトーシス特異的eIF-5Aに対するsiRNAをトランスフェクトするか、逆配列を有する対照siRNAをトランスフェクトした。使用したsiRNAは、以下のものであった:
位置690(3'UTR)%G/C=48
5'AAGCUGGACUCCUCCUACACA3'(配列番号79)。
使用した対照siRNAは、以下のものであった:
%G/C=39
5'AAACACAUCCUCCUCAGGUCG3'(配列番号80)。
U-937細胞系の組織培養条件
U-937は、懸濁液の中で増殖するヒト単球細胞系であり、接着性になり、PMA(この細胞をATCCから直接得ることはできない)で刺激したときにマクロファージに分化する(ATCC番号CRL-1593.2)。細胞を、CO2が5%含まれている37℃のインキュベータの中で、2mMのL-グルタミンと、1.5g/lの炭酸水素ナトリウムと、4.5g/lのグルコースと、10mMのヘペスと、1.0mMのピルビン酸ナトリウムと、10%ウシ胎仔血清とを含むRPMI1640培地の中に維持した。細胞を、一週間に2回、新鮮な培地に分割し(分割比は1:4または1:5)、細胞密度を常に1ml当たり105〜2×106個に維持した。組織培養物で処理したプラスチック製T-25フラスコに入れた懸濁液の中で細胞を培養し、24ウエルのプレートの中で実験を行なった。
実験を開始する2日前、細胞密度を培地1mlにつき3×105個に調節した。実験の当日、対数増殖期の細胞を回収した。細胞懸濁液を15mlの試験管に移し、室温にて400×gで10分間にわたって遠心分離した。上清を吸引し、細胞ペレットを新鮮な培地で洗浄し、新鮮な培地の中に再び懸濁させた。細胞を再び400×gで10分間にわたって遠心分離し、上清を吸引し、細胞ペレットを最終的に新鮮な培地に再び懸濁させた。同じ体積の細胞懸濁液とトリパン・ブルー溶液(0.4%のトリパン・ブルー染料を含むPBS)を混合し、血球計数器と顕微鏡を用いて生きた細胞をカウントした。細胞を1ml当たり4×105個に希釈した。
各細胞サンプル中のタンパク質の濃度は、BSA(ウシ血清アルブミン)を標準タンパク質として使用したBCA(ビシンコニン酸)法によって測定した。タンパク質サンプル(合計でタンパク質が5μg)を12%SDS-PAGE電気泳動で分離し、PVDF膜に移した。ポリビニルアルコール(1μg/ml、30秒間)と、5%のスキムミルクを含むPBS-t(1時間)とでその膜をブロックした。ヒトeIF-5Aに対するマウス・モノクローナル抗体(BDバイオサイエンシーズ社、カタログ番号611976;5%スキムミルクの中に20,000倍に希釈、1時間)を用いて膜を調べた。膜をPBS-tで10分間ずつ3回洗浄した。二次抗体は、セイヨウワサビのペルオキシダーゼが共役した抗マウス抗体(シグマ社、1%スキムミルクの中に5000倍に希釈、1時間)であった。膜をPBS-tで10分間ずつ3回洗浄した。タンパク質のバンドを化学発光によって可視化した(ECL検出システム、アマーシャム・ファルマシア・バイオテック社)。
インターフェロンγに応答したIL-8産生の、アポトーシス特異的eIF-5A siRNAによる抑制
HT-29(ヒト大腸腺がん)細胞に、アポトーシス特異的eIF-5Aに対するsiRNAをトランスフェクトした。トランスフェクションの約48時間後、培地を交換した。そのとき、テスト・サンプルの一部にはインターフェロンγが含まれ、サンプルの別の一部にはインターフェロンγが含まれないようにした。インターフェロンγを添加してから16時間後、細胞を洗浄し、TNF-αを含む培地と含まない培地を細胞に添加した。培地(IL-8をELISAで検出するのに用いる)と細胞ライセートを8時間後または24時間後に回収した。
ヒト篩板細胞の培養
ヒトの一対の眼球をカナダのアイ・バンク(オンタリオ分室)から死後48時間以内に取得した。(極の付いた)視神経頭部を取り出し、抗生物質/抗真菌剤と、グルタミンと、10%FBSを補足したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)の中に3時間入れた。視神経頭部(ONH)のボタンを各組織サンプルから回収し、細断用のハサミで小片にした。移植片を、12.5cm2のプラスチック製培養フラスコに入れたDMEMの中で培養した。1ヶ月以内の期間、生きている移植片の増殖を観察した。細胞の集密度が90%に達したとき、トリプシンで処理し、分別継代培養を行なって篩板(LC)細胞と星状細胞の集団を生成させた。LC細胞は、ゲンタマイシンと、グルタミンと、10%FBSとを補足したDMEMを入れた25cm2のプラスチック製培養フラスコの中で継代培養することによって増やした。このプロトコルに従って細胞を維持し、継代培養した。
50μMのカンプトテシン(シグマ社)と10ng/mlのTNF-α(レインコ・テクノロジーズ社)を組み合わせて篩板細胞にアポトーシスを誘導した。カンプトテシンとTNF-αの組み合わせは、カンプトテシンまたはTNF-α単独の場合よりもアポトーシスを誘導するのに効果的であることがわかった。
ヒトのアポトーシス特異的eIF-5Aに対する短い阻害RNA(siRNA)を用い、篩板細胞においてeIF-5Aの発現を特異的に抑制した。サイレンサー(登録商標)siRNA構成キット(アンビオン社)を用いて試験管内で転写を行なうことにより、6つのsiRNAを作った。ヒトのアポトーシス特異的eIF-5Aに対するsiRNAを4つ作った(siRNA #1〜#4)。2つのsiRNAを対照として使用した。1つは、キットに含まれているGAPDHに対するsiRNAであり、もう1つは、アポトーシス特異的eIF-5A siRNA #1(配列番号30)の逆配列を持つが、それ自身はアポトーシス特異的eIF-5Aを標的としないsiRNA(siRNA #5)である。これらのsiRNAは、製造会社のプロトコルに従って作った。eIF-5Aを標的するsiRNAと対照siRNAは、以下の配列であった。siRNA #1 5'AAAGGAATGACTTCCAGCTGA3'(配列番号81);siRNA #2 5'AAGATCGTCGAGATGTCTACT3'(配列番号82);siRNA #3 5'AAGGTCCATCTGGTTGGTATT3'(配列番号83);siRNA #4 5'AAGCTGGACTCCTCCTACACA3'(配列番号84);siRNA #5 5'AAAGTCGACCTTCAGTAAGGA3'(配列番号85)。リポフェクタアミン2000を用い、篩板細胞にsiRNAをトランスフェクトした。
トランスフェクトされた細胞をTNF-αとカンプトテシンで24時間にわたって処理した後、ヘキスト33258で染色し、アポトーシスを起こしている細胞の割合を調べた。簡単に説明すると、無水メタノールと氷酢酸が3:1になった混合物を用いて細胞を固定した後、ヘキスト染色剤(0.5μg/mlのヘキスト33258を含むPBS)とともにインキュベートした。暗所で10分間にわたってインキュベートした後、染色溶液を廃棄し、培養スライドのウエルを隔てているチェンバーを除去し、スライドを脱イオン水で1分間ずつ3回洗浄した。洗浄後、数滴のマッキルベン緩衝液(0.021Mのクエン酸、0.058MのNa2HPO4・7H2O;pH5.6)を細胞に添加し、カバーガラスを上から被せた。染色された細胞を、UVフィルタを使用して蛍光顕微鏡で観察した。明るく染色された細胞または断片化された核をアポトーシスとした。ウエル1つにつき最低で200個の細胞がカウントされた。デッドエンド(登録商標)蛍光測定TUNEL(プロメガ社)を利用し、アポトーシスを起こした細胞の1つの特徴であるDNAの断片化を検出した。ヘキスト染色の後、培養スライドを蒸留水で軽く洗浄し、スライドをPBS(137mMのNaCl、2.68mMのKCl、1.47mMのKH2PO4、8.1mMのNa2HPO4)の中に5分間ずつ2回浸すことによってさらに洗浄し、洗浄と洗浄の間にスライドを紙タオルにブロッティングした。0.2%のトリトンX-100を含むPBSの中に細胞を5分間にわたって浸すことにより、細胞を浸透性にした。次にスライドを5分間ずつ2回PBSの中に浸すことによって細胞を再び洗浄し、洗浄と洗浄の間にスライドを紙タオルにブロッティングした。ウエル1つにつき25μlの平衡用緩衝液(200mMのカコジル酸カリウム(pH6.6)、25mMのトリス-HCl(pH6.6)、0.2mMのジチオトレイトール、0.25mg/mlのウシ血清アルブミン、2.5mMの塩化コバルト)を添加し、5〜10分間にわたってインキュベートした。平衡させている間、平衡用緩衝液とヌクレオチド混合物(50μMのフルオレセイン-12-dUTP、100μMのdATP、10mMのトリス-HCl(pH7.6)、1mMのEDTA)とターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ酵素(Tdt、25U/μl)を45:5:1の比で混合することにより、各ウエルに反応混合物を30μl調製した。平衡用緩衝液の中でインキュベートした後、ウエル1つにつき反応混合物を30μl添加し、カバーガラスを上から被せた。反応は、暗所で37℃にて1時間にわたって行なわせた。反応は、スライドを2×SSC(0.3MのNaCl、30mMのクエン酸ナトリウム(pH7.0))の中に浸して15分間にわたってインキュベートすることによって終了させた。次に、スライドをPBSの中に5分間ずつ3回浸すことによって洗浄した。キム・ワイプを用いてウエルのまわりをぬぐうことによってPBSを除去し、封入剤(オンコジーン・リサーチ・プロジェクト社、JA1750-4ML)を各ウエルに添加し、スライドにカバーガラスを被せた。UVフィルタ(UV-G365、フィルタ・セット487902)を用いて細胞を蛍光顕微鏡で観察し、ヘキスト染色した核をカウントした。明るく染色された核または断片化した核はすべて、アポトーシスと判断した。同じ視野において、フルオレセイン・フィルタ(グリーンH546、フィルタ・セット48915)を用いて細胞を観察した。明るい緑色の蛍光を発している細胞はすべて、アポトーシスと判断した。その視野においてアポトーシスを起こした細胞の割合は、フルオレセイン・フィルタを用いてカウントした明るい緑色の核を、UVフィルタのもとでカウントした核の合計数で割ることによって計算した。ウエル1つにつき、最低で200個の細胞がカウントされた。
ウエスタン・ブロッティングを行なうため、24ウエルのプレート上で増殖している篩板細胞をPBS(8g/lのNaCl、0.2g/lのKCl、1.44g/lのNa2HPO4、0.24g/lのKH2PO4)の中で2回洗浄した後、50μlの溶解用緩衝液(2%SDS、50mMのトリス-HCl(pH7.4))を添加することにより、その細胞からタンパク質を単離した。細胞ライセートをマイクロ遠心管に入れ、5分間にわたって煮沸した後、使用する準備が整うまで-20℃で保管した。ビシンコニン酸キット(BCA;シグマ社)を用いてタンパク質の濃度を決定した。ウエスタン・ブロッティングを行なうため、12%SDS-ポリアクリルアミド・ゲル上で全タンパク質を5μg分離した。分離されたタンパク質をポリジフッ化ビニリデン膜に移した。次いでこの膜を1時間にわたってインキュベートし、溶液(5%のスキムミルク粉末と0.02%のアジ化ナトリウムを含むPBS)をブロックし、PBS-T(PBS+0.05%ツイーン20)の中で15分間ずつ3回洗浄した。膜をPBS-Tの中で4℃にて一晩保管した。翌日、膜を室温まで温めた後、1μg/mlのポリビニルアルコールの中で30秒間ブロックした。膜を脱イオン水の中で5回洗浄した後、5%のミルクを含むPBS溶液の中で30分間にわたってブロックした。5%のミルクを含むPBS溶液の中で一次抗体を30分間にわたってあらかじめインキュベートした後、膜とともにインキュベートした。使用した一次抗体は、抗eIF-5A(BDトランスダクション・ラボラトリーズ社)を20,000倍に希釈したものと、抗β-アクチン(オンコジーン社)であった。膜をPBS-Tの中で3回洗浄し、1%のミルクを含むPBSの中に適切なHRP共役二次抗体を希釈したものとともに、1時間にわたってインキュベートした。ブロットを洗浄し、ECLプラス・ウエスタン・ブロッティング検出キット(アマーシャム・ファルマシア・バイオテック社)を使用してペルオキシダーゼ共役結合抗体を検出した。
年齢が83歳(#506)〜17歳(#517)の男性ドナーから採取した視神経頭部から、2つの篩板(LC)細胞系を樹立した。ヒト篩板細胞から単離した細胞は、他の研究(Lambert他、2001年)で観察されたのと同様、広がっていて平坦な形状であり、目立つ核を持っていた。他のグループで行なわれたキャラクタリゼーションの結果と同様、LC細胞は、免疫活性を、α平滑筋アクチンに対して(図82a)と、多数の細胞外マトリックスタンパク質、例えば細胞フィブロネクチン(図82b)、ラミニン(図82c)、コラーゲンIとコラーゲンIV(データは示さず)に対して示した(Clark他、1995年;Hernandez他、1998年;HernandezとYang、2000年;Lambert他、2001年)。グリア繊維酸性タンパク質(GFAP)に対するLC細胞の負の免疫活性も観察されたが、これは以前の知見と一致している(図82d)(Lambert他、2001年)。これらの知見は、単離された細胞が、視神経頭部の星状細胞であるというよりは、LC細胞であることを支持している。
血液の採取とPBMCの調製
約10mlの血液を健康なそれぞれのドナーから採取した。その血液は静脈穿刺によって採取し、抗凝血剤としてクエン酸ナトリウムを含む真空容器に入れた。サンプルは、回収から24時間以内に処理した。
PBMCを単離し、ウエル1つにつき細胞が2×105〜5×105個となるように植えた。細胞をホルボール12-ミリステート13-アセテート(PMA;ウエル1つにつき100ng)で処理した。72時間経過した時点で培地を交換した。その培地は、刺激因子をまったく含んでいなかった。今度は96時間後、PBMCにPMAを添加した後、リポ多糖(LPS;ウエル1つにつき100ng;大腸菌の血清型0111からのもの)をウエルに添加した。サンプルの回収は、図91に示してあるように、LPSを添加する前(96時間)と、添加後のさまざまな時点で行なった。接着細胞(単球とマクロファージらしい)と浮遊細胞(リンパ球らしい)の両方を回収した。サンプルを回収してサイトカインの分泌を分析するため、各ウエルからの培地を清潔なマイクロ遠心管に移し、13,000×gで3分間にわたって遠心分離することにより、あらゆるゴミを除去した。得られたペレットを接着細胞とともに回収した。培地を-20℃で保管し、分析する前に200〜250μlのアリコートに分けた。細胞を37℃のリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)1mlで洗浄した後、沸騰している溶解用緩衝液(50mMのトリス(pH7.2)、2%SDS;ウエル1つにつき100μl)の中で溶解させた。細胞ライセートを煮沸し、凍結させて-20℃で保管した。ウエスタン・ブロットを図92に、対応するELISAの結果を図93に示してある。
PBMCを単離し、ウエル1つにつき細胞が2×105〜5×105個となるように植えた。どの刺激因子がアポトーシス特異的eIF-5Aを誘導するかを明らかにするためと、刺激因子同士が相乗作用するかどうかを知るため、PBMCをフィトヘマグルチニン(PHA;100ng/ml)、ホルボール 12-ミリステート13-アセテート(PMA;ウエル1つにつき100ng)、リポ多糖(LPS;100ng/ml)のいずれか、またはこれら3つのすべて(それぞれ100ng/ml)で刺激した。刺激してから12時間後と36時間後にサンプルを回収し、アポトーシス特異的eIF-5Aの発現を分析した(図94)。
PBMCを調製した日にPBMCにトランスフェクションを行なった。ウエル1つにつき細胞が2×105〜5×105個となるように植えた(24ウエルのプレートに、ウエル1つにつき150μl)。細胞は、各ウエルに個別にトランスフェクトする(ドナー77、78、79;図95と図96)か、すべてを一度に円錐形チューブに入れてから植えた(ドナー80、84;図96)。トランスフェクトされる細胞を含む各ウエル用に、15ピコモルのsiRNAを50μlのオプティ-メム(シグマ社)で希釈した。1μlのリポフェクタミン2000(インヴィトロジェン社)を49μlのオプティ-メム(シグマ社)で希釈し、7〜10分間にわたってインキュベートし、希釈したsiRNAに添加し、25分間にわたってインキュベートした。トランスフェクション培地を細胞の上に載せ、その細胞を37℃にした増殖チェンバーの中で4時間にわたってインキュベートした。最終的なトランスフェクション培地は、血清を9%含んでいた。インキュベーションの後、250μlの無血清RPMI+21%FBSを細胞に添加して最終血清濃度を15%にした。
上に大まかに説明したようにしてPBMCにトランスフェクションを行なってから72時間後、リポ多糖(LPS;ウエル1つにつき100ng;大腸菌の血清型0111からのもの)を、培地500μlの中に入れた細胞に添加した。刺激後24時間の時点でサンプルを回収した。LPSで処理したウエルと、トランスフェクションだけを行なったウエル(すなわち刺激なし)の両方を回収した。サンプルを回収してサイトカインの分泌を分析するため、各ウエルからの培地を清潔なマイクロ遠心管に移し、13,000×gで3分間にわたって遠心分離することにより、あらゆるゴミを除去した。得られたペレットを接着細胞とともに回収した。培地を-20℃で保管し、分析する前に200〜250μlのアリコートに分けた。細胞を37℃のリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)1mlで洗浄した後、沸騰している溶解用緩衝液(50mMのトリス(pH7.2)、2%SDS;ウエル1つにつき100μl)の中で溶解させた。細胞ライセートを煮沸し、BCAでタンパク質の定量を行なうために凍結させて-20℃で保管した。
細胞の培養
HT-29細胞(ヒト直腸大腸腺がん細胞系)を、10%ウシ胎仔血清(FBS)を含むRPMIの中に維持した。U937(組織球リンパ腫細胞系)を、10%FBSを含むRPMIの中に懸濁させて増殖させた。両方の細胞系を、CO2が5%の湿潤な環境の中で37℃に維持した。U937細胞を用いた実験を行なうため、細胞をカウントし、実験を開始する2日前に細胞を1mlにつき3×105個に調節した。実験の1日目、400×gで10分間にわたって遠心分離することによって細胞を回収し、得られた細胞ペレットを、10%FBSを含む新鮮なRPMI培地の中に再び懸濁させ、遠心分離をもう一度行ない、再びペレット化した細胞を、FBSを含まない新鮮なRPMI培地の中に再び懸濁させた。細胞をカウントし、1mlにつき2×106個に調節した。
ヒトのアポトーシス特異的eIF-5A配列に基づいてsiRNA配列を設計し、そのsiRNA配列をダルマコンRNA法によって合成した。アポトーシス特異的eIF-5A siRNA(h5A1)標的配列は、5'NNGCUGGACUCCUCCUACACA3'であった。対応する二本鎖siRNA配列は、
5'GCUGGACUCCUCCUACACAdTdT3'
3'dTdTCGACCUGAGGAGGAUGUGU5'であった。
対照siRNA(h対照)配列は、5'NNACACAUCCUCCUCAGGUCG3'であった。対応する二本鎖siRNA配列は、
5'ACACAUCCUCCUCAGGUCGdTdT3'
3'dTdTUGUGUAGGAGGAGUCCAGC5'であった。
トランスフェクションの前日、HT-29細胞を、24ウエルのプレートに、ウエル1つにつき105,000個となるように植えた。トランスフェクトされる細胞を含む各ウエル用に、25.5ピコモルのsiRNAを50μlのオプティ-メム(シグマ社)で希釈した。1μlのリポフェクタミン2000(インヴィトロジェン社)を49μlのオプティ-メム(シグマ社)で希釈し、7〜10分間にわたってインキュベートし、希釈したsiRNAに添加し、25分間にわたってインキュベートした。トランスフェクトされる細胞を無血清RPMIで1回洗浄した後、300μlの無血清RPMIを添加し、その上に100μlのトランスフェクション培地を載せた。細胞を増殖チェンバーの中に戻して4時間にわたってインキュベートした。インキュベーションの後、300μlの無血清RPMI+30%FBSを細胞に添加した。
アポトーシス特異的eIF-5Aと対照siRNAをオプティ-メム培地(シグマ社)で希釈した。0.4mmの電気穿孔用キュベットの中で400μlの細胞(800,000個の細胞)と100ピコモルのsiRNAを混合した。ECM 830エレクトロスクエア穿孔装置(BTX社、サン・ディエゴ、カリフォルニア州)を用い、300V、10ミリ秒、1パルスで細胞に電気穿孔した。電気穿孔の後、細胞を穏やかに混合し、RPMIと濃縮FBSを含むウエルに添加し、FBSの最終濃度を10%にした。
スズキら(2003年)によって開発された方法に従い、HT-29細胞の中でTNF-αの産生を誘導した。トランスフェクションの48時間後、HT-29細胞を200単位/mlのインターフェロンγ(ロッシュ・ディアグノスティックス社)で刺激した。インターフェロンγ(IFN-γ)で刺激してから16時間後、細胞を培地で洗浄し、リポ多糖(LPS;100ng/ml;大腸菌の血清型0111からのもの)を100μg/mlの割合で添加した。LPSで刺激してから8時間後または24時間後、各ウエルからの培地をマイクロ遠心管に移し、ELISAでTNF-αを調べるために-20℃で保管した。細胞を、37℃に加熱した1mlのリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で洗浄した後、沸騰している溶解用緩衝液(50mMのトリス(pH7)、2%SDS)の中で溶解させた。細胞ライセートを沸騰させ、-20℃で凍結させて保管した。ウシ血清アルブミンを基準として用いたビシンコニン酸アッセイ(BCA)により、細胞ライセート中のタンパク質濃度を調べた。
U937細胞を回収し、電気穿孔の16時間後にカウントした。24ウエルのプレートの各ウエルに、培地1mlにつき細胞を200,000個添加した。ホルボール 12-ミリステート13-アセテート(PMA;100ng/ml)を添加することによってマクロファージの分化を促進した。PMAを添加してから48時間後、80%を超える単球が、懸濁した細胞(単球)から接着細胞(マクロファージ)へと変化していた。48時間の時点で培地と非接着細胞を取り出し、10%FBSを含む新鮮なRPMI培地(ウエル1つにつき1ml)を添加した。細胞を新鮮な培地の中に24時間放置すると不活性になった。
U937細胞にPMAを添加してから72時間後、リポ多糖(LPS;100ng/ml;大腸菌の血清型0111からのもの)、またはインターフェロンγ(IFN-γ;100単位/ml)、またはLPSとIFN-γの組み合わせをウエルに添加した。サンプルの回収は、図108に示してあるように、刺激因子を添加する前(72時間)と、添加後のさまざまな時点で行なった。サンプルを回収してサイトカインの分泌を分析するため、各ウエルからの培地を清潔なマイクロ遠心管に移し、13,000×gで3分間にわたって遠心分離することにより、あらゆるゴミを除去した。培地を-20℃で保管し、分析する前に200〜250μlのアリコートに分けた。細胞を37℃のリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)1mlで洗浄した後、沸騰している溶解用緩衝液(50mMのトリス(pH7.2)、2%SDS;ウエル1つにつき75μl)の中で溶解させた。同様のウエルをプールした。細胞ライセートを煮沸し、凍結させて-20℃で保管した。
すべての培地サンプルを-20℃で保管した。アッセイ・デザインズ社のELISAキットを製造会社の指示に従って用い、TNFαを定量した。そのとき、基準として1mlにつき0〜250pgのTNF-αを供給した。U937で実験を行なうため、TNFαのための培地サンプルをRPMI+10%FBSを用いて20倍(0時間、3時間LPS)または80倍(6時間、24時間、30時間LPS)に希釈した。液相電気化学発光(ECL)法によってIL-1β、IL-8、IL-6を定量した。HT-29での実験からの培地は希釈しなかった。サイトカイン測定の結果はすべて、ウエル1つ当たりの全細胞タンパク質の量で補正した。
ウシ血清アルブミンを基準として使用し、ビシンコニン酸アッセイ(BCA)によって細胞ライセート中のタンパク質の濃度を測定した。10%または14%SDS-PAGE(ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動)により、全細胞タンパク質5μgを分離した。50kDaを超えるタンパク質(TLR4、IFN-γ、TNF-R1、iNOS)の分析には10%ゲルを用いたのに対し、アポトーシス特異的eIF-5A(17kDa)の分析には14%ゲルを用いた。半乾燥トランスファー・ユニット(バイオ-ラド社)を利用し、トランスファー用緩衝液(48mMのトリス、39mMのグリシン、1.3mMのSDS、pH9.2;15Vで18分間)を用いてゲルをポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜に移した。5%のスキムミルクを含むPBS-t(0.1%のツイーン20を含むPBS)を用いて膜を1時間にわたってブロックした。一次抗体をこのブロック溶液で希釈し、揺すりながらすべてのブロットを室温でインキュベートした。使用した一次抗体は、アポトーシス特異的eIF-5A(BDバイオサイエンシーズ社;1:20,000;1時間インキュベート;アポトーシス特異的eIF-5AとeIF-5A2の両方を認識)、TLR4(サンタ・クルス・バイオテクノロジー社;TLR4(H-80):sc-10741;1:1000;2時間インキュベート)、IFN-γRα(サンタ・クルス・バイオテクノロジー社;IFN-γRα(C-20):sc-700;1:1000;1時間インキュベート)、TNF-R1(サンタ・クルス・バイオテクノロジー社;TNF-R1(H-5):sc-8436;1:200;3時間インキュベート)、iNOS(BDトランスダクション・ラボラトリーズ社:610431;1:10,000;1時間インキュベート)、β-アクチン(オンコジーン社;アクチン(Ab-1);1:20,000;1時間インキュベート)であった。一次抗体とともにインキュベートした後、ブロットをPBS-tで5〜10分間ずつ3回洗浄した。セイヨウワサビのペルオキシダーゼ(HRP)と共役した二次抗体を1%スキムミルクで希釈し、膜とともに1時間にわたってインキュベートした。使用した二次抗体は、抗マウスIgG-HRP(シグマ社;1:5000;アポトーシス特異的eIF-5AとTNF-R1用)、抗ウサギIgG-HRP(アマーシャム・ファルマシア・バイオテック社;1:2500;TLR4とIFN-γRα用)、抗マウスIgM-HRP(カルバイオケム社;1:5000;アクチン用)であった。二次抗体とともにインキュベートした後、ブロットをPBS-tで5〜10分間ずつ4回洗浄した。増強化学発光検出試薬(ECL;アマーシャム・ファルマシア・バイオテック社)を製造会社の指示に従って用いてブロットを現像し、バンドをX線フィルム(富士フィルム社)上で可視化した。
トランスフェクトされたHT-29細胞がIFN-γに応答してTLR4のmRNAの発現を変化させるのを観察するため、Medvedevら(2002年)に従ってRT-PCRを実行した。どのサンプルでも同量のcDNAが使用されていることを確認するため、GAPDHの発現を対照として利用した。PCRサイクルの数を増やしながら(20、25、30、35サイクル)、非飽和条件下で増幅産物が検出可能になる最適なサイクル数を決定した。PCR産物は、臭化エチジウムの組み込みによって検出し、アガロース・ゲル電気泳動によって分離した。siRNAをトランスフェクトしたHT-29細胞をIFN-γで6時間にわたって処理した後に、またはIFN-γで処理せずに単離した全mRNAのRT-PCRを利用し、TLR4転写産物とGAPDH転写産物を検出した。HT-29細胞には、すでに説明したようにしてsiRNAをトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、細胞を1ml当たり200単位のIFN-γで処理した。IFN-γで処理しなかった対照細胞は、培地を交換しただけであった。GenElute哺乳動物RNAミニプレップ・キット(シグマ社)を製造会社のプロトコルに従って使用し、接着細胞に関して全mRNAを単離した。培地を取り出し、細胞を温かいPBSで2回洗浄した。溶解用緩衝液を細胞に添加し、ライセートをマイクロ遠心管に移し、全RNAを製造会社のプロトコルに従って単離した。
順プライマー5'CGGATGGCAACATTTAGAATTAGT3'
逆プライマー5'TGATTGAGACTGTAATCAAGAACC3'
予想される断片のサイズ:674bp。
順プライマー5'CTGATGCCCCCATGTTCGTCAT3'
逆プライマー5'CCACCACCCTGTTGCTGTAG3'
予想される断片のサイズ:599bp。
混合物:
RNA 2.5μg
ポリ(T)プライマー 6.25μl
Depc水 13.75μlになるまで
5分間にわたって70℃に加熱
5分間にわたって氷の上で冷却
添加物:
5×AMV緩衝液 5.0μl
dNTP(10mM) 2.5μl
RNアーゼ阻害剤 1.25μl
AMV RT 2.5μl
60分間にわたって42℃に加熱
10分間にわたって70℃に加熱。
10×Tsg緩衝液 2.0μl
dNTP(10mM) 0.4μl
順プライマー(25ピコモル/μl) 0.4μl
逆プライマー(25ピコモル/μl) 0.4μl
MgCl2(15mM) 2.0μl
CDNA 0.8μl
H2O 13.88μl
Tsgポリメラーゼ 0.12μl。
5分間にわたって95℃に加熱
95℃で1分間、55℃で1分間、72℃で2分間を20サイクル、または25サイクル、または30サイクル、または35サイクル
72℃で10分間伸長
4℃に下げる。
5分間にわたって95℃に加熱
95℃で1分間、57℃で1分間、72℃で2分間を20サイクル、または25サイクル、または30サイクル、または35サイクル
72℃で10分間伸長
4℃に下げる。
Claims (6)
- 配列番号29のヌクレオチド配列によってコードされるアポトーシス特異的eIF−5Aの内在性発現を抑制するsiRNAを含む、siRNAをインビボでヒトの肺細胞に送達するための医薬組成物であって、siRNAが、配列番号44に示す配列、配列番号47に示す配列、配列番号50に示す配列及び配列番号53に示す配列からなる群から選択される一つの配列を標的する、鼻腔内に投与される、医薬組成物。
- 前記siRNAが配列番号45及び46に示す配列を有する、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記siRNAが配列番号48及び49に示す配列を有する、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記siRNAが配列番号51及び52に示す配列を有する、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記siRNAが配列番号54及び55に示す配列を有する、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記肺細胞内における配列番号29のヌクレオチド配列によってコードされるアポトーシス特異的eIF−5Aの前記内在性発現抑制が、当該細胞に対して、その細胞内でのアポトーシス抑制、その細胞内でのp53の発現低下、その細胞内で産生されるサイトカインのレベル低下、その細胞内でのBcl−2の発現増大、その細胞内で産生されるミエロペルオキシダーゼのレベル低下、その細胞内での活性なNFκBのレベル低下、その細胞内でのTLR4のレベル低下、その細胞内でのTNFR−1のレベル低下、及びその細胞内でのiNOSのレベル低下からなる群より選ばれる効果を当該細胞に対して及ぼす、請求項1に記載の医薬組成物。
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