CN102282259A - 与有义构建体实现期望多核苷酸的表达的用途相组合的、sirna实现内源基因的减量调节的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及靶向内源基因的SIRNA来敲除或敲低宿主中内源基因的表达、以及处在递送运载体/表达载体中编码所述基因的多核苷酸向宿主递送来提供所述多核苷酸编码的蛋白质在宿主中的表达的组合用途。
Description
发明领域
本发明涉及组合的用途,即,靶向基因的siRNA敲低或敲除该内源基因的表达的用途以及编码外源基因的多核苷酸影响该基因的表达的用途。
发明背景
相对近来地,研究人员注意到双链RNA(“dsRNA”)可以用于抑制蛋白质表达。沉默基因的这种能力具有用于治疗人类疾病的广大潜力,当前许多研究人员和商业实体在开发基于这种技术的治疗方面投注了相当大的资源。
双链的RNA诱导的基因沉默可以在至少三种不同的水平上发生:(i)转录灭活,这是指RNA指导的DNA或组蛋白甲基化;(ii)siRNA诱导的mRNA降解;和(iii)mRNA诱导的转录减弱。
一般认为的是,在哺乳动物细胞中RNA诱导的沉默(RNA干扰,或RNAi)的主要机制是mRNA降解。在哺乳动物细胞中利用RNAi的初步尝试集中于利用dsRNA的长链。然而,诱导RNAi的这些尝试获得有有限的成功,部分是由于干扰素应答的诱导,这引起蛋白质合成的一般性抑制,与目标特异性抑制相反。因而,长dsRNA不是哺乳动物系统中RNAi的可行的选择。
更近一些,已经显示的是,当短(18-30bp)RNA双螺旋被导入培养物中的哺乳动物细胞中时,可以实现目标mRNA的序列特异性抑制而不诱导干扰素应答。这些短dsRNA中的某一些,被称为小抑制性RNA(“siRNA”)的,可以在亚摩尔浓度下催化性地起作用来裂解细胞中超过95%的目标mRNA。在Provost et al.(2002)RibonucleaseActivity and RNA Binding of Recombinant Human Dicer,EMBO J.21(21):5864-5874;Tabara et al.(2002)The dsRNA Binding ProteinRDE-4 Interacts with RDE-1,DCR-1 and a DexH-box Helicase to DirectRNAi in C.elegans,Cell 109(7):861-71;Ketting et al.(2002)DicerFunctions in RNA Interference and in Synthesis of Small RNA Involvedin Developmental Timing in C.elegans;Martinez et al.,Single-StrandedAntisense siRNAs Guide Target RNA Cleavage in RNAi,Cell 110(5):563;Hutvagner & Zamore(2002)A microRNA in amultiple-turnover RNAi enzyme complex,Science 297:2056中描述了siRNA活性的机制的说明以及它的一些应用。
从机制的角度,长双链RNA向植物和无脊椎动物细胞中的导入被称为Dicer的III型核酸内切酶分解成siRNA。Sharp,RNAinterference-2001,Genes Dev.2001,15:485.Dicer,一种核糖核酸酶-III样酶,将dsRNA加工成19-23碱基对的短干扰RNA,其具有特征性的两个碱基的3′突出。Bernstein,Caudy,Hammond,& Hannon(2001)Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNAinterference,Nature 409:363。siRNA然后掺入到RNA诱导的沉默复合物(RISC)中,其中一种或更多种解旋酶展开siRNA双螺旋,允许互补的反义链来指导目标识别。Nykanen,Haley,& Zamore(2001)ATPrequirements and small interfering RNA structure in the RNAinterference pathway,Cell 107:309.在结合到合适的目标mRNA时,RISC内的一种或更多种核酸内切酶裂解目标来诱导沉默。Elbashir,Lendeckel,& Tuschl(2001)RNA interference is mediated by 21-and22-nucleotide RNAs,Genes Dev.15:188,FIG.1.
干扰作用可以是长久持续的,可以在许多次细胞分裂之后检测到。此外,RNAi展现了序列特异性。Kisielow,M.et al.(2002)Isoform-specific knockdown and expression of adaptor protein ShcAusing small interfering RNA,J.Biochem.363:1-5.因而,RNAi机制可以特异性地敲低一种转录产物,而不影响紧密相关的mRNA。这些性质使得siRNA成为抑制基因表达和研究基因功能和药物靶点验证的潜在有价值的工具。此外,对于:(1)由基因的过量表达或错误表达所引起的疾病;和(2)由含有突变的基因的表达所导致的疾病,siRNA作为治疗试剂是可能有用的。
成功的siRNA依赖性基因沉默取决于许多因素。在RNAi中最具争议的问题之一是siRNA设计、即,考虑使用的siRNA的序列的必需性的问题。在C.elegans和植物中的早期工作通过引入长的dsRNA绕过了设计的问题(参见,例如,Fire,A.et al.(1998)Nature391:806-811)。在这种原始的生物体中,长dsRNA分子被Dicer裂解成siRNA,从而产生可以潜在地覆盖全部转录产物的双螺旋的各种群体。虽然这些分子的一些部分是非功能性的(即,不诱导或很少诱导沉默),一种或更多种可能具有潜力成为高度功能性的,从而沉默感兴趣的基因并减少siRNA设计的必要性。令人遗憾地,由于干扰素应答,这种相同的方法对于哺乳动物系统不是可用的。虽然这种效应可以通过回避Dicer裂解步骤并直接导入siRNA来绕过,这种策略带有风险,即所选的siRNA序列可能是无功能的或半功能的。
许多研究表述了siRNA设计不是RNAi的关键要素的观点。另一方面,本领域中的其它人开始探索通过注意siRNA的设计来使得RNAi更有效率的可能性。
为了治疗各种疾病或病症,某些蛋白质的增量调节是期望的,但这可能不是所需的全部。例如,可能需要siRNA的组合使用来敲低或敲除内源蛋白或不同蛋白质的表达。本发明将满足这种需求,并提供了治疗癌症、特别是多发性骨髓瘤的方法。
癌症,包括多发性骨髓瘤,是将会受益于诱导细胞凋亡的能力的疾病。多发性骨髓瘤的常规的疗法包括化学治疗、干细胞移植、伴有干细胞移植的高剂量化学治疗以及补救(salvage)疗法。化学治疗包括用Thalomid(沙利度胺)、bortezomib、Aredia(pamidronate)、类固醇和Zometa(唑来膦酸)治疗。然而,许多化学治疗药物对于活跃地分裂的非癌细胞,例如骨髓、胃和肠的粘膜和毛囊的细胞是有毒的。因此,化学治疗可能引起血细胞计数的降低、恶心、呕吐、腹泻和脱发。
常规的化学治疗或标准剂量的化学治疗一般是用于多发性骨髓瘤患者的主要的或初步的治疗。患者也可能接受化学治疗作为高剂量化学治疗和干细胞移植的预备。诱导疗法(在干细胞移植之前的常规的化学治疗)可以用于在移植之前降低肿瘤负荷。某些化学治疗药物比其它的更适合于诱导疗法,因为它们对于骨髓细胞是较低毒性的,产生来自骨髓的更大的干细胞产量。适合于诱导疗法的化学治疗药物的实例包括地塞米松、沙利度胺/地塞米松、VAD(组合的长春新碱、Adriamycin(多柔比星)和地塞米松)以及DVd(组合的聚乙二醇化的脂质体多柔比星(Doxil,Caelyx)、长春新碱和降低的日程地塞米松)。
多发性骨髓瘤的标准治疗是与泼尼松(皮质类固醇药物)组合的米尔法兰,实现50%的响应率。令人遗憾地,米尔法兰是烷化剂,不太适合于诱导疗法。皮质类固醇(特别是地塞米松)有时单独用于多发性骨髓瘤治疗,特别是在年长的患者和不能耐受化学治疗的患者中。单独地或与其它试剂组合地,地塞米松也用于诱导疗法。VAD是最常用的诱导疗法,但是DVd近年来显示了在诱导疗法中是有效的。近来Bortezomib已经被批准用于多发性骨髓瘤的治疗,但是它是非常有毒的。然而,现有疗法都没有提供治愈的显著可能性。因而,仍然需要寻找用于癌症和多发性骨髓瘤的适合的治疗。本发明满足了这种需求。
发明概述
本发明涉及靶向内源基因的siRNA来敲除或敲低宿主中内源基因的表达、以及处在递送运载体/表达载体中编码基因的多核苷酸向宿主递送来提供所述多核苷酸编码的蛋白质在宿主中的表达的组合用途。编码正常(非缺陷的)蛋白质(或蛋白质本身)的多核苷酸被施用给宿主,或被表达(对于所述多核苷酸来说),从而所述正常蛋白质可以进行它的必需的功能。siRNA优选地被设计以靶向基因的区域,从而它敲低或敲除缺陷蛋白质的内源表达,但同时不影响所施用的编码正常蛋白质的多核苷酸的外源表达。
本发明提供了一种组合物,其包含靶向eIF5A1的3′末端的eIF5A1siRNA、包含编码突变体eIF5A1的多核苷酸的表达载体的复合物,其中所述突变体eIF5A1不能被羟丁赖氨酸化,和其中所述siRNA和所述表达载体复合到聚乙烯亚胺来形成复合物。
本发明提供了包含靶向目标基因来抑制受试者中目标基因的内源表达的siRNA、以及编码能够在受试者中表达的目标蛋白质的多核苷酸的组合物。在某些实施方式中,所述多核苷酸处在RNAI抗性质粒中(将不被siRNA抑制)。所述siRNA和所述质粒优选地复合到聚乙烯亚胺来形成复合物。
在某些实施方式中,所述siRNA具有附图25中所示的序列,其中编码突变体eIF5A1的多核苷酸是eIF5A1K50R。所述表达载体包含编码突变体eIF5A1的多核苷酸和可操作连接的启动子,来提供在受试者中所述多核苷酸的表达。所述启动子优选地是组织特异性的或全身性的。例如,如果所述组合物被用于治疗癌症,则优选的,所述启动子是对癌症存在的组织是组织特异性的。例如,对于治疗多发性骨髓瘤,优选的是使用B细胞特异性启动子,例如B29。在某些实施方式中,所述表达载体包含pCpG质粒。
在某些实施方式中,eIF5A1 siRNA和包含突变体eIF5A1多核苷酸的表达载体独立地复合到聚乙烯亚胺,例如,in vivo JetPEITM。在其它实施方式中,eIF5A1 siRNA和包含突变体eIF5A1多核苷酸的表达载体一起复合到聚乙烯亚胺。
本发明进一步提供了包含靶向eIF5A1的3′末端的eIF5A1 siRNA和表达载体的组合物,所述表达载体包含编码突变体eIF5A1的多核苷酸,其中所述突变体eIF5A1不能被羟丁赖氨酸化,其中所述siRNA和所述表达载体被递送给受试者来治疗癌症。所述癌症可以是任何癌症,包括多发性骨髓瘤。
本发明进一步提供了治疗癌症的方法,包括向受试者(包括但不限于哺乳动物和人类)施用本发明的组合物。
所述组合物可以以任何可接受的途径施用,例如但不限于,静脉内地、腹膜内地、皮下地或肿瘤内地。siRNA和表达载体可以在不同的时间和经由不同的途径施用,或可以同时地经由相同的途径一起施用。例如,但不限于,siRNA可以裸露地或复合到载体如in vivo jetPEI经由IV来递送,表达载体可以肿瘤内地施用,或者siRNA和表达载体可以都IV或肿瘤内地施用,等等。
本发明提供了抑制癌细胞生长和/或杀死癌细胞的方法。本发明还提供了抑制或减慢癌细胞转移的能力的方法。抑制癌症生长包括肿瘤的大小的降低、肿瘤的生长方面的降低,也可以包括肿瘤的完全缓解。癌症可以是任何癌症或肿瘤,包括但不限于结肠癌、结肠直肠腺癌、膀胱癌、子宫颈腺癌和肺癌。优选的,所述癌症是多发性骨髓瘤。
在优选的实施方式中,eIF-5A是不能被羟丁赖氨酸化的突变体。在此描述了示范性的突变体。
除了向受试者提供eIF-5A或编码eIF-5A的多核苷酸(来提供eIF-5A的表达)之外,提供siRNA来敲除或敲低eIF-5A的内源表达。
本发明还提供了eIF5A、编码eIF5A1的多核苷酸、针对eIF5A1的siRNA来制造治疗患有多发性骨髓瘤的受试者中的acner杀死多发性骨髓瘤细胞的药物的用途。优选的,编码突变体eIF-5A的多核苷酸不能被羟丁赖氨酸化。
本发明还提供了治疗镰状细胞贫血的方法。编码健康血红蛋白基因(例如HBB)的多核苷酸被施用给患有镰状细胞贫血的患者。结合地,所述患者也施用siRNA,所述siRNA靶向编码缺陷血红蛋白基因的基因(例如,编码突变体HbS的基因)来敲低或敲除缺陷蛋白质的表达。治疗可以进一步包括通常用于治疗镰状细胞贫血的其它已知的药物或治疗的施用。
附图的简要说明
附图1提供了人类eIF-5A1的氨基酸序列,显示了各个重要的位点。
附图2显示了eIF-5A1在K50和K67处的突变提高了转染的蛋白质的积累。参见实施例1。
附图3显示了eIF5A1在K47、K50和K67处的突变提高了转染的蛋白质的积累。参见实施例2。
附图4显示了在K50和K67处的eIF5A1的突变当转染到KAS细胞中时引起了细胞凋亡的诱导。参见实施例3。
附图5显示了在K50和K67处的eIF5A1的突变当转染到KAS细胞中时引起了细胞凋亡的诱导。参见实施例4。
附图6显示了在K60和K67处的eIF5A1的突变当转染到KAS细胞中时引起了细胞凋亡的诱导。参见实施例5。
附图7A显示了用siRNA转染和用被修饰以表达eIF-5A1的腺病毒处理引起了KAS细胞中的细胞凋亡。参见实施例6A。附图7B显示了用eIF5A1 siRNA(针对靶#1(SEQ ID NO:1))(附图25中显示的siRNA构建体的序列)的预处理降低了内源eIF5A1的表达,但是容许腺病毒表达的RNAi抗性eIF5Ak50A的积累。参见实施例6B。附图7C显示了在腺病毒感染之前用针对靶#1的eIF5A1 siRNA预处理降低人类多发性骨髓瘤细胞中磷酸化的NF-κB的表达。参见实施例6C。附图7D显示了在腺病毒感染之前用针对靶#1的eIF5A1 siRNA预处理降低人类多发性骨髓瘤细胞中磷酸化的NF-κB和ICAM-1的表达。参见实施例6D。附图7E显示了在人类多发性骨髓瘤细胞中siRNA介导的eIF5A的抑制抑制了LPS介导的NFκB DNA结合活性的诱导。eIF5A siRNA对NFκB活性的抑制作用可以解释当与eIF5AK50R的过量表达组合时它提高细胞凋亡诱导的能力,因为NF-κB调节许多促-存活和抗细胞凋亡途径。附图7F显示了用siRNA预处理KAS细胞通过在存在IL-6的情况下的eIF5A1K50R基因递送提高了细胞凋亡。参见实施例6E。
附图8显示了eIF5A1质粒和eIF5A1 siRNA的共同施用延缓了多发性骨髓瘤皮下肿瘤的生长。显示的数据是每个组中所有小鼠的肿瘤体积。参见实施例7。
附图9显示了eIF5A1质粒和eIF5A1 siRNA的共同施用延缓了多发性骨髓瘤皮下肿瘤的生长。显示的数据是每个组的平均肿瘤体积+/-标准误差。参见实施例7。
附图10显示了eIF5A1质粒和eIF5A1 siRNA的共同施用降低了多发性骨髓瘤皮下肿瘤的重量。参见实施例7。
附图11显示了eIF5A1质粒和eIF5A1 siRNA的共同施用延缓了多发性骨髓瘤皮下肿瘤的生长并引起了肿瘤收缩。参见实施例8。
附图12显示了静脉内(i.v.)的eIF5A1 siRNA和肿瘤内(i.t.)的PEI/eIF5A1K50R质粒复合物的施用引起了多发性骨髓瘤皮下肿瘤的肿瘤收缩。参见实施例9。
附图13A显示了eIF5A1质粒和eIF5A1 siRNA的治疗延缓了多发性骨髓瘤皮下肿瘤的生长并引起了肿瘤收缩。附图13B显示了eIF5A1质粒和eIF5A1 siRNA的共同施用引起了肿瘤皱缩。附图13C显示了静脉内(i.v.)的eIF5A1 siRNA和肿瘤内(i.t.)的PEI/eIF5A1K50R质粒复合物的施用引起了多发性骨髓瘤皮下肿瘤的肿瘤收缩。
附图14显示了eIF5A1质粒和eIF5A1 siRNA的静脉内共同施用延缓了多发性骨髓瘤皮下肿瘤的生长。参见实施例10。
附图15显示了静脉内(i.v.)的eIF5A1 siRNA和静脉内(i.v.)或腹膜内(i.p.)的PEI/eIF5A1K50R质粒复合物的施用延缓了多发性骨髓瘤皮下肿瘤的生长。参见实施例11。
附图16显示了用eIF5A1质粒和eIF5A1 siRNA治疗延缓了多发性骨髓瘤皮下肿瘤的生长。
附图17显示了eIF5A1质粒和eIF5A1 siRNA的共同施用延缓了多发性骨髓瘤皮下肿瘤的生长并引起了肿瘤收缩。参见实施例12。
附图18显示了静脉内(i.v.)的eIF5A1 siRNA和肿瘤内(i.t.)的PEI/eIF5A1K50R质粒复合物的施用引起了多发性骨髓瘤皮下肿瘤的肿瘤收缩。参见实施例13。
附图19显示了由EF1或B29启动子驱动的eIF5A1K50R质粒、与eIF5A1 siRNA的共同施用延缓了多发性骨髓瘤皮下肿瘤的生长并引起肿瘤收缩(KAS-SQ-5)。参见实施例14。
附图20显示了eIF5A1 siRNA的共同施用提高了由EF1或B29启动子驱动的eIF5A1K50R质粒对多发性骨髓瘤皮下肿瘤的抗肿瘤作用并产生了降低的肿瘤负荷(KAS-SQ-5)。参见实施例15。
附图21显示了eIF5A1 siRNA协同地提高肺腺癌细胞中源自Ad-eIF5A的感染的细胞凋亡。参见实施例16。
附图22显示了pExp5A的图谱,其构建在实施例17中描述。
附图23显示了pExp5A(3371bp)的预测的序列。参见实施例17。
附图24显示了eIF5A1K50R在各种细胞系中的重新表达。参见实施例18。
附图25显示了优选的eIF5A1 siRNA的目标序列和序列。
附图26提供了多发性骨髓瘤中的效力研究的结果。参见实施例21。
附图27提供了多发性骨髓瘤中的效力研究的结果。参见实施例21。
附图28提供了eIF5A1K50R cDNA的序列。
附图29提供了人类eIF5A1相对于人类eIF5A1K50R的比对。
附图30显示了DNA∶siRNA比例对HA-eIF5AK50R表达的影响。参见实施例23。
附图31显示了DNA∶siRNA比例对纳米颗粒转染诱导的细胞凋亡的影响。参见实施例24。
附图32显示了含有eIF5A1K50R质粒和eIF5A1 siRNA(siSTABLE或非siSTABLE)的PEI复合物(N/P=6或8)的施用抑制多发性骨髓瘤皮下肿瘤的生长并引起肿瘤收缩。参见实施例25。
附图33显示了JET PEITM纳米颗粒正被肿瘤组织有效地吸收,以及纳米颗粒正将质粒和siRNA递送给同一细胞。参见实施例26。
发明的详细说明
本发明涉及靶向内源基因的siRNA来敲除或敲低受试者中内源基因的表达、以及处在递送运载体/表达载体中编码所述基因的多核苷酸向受试者提供来提供所述多核苷酸编码的蛋白质在受试者中的表达的组合用途。
这种组合在治疗患有由于缺陷的或突变体蛋白质的存在所引起的疾病或状况的受试者中是有用的,即,其中在所述受试者中产生的所述蛋白质不能进行它必需的功能,或作为选择,由于它的缺陷的结构破坏代谢途径或生物分子相互作用。所述siRNA被设计以靶向编码缺陷蛋白质的基因,并敲低或敲除该缺陷蛋白质的表达。编码正常(非缺陷)蛋白质的多核苷酸被施用给该受试者,在该受试者中表达,从而可获得正常蛋白质来进行它的必需的功能。
在另一个实施方式中,与施用编码期望的蛋白质的多核苷酸不同,所述蛋白质被施用给受试者。术语蛋白质、肽和多肽在此可互换地使用。
siRNA优选地被设计以靶向基因的某些区域,从而它敲低或敲除缺陷蛋白质的内源表达,但同时不影响所施用的编码正常蛋白质的多核苷酸的外源表达。例如,siRNA可以靶向3′UTR,从而它不影响所施用的正义构建体(编码蛋白质的多核苷酸)的外源表达。通过敲低或敲除缺陷基因的内源表达,将有很少的或没有缺陷蛋白质与从外源多核苷酸表达的正常蛋白质竞争。
这种应用将会有用的疾病状态的一个实例涉及镰状细胞贫血。镰状细胞贫血是一种影响血红蛋白的血液病症,血红蛋白是在红细胞(RBC)中存在的、帮助携带氧气贯穿身体的蛋白质。
当人遗传有引起突变体血红蛋白(Hbs)的表达的两个异常基因(每个亲本获得一个)时,发生镰状细胞贫血。突变体血红蛋白引起RBC改变形状。具有正常血红蛋白(血红蛋白A,或HbA)的红细胞容易在血流中移动,将氧气递送给身体的所有细胞。它们可以容易地“挤”过甚至非常小的血管。由于血红蛋白(HbS)的异常形状倾向于凝集在一起,使得红细胞有粘性、僵硬和更为脆性,使得它们形成弯曲的镰刀形状,发生镰状细胞贫血。
虽然已知几百种HBB基因变体,镰状细胞贫血最通常地由血红蛋白变体HbS引起。在这种变体中,疏水性的氨基酸缬氨酸代替了HBB多肽链的第六氨基酸位置处的亲水性的谷氨酸。这种取代产生了蛋白质结构的外侧的疏水性部位,其粘附到邻近的血红蛋白分子的β链的疏水性区域上。HbS分子的这种凝集在一起(聚合化)成为刚性的纤维导致红细胞的“镰状化”。
仅在红细胞释放了它们携带到身体中的各个组织的氧气分子之后发生聚合化。一旦红细胞回到血红蛋白可以结合氧气的肺部,HbS分子的长纤维解聚或破裂成为单独的分子。聚合化和解聚之间的循环导致红细胞膜变得刚硬。这些红细胞的刚性和它们不携带氧气时的扭曲的形状可能引起小的血管的阻塞。这种阻塞可能导致疼痛的发作并可能损伤器官。
镰状细胞贫血是一种常染色体的隐性遗传病症。该疾病要表达,人必需遗传有两个HbS变体的拷贝,或HbS的一个拷贝和另一种变体的一个拷贝。具有正常的HBB基因(HbA)的一个拷贝和HbS的一个拷贝的携带者被称为具有镰状细胞性状但是不表达疾病症状。
因而,本发明的一个实施方式提供了治疗患有镰状细胞贫血的受试者的方法。靶向HBB基因的siRNA被施用给患者。所述siRNA被设计以敲低和优选地敲除血红蛋白的Hbs变体的表达。编码正常血红蛋白的多核苷酸被提供给受试者,从而该受试者表达正常血红蛋白。还设计了siRNA,使得它不会影响编码正常血红蛋白的外源多核苷酸的表达。因而,受试者不再产生变体血红蛋白(或产生实质上很少的),而是产生正常的健康血红蛋白,产生正常地起作用的更为正常的红细胞。
在蛋白质发生翻译后修饰,其引起或导致疾病状态的情况下,本发明也是有用的。siRNA被用于敲低内源蛋白质的表达,从而没有或很少的蛋白质可用于翻译后修饰。然后,向患者提供编码蛋白质的多核苷酸用于外源表达。蛋白质被修饰,从而它不能被翻译后修饰。然后,身体可获得这种蛋白质用于其合适的用途,但是将不导致疾病状态,因为它不能被翻译后修饰。本领域技术人员将理解不同的翻译后修饰。例如,在翻译之后,通过向蛋白质附着其它生物化学官能团,例如乙酸、磷酸、各种脂质和碳水化合物,通过改变氨基酸的化学性质(例如,瓜氨酸化)或通过产生结构改变,例如形成二硫键,氨基酸的翻译后修饰延伸了蛋白质的功能范围。同时,酶可以从蛋白质的氨基末端除去氨基酸,或在中间切割肽链。例如,肽激素胰岛素在二硫键形成之后被切割两次,原肽从链的中部除去;产生的蛋白质由通过二硫键连接的两条多肽链组成。同样,大多数初生的多肽以氨基酸甲硫氨酸开始,因为mRNA上的“起始”密码子也编码这个氨基酸。这个氨基酸通常在翻译后修饰期间被除掉。其它修饰,如磷酸化,是控制蛋白质的行为的常见机制的一部分,例如,活化或灭活一种酶。其它翻译后修饰包括通过脱氧羟丁赖氨酸合酶(DHS)的真核起始因子5A(eIF5A)的羟丁赖氨酸化。
因而,本发明提供了改变受试者中基因表达的方法,其中编码蛋白质的多核苷酸被提供给患者并在所述患者中表达。所述蛋白质可以是正常的/野生型蛋白质或突变的蛋白质。相应的内源基因的表达用施用给所述受试者的siRNA来抑制。
所述方法进一步包括提供包含编码目标蛋白质的多核苷酸的构建体,其中所述多核苷酸在所述受试者中表达来产生所述目标蛋白质。在内源的基因表达缺陷蛋白质的某些实施方式中,多核苷酸被设计以编码正常的/健康的蛋白质。施用siRNA来抑制缺陷内源蛋白质的表达。在内源基因表达正常的健康蛋白质的某些实施方式中,多核苷酸被设计以编码不能被翻译后修饰的突变体蛋白质,所述翻译后修饰将对正常的/健康的或非突变体蛋白质发生。施用siRNA来抑制内源蛋白质的表达,从而很少的这种蛋白质可用于翻译后修饰。
在某些实施方式中,选择或设计siRNA来靶向基因的区域,从而不影响外源多核苷酸的表达。例如,siRNA可以靶向3′UTR或3′末端。
siRNA可以作为裸露的siRNA或对于血清稳定化的裸露siRNA来递送给患者。siRNA可以全身地地注射,即,IP或IV。做为选择,siRNA可以局部地注射或递送到身体的期望的区域。在某些实施方式中,siRNA可以在递送运载体中施用,例如但不限于枝状聚合物、脂质体或聚合物。
编码期望的蛋白质的多核苷酸可以通过任何递送方式施用,所述递送方式提供或容许核苷酸的表达。术语多核苷酸和核苷酸在此可互换地使用。递送可以通过任何病毒或非病毒的机制,例如,但不限于,质粒、表达载体、病毒构建体、腺病毒构建体、枝状聚合物(dendrimer)、脂质体或聚合物。
在某些实施方式中,具有降低的CpG二核苷酸的表达质粒被用于表达所述多核苷酸。可以使用能够促进多核苷酸的表达的任何启动子,其可以根据治疗所期望的应用来选择。例如,为了杀死多发性骨髓瘤,特异于B细胞的启动子可能是期望的,例如,人类B29启动子/增强子。在其它实施方式中,启动子可以是其它组织特异性启动子,或可以是系统启动子。
编码目标蛋白质的多核苷酸可以通过IV或皮下注射或任何其它生物学适合的递送机制来递送。
做为选择,多核苷酸可以在脂质体或提供了DNA(或质粒或表达载体)向目标肿瘤或癌细胞的递送的任何其它适合的“载体”或“运载体”中递送。合成的DNA递送系统的综述参见,例如,Luo,Dan,etal.,Nature Biotechnology,Vol.18,January 2000,pp.33-37。因而,可能优选的是通过纳米大小的运载体,例如脂质体、枝状聚合物或类似的无毒的纳米颗粒来递送核苷酸/质粒/表达载体。当递送有效量的核苷酸/质粒/表达载体给受试者、肿瘤或癌细胞时,运载体优选地保护所述核苷酸/质粒/表达载体免于过早清除或引起免疫反应。示范性的运载体范围可以从与核苷酸/质粒/表达载体缔合的简单的纳米颗粒到更复杂的聚乙二醇化的运载体,例如,具有附着于其表面的配体以靶向特定细胞受体的聚乙二醇化的脂质体。
脂质体和聚乙二醇化的脂质体是本领域已知的。在常规的脂质体中,要递送的分子(即,小的药物、蛋白质、核苷酸或质粒)被包含在脂质体的中央腔中。本领域技术人员将理解,也存在某些对分子递送有用的“秘密”,靶向的和阳离子的脂质体。参见,例如,Hortobagyi,Gabriel N.,et al.,J.Clinical Oncology,Vol.19,Issue 14(July)2001:3422-3433 and Yu,Wei,et al,Nucleic Acids Research.2004,32(5);e48。脂质体可以静脉内地注射,可以被修饰以使得它们的表面更具亲水性(通过向双分子层添加聚乙二醇(“聚乙二醇化”),这提高了它们在血流中的循环时间。这些被称为“秘密”脂质体,作为亲水性(水溶性的)抗癌药物例如多柔比星和米托蒽醌的载体是特别有用的。为促进携带药物的脂质体对目标细胞例如肿瘤细胞的特异性结合性质、特定分子如抗体、蛋白质、肽等等可以附着到脂质体表面上。例如,针对癌细胞上存在的受体的抗体可以用于将脂质体靶向癌细胞。对于靶向多发性骨髓瘤来说,例如,叶酸盐、IL-6或转铁蛋白可以用于将脂质体靶向到多发性骨髓瘤细胞。
枝状聚合物也是本领域已知的,提供了优选的递送运载体。枝状聚合物的论述参见,例如,Marjoros,Istvan,J.,et al.,″PAMAMDendrimer-Based Multifunctional Conjugate for Cancer Therapy:Synthesis,Characterization,和Functionality,″Biomacromolecules,Vol.7,No.2,2006;572-579,和Majoros,Istvan J.,et al.,J.Med.Chem,2005.48,5892-5899。
在优选的实施方式中,递送运载体包括聚乙烯亚胺纳米颗粒。示范性的聚乙烯亚胺纳米颗粒是in vivo-jetPEITM,当前由PolyplusTransfection,Inc生产。in vivo jetPEITM是作为DNA和siRNA递送试剂有用的阳离子聚合物转染试剂。来自Polyplus Transfection的invivo-jetPEITM是提供了动物中的可靠的核酸递送的线性聚乙烯亚胺试剂。它被用于基因治疗(Ohana et al.,2004.Gene Ther Mol Bio8:181-192;Vernejoul et al,2002.Cancer Research 62:6124-31)、RNA干扰(Urbain-Klein et al,2004.Gene therapy 23:1-6;Grezelinski et al.,2006.Human Gene Therapy 17:751-66)和遗传免疫接种(Garzon et al.,2005.Vacine 23:1384-92)。in vivo JET-PEI当前作为癌症基因治疗的递送载体在人类临床试验中使用(Lemkine et al,2002.Mol.Cell.Neurosci.19:165-174)。
in vivo-jetPEITM将核酸浓缩成大约50nm的纳米颗粒,其是几个小时稳定的。作为这种独特的保护机制的结果,与其它试剂相比,在注射之后的血细胞聚集被降低,从而防止了组织内的有限扩散、红血球聚集和微栓化。这些纳米颗粒是足够小的以扩散到组织中和通过内吞作用进入细胞。in vivo-jetPEITM有利于核酸从内涵体释放并转移跨越核膜。
在优选的实施方式中,siRNA和包含多核苷酸的载体/质粒通过invivo-jetPEITM复合物施用给受试者。siRNA和包含多核苷酸的载体/质粒可以通过聚合物复合物,例如聚乙烯亚胺或in vivo jetPEITM复合物来复合在一起,或可以分别地复合到聚合物上。例如,当siRNA和包含多核苷酸的载体/质粒要单独地施用给受试者时(在时间上和/或递送位点上单独地),优选的是使siRNA和多核苷酸复合到不同的载体上。当施用将是同时和同一位点时,可能优选的是将siRNA和多核苷酸复合在一起。
在另一个实施方式中,与施用质粒或载体来递送将要在受试者中表达的多核苷酸不同的是,蛋白质本身被递送给受试者。蛋白质可以是分离的或可以是合成的。
本发明的一个实施方式提供了在受试者,包括哺乳动物和人类中治疗癌症的方法。治疗癌症包括但不限于诱导癌细胞中的细胞凋亡、杀死癌细胞、降低癌细胞的数量和降低肿瘤体积/重量。所述方法包括施用包含eIF5A1 siRNA和编码突变体eIF5A1的多核苷酸的组合物。组合物和eIF5A1 siRNA和编码突变体eIF5A1的多核苷酸将在下文讨论。
所有的细胞产生真核的起始因子5A(“eIF-5A”)(或在此也称为“因子5A”)。哺乳动物细胞产生eIF-5A1的两种同种型(eIF-5A1和eIF-5A2)。eIF-5A1被称为细胞凋亡特异性eIF-5A,因为它在经历细胞凋亡的细胞中增量调节。人类eIF-5A1具有登记号码NM 001970,在附图1中示出。相信的是,eIF-5A1对编码细胞凋亡所必需的蛋白质的mRNA的核子集的穿出负责。eIF-5A2被称为增殖eIF-5A,因为它被认为对编码细胞增殖所必需的蛋白质的mRNA的核子集的穿出负责。参见Liu & Tartakoff(1997)Supplement to Molecular Biology ofthe Cell,8,426a.Abstract No.2476,37th American Society for CellBiology Annual Meeting,and Rosorius et al.(1999)J.Cell Science,112,2369-2380。
两种因子5A都被脱氧羟丁赖氨酸合酶(“DHS”)翻译后修饰。DHS将eIF-5A羟丁赖氨酸化。羟丁赖氨酸,一种独特的氨基酸,在所有检查过的真核生物和古细菌中存在,但是不存在于真细菌中,eIF-5A是已知仅有的含有羟丁赖氨酸的蛋白质。Park(1988)J.Biol.Chem.,263,7447-7449;Schumann & Klink(1989)System.Appl.Microbiol,11,103-107;Bartig et al.(1990)System.Appl.Microbiol,13,112-116;Gordon et al.(1987a)J.Biol.Chem.,262,16585-16589。羟丁赖氨酸化的eIF-5A在两个翻译后步骤中形成:第一步骤是由脱氧羟丁赖氨酸合酶催化的、亚精胺的4-氨基丁基部分向前体eIF-5A的特定赖氨酸的α-氨基基团的转移形成脱氧羟丁赖氨酸残基。第二步骤涉及这个4-氨基丁基部分被脱氧羟丁赖氨酸羟化酶羟基化形成羟丁赖氨酸。
eIF5A的氨基酸序列在物种之间是充分保守的,在eIF-5A中围绕羟丁赖氨酸残基的氨基酸序列有严格的保守性,这表明这个修饰对于存活可能是重要的。Park et al.(1993)Biofactors,4,95-104.这种假说进一步由以下观察结果得到支持,迄今为止在酵母中发现的eIF-5A的两种同种型的灭活,或催化它们的活化的第一步骤的DHS基因的灭活阻断了细胞分裂。Schnier et al.(1991)Mol Cell.Biol,11,3105-3114;Sasaki et al.(1996)FEBS Lett.,384,151-154;Park et al.(1998)J.Biol.Chem.,273,1677-1683.然而,在酵母中eIF-5A蛋白质的缺失仅导致总蛋白合成方面的小的下降,表明eIF-5A可能是mRNA的特定子集的翻译所需的,而不是蛋白质全局合成所需的。Kang et al.(1993),″Effect of initiation factor eIF-5A depletion on cell proliferation andprotein synthesis,″in Tuite,M.(ed.),Protein Synthesis and Targeting inYeast,NATO Series H.新近的发现是,结合eIF-5A的配体共有高度地保守的基序,也支持了eIF-5A的重要性。Xu & Chen(2001)J.Biol.Chem.,276,2555-2561.此外,修饰的eIF-5A的羟丁赖氨酸残基被发现对与RNA的序列特异性结合是必需的,结合不提供对核酶的防护。
本发明人显示了,当编码eIF-5A的多核苷酸被施用给细胞时,在那些细胞的细胞凋亡方面存在提高。他们显示了,通过施用随后在癌细胞中表达的eIF-5A1多核苷酸,他们能推动癌细胞进入细胞凋亡。参见共同待决申请10/200,148;11/287,460;11/293,391;和11/637,835,所有这些通过完全引用来合并在此。
本发明人已经另外确定了,当细胞具有因子5A的羟丁赖氨酸化形式的建成时,细胞进入存活模式,不经历它们通常将会随着时间的过去而遭遇的细胞凋亡。特别是,在癌细胞中,存在显著数量的羟丁赖氨酸化的因子5A,因而,细胞不进入细胞凋亡(不死亡)。因而,为了通过杀死癌细胞来治疗癌症(推动癌细胞进入细胞凋亡途径),编码eIF-5A1的多核苷酸被施用给受试者或癌细胞或肿瘤,来提供eIF5A1的提高的表达,其转而导致癌细胞中的细胞凋亡,最终导致细胞死亡和肿瘤收缩。然而,如果人们仅提供编码eIF-5A1蛋白质的多核苷酸来增量调节eIF-5A1的基因表达,不使用siRNA来敲低eIF-5A1的内源表达,存在着两派间的较量:指导细胞朝向细胞凋亡途径的eIF-5A1表达,与指导细胞朝向细胞存活途径的羟丁赖氨酸化的因子5A的存在相竞争。本发明消除了这种较量,是对仅提高eIF-5A1的表达的改进。施用给受试者或细胞的多核苷酸被突变,从而产生的表达的蛋白质不能被羟丁赖氨酸化。此外,因子5A的内源表达用靶向eIF-5A的siRNA敲除或敲低,从而周围没有/很少的内源eIF-5A1被羟丁赖氨酸化。因而,由于在细胞中没有(或有基本上很少的)羟丁赖氨酸化eIF-5A,它们不被推入存活模式。
突变的eIF-5A1的多核苷酸优选地被突变,从而它不能被羟丁赖氨酸化,因而将不可用于驱动细胞进入存活模式。例如,在一个实施方式中,编码eIF-5A的多核苷酸被突变,从而通常被DHS羟丁赖氨酸化的在位置50的赖氨酸(K),被改变成丙氨酸(A)(其不能被羟丁赖氨酸化)。这个突变体被称为K50A。
在另一个实施方式中,在位置67处的赖氨酸被改变成精氨酸(R)。这个突变体被称为(K67R)。在另一个实施方式中,在位置67处的赖氨酸(K)被改变成丙氨酸(A),被称为(K67A)。在另一个实施方式中,在位置50处的赖氨酸(K)被改变成精氨酸(K50R),另一个实施方式提供了位置47处的赖氨酸(K)被改变成精氨酸的突变体(K47R)。
在其它实施方式中,使用双突变体。一种双突变体是其中在位置50处的赖氨酸(K)被改变成精氨酸(R),在位置67处的赖氨酸(K)被改变成精氨酸(R)。这个双突变体被称为K50R/K67R。这种双突变体类似地不会被羟丁赖氨酸化,但是在氨基酸中的改变不会象单一突变(K50A)一样那么多地改变eIF-5A1的3-D结构。因而双突变提供了一种在3-D形状和折叠方面与野生型非常类似的蛋白质,因而比单突变体更为稳定。更为稳定后,它在身体中存在更长时间来提供更久的治疗效益。因而,身体将具有它为正常细胞功能所需的因子5A,但是将不能被羟丁赖氨酸化,从而细胞不被锁定在细胞存活模式中而逃避细胞凋亡。
另一种双突变体是在位置47的赖氨酸(K)被改变成精氨酸(R),在位置50处的赖氨酸被改变成精氨酸(R)。这个突变体被称为(K47R/K50R)。本发明提供了另一种双突变体,其中在位置50处的赖氨酸(L)被改变成丙氨酸(A),在位置67处的赖氨酸被改变成丙氨酸(A)。这个突变体被称为(K50A/K67A)。
由于身体为了正常的细胞存活和健康的细胞增殖需要因子5A,优选的是,如果siRNA被全身地递送,不使用siRNA完全关闭受试者中的表达。通过利用在关闭表达方面不那么好的siRNA(即,关小或降低表达,但不完全关闭表达),或作为选择,利用给药和/或治疗方案来平衡表达水平,可以实现eIF-5A表达的控制,以容许健康细胞的正常生长和起作用,但是也推动癌细胞进入细胞凋亡。
做为选择,人们可以利用siRNA的局部递送。如果siRNA被局部地递送给癌细胞或肿瘤,则优选地,表达被敲除。通过敲除表达,周围没有可被羟丁赖氨酸化的因子5A,因而没有羟丁赖氨酸化eIF-5A来锁定细胞进入存活模式。由于siRNA被局部地递送给癌症或肿瘤,不需要有eIF-5A可用于规则细胞的生长。
在某些实施方式中,内源基因是eIF5A1。靶向eIF5A1的siRNA被施用给受试者来抑制内源eIF-5A1的表达。在某些实施方式中,所述siRNA包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2,或是将会抑制内源eIF-5A1的表达的、靶向eIF5A1的任何siRNA。在某些实施方式中,eIF5A1是人类eIF-5A1(在附图1中示出),受试者是人类。靶向人类eIF-5A1的其它siRNA是已知的,在共同待决申请11/134,445;11/287,460;11/184,982;11/293,391;11/725,520;11/725,470;11/637,835中公开了。在其它实施方式中,受试者是哺乳动物,eIF5A1是特异于所述哺乳动物的。例如,受试者是狗,eIF5A1是犬eIF5A1。在某些实施方式中,siRNA基本上由附图25中所示的siRNA构建体组成。例如,所述siRNA含有靶向eIF5A1的核酸,但是也含有突出物,例如U或T核酸,或还含有标签,例如his标签(常称为HA标签,其通常用于体外研究)。附着在5′或3′末端(或甚至如附图25所示的核酸的连续串内部,例如)的分子或其它核酸可以被包括,并且落入“基本上由……组成”之内,只要siRNA构建体能够降低目标基因的表达。优选的,siRNA靶向eIF5A1基因的区域,从而不影响外源多核苷酸的表达。例如,eIF5A1 siRNA靶向3′UTR或3′末端。附图25中所示的siRNA是示范性的eIF5A1 siRNA。
多核苷酸编码eIF5A1,其中所述多核苷酸被突变来编码eIF5A1变体。设计突变的eIF5A1,从而变体eIF5A1不能被翻译后修饰(不能被羟丁赖氨酸化)。此处的上文中讨论了示范性的突变体。
对于涉及实体肿瘤的癌症来说,期望的是直接将siRNA递送到肿瘤。相对于多核苷酸的递送时间和位点,siRNA可以单独地施用,或可以在同时和/或在同一递送位点一起施用。本领域技术人员将理解,siRNA施用的时机可能必需是当内源蛋白质被翻译时施用,而不是在内源蛋白质已经产生之后。
虽然本发明人早先显示了eIF5A1对正常的组织是无毒的(参见2005年11月28日提交的待审申请Ser.No.11/293,391,通过完全引用将其合并在此),递送复合物(与eIF5A多核苷酸/质粒/表达载体的直接施用相比)可能是优选的。优选的递送系统向受试者、肿瘤或癌细胞的群体提供有效量的eIF5A1,以及优选地提供向肿瘤或癌细胞群体的靶向的递送。因而,在某些实施方式中,优选的是通过纳米大小的运载体,例如,脂质体、枝状聚合物或类似的无毒的纳米颗粒,如聚乙烯亚胺聚合物(例如,in vivo JetPEITM复合物)来递送eIF5A1核苷酸/质粒/表达载体。
eIF5A1蛋白质也可以直接递送到肿瘤的位点。本领域技术人员将能够确定用于递送eIF5A1蛋白质的治疗方案的剂量和时长。
以下讨论eIF5A1的细胞凋亡诱导的分子基础。
死亡受体信号传导
用Ad-eIF5A1(具有野生型eIF5A1的腺病毒)或Ad-eIF5A1(K50A)处理癌细胞诱导了胱天蛋白酶8的活化,其是由死亡受体配体结合启动的,以及刽子手胱天蛋白酶——胱天蛋白酶3的活化。这些可能是eIF5A1的间接效应,胱天蛋白酶8和胱天蛋白酶3在用不能被羟丁赖氨酸化的eIF5A1(K50A)处理之后也被活化的事实,表明所述效应归因于赖氨酸50eIF5A1。如早先TNFR1的增量调节所显示的,用Ad-eIF5A1处理似乎也产生死亡受体的增量调节。
线粒体途径
赖氨酸50eIF5A1在细胞凋亡的线粒体途径中的直接或间接牵连得到许多观察结果的支持,包括,胱天蛋白酶9通过用eIF5A1或eIF5A1(K50A)处理癌细胞被活化的发现。同样,在线粒体细胞凋亡途径的活化中起作用的p53看起来受到eIF5A1的调节。例如,用放线菌素D处理癌细胞增量调节p53,这种p53的增量调节受到eIF5A1siRNA的抑制。与这一致地,用Ad-eIF5A1处理癌细胞增量调节p53mRNA。用eIF5A1处理癌细胞也诱导Bax从胞质液到线粒体的迁移,结果产生线粒体膜电势的损失和细胞色素C从线粒体内间隙向胞质液的释放。此外,这种处理引起裂解的Bcl2、Bim和剪接的Bim的增量调节,它们都是促细胞凋亡的。
MAPK信号传导
此外,本发明人获得了eIF5A1涉及与细胞凋亡相关的MAPK信号传导的证据。例如,用Ad-eIF5A1处理癌细胞增量调节P-JNK,其随后抑制抗细胞凋亡的Bcl2。此外,Ad-eIF5A1和Ad-eIF5A1(K50A)都诱导P-p38的形成,其随后通过影响多种促细胞凋亡试剂,包括TNFR1 & TNF;FAS & FASL;胱天蛋白酶8;Bid;细胞色素C和Capase3来启动细胞凋亡。
NF-κB信号传导
有证据表明,NF-κB信号传导支持了骨髓瘤生长。例如,骨髓瘤细胞对骨髓基质细胞的附着诱导IL-6的NF-κB依赖性转录的增量调节,其是多发性骨髓瘤中的生长和抗细胞凋亡因子[Chauhan et al.(1996)Blood 87,1104.]此外,骨髓瘤细胞分泌的TNF-α活化骨髓基质细胞中的NF-κB,从而增量调节IL-6转录和分泌。TNF-α还活化骨髓瘤细胞中的NF-κB,引起细胞内粘附分子-1(ICAM-1;CD54)和血管细胞粘附分子-1(VCAM-1;CD 106)在骨髓瘤细胞和骨髓基质细胞上的增量调节[Hideshima et al.(2001)Oncogene 20,4519]。这随后增强了骨髓瘤细胞与骨髓基质细胞的缔合[Hideshima et al.(2001)Oncogene 20,4519]。反之,这些效应通过阻断TNF α诱导的NF-κB活化被抑制[Hideshima et al.(2001)Oncogene 20,4519]。实际上,看起来可能的是,NF-κB介导了骨髓瘤细胞中针对TNFα诱导的细胞凋亡的保护[Hideshima et al.(2002)JBC 277,16639]。这些和其它观察结果提示了一种观点,NF-κB信号传导可能是多发性骨髓瘤治疗的吸引人的靶点。
发明人显示了,eIF5A1 siRNA抑制人类骨髓瘤细胞中NF-κB的活化和ICAM-1的形成。这些观察结果表明,eIF5A1在NF-κB活化中起到作用,由于NF-κB活化的随后的效应天然是促存活的,我们预计这种活化由羟丁赖氨酸化的eIF5A1直接或间接地介导。
IL-1
骨髓瘤细胞的促炎症性细胞因子IL-1的过量产生是导致骨组织的退化的多发性骨髓瘤的特征。已经显示了eIF5A1 siRNA在小鼠中显著地降低LPS攻击所诱导的IL-1的过量产生。
本发明的一个实施方式提供了治疗多发性骨髓瘤的方法。多发性骨髓瘤(“MM”)是渐进性的和致命的疾病,其特征在于骨髓中恶性的浆细胞的扩增和溶骨性病变的存在。多发性骨髓瘤是不可治愈的、但可治疗的浆细胞癌症。浆细胞是免疫系统的重要部分,产生帮助对抗感染和疾病的免疫球蛋白(抗体)。多发性骨髓瘤的特征在于在骨髓中过多数量的异常浆细胞和完整的单克隆免疫球蛋白(IgG、IgA、IgD或IgE;“M-蛋白质”)或Bence-Jones蛋白(游离的单克隆轻链)的过量产生。低血钙、贫血、肾损害、对细菌性感染的提高的敏感性和正常免疫球蛋白的受损的生产是多发性骨髓瘤的常见的临床表现。通常多发性骨髓瘤的特征还有弥散性骨质疏松症,通常在骨盆、脊柱、肋骨和颅骨中。
由于在多发性骨髓瘤中存在的刺激反馈环路,本发明看起来非常适合于治疗多发性骨髓瘤。例如,多发性骨髓瘤在骨髓中产生低浓度的IL-1。IL-1随后刺激基质细胞来产生IL-6,其然后刺激多发性骨髓瘤的生长。发明人早先显示了(参见待审申请11/725,539和11/184,982),针对eIF-5A1的siRNA能够抑制促炎性细胞因子的表达,例如,IL-1;TNF-α和IL-8。因而,siRNA将不仅敲低eIF-5A的表达使得其更少的可以用于羟丁赖氨酸化,它还将切断或降低IL-1/IL-6反馈环路。
靶向人类eIF5A的siRNA被用于抑制肿瘤中内源的羟丁赖氨酸化eIF5A的水平,而表达不能被羟丁赖氨酸化的eIF5A的突变体(eIF5AK50R)的RNAi抗性质粒被用于提高体内未修饰的eIF5A的水平。含有eIF5A siRNA的PEI纳米复合物的肿瘤内注射与含有对照siRNA的复合物相比抑制MM肿瘤生长超过80%(***p=0.0003),表明抑制羟丁赖氨酸化的eIF5A的水平具有抗肿瘤作用。含有eIF5AK50R表达质粒的PEI复合物具有相似的作用,并且与含有对照质粒的复合物相比抑制肿瘤生长超过70%(**p=0.001)。因而,MM肿瘤生长可以通过抑制生长促进性羟丁赖氨酸化eIF5A,或通过提高eIF5A的促细胞凋亡的未羟丁赖氨酸化的形式的水平来抑制。含有eIF5A siRNA和RNAi抗性eIF5AK50R质粒的复合物的肿瘤内递送对肿瘤生长具有协同效应,引起显著的肿瘤收缩,抑制肿瘤生长达94%(***p=0.0002)。eIF5A siRNA/eIF5AK50R PEI复合物的静脉内递送也有效地降低肿瘤生长达95%(**p=0.002)表明治疗剂的全身递送是可行的。
eIF5A siRNA/eIF5AK50R pDNA PEI复合物的局部和全身性递送在多发性骨髓瘤中引起显著的抗肿瘤应答。
本发明进一步提供了在癌症,包括多发性骨髓瘤的治疗中有用的组合物。在优选的实施方式中,所述组合物是编码不能被羟丁赖氨酸化的点突变的eIF5A1的质粒DNA,与选择性抑制内源的人类eIF5A1、但对所述质粒编码的点突变的eIF5A1无效的eIF5A1 siRNA的复合物。eIF5A1 siRNA和编码突变体eIF5A1的多核苷酸是以上讨论的。质粒DNA和siRNA优选地都复合到PEI(聚乙烯亚胺)纳米颗粒。它们可以单独地复合并单独地或一起地施用,或它们可以复合在一起。DNA和RNA结合到PEI的带正电的氨基基团上,当纳米颗粒被吸收到细胞中时被释放。已经展现的是,PEI核酸复合物被有效地吸收到分裂的和非分裂的细胞中。
质粒DNA优选地编码eIF5A1(K50R),其象eIF5A1(K50A)一样,不能被羟丁赖氨酸化,因而是强烈的致凋亡的。eIF5A1(K50R)的表达优选地由B细胞特异性启动子来调节。
eIF5A1 siRNA优选地特异于内源的人类eIF5A1的3′末端,对反式eIF5A1(K50R)的表达没有作用。示范性的优选的eIF5A1 siRNA包含,或基本上由、或由附图25中所示的siRNA组成。包括eIF5A1siRNA的原理是:(1)耗尽内源的eIF5A1,其几乎全被羟丁赖氨酸化由此处于促存活形式;(2)抑制NF-κB的活化,从而降低IL-6的产生和细胞内粘附分子的形成;和(3)抑制IL-1的形成。eIF5A1 siRNA协同地与eIF5A1(K50R)作用来诱导骨髓瘤细胞中的细胞凋亡。由于上述的(2)和(3)是促存活事件,它们可能由羟丁赖氨酸化eIF5A1介导,因此不受不能被羟丁赖氨酸化的eIF5A1(K50R)的作用。这种方法产生了导致癌细胞包括多发性骨髓瘤细胞的细胞凋亡的未羟丁赖氨酸化的eIF5A的更大的库,其具有对健康细胞的很少的作用。
优选的组合物在此被称为SNS01。SNS01是一种复合物,所述复合物含有编码eIF5AK50R的RNAi抗性质粒DNA,其由为了增强安全性将表达限制到B细胞来源的细胞(包括骨髓瘤细胞)的启动子来驱动,和含有靶向人类eIF5A的具有用于增强核酸酶抗性的dTdT 3′突出物的siRNA,所述siRNA和所述质粒被复合到in vivo JetPEITM。
实施例
实施例1:用eIF-5A1的野生型和变体转染HeLaS3细胞
使用表达HA标签化的eIF5A1变体,包括野生型eIF5A1(WT)、eIF5A1K50R(K50R)、eIF5A1K67R(K67R)、eIF5A1K67A(K67A)、eIF5A1K47R/K50R(K4750R)、eIF5A1K50R/K67R(K5067R)或eIF5A1K50A/K67A(K5067A)的质粒利用Lipofectamine 2000转染HeLa S3细胞。表达LacZ的质粒被用作对照。在转染后24和48小时(A)或28和52小时(B),收获细胞溶胞产物,通过SDS-PAGE分级分离。转染的eIF5A1的表达水平用针对HA的抗体来检测。结果,eIF5A1在推定的遍在蛋白化位点(K67R)的赖氨酸处的突变提高了高于野生型的eIF5A1转基因的积累(A)。在羟丁赖氨酸化所需的赖氨酸处的eIF5A1的突变(K50R)也提高了eIF5A1转基因高于野生型eIF5A1的积累(B)。当与未突变的野生型eIF5A1转基因相比较时,双突变体形式的eIF5A1(K50A/K67A)特别好地表达(A+B)。参见附图2。
实施例2:用eIF-5A1的野生型和变体转染KAS细胞
使用表达HA标签化的eIF5A1变体,包括野生型eIF5A1(5A1),eIF5A1K67A(K67A)、eIF5A1K50A/K67A(K50A K67A)、eIF5A1K50R(K50R)、eIF5A1K47R(K47R)、eIF5A1K67R(K67R)、eIF5A1K47R/K50R(K47R K50R)或eIF5A1K50R/K67R(K50R K67R)的质粒利用PAMAM枝状聚合物(FMD44)转染KAS细胞。表达LacZ的质粒被用作对照。转染后48小时,收获细胞溶胞产物,通过SDS-PAGE分级分离。转染的eIF5A1的表达水平用针对HA的抗体来检测。利用针对肌动蛋白的抗体验证相等的加载。结果,eIF5A1在推定的遍在蛋白化位点的赖氨酸处的突变(K67A或K67R)提高了高于野生型的eIF5A1转基因的积累。在羟丁赖氨酸化所需的赖氨酸处(K50R)或在乙酰化位点(K47R)处的eIF5A1的突变也提高了高于野生型eIF5A的eIF5A1转基因的积累。当与未突变的野生型eIF5A1转基因比较时,双突变体形式的eIF5A1(K50A/K67A)也以更高的水平表达。参见附图3。
实施例3:利用PAMAM枝状聚合物转染KAS细胞
使用表达HA标签化的eIF5A1变体,包括eIF5A1K50R(K50R)、eIF5A1K50A/K67A(K50A/K67A)、或eIF5A1K50R/K67R(K50R K67R)的质粒,使用PAMAM枝状聚合物(FMD45-2)转染KAS细胞。表达LacZ的质粒被用作对照。转染后七十二小时,细胞用Annexin/PI染色,通过FACS来分析。对Annexin V阳性染色的、对PI(碘化丙锭)阴性染色的细胞被认为处于细胞凋亡的早期阶段(Ann+/PI-),对Annexin V和PI都是阳性染色的细胞被认为处于细胞凋亡的晚期阶段(Ann+/PI+)。结果:eIF5A1在羟丁赖氨酸化位点(K50R)中或在推定的遍在蛋白化位点(K67R)中的赖氨酸处的突变,以及双突变体(K50A/K67A)产生显著高于LacZ对照的水平的KAS细胞的细胞凋亡。参见附图4。
实施例4:用表达eIF-5A1和eIF-5A1变体的质粒转染KAS细胞
用表达HA-标签化的eIF5A1变体,包括eIF5A1K50A(K50A)、eIF5A1K50R(K50R)、eIF5A1K67R(K67R)、eIF5A1K50A/K67A(K50A/K67A)或eIF5A1K50R/K67R(K50R K67R)的质粒,使用Lipofectamine 2000转染KAS细胞。表达LacZ的质粒被用作对照。转染后七十二小时,细胞用Annexin/PI染色,通过FACS来分析。对Annexin V阳性染色的、对PI(碘化丙锭)阴性染色的细胞被认为处于细胞凋亡的早期阶段(Ann+/PI-),对Annexin V和PI都是阳性染色的细胞被认为处于细胞凋亡的晚期阶段(Ann+/PI+)。结果:eIF5A1在羟丁赖氨酸化位点(K50R)中或在推定的遍在蛋白化位点(K67R)中的赖氨酸处的突变,以及双突变体(K50A/K67A)产生显著高于LacZ对照的水平的KAS细胞的细胞凋亡。参见附图5。
实施例5:使用突变的eIF-5A1处理KAS细胞引起细胞凋亡
利用表达HA-标签化的eIF5A1变体eIF5A1K50R(K50R)或eIF5A1K50A/K67A(K50A/K67A)的质粒使用Lipofectamine 2000转染KAS细胞。表达LacZ的质粒被用作对照。转染后七十二小时,细胞用Annexin/PI染色,通过FACS来分析。对Annexin V阳性染色的、对PI(碘化丙锭)阴性染色的细胞被认为处于细胞凋亡的早期阶段(Ann+/PI-),对Annexin V和PI都是阳性染色的细胞被认为处于细胞凋亡的晚期阶段(Ann+/PI+)。结果:eIF5A1在羟丁赖氨酸化位点(K50R)中赖氨酸的突变、或在羟丁赖氨酸化位点和在推定的遍在蛋白化位点(K50A/K67A)两处的eIF5A1的突变,产生显著高于LacZ对照的水平的KAS细胞的细胞凋亡。参见附图6。
实施例6A:多发性骨髓瘤细胞的siRNA/腺病毒介导的杀伤
KAS(人类多发性骨髓瘤)细胞维持在S10培养基[具有4ng/mlIL-6、10%胎儿牛血清(FBS)和青霉素/链霉素(P/S)的RPMI 1640]中。利用Lipofectamine 2000(Invitrogen)用58.7pmoles的siRNA转染KAS细胞。模拟转染的细胞在不存在siRNA的情况下用Lipofectamine 2000处理。在无抗生素的S10培养基中进行转染。
a)靶向人类eIF5A1的siRNA:
eIF5A1 siRNA靶#1(该siRNA靶向人类eIF5A1的这个区域:5’-AAGCTGGACTCCTCCTACACA-3’(SEQ ID NO:____)。该siRNA序列在附图25中示出,在此常常称为h5A1。
eIF5A1 siRNA靶#2 eIF5A1(该siRNA靶向人类eIF5A1的这个区域:5’-AAAGGAATGACTTCCAGCTGA-3(SEQ ID NO:____)。(该siRNA序列在此常常称为h5A1-ALT)
b)对照siRNA:对照siRNA具有以下序列:正义链,5′-ACACAUCCUCCUCAGGUCGdTdT-3′;反义链,3′-dTdTUGUGUAGGAGGAGUCCAGC-5′″。
已经使用的其它对照包括来自Dharmacon的非靶向的证实的siRNA,因为它们被微阵列测试来限制不需要的脱靶效应。例如,对于研究NFκB的体外工作,使用的对照是Dharmacon的非靶向siRNA’s(序列D-001700-01),对于体内工作,使用的对照是Dharmacon’s(序列D-001810-01)。
转染后四小时,细胞进行团化,重悬浮在1ml的S10培养基中。起始的siRNA转染后72小时,对转染的KAS细胞计数,以300,000细胞/孔播种到24孔平板中,用相同的siRNA第二次转染。
转染后四小时,细胞进行团化,重悬浮在含有3000ifu的Ad-LacZ(表达β-半乳糖苷酶的腺病毒)或Ad-5A1M(表达人类eIF5A1K50A的腺病毒)的1ml S10培养基(没有IL-6)中。
72小时后,收获细胞,通过用Annexin V-FITC和PI(BDBioscience)染色,随后通过FACS分析来分析细胞凋亡。
a)早期细胞凋亡被定义为Annexin-FITC阳性染色,PI染色为阴性(Ann+/PI-)的细胞。
b)总的细胞凋亡被定义为处于早期细胞凋亡(Ann+/PI-)或晚期细胞凋亡/坏死(Ann+/PI+)的细胞的总和。
5A1siRNA靶向#1靶向人类eIF5A1的3′UTR,因而将不影响来自腺病毒的eIF5A1的表达。5A1 siRNA靶向#2靶向人类eIF5A1的开放阅读框内部,因而它可能潜在地干扰eIF5A1从腺病毒的表达。
结果:与未处理的和仅用siRNA处理的细胞相比,用siRNA处理和用表达eIF-5A1 K50A变体的腺病毒感染的细胞经历更大数量的细胞凋亡。参见附图7。
实施例6B:用针对eIF5A1靶#1的eIF5A1 siRNA(附图25中所示的)预处理,降低了内源的eIF5A1的表达,但容许由腺病毒表达的RNAi抗性eIF5A1K50A的积累。
KAS细胞使用对照siRNA(C)或两种靶向eIF5A1的siRNA(#1和#2)之一用Lipofectamine 2000转染。eIF5A1 siRNA #1靶向eIF5A1的3′UTR,因而不影响来自腺病毒的eIF5A1的表达,因为它仅含有eIF5A1的开放阅读框。siRNA的序列在附图25中示出。eIF5A1 #2siRNA靶向eIF5A1的开放阅读框,因而将影响内源和外源表达的eIF5A1两者的表达。起始的转染之后72小时,细胞用相同的siRNA第二次转染。四小时后,从细胞中除去转染复合物,用含有Ad-LacZ(L)或Ad-eIF5A1K50A(5M)的生长培养基(-)IL6替换。72小时之后,收获细胞溶胞产物,利用针对eIF5A和肌动蛋白的抗体通过Western印迹来分析。参见附图7B。可以观察到病毒表达的eIF5A1的积累(泳道1对比泳道2),eIF5A1 siRNA靶向#1和#2的eIF5A表达的降低是明显可见的(泳道5和7对比泳道3)。如所预计的,eIF5A1 siRNA #1不影响病毒表达的eIF5A1K50A的积累(泳道6对比泳道4),而eIF5A1 siRNA #2仅中度地影响病毒表达的转基因的表达(泳道8对比泳道4)。
实施例6C:在腺病毒感染之前用针对靶#1的eIF5A1 siRNA预处理降低人类多发性骨髓瘤细胞中磷酸化的NF-κB的表达。
KAS细胞使用对照siRNA(hC)或靶向eIF5A1的siRNA(#1)用Lipofectamine 2000转染。eIF5A1 siRNA #1靶向eIF5A1的3′UTR,因而不影响来自腺病毒的eIF5A1的表达,因为它仅含有eIF5A1的开放阅读框。起始的转染之后72小时,细胞用相同的siRNA第二次转染。四小时后,从细胞中除去转染复合物,用含有Ad-LacZ(L)或Ad-eIF5A1K50A(5M)的生长培养基(+)IL6替换。二十四小时后,收获细胞溶胞产物,利用针对磷酸-NF-κB p65(Ser 536)和eIF5A的抗体通过Western印迹来分析。如所预计的,eIF5A1 siRNA #1不影响病毒表达的eIF5A1K50A的积累。NF-κB p65在丝氨酸536处的磷酸化调节活化、核定位、蛋白质-蛋白质相互作用和转录活性。参见附图7C。
实施例6D:在腺病毒感染之前用eIF5A1 siRNA #1预处理降低人类多发性骨髓瘤细胞中磷酸化的NF-κB和ICAM-1的表达。
KAS细胞使用对照siRNA(C)或两种靶向eIF5A1的siRNA(#1和#2)之一用Lipofectamine 2000转染。起始的转染之后72小时,细胞用相同的siRNA第二次转染。四小时后,从细胞中除去转染复合物,用生长培养基(+)IL6替换。第二次转染后二十四小时,细胞用40ng/ml的TNF-α刺激,在0、4或24小时收获细胞溶胞产物,利用针对磷酸-NF-κB p65(Ser 536)、ICAM-1和肌动蛋白的抗体通过Western印迹来分析。在用两种eIF5A1特异性siRNAs转染之后,观察到TNF-α诱导的NF-κB p65磷酸化(ser 536)和ICAM-1表达的降低。NF-κBp65在丝氨酸536处的磷酸化调节活化、核定位、蛋白质-蛋白质相互作用和转录活性。ICAM-1是细胞内的粘附表面糖蛋白,其被认为涉及多发性骨髓瘤的病理。参见附图7D。
实施例6E:用siRNA预处理KAS细胞通过在存在IL-6的情况下的eIF5A1K50R基因递送提高了细胞凋亡。
KAS细胞用对照siRNA(hcon)或人类eIF5A1 siRNA(h5A1)使用Lipofectamine 2000转染。72小时后,细胞用siRNA重新转染。在siRNA转染介质的去除之后4小时,空载体(mcs)或eIF5A1K50R(K50R)质粒的PEI复合物添加到细胞。整个研究中使用的生长培养基含有IL-6。在72小时后通过用Annexin/PI染色细胞和FACS分析来测量细胞凋亡。参见附图7F。
实施例7:eIF-5A1质粒和eIF-5A1 siRNA的共同施用延迟了多发性骨髓瘤皮下肿瘤的生长(附图8-10)。
SCID小鼠皮下地注射KAS细胞。当观察到明显的肿瘤时启动治疗。六只3-5周龄SCID/CB17小鼠在它们的右肋注射200μ1PBS中的1千万个KAS-6/1骨髓瘤细胞,当肿瘤达到4mm3的最小尺寸时启动治疗。
对照小鼠用含有pCpG-mcs(空载体)和对照siRNA的PEI复合物每周2次地肿瘤内注射(对照组由3只小鼠组成:C-1、C-2和C-3)。治疗的小鼠用含有RNAi抗性质粒pCpG-eIF5A1K50R和eIF5A1 siRNA的PEI复合物每周2次地肿瘤内注射(治疗组由3只小鼠组成:5A-1、5A-2和5A-3)。在肿瘤内的多个位点进行注射以防止回流,缓慢速度的注射用于提高吸收。附图8中的数据显示了组中所有小鼠的肿瘤体积。附图9中显示的数据是每个组的平均肿瘤体积+/-标准误差。星号指示统计显著性(*=p<0.025;n=3)。
附图10显示了eIF-5A1质粒和eIF-5A1 siRNA的共同施用降低了多发性骨髓瘤皮下肿瘤的重量。显示的数据是每个组的平均肿瘤重量+/-标准误差。星号指示统计显著性(*=p<0.05;n=3)。
2×0.1ml的JET-PEI(PolyPlus)用于体内测试。N/P比例是8。PEI/DNA/siRNA复合物在5%葡萄糖中0.1ml的总体积中形成。形成复合物的方案如下。
1.使成分达到室温。保持无菌。
2.将20μg的质粒DNA(2mg/mL,~10μl)和10μg siRNA(1mg/mL,10μl)稀释到25μl的总体积。使用无菌水来补足差额。
3.通过添加25μl 10%的葡萄糖调节DNA溶液的体积到50μl5%葡萄糖。轻轻地涡旋并简短地离心。
4.将4.8μl的invivo JETPEI稀释到25μl 10%葡萄糖的总体积。用无菌水调节体积到50μl,以5%葡萄糖的终浓度结束。轻轻地涡旋并简短地离心。
5.立即添加50μl稀释的PEI到50μl稀释的DNA中(不逆转顺序)。简短地涡旋,立即旋转沉淀。
6.注射之前孵育15分钟。复合物稳定6小时。
无CpG的克隆载体和pCpG质粒获自InvivoGen。这些质粒完全缺乏CpG二核苷酸,称为pCpG。这些质粒在体外和体内产生高水平的转基因表达,相比之下,基于CMV的质粒容许体内的持续表达。pCpG质粒含有一些组件,其要么天然地缺少CpG二核苷酸、被修饰除去了所有的CpGs、或是完全地合成的,例如编码可选择标记物或报告物的基因。根据在形成遗传密码的十六种二核苷酸之中CG是仅有的非必需二核苷酸并且可以被替换的事实,这些新等位基因的合成得以成为可能。八个密码子含有编码五种不同氨基酸的CG。所有八种密码子可以由编码相同氨基酸的至少两个密码子的备选者替代,来产生编码具有保持与野生型相同的氨基酸序列、并因而与它们的野生型对应物一样有活性的蛋白质的新的等位基因。这些新的等位基因可以在命名为pMOD的质粒中分别地获得,从所述质粒上可以容易地切下它们。
pCpG质粒容许体内的持久表达,是利用表达TLR9的细胞系研究在体内和体外CpGs对基因表达的影响、以及它们对先天和获得性免疫系统的影响的重要工具。
空载体pCpG-mcs(Invivogen)是没有表达的基因产物、仅有多克隆位点的载体,被用作对照载体。HA-标签化的eIF5A1K50R cDNA亚克隆到pCpG-LacZ载体(Invivogen)的NcoI和NheI位点中,所述载体中已经除去了LacZ基因,来产生治疗载体pCpG-eIF5A1(K50R)。利用Endo-Free Qiagen试剂盒制备DNA。测量内毒素水平,为<0.03EU/μg,DNA是在水中2mg/ml。
实验中使用的对照siRNA是来自Dharmacon的微阵列证实的非靶向对照siRNA(D-001810-01)。用修饰(siSTABLE)来获得siRNA以防止血清中的降解。
针对人类eIF5A1的3′UTR设计实验中使用的eIF5A1 siRNA。在eIF5A1 siRNA和小鼠eIF5A1之间没有相似性,因而siRNA应当仅抑制人类(而不是小鼠的)eIF5A1。该siRNA也与eIF5A2没有相似性(人类或小鼠的)。用修饰(siSTABLE)来获得siRNA以防止血清中的降解。所述eIF5A1 siRNA具有以下靶序列:
5’GCU GGA CUC CUC CUA CAC A(UU)3
siSTABLE siRNA以1mg/ml溶解在水中(以等分量保存在-20C)。
长度(l)和宽度(w)的肿瘤尺寸利用数字卡尺每周测量2-3次。根据以下公式计算肿瘤体积:
l=长度;最小的尺寸
w=宽度;最大的尺寸
肿瘤体积(mm3)=l2*w*0.5
统计分析
Student′s t-测验被用于统计分析。显著性被认为是高于95%的可信水平(p<0.05)。
实施例8:eIF5A1质粒和eIF5A1 siRNA的共同施用延迟了多发性骨髓瘤皮下肿瘤的生长并引起肿瘤收缩。
在另一个研究中,SCID小鼠再次用KAS细胞皮下地注射。当观察到明显的肿瘤时启动治疗。对照小鼠用含有pCpG-mGs(空载体)和对照siRNA的PEI复合物每周2次地肿瘤内注射(对照组:G-1、G-2和G-3)。治疗的小鼠用含有RNAi抗性质粒pCpG-eIF5A1K50R(20μg的质粒DNA)和eIF5A1 siRNA(10μg的siRNA)的PEI复合物每周2次地肿瘤内注射(治疗组G-4、G-5和G-6)。附图11中显示的数据是每个组的平均肿瘤体积+/-标准误差。星号指示统计显著性(*=p<0.025;n=3)。在21天内给予六次注射(红色箭头)。
实施例9:静脉内(i.v.)的eIF5A1 siRNA和肿瘤内(i.t.)的PEI/eIF5A1K50R质粒复合物的施用引起了多发性骨髓瘤皮下肿瘤的肿瘤收缩(组2B)。
SCID小鼠皮下地注射KAS细胞。当观察到明显的肿瘤时启动治疗,50微克对照siRNA(对照组)或人类eIF5A1 siRNA(治疗组)的初始尾部注射。随后对照小鼠用含有pCpG-mcs(空载体;对照组:G-1、G-2和G-3)的PEI复合物每周2次地通过肿瘤内注射来治疗。随后,治疗的小鼠随后通过用含有RNAi抗性质粒pCpG-eIF5A1K50R(20μg质粒DNA)的PEI复合物每周2次地肿瘤内注射来治疗(治疗组:G-4、G-5和G-6)。对照小鼠继续通过每周一次的i.v.注射接受对照siRNA(对照组R-1、R-2和R-3)。治疗的小鼠继续通过每周一次的i.v.注射接受人类eIF5A1 siRNA(20μg)(治疗组R-4、R-5和R-6)。附图12中显示的数据是每个组中所有小鼠的肿瘤体积。在21天的时间内给予PEI/DNA的六次壁内注射(红色箭头)和siRNA的四次i.v.注射(蓝色箭头)。
附图13提供了来自实施例8和9的结果的总览。SCID小鼠皮下地注射KAS细胞。附图13中显示的数据是每个组中小鼠的平均肿瘤体积+/-标准误差。星号指示治疗组和对照组之间的统计显著性(**=p<0.01;***=p<0.001;n=3)。
形成PEI复合物的方案:
1.使成分达到室温。保持无菌。
2.将质粒DNA或质粒DNA+siRNA稀释到25μl的总体积。
使用无菌水来调整体积。
a)对于仅有质粒DNA的复合物:
将20μg的质粒DNA(2mg/ml的10μl)稀释到25μl的总体积。使用无菌水来补足差额。
b)对于质粒DNA+siRNA复合物:
将20μg的质粒DNA(2mg/ml的~10μl),10μg的siRNA(1mg/ml的10μl)稀释到25μl的总体积。使用无菌水来补足差额。
3.通过添加25μl的10%葡萄糖(PEI试剂盒提供的)将DNA溶液的体积调整到50μl 5%葡萄糖。轻轻地涡旋并简短地离心。
4.将in vivo JETPEI稀释到10%葡萄糖的25μl总体积。
a)对于仅有质粒DNA的复合物:
将3.2μl的in vivo JETPEI稀释到10%葡萄糖的25μl的总体积。用无菌水调节体积到50μl,以5%葡萄糖的终浓度结束。轻轻地涡旋并简短地离心。
b)对于质粒DNA+siRNA复合物:
将4.8μl的in vivo JETPEI稀释到10%葡萄糖的25μl的总体积。用无菌水调节体积到50μl,以5%葡萄糖的终浓度结束。轻轻地涡旋并简短地离心。
5.立即添加50μl稀释的PEI到50μl稀释的DNA中(不逆转顺序)。简短地涡旋,立即旋转沉淀。
6.注射之前孵育15分钟。复合物稳定6小时。
对于siRNA的尾静脉注射,起始的siRNA注射是50微克。siRNA在PBS中稀释到0.4mg/ml。125μl每只小鼠(50μg)注射到尾静脉中。血清稳定的siRNA的随后的注射以20μg每只小鼠每周两次地给予。siRNA在PBS中稀释到0.4mg/ml。每只小鼠50μl(20μg)注射到尾部静脉中。
附图13B显示了eIF5A1质粒和eIF5A1 siRNA的共同施用引起了肿瘤收缩。SCID小鼠用KAS细胞皮下地注射。当观察到明显的肿瘤时启动治疗。治疗的小鼠用含有RNAi抗性质粒pCpG-eIF5A1K50R和eIF5A1 siRNA的PEI复合物每周2次地肿瘤内注射(治疗组:G-4、G-5和G-6)。在21天的时间内给予六次注射。开始治疗后四十二天,处死小鼠,打开肿瘤位点下的皮肤,检查肿瘤生长的证据。在组2A治疗的小鼠中的任何一只中没有观察到肿瘤生长。
附图13C显示了静脉内(i.v.)的eIF5A1 siRNA和肿瘤内(i.t.)的PEI/eIF5A1K50R质粒复合物的施用引起了多发性骨髓瘤皮下肿瘤的肿瘤收缩。SCID小鼠皮下地注射KAS细胞。当观察到明显的肿瘤时启动治疗,50微克人类eIF5A1 siRNA的初次注射(治疗组)。小鼠随后通过用含有RNAi抗性质粒pCpG-eIF5A1K50R的PEI复合物每周2次地肿瘤内注射来治疗(治疗组:R-4、R-5和R-6)。通过每周一次的i.v.注射,小鼠继续接受人类eIF5A1 siRNA。治疗在处理开始后21天结束。开始治疗后四十二天,处死小鼠,打开肿瘤位点下的皮肤,检查肿瘤生长的证据。在治疗组的一只小鼠中没有肿瘤生长的证据(组2B)。
实施例10:eIF5A1质粒和eIF5A1 siRNA的静脉内共同施用延迟了多发性骨髓瘤皮下肿瘤的生长。
SCID小鼠皮下地注射KAS细胞。当观察到明显的肿瘤时启动治疗,50微克对照siRNA(对照组)或人类eIF5A1 siRNA(治疗组)的初始注射。随后用含有pCpG-mcs(空载体;对照组A1、A2和A3)的PEI复合物,或含有RNAi抗性质粒pCpG-eIF5A1K50R的PEI复合物(治疗组;A4、A5和A6)~每周两次地静脉内(红色箭头)或腹膜内注射(绿色箭头)治疗小鼠。小鼠继续通过i.v.注射(蓝色箭头)每周一次地接受对照siRNA(对照组A1、A2和A3)或人类eIF5A1siRNA(治疗组A4、A5和A6)。显示的数据是每个组中所有小鼠的肿瘤体积。附图14中显示的数据是每个组中所有小鼠的肿瘤体积。
实施例11:静脉内(i.v.)的eIF5A1 siRNA和静脉内(i.v.)或腹膜内(i.p.)的PEI/eIF5A1K50R质粒复合物的施用延缓了多发性骨髓瘤皮下肿瘤的生长。
SCID小鼠皮下地注射KAS细胞。当观察到明显的肿瘤时启动治疗,50微克对照siRNA(对照组)或人类eIF5A1 siRNA(治疗组)的初始注射。对照小鼠随后用含有pCpG-mcs(空载体;对照组是三只小鼠:B1、B2和B3)的PEI复合物~每周一次地静脉内或腹膜内注射来治疗。治疗的小鼠随后用含有RNAi抗性质粒pCpG-eIF5A1K50R(治疗组:B4、B5和B6)的PEI复合物~每周一次地静脉内或腹膜内注射来治疗。小鼠通过每周一次的i.v.注射继续接受对照siRNA(对照组B1、B2和B3)或人类eIF5A1 siRNA(治疗组是三只小鼠:B4、B5和B6)。实验以50μg的起始siRNA注射开始(附图15中图形上的第2天)。随后的注射使用每周一次的20微克siRNA。siRNA裸露地给予,即,没有递送运载体。PEI复合物含有20μg的质粒DNA。i.p.给予起始的PEI注射,i.v.给予随后的注射。附图15中显示的数据是每个组中所有小鼠的肿瘤体积。
附图16提供了实施例10和11的总览。SCID小鼠皮下地注射KAS细胞。当观察到明显的肿瘤时启动治疗。一组小鼠接受每周一次的对照siRNA(对照;组A)或eIF5A1 siRNA(治疗的;组A)i.v.注射,以及含有pCpG-mcs的PEI复合物(对照;组A)或含有RNAi抗性质粒pCpG-eIF5A1K50R的PEI复合物(治疗的;组A)的i.v.或i.p.注射。第二组小鼠用含有pCpG-mcs(空载体)和对照siRNA的PEI复合物(对照;组B)、或含有RNAi抗性质粒pCpG-eIF5A1K50R和eIF5A1 siRNA的PEI复合物(治疗的;组B)~每周2次地给予i.v.或i.p.注射。显示的数据是每个组中小鼠的平均肿瘤体积+/-标准误差。星号指示治疗组和对照组之间的统计显著性(*=p<0.05;***=p<0.001;n=3)。
制备PEI复合物和siRNA的方案是早先实施例中描述的。
实施例12:eIF5A1质粒和eIF5A1 siRNA的共同施用延迟了多发性骨髓瘤皮下肿瘤的生长并引起肿瘤收缩。
SCID小鼠皮下地注射KAS细胞。当观察到明显的肿瘤时启动治疗。对照小鼠用含有pCpG-mcs(空载体)和对照siRNA的PEI复合物每周2次地肿瘤内注射(对照组有3只小鼠:对照1、对照2和对照3)。治疗的小鼠用含有RNAi抗性质粒pCpG-eIF5A1K50R和eIF5A1siRNA的PEI复合物每周2次地肿瘤内注射(治疗组含有4只小鼠:5A-1、5A-2、5A-3和5A-4)。PEI复合物的肿瘤内注射含有20μg的质粒DNA和10μg的siRNA。附图17中显示的数据是每个组中所有小鼠的肿瘤体积。
实施例13:静脉内(i.v.)的eIF5A1 siRNA和肿瘤内(i.t.)的PEI/eIF5A1K50R质粒复合物的施用引起了多发性骨髓瘤皮下肿瘤的肿瘤收缩。
SCID小鼠皮下地注射KAS细胞。当观察到明显的肿瘤时启动治疗,50微克的对照siRNA(对照组有三只小鼠:对照1、对照2和对照3)或人类eIF5A1 siRNA(治疗组有3只小鼠:5A-1、5A-2、5A-3)的起始注射。对照小鼠随后用含有pCpG-mcs(20μg)的PEI复合物每周2次地肿瘤内注射来治疗(对照组1-3)。治疗的小鼠随后用含有RNAi抗性质粒pCpG-eIF5A1K50R(20μg)的PEI复合物每周2次地肿瘤内注射来治疗(5A-1、5A-2、5A-3)。对照小鼠继续通过每周两次的尾静脉i.v注射来接受对照siRNA(20μg)。治疗的小鼠继续通过每周两次的尾静脉i.v注射来接受人类eIF5A1 siRNA(20μg)。在肿瘤内注射之前48小时给予注射。siRNA作为裸露的siRNA来给予,即,没有递送运载体。附图18中显示的数据是每个组中所有小鼠的肿瘤体积。
实施例14:由EF1或B29启动子驱动的eIF5A1K50R质粒与eIF5A1siRNA的共同施用延迟了多发性骨髓瘤皮下肿瘤的生长并引起肿瘤收缩。
SCID小鼠皮下地注射KAS细胞。当观察到明显的肿瘤时启动治疗。小鼠用含有对照载体(G1和G2)或由B29启动子(G3和G4)或EF1启动子(G5和G6)驱动的eIF5A1质粒,以及对照siRNA(G1、G3、G5)或h5A1 siRNA(G2、G4、G6)的PEI复合物每周2次地肿瘤内注射。显示的数据是每个组的平均肿瘤体积+/-标准误差。注意:B29启动子意图作为B细胞特异性启动子。然而,虽然发现在这项研究中使用的B29启动子/mCMV增强子在体外驱动KAS细胞中的HA-eIF5A1K50R的高表达,它看起来不是B细胞特异性的(可能由于CMV增强子)。参见附图19。
实施例15:eIF5A1 siRNA的共同施用提高了由EF1或B29启动子驱动的eIF5A1K50R质粒对多发性骨髓瘤皮下肿瘤的抗肿瘤作用,并产生了降低的肿瘤负荷。
SCID小鼠皮下地注射KAS细胞。当观察到明显的肿瘤时启动治疗。小鼠用含有对照载体(G1和G2)或由B29启动子(G3和G4)或EF1启动子(G5和G6)驱动的eIF5A1质粒,以及对照siRNA(G1、G3、G5)或h5A1 siRNA(G2、G4、G6)的PEI复合物每周2次地肿瘤内注射。在开始处理后24天处死小鼠,移除皮下肿瘤并称重。显示的数据是所有组的平均肿瘤重量+/-标准误差。参见附图20。
实施例16:eIF5A1 siRNA协同地提高肺腺癌细胞中源自Ad-eIF5A的感染的细胞凋亡诱导。
A549细胞用Ad-LacZ或Ad-eIF5A感染。通过在添加病毒之后立即向细胞添加转染介质,用对照siRNA或靶向人类eIF5A1的siRNA(h5A1)转染细胞。用siRNA转染和用病毒感染后四小时,培养基替换为新鲜培养基,细胞孵育72小时,之后用Annexin/PI标记来检测细胞凋亡的细胞。注意:这个细胞系中eIF5A1的过量表达,由于限制DHS和DOHH的数量而引起未羟丁赖氨酸化的eIF5A1的积累,因而产生与eIF5AK50R的过量表达过量表达相同的促细胞凋亡效果。这些数据表明,也在非骨髓瘤肿瘤类型中观察到了由同时的羟丁赖氨酸化eIF5A的抑制和未羟丁赖氨酸化的eIF5A的过量表达所引起的细胞凋亡中的协同效应。参见附图21。
实施例17:质粒pExp5A的构建
pExp5A是具有降低的CpG二核苷酸的表达质粒,被设计以驱动人类eIF5A1K50R主要在B细胞谱系的细胞中的表达。载体来源于pCpG-LacZ,一种完全缺乏CpG二核苷酸的质粒(Invivogen)。在大肠杆菌中复制和选择所需的所有组件都没有CpG二核苷酸。来自CpG-LacZ载体的原始的CMV增强子/启动子和LacZ基因分别被人类最小B细胞特异性启动子(B29/CD79b;Invivogen)和人类eIF5A1K50R替代,以驱动eIF5A1K50R的B细胞特异性表达。B29 DHS4.4 3′增强子已经被导入质粒中eIF5A1表达盒的下游,以增强B29启动子的活性和降低在非B细胞中的表达(Malone et al.2006.B29 gene silencing inpituitary cells is regulated by its 3′enhancer.J.Mol.Biol.362:173-183)。B29最小启动子、eIF5A1K50R和B29 DHS4.4 3′增强子的掺入向载体中引入了32个CpG二核苷酸。
用于大肠杆菌中的表达的组件
复制起点:大肠杆菌 R6K γ ori。
*由于R6K γ复制起点的存在,pCpG质粒可以仅在表达pir突变体基因的大肠杆菌突变菌株中扩增。它们将不会在标准的大肠杆菌菌株中复制。因此,pCpG质粒与大肠杆菌GT115菌株,一种在Dcm甲基化方面也是缺陷的(Invivogen)pir突变体,一起提供。
细菌启动子:EM2K,细菌EM7启动子的无CpG的版本。可选择标记物:ZeocinTM抗性基因;没有CpG的合成的等位基因。
用于哺乳动物细胞中的表达的组件
哺乳动物启动子:用于B细胞中的组织特异性表达的人类-167bp最小B29(CD79b)启动子。合成的内含子(I 140)也在5′UTR中存在。
多腺苷酸化信号:晚期SV40多腺苷酸化信号的无CpG二核苷酸的版本。
3′增强子:人类B29 DHS4.4 3′增强子。
MAR:两个无CpG的基质附着区域(MAR)存在于细菌和哺乳动物转录单元之间。一个MAR来自于人类IFN-β基因的5′区域,一个来自β-珠蛋白基因的5′区域。
pExp5A的预计的序列在附图23中提供(3371bp)。
eIF5A1K50R的氨基酸序列
*K50R突变是下划线的。
MADDLDFETGDAGASATFPMQCSALRKNGFVVLKGRPCKIVEMSTSKTGRHGH
AKVHLVGIDIFTGKKYEDICPSTHNMDVPNIKRNDFQLIGIQDGYLSLLQDSGEVR
EDLRLPEGDLGKEIEQKYDCGEEILITVLSAMTEEAAVAIKAMAK
pExp5A的构建:构建概述:
步骤1:B29 DHS4.4 3′增强子的克隆和向pGEM T easy(Promega)中的亚克隆——产生pGEM-4.4enh #8。
步骤2:最小B29启动子向pCpG-LacZ(Invivogen)中的亚克隆——产生B29-5 #3。
步骤3:HA-eIF5A1K50R向B29-5#3载体中的亚克隆——产生B29-5#3-eIF5A1K50R
步骤4:在pCpG-mcs(Invivogen)中新的多克隆位点的产生——产生pCpGLinker4。
步骤5:B29 DS4.4 3′增强子向pCpG-Linker4中的亚克隆——产生pCpG-DHS4.4。
步骤6:B29启动子+HA-eIF5A1K50R+SV40pA表达盒向pCpG-DHS4.4中的亚克隆——产生pExp-5。
步骤7:在pExp-5中的HA-eIF5A1K50R用非-HA eIF5A1K50R替换——产生最终的载体pExp5A。
详细的构建:
步骤1:B29 DHS4.4 3′增强子的克隆和向pGEM T easy(Promega)中的亚克隆——产生pGEM-4.4enh #8。
B29 DHS4.4 3′增强子利用以下引物从分离自KAS细胞(人类多发性骨髓瘤细胞系)的基因组DNA通过PCR克隆:正向5’-CAGCAAGGGAGCACCTATG-3’和反向5’-GTTGCAGTGAGCGGAGATG-3’。引物利用人类CD79B/GH-1基因间区域的序列(登记号AB062674)来设计。产生的608bp PCR片段亚克隆到pGEM T easy克隆载体(Promega)中并测序。Komatsu et al.2002.Novel regulatory regions founddownstream of the rat B29/Ig-b gene.Eur.J.Biochem.269:1227-1236.
pGEM-4.4enh #8中B29 DHS4.4 3′增强子PCR片段(297bp)的序列
ACCACCCTGGGCCAGGCTGGGCCAAGCCAGGCGGCCCCTGTGTTTTCCCCAG
ACCTCCACCAGGGACCTAGGCAGCCGGGTAGATGGTGGGAGGAGGCTTCACT
CCTTGGCTTTACCTAAAGACTTTTTAACACCTCT
o +4.4区域含有几个转录因子结合位点
pGEM-4.4enh #8中的B29 DHS4.4 3′增强子PCR片段(297bp)与人
类CD79B/GH-1基因间区域的序列(登记号AB062674)的比对。
步骤2:最小B29启动子向pCpG-LacZ(Invivogen)中的亚克隆-产生B29-5 #3。
最小的-167人类B29启动子从带有全长人类B29启动子的商售质粒(pDrive-hB29;Invivogen)使用以下的引物扩增:5’-CCAACTAGTGCGACCGCCAAACCTTAGC-3’;反向5’-CAAAAGCTTGACAACGTCCGAGGCTCCTTGG-3’。产生的PCR片段用SpeI和HindIII消化,并连接到pCpG-LacZ载体(Invivogen)的SpeI和HindIII位点来产生B29-5 #3。
B29-5 #3中B29最小启动子PCR片段(188bp)的序列
GCGACCGCCAAACCTTAGCGGCCCAGCTGACAAAAGCCTGCCCTCCCCCAGG
GTCCCCGGAGAGCTGGTGCCTCCCCTGGGTCCCAATTTGCATGGCAGGAAGG
GGCCTGGTGAGGAAGAGGCGGGGAGGGGACAGGCTGCAGCCGGTGCAGTTA
CACGTTTTCCTCCAAGGAGCCTCGGACGTTGTC
B29-5 #3中B29最小启动子PCR片段(B29min)与来自pDrive-hB29
的全长人类B29启动子的比对
步骤3:HA-eIF5A1K50R亚克隆到B29-5# 3载体中——产生pB29-eIF5A1K50R_7。
HA-eIF5A1K50R通过利用pHM6-eIF5A1K50R作为DNA模板和以下的引物来扩增:正向5’-CGCCATGGACATGTACCCTTACGACGTCCCAGACTACGCTGCAGATGATTTG GACTTCGAG-3’和反向5′-CGCGCTAGCCAGTTATTTTGCCATCGCC-3’。产生的PCR片段用NcoI和NheI消化并亚克隆到B29-5 # 3的NcoI和NheI位点来替换LacZ。
在pB29-eIF5A1
K50R
_7中HA-eIF5A1
K50R
PCR片段(497bp)的序列
ACATGTACCCTTACGACGTCCCAGACTACGCTGCAGATGATTTGGACTTCGAG
ACAGGAGATGCAGGGGCCTCAGCCACCTTCCCAATGCAGTGCTCAGCATTAC
GTAAGAATGGTTTTGTGGTGCTCAAGGGCCGGCCATGTAAGATCGTCGAGAT
GTCTACTTCGAAGACTGGCAGGCATGGCCATGCCAAGGTCCATCTGGTTGGC
ATTGATATTTTTACTGGGAAGAAATATGAAGATATCTGCCCGTCGACTCATAA
CATGGATGTCCCCAACATCAAAAGGAATGATTTCCAGCTGATTGGCATCCAG
GATGGGTACCTATCCCTGCTCCAGGACAGTGGGGAGGTACGAGAGGACCTTC
GTCTGCCTGAGGGAGACCTTGGCAAGGAGATTGAGCAGAAGTATGACTGTGG
AGAAGAGATCCTGATCACAGTGCTGTCCGCCATGACAGAGGAGGCAGCTGTT
GCAATCAAGGCGATGGCAAAATAACTG
pB29-eIF5A1
K50R
_7中HA-eIF5A1
K50R
PCR片段的翻译
pB29-eIF5A1
K50R
_7中的HA-eIF5A1
K50R
PCR片段与人类eIF5A1(登
记号#NP 001961)的比对
步骤4:在pCpG-mcs(Invivogen)中新的多克隆位点的产生——产生pCpG-Linker4。
pCpG克隆载体pCpG-mcs G2(Invivogen)用EcoRI消化来除去含有mCMV增强子、hEF1启动子、合成的内含子、多克隆位点和SV40多腺苷酸化信号的哺乳动物表达盒。EcoRI消化的pCpG-mcs G2载体然后连接到具有EcoRI粘性末端的合成接头来产生具有新的多克隆位点的无启动子载体(pCpG-Linker4)。
合成的接头,具有两个EcoRI粘性末端的Linker4
pCpG-Linker4中围绕新的多克隆位点的区域的序列
步骤5:B29 DS4.4 3′增强子向pCpG-Linker4中的亚克隆——产生pCpG-DHS4.4。
B29 DHS4.4 3′增强子将利用pGEM-4.4enh #8作为模板和以下的引物通过PCR来扩增:正向5’-GAAGCGGCCGCACCACCCTGGGCCAGGCTGG-3’;和反向5’-CCACGCGTAGAGGTGTTAAAAAGTCTTTAGGTAAAG-3’。产生的PCR片段用NotI和MluI消化,连接到pCpG-Linker4的新的多克隆位点中的NotI和MluI位点来产生pCpG-DHS4.4。
>pCpG-DHS4.4全长序列(2,282bp)
步骤6:B29启动子+HA-eIF5A1K50R+SV40 pA表达盒向pCpG-DHS4.4中的亚克隆——产生pExp-5。
含有最小B29启动子、合成的内含子、HA-eIF5A1K50R和SV40 pA的B29-eIF5A1表达盒利用以下引物通过PCR从pB29-eIF5A1K50R_7(步骤3)扩增:正向5’-GTTATCGATACTAGTGCGACCGCCAAACC-3’;和反向5’-CAAGCGGCCGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTAC-3’。产生的PCR片段用ClaI和NotI消化,亚克隆到pCpG-DHS4.4的多克隆位点中的ClaI和NotI位点来产生pExp-5。
步骤7:在pExp-5中的HA-eIF5A1K50R用非-HA eIF5A1K50R替换——产生最终的载体pExp5A。
pExp-5质粒用NcoI和NheI消化来除去HA-eIF5A1K50R。非HA-标签化的eIF5A1K50R PCR片段利用以下引物从pHM6-eIF5A1K50R通过PCR扩增:正向5’-CACCATGGCAGATGATTTGGACTTC-3’;和反向5′-CGCGCTAGCCAGTTATTTTGCCATCGCC-3′。产生的PCR产物用NcoI和NheI消化并连接到B29-5 #3的NcoI和NheI位点来产生B29-K50R。B29-K50R用NcoI和NheI消化,470bp eIF5A1K50R片段进行凝胶纯化,连接到NcoI/NheI消化的pExp-5来产生最终的表达载体pExp5A。
实施例18:pExp5A的测试
各种细胞系利用Lipofectamine 2000用质粒转染,HA-eIF5A1K50R的表达在转染后24小时通过使用抗HA抗体(Roche)的Western印迹来测定。测试的不同细胞系是P3X63Ag8.653(小鼠B成淋巴细胞-骨髓瘤)、KAS(人类骨髓瘤)、HepG2(人类肝脏肝细胞癌)、T24(人类膀胱癌);HT-29(人类结肠直肠腺癌)、HEK-293(人类胚肾细胞)、PC3(人类前列腺的腺癌);HeLa(人类子宫颈腺癌)和A549(肺癌)。参见附图24。
pExp-5质粒在人类和小鼠骨髓瘤细胞系中以与具有组成型EF1启动子的质粒(CpG-eIF5A1K50R)相当的水平表达HA-eIF5A1K50R。然而,与组成型启动子的表达相比,由pExp-5驱动的HA-eIF5A1K50R的表达在非B细胞系中是受限的。一个例外是在HEK-293细胞中,人类胚肾细胞系,其中在pExp-5转染之后观察到高水平的HA-eIF5A1K50R表达,这可能是由于该细胞系的胚胎性质;此时我们不知道pExp-5是否在成年人肾脏细胞中表达。用于毒性研究和临床试验的最终的质粒将是pExp-5的版本,其中HA-eIF5A1K50R被非HA标签化的eIF5A1K50R替代(pExp5A)。pExp-5含有处在最小人类B29启动子/增强子的控制下的HA-标签化的eIF5A1K50R;HA-eIF5A1K50R的表达与具有组成型表达的质粒驱动的表达、以及与含有全长B29启动子的质粒相比较。
实施例19:in vivo JETPEITM纳米颗粒的形成
给出的这个实施例是in vivo JETPEITM纳米颗粒复合物的形成,用于1.5mg/kg(0.1mL)的剂量注射到20g小鼠中——1.5mg/kg=1.0mg pExp5A/kg+0.5mg h5A1/kg——DNA∶siRNA比例=2∶1。
稀释质粒DNA和siRNA到25mL的总体积。使用无菌水来调整体积。*将20mg的质粒DNA(2mg/ml的10ml),10mg的siRNA(1mg/ml的10ml)稀释到25ml的总体积。使用无菌水来补足差额。通过添加25ml的10%葡萄糖(PEI试剂盒提供的)将DNA溶液的体积调整到50ml 5%葡萄糖。轻轻地涡旋并简短地离心。将in vivoJETPEITM稀释成25ml水的总体积。*将3.6ml的in vivo JETPEITM稀释到25ml水的总体积中。用10%葡萄糖调节最终体积到50ml,以5%葡萄糖的终浓度结束。轻轻地涡旋并简短地离心。立即添加50ml稀释的PEI到50ml稀释的DNA中(不逆转顺序)。简短地涡旋,立即旋转沉淀。
在形成之后,复合物稳定8到10小时。复合物的N/P比例应当是6。N/P比值是in vivo-jetPEI的带正电的氮残基的数量与DNA和siRNA的带负电的磷酸残基的数量的比值。DNA和RNA每克含有相同数量的磷酸基团。因而N/P比值是复合物内离子平衡的度量。提高复合物的N/P比值可能提高复合物的毒性。In vivo JET-PEI作为150mM溶液来提供(表示为氮残基),而DNA在1mg中含有3nmoles的阴离子磷酸盐。最终体积中DNA的终浓度不应超过0.5mg/ml。DNA应当是高质量的,并且在水中制备。in vivo-jetPEI和10%葡萄糖应当在使用前变为室温。
实施例20:在小鼠中使用静脉内的SNS01和SNS-EF1/UU的剂量范围寻找和重复剂量研究。
SNS01是本发明的一个实施方式,它是生物学地针对多发性骨髓瘤的治疗的癌症疗法。SNS01由三种成分组成:表达eIF5A的促细胞凋亡突变体的DNA载体(参见附图22);靶向促进癌细胞的生长/抗细胞凋亡的天然eIF5A的siRNA(参见附图25中的序列);和称为聚乙烯亚胺的合成聚合物(In vivo-jetPEI;Polyplus Transfection Inc.),其作为递送运载体。
研究的目的是测定最大耐受剂量,以及治疗剂量的静脉内的SNS01向小鼠长期施用的可行性。进行两个独立的研究。最大耐受剂量(研究ID:MTD)研究是8天的研究,其中小鼠接受提高数量的SNS01(从2.2mg/kg到3.7mg/kg)的两次静脉内剂量,通过监视临床病征、体重、器官重量和肝脏酶来评估毒性。9周的重复剂量研究(研究ID:EX6)是被设计以评估SNS-EF1/UU以及它的各种成分的治疗剂量(1.5mg/kg)的每周两次的长期施用后的毒性的研究。SNS-EF1/UU是SNS01的临床前的版本,主要不同在于eIF5AK50R的表达由组成型启动子驱动(在所有时候在所有组织中表达的启动子),而不是SNS01复合物中的B细胞特异性启动子。在SNS01中B细胞特异性B29启动子的使用是设计以通过将促细胞凋亡eIF5A突变体的表达限制到B细胞来源的细胞,包括骨髓瘤细胞来增强治疗的安全性。EX6研究还包括一组小鼠,其被给予小鼠特异性eIF5A siRNA来确定在小鼠组织中是否存在抑制eIF5A的任何有毒影响。重复剂量研究中的毒性通过监视临床病征、体重、血液学、肝脏酶以及组织病理学来评估。
临床前的实验表明,在0.75mg/kg到1.5mg/kg的剂量下SNS01是治疗性的(研究EX9)。在8天的剂量范围寻找研究(研究ID:MTD)中,测试了比治疗范围显著更高的剂量来确定剂量范围的上限。测试物的每周两次的静脉内剂量在2.2mg/kg和2.9mg/kg的低剂量水平下是良好耐受的,然而一只小鼠在2.9mg/kg下达到发病并且被安乐死。在3.3mg/kg或更高的剂量产生大约20-25%的存活率。因而,最大耐受的剂量在2.2mg/kg和2.9mg/kg之间,大大高于0.75mg/kg到1.5mg/kg的治疗范围。
在9周的重复剂量研究(研究ID:EX6)中,小鼠接受每周两次的治疗剂量(1.5mg/kg)的SNS-EF1/UU的尾静脉注射,在研究的时间内没有观察到测试物相关的毒性作用。在这项研究还单独地测试了DNA和siRNA,两者都是小鼠良好耐受的。由于人类eIF5A siRNA在小鼠中不是活性的,小鼠eIF5A特异性siRNA也被包括在这项研究中。在9周的时间内没有观察到与小鼠eIF5A siRNA的长期施用相关的毒性作用。这些结果表明,SNS01和SNS-EF1/UU的治疗剂量即使当长期施用时对小鼠也是无毒的。
测试物和运载体
测试系统和研究设计
这项研究的所有方面根据滑铁卢大学动物照料委员会(Waterloo,Ontario,Canada)阐述的指南来进行,其由Canadian Council on AnimalCare and the Province of Ontario Animals for Research Act建立。
CD-1和BALB/c小鼠获自Charles River实验室(魁北克,加拿大)。两项研究的小鼠都经由尾静脉的静脉内注射每周两次接受测试物。缓慢的注射(~2-3分钟)用于递送大于0.2ml的体积。
用于8天研究的小鼠在研究的开始时是大约6-9周龄的。9周重复剂量研究的小鼠在研究的开始时是大约5-6周龄的。
8天的最大耐受剂量研究(MTD)
两种剂量的8天研究是被设计以确定SNS01的最大耐受剂量的剂量范围寻找研究。剂量范围在2.2mg/kg到3.7mg/kg之间,大大高于0.75mg/kg到1.5mg/kg的治疗剂量范围。在SNS01的最低剂量(2.2mg/kg)下,除了一只小鼠之外没有观察到毒性的临床病征,所述小鼠展现了稍微起皱的毛皮以及在一小时内分辨的降低的活动。在2.2mg/kg的SNS01的第二次注射之后没有观察到毒性的临床病征。所有小鼠在整个研究中维持了它们的重量。没有观察到器官中的宏观改变。除了在肝脏重量:体重比例方面的中度提高之外,器官重量比体重的比值与对照组没有变化。然而,由于这种比值的提高没有在任何更高剂量水平组中观察到,其不太可能与测试物相关。
五只小鼠中的四只耐受2.9mg/kg的SNS01而没有毒性的临床病征。然而,一只小鼠在注射的1小时内经历了惊厥和轻微的呼吸窘迫,不得不被人道地安乐死。在其余的小鼠中在SNS01的第二次注射之后没有观察到毒性的临床病征。小鼠在整个研究中维持了它们的体重,没有观察到在器官中的宏观改变或在器官重量与体重的比值方面的改变。在两剂的2.9mg/kg SNS01之后,在ALT的血清水平方面存在轻微的提高。
如所预计的,除了被人道地安乐死的一只之外,处在3.3mg/kg或之上的SNS01剂量在两个组的所有小鼠中不是良好耐受的。在由于发病而对小鼠人道地安乐死的所有情况下,临床病征在注射的1小时内出现,并且与使用高剂量的PEI的其他报道过的研究是一致的。3.3mg/kg和3.7mg/kg的存活的小鼠在注射后4小时内完全地康复,在整个研究中维持了它们的体重,不过它们没有接受第二次剂量。因而SNS01的最大耐受剂量看起来在2.2mg/kg和2.9mg/kg之间。
9-周重复剂量研究(EX6)
9周重复剂量研究的目的是评估治疗剂量(1.5mg/kg)的SNS-EF1/UU的长期施用的安全性,SNS-EF1/UU是在SNS01的开发期间用于临床前研究的复合物。SNS-EF1/UU与SNS01没有显著区别,主要区别是材料是研究级别的,以及eIF5AK50R表达由在所有细胞类型中有活性的组成型人类EF1启动子驱动。虽然SNS01利用B细胞特异性启动子来驱动eIF5AK50R表达,在这项安全性研究中使用组成型启动子允许评估由非B细胞组织中突变体eIF5AK50R蛋白质的积累所引起的毒性。9周重复剂量研究的另一个方面是包括复数个组来测试SNS-EF1/UU的单独成分的安全性。DNA组(Ex6-G3)用含有eIF5A质粒和非靶向对照siRNA的复合物来给药,而siRNA组(Ex6-G4)用含有人类eIF5A(h5A1)siRNA和非表达质粒的复合物来给药。由于测试物SNS-EF1/UU含有将不会影响内源小鼠eIF5A的表达的人类eIF5A siRNA,这项研究的另一个特征是包括组(Ex6-G6),其用含有非表达质粒和有效地靶向小鼠eIF5A的siRNA的PEI复合物来给药。这个组容许活性eIF5A siRNA的长期施用的安全性的评估。
所有动物存活到预定的处死日期。在9周研究的过程中任何组中没有观察到毒性的临床病征,所有组中的小鼠在研究期期间继续增加体重。在开始治疗后三周和六周测量红细胞和白细胞计数,所有给药的组都是正常的。在处死之后测量血清肝脏酶水平,所有小鼠处在正常的范围之内。在任何组中在器官的宏观外观方面没有观察到改变。主要器官的组织病理学分析由独立的病理学家进行,没有显示可归因于测试物的毒性。
SNS-EF1/UU的治疗剂量的长期施用是小鼠良好耐受的,没有观察到副作用。此外,小鼠特异性eIF5A siRNA的长期施用没有显示毒性作用,表明含有人类eIF5A siRNA的PEI复合物的施用对人类应当是安全的。
实施例21:在带有多发性骨髓瘤肿瘤的小鼠中使用静脉内的SNS-B29/UU和SNS01的治疗效力研究
SNS01是如上所述的。测试物SNS-B29/UU是SNS01的临床前的版本。SNS-B29/UU很小地不同于SNS01,主要差别是成分是研究级别的而不是GLP级别的。在此报道的研究的目的是测定SNS-B29/UU的最低有效剂量,和确认包含SNS01的GLP级材料与用于临床前研究的研究级材料一样地进行良好。重复剂量肿瘤研究(研究ID:EX9)是5周的研究,其中评估了SNS-B29/UU的逐步减少的每周两次的剂量抑制小鼠中的皮下肿瘤生长的能力,以确定SNS01的最佳治疗剂量。还通过监视临床病征、体重和器官重量来评估治疗的动物的毒性病征。
测定带有皮下人类多发性骨髓瘤肿瘤的SCID小鼠中SNS-B29/UU的治疗范围。测试了在0.15mg/kg和1.5mg/kg之间的SNS-B29/UU的剂量。通过每周两次的肿瘤体积测量和通过在处死后切下并称重肿瘤组织,测定测试物的抗肿瘤效力。0.75mg/kg和1.5mg/kg的SNS-B29/UU剂量引起显著的肿瘤收缩,表明SNS-B29/UU的治疗范围在0.75mg/kg和1.5mg/kg之间。在0.38mg/kgSNS-B29/UU下也观察到皮下的肿瘤的生长的有效抑制,然而没有观察到肿瘤收缩。甚至在低至0.15mg/kg SNS-B29/UU的剂量下观察到肿瘤生长的一定抑制,表明了广泛的治疗范围。参见附图26和27。
利用GLP级成分制得的SNS01的效力与SNS-B29/UU比较,发现在肿瘤生长的抑制方面具有相当的效力。使用SNS01和SNS-B29/UU对带有肿瘤的SCID小鼠的治疗是良好耐受的,在整个研究中小鼠继续增加体重。
测试物和运载体
测试系统和研究设计
雌性C.B.17/IcrHsd-Prkdc(SCID)小鼠获自Harlan(Indianapolis,IN,USA)。通过注射10×106活的KAS-6/1(人类多发性骨髓瘤)细胞到5至6周龄小鼠的右肋中来建立皮下肿瘤。当肿瘤达到20到40mm3的近似大小时(在肿瘤细胞注射后约4周),开始用SNS-B29/UU治疗。当肿瘤达到130mm3的近似大小时(在肿瘤细胞注射后约6周),开始用SNS01治疗。小鼠经由尾静脉的静脉内注射每周两次接受测试物。
重复剂量肿瘤研究
重复剂量肿瘤研究被设计以确定SNS-B29/UU的最小有效治疗剂量,和确认GLP级的SNS01测试物保持了由研究级的测试物SNS-B29/UU所展现的肿瘤抑制活性。次要目的是通过监视治疗的小鼠的临床病征、体重和器官重量来评估治疗的任何毒性作用。通过利用数字卡尺每周两次的肿瘤体积测量来监视测试物的治疗性抗肿瘤活性。在处死时,切下肿瘤并称重。
所有小鼠存活到预定的处死日期。用含有非表达质粒和非靶向siRNA的PEI纳米复合物治疗的对照小鼠在处死时具有284mm3的平均肿瘤体积,而用1.5mg/kg SNS-B29/UU处理的小鼠具有仅13mm3的平均肿瘤体积,肿瘤生长方面95%(*p=0.026)的降低。然而,当试图从用1.5mg/kg SNS-B29/UU治疗的小鼠切下肿瘤时,在任何小鼠中没有发现肿瘤的证据。SNS-B29/UU的剂量降低到一半至0.75mg/kg仍然引起了肿瘤体积和重量的分别91%(*p=0.03)和87%(*p=0.04)的降低,在一只小鼠中肿瘤完全消失。因而,SNS-B29/UU的每周两次注射的最佳治疗剂量看起来在0.75mg/kg和1.5mg/kg之间。低达0.15mg/kg的SNS-B29/UU剂量的每周两次给药仍然产生了最终肿瘤体积的60%降低,表明SNS-B29/UU具有在广泛的剂量范围下的强大抗肿瘤活性。
除了抑制肿瘤生长之外,用0.75mg/kg和1.5mg/kg的SNS-B29/UU和SNS01治疗还引起了肿瘤体积的显著降低,表明这种治疗能够诱导肿瘤退化,可能是通过肿瘤中细胞凋亡的诱导。在用0.75mg/kg和1.5mg/kg的剂量水平的SNS-B29/UU治疗的带有肿瘤的小鼠中,肿瘤体积的改变百分比分别是-244%和-245%。对照小鼠的肿瘤在同样的时间期期间大小增加超过2000%。SNS01的每周两次注射也显著地缩小了多发性骨髓瘤肿瘤。用1.5mg/kg SNS01治疗的小鼠的肿瘤体积的改变百分比是-349%,表明SNS01与SNS-B29/UU是一样有效的。GLP级材料的使用实际上可能具有提高的生物学活性,因为用SNS01治疗在仅治疗25天后实现了肿瘤体积的349%的降低,而SNS-B29/UU在治疗35天后实现肿瘤体积的245%降低。此外,用SNS01治疗的肿瘤是相当大的(~130mm3),表明用SNS01治疗针对充分建立的肿瘤是有效的。
治疗是所有小鼠良好耐受的,没有观察到毒性的临床病征。所有组中的小鼠在整个研究中继续增加体重。在尸检时在器官的宏观外观方面没有观察到改变,在器官重量比体重比值方面没有发生显著的变化。
因此,SNS01(和它的临床前的版本SNS-B29/UU)是SCID小鼠良好耐受的,当通过每周两次的静脉内注射来递送时在治疗皮下的人类多发性骨髓瘤肿瘤方面是极其有效的。测试的SNS-B29/UU的所有剂量在抑制肿瘤生长方面都是有效的,但是1.5mg/kg的最高剂量成功地在所有接受治疗的小鼠中消灭了肿瘤。
实施例22:质粒DNA和siRNA聚乙烯亚胺(JetPEI)复合物的生物分布
绿色荧光蛋白(“GFP”)GFP-表达构建体被用于确定由PEI复合物递送的质粒DNA的定位。两种启动子被用于驱动GFP表达:EF1:遍在启动子(EF1::GFP)或B29:B细胞特异性启动子(B29::GFP)。含有20微克GFP质粒DNA和10微克荧光标记的(DY547)h5A1siRNA的PEI复合物以6的N/P比值来制备。BalB/C小鼠用5%葡萄糖或PEI复合物连续两天静脉内注射。第一次注射后72小时,小鼠进行安乐死,收获它们的器官并通过共焦显微镜检查来分析GFP表达和DY547-siRNA。
骨髓:在大多数情况下,存在DY547-siRNA的证据,但是没有GFP表达。器官收获的时机可能与GFP的峰值表达不符;可能存在GFP信号的猝灭,或GFP可能未被表达。然而,在某些情况下观察到共同定位到同一骨髓细胞的GFP和DY547。因此,这提供了证据,即,当通过静脉内注射时PEI纳米颗粒可以在活的动物中转染骨髓细胞。
肺:在大多数情况下,存在DY547-siRNA的证据,但是没有GFP表达。器官收获的时机可能与GFP的峰值表达不符;或可能存在GFP信号的淬灭,或GFP可能未被表达。
脾脏:见到在细胞中共同定位的GFP表达(当由EF1启动子驱动时)的证据,DY547-siRNA的存在也是阳性的。当由B29启动子驱动时,GFP的表达在脾脏细胞中低得多。这显示了,PEI纳米颗粒看起来转染脾脏的细胞。
肾脏:没有观察到GFP或DY547,表明纳米颗粒不进入肾脏。
肝脏:在大多数情况下,存在DY547-siRNA的证据,但是没有GFP表达。这提供了证据,即,PEI纳米颗粒转染肝脏的细胞。
心脏:见到在心脏的组织中EF1::GFP和DY547-siRNA的共同定位,因而表明PEI纳米颗粒可以转染这个器官。使用B29启动子没有观察到GFP。
实施例23:DNA∶siRNA比例对HA-eIF5AK50R表达的影响。
用含有B29-HA-eIF5AK50R(由B细胞特异性启动子驱动的质粒)和h5A1 siRNA的纳米颗粒转染KAS细胞。构建含有不同比例的pExp5A和h5A1 siRNA的JET PEITM纳米颗粒,在添加到KAS细胞之前在室温下孵育4小时。转染后四小时,含有纳米颗粒的培养基替换为新鲜培养基。二十四小时后,收获细胞溶胞产物,用于使用针对HA的抗体的Western印迹分析。DNA∶siRNA的比例不同于标准比例2∶1。在1∶0、3∶1和2∶1的比例下,HA-eIF5AK50R的积累达到峰值。参见附图30。
实施例24:DNA∶siRNA比例对纳米颗粒转染诱导的细胞凋亡的影响
构建含有不同比例的pExp5A和h5A1 siRNA的纳米颗粒,在添加到KAS细胞之前在室温下孵育4小时。转染后四小时,含有纳米颗粒的培养基替换为新鲜培养基。四十八小时后,收获细胞,用Annexin V/PI标记,通过FACS分析。细胞凋亡的诱导在用2∶1的标准DNA∶siRNA比例的纳米颗粒转染的细胞中是最高的。参见附图31。
实施例25:含有eIF5A1K50R质粒和eIF5A1 siRNA(siSTABLE或非siSTABLE)的PEI复合物(N/P=6或8)的施用抑制多发性骨髓瘤皮下肿瘤的生长并引起肿瘤收缩。
SCID小鼠皮下地注射KAS细胞。当观察到明显的肿瘤时启动治疗。小鼠用以下的每周2次静脉内注射:(G1)含有20mg pCpG-mcs(空载体)和10mg对照siRNA,N/P=8的PEI复合物(中等剂量);(G5)含有20mg RNAi抗性质粒pCpG-eIF5A1K50R和10mg siSTABLEh5A1 siRNA,N/P=8的PEI复合物(中等剂量,siSTABLE);(G8)含有20mg RNAi抗性质粒pCpG-eIF5A1K50R和10mg h5A1 siRNA,N/P=6的PEI复合物(中等剂量,N/P=6)。显示的数据是每个组中小鼠的单独的肿瘤体积。最后的注射在治疗开始后40天给予。参见附图32。
实施例26:JET PEITM纳米颗粒正被肿瘤组织有效地吸收,以及纳米颗粒正将质粒和siRNA递送给同一细胞。
在用含有pExp-GFP(B细胞特异性启动子控制下的GFP)和DY547-siRNA(荧光标记的siRNA)的纳米颗粒注射之后48小时的肿瘤切片。在共焦显微镜检查之后在肿瘤切片中观察到GFP和DY547的共同定位表达,表明纳米颗粒正在被肿瘤组织有效地吸收,以及纳米颗粒正在将质粒和siRNA递送给同一细胞。参见附图33。
Claims (17)
1.一种组合物,其包含靶向eIF5A1的3′末端的eIF5A1 siRNA,表达载体的复合物,所述表达载体包含编码突变体eIF5A1的多核苷酸,其中所述突变体eIF5A1不能被羟丁赖氨酸化,和其中所述siRNA和所述表达载体复合到聚乙烯亚胺来形成复合物。
2.一种组合物,包含靶向目标基因来抑制所述目标基因在受试者中的内源表达的siRNA;和处在RNAI抗性质粒中、编码能在所述受试者中表达的目标蛋白质的多核苷酸,其中所述siRNA和所述质粒复合到聚乙烯亚胺来形成复合物。
3.权利要求1的组合物,其中所述siRNA具有附图25中所示的序列,其中编码所述突变体eIF5A1的多核苷酸是eIF5A1K50R。
4.权利要求3的组合物,包含组织特异性启动子。
5.权利要求4的组合物,包含B细胞特异性启动子。
6.权利要求5的组合物,其中所述B细胞启动子是B29。
7.权利要求3的组合物,其中所述表达载体包含pCpG质粒。
8.权利要求1的组合物,其中所述eIF5A1 siRNA和所述包含突变体eIF5A1多核苷酸的表达载体独立地复合到聚乙烯亚胺。
9.权利要求1的组合物,其中所述eIF5A1 siRNA和所述包含突变体eIF5A1多核苷酸的表达载体一起复合到聚乙烯亚胺。
10.一种组合物,其包含靶向eIF5A1的3′末端的eIF5A1 siRNA和表达载体,所述表达载体包含编码突变体eIF5A1的多核苷酸,其中所述突变体eIF5A1不能被羟丁赖氨酸化,和其中所述siRNA和所述表达载体被递送给受试者来治疗癌症。
11.权利要求10的组合物,其中所述癌症是多发性骨髓瘤。
12.一种治疗癌症的方法,包括向受试者施用权利要求10的组合物。
13.一种治疗癌症的方法,包括向受试者施用权利要求1的组合物。
14.权利要求12的方法,其中所述组合物静脉内地、腹膜内地或肿瘤内地施用。
15.权利要求13的方法,其中所述靶向eIF5A1的3′末端的siRNA和所述包含编码突变体eIF5A1的多核苷酸的表达载体经由不同的途径递送。
16.权利要求12的方法,其中所述组合物以约0.15mg/kg到约1.5mg/kg的剂量每周两次注射来提供。
17.权利要求12的方法,其中所述组合物以约0.75mg/kg到约1.5mg/kg的剂量每周两次注射来提供。
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Families Citing this family (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AR057234A1 (es) * | 2005-12-13 | 2007-11-21 | Senesco Technologies Inc | Uso de eif-5a para destruir celulas de meiloma multiple |
US8445638B2 (en) * | 2008-09-03 | 2013-05-21 | Senesco Technologies, Inc. | Use of a truncated eIF-5A1 polynucleotide to induce apoptosis in cancer cells |
EP2329854A3 (de) * | 2009-12-04 | 2014-02-19 | Biotronik VI Patent AG | Implantatbeschichtung mit Nukleinsäuren |
WO2013082449A2 (en) * | 2011-11-30 | 2013-06-06 | Senesco Technologies, Inc. | Treatment of b cell lymphomas |
EP2850188A4 (en) * | 2012-05-16 | 2016-01-20 | Rana Therapeutics Inc | COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING THE EXPRESSION OF THE MULTIGENIC FAMILY OF HEMOGLOBIN |
US10837014B2 (en) | 2012-05-16 | 2020-11-17 | Translate Bio Ma, Inc. | Compositions and methods for modulating SMN gene family expression |
US10059941B2 (en) | 2012-05-16 | 2018-08-28 | Translate Bio Ma, Inc. | Compositions and methods for modulating SMN gene family expression |
SG11201407486PA (en) | 2012-05-16 | 2014-12-30 | Rana Therapeutics Inc | Compositions and methods for modulating utrn expression |
AU2013262699A1 (en) | 2012-05-16 | 2015-01-22 | Rana Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for modulating ATP2A2 expression |
CN104583402A (zh) | 2012-05-16 | 2015-04-29 | Rana医疗有限公司 | 用于调节mecp2表达的组合物和方法 |
CN107345230A (zh) * | 2016-05-05 | 2017-11-14 | 江苏命码生物科技有限公司 | 一种抑制K-RAS基因表达的siRNA及其前体和应用 |
US20200085758A1 (en) * | 2016-12-16 | 2020-03-19 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Co-delivery of nucleic acids for simultaneous suppression and expression of target genes |
EP3573618B1 (en) | 2017-01-30 | 2023-08-16 | The Children's Hospital of Philadelphia | Compositions and methods for hemoglobin production |
US11560136B2 (en) | 2018-03-02 | 2023-01-24 | Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha | Control device |
US11013340B2 (en) | 2018-05-23 | 2021-05-25 | L&P Property Management Company | Pocketed spring assembly having dimensionally stabilizing substrate |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007070824A2 (en) * | 2005-12-13 | 2007-06-21 | Senesco Technologies, Inc. | Use of eif-5a to kill multiple myeloma cells |
Family Cites Families (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5344846A (en) | 1992-12-30 | 1994-09-06 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Compositions and methods for inhibiting deoxyhypusine synthase and the growth of cells |
HUP9801681A3 (en) | 1995-02-13 | 2000-10-30 | Novartis Ag | Mutant proteins |
US5849587A (en) | 1995-06-09 | 1998-12-15 | Cornell Research Foundation, Inc. | Method of inhibiting viral replication in eukaryotic cells and of inducing apoptosis of virally-infected cells |
US6468983B2 (en) * | 1997-04-21 | 2002-10-22 | The Cleveland Clinic Foundation | RNase L activators and antisense oligonucleotides effective to treat telomerase-expressing malignancies |
CA2296105A1 (en) * | 1997-06-30 | 1999-01-14 | Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. | Novel inhibitor of cellular proliferation |
US6538182B1 (en) | 1999-07-06 | 2003-03-25 | Senesco, Inc. | DNA encoding a plant deoxyhypusine synthase, a plant eukaryotic initiation factor 5A, transgenic plants and a method for controlling senescence programmed and cell death in plants |
US7358418B2 (en) | 1999-07-06 | 2008-04-15 | Senesco Technologies, Inc. | Isoforms of eIF-5A: senescence-induced eLF5A; wounding-induced eIF-4A; growth eIF-5A; and DHS |
US6033910A (en) * | 1999-07-19 | 2000-03-07 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Antisense inhibition of MAP kinase kinase 6 expression |
WO2001010906A1 (en) | 1999-08-06 | 2001-02-15 | Pharmacia & Upjohn Company | Crystallization and structure determination of staphylococcus aureus elongation factor p |
US7381708B2 (en) * | 2001-07-23 | 2008-06-03 | Sensco Technologies, Inc. | Suppression of eIF5A1 expression by the use of antisense oligonucleotides for the prevention of retinal cell death in the glaucomatous eye |
US7166467B2 (en) | 2001-07-23 | 2007-01-23 | Senesco Technologies, Inc. | Nucleic acids, polypeptides, compositions, and methods for modulating apoptosis |
US20060287265A1 (en) * | 2001-07-23 | 2006-12-21 | Thompson John E | Apoptosis-specific eIF-5A and polynucleotides encoding same |
CA2462638A1 (en) * | 2001-10-02 | 2003-04-10 | University Of Chicago | Methods and compositions for modulating apoptosis |
WO2004011060A2 (en) * | 2002-07-26 | 2004-02-05 | Mirus Corporation | Delivery of molecules and complexes to mammalian cells in vivo |
KR20050098954A (ko) | 2003-03-05 | 2005-10-12 | 세네스코 테크놀로지스 인코포레이티드 | 이아이에프-5에이1의 발현을 억제하기 위한 안티센스올리고뉴클레오타이드 또는 에스아이알엔에이의 이용 |
NZ544159A (en) | 2003-06-06 | 2009-04-30 | Senesco Technologies Inc | Inhibition of apoptosis-specific eIF-5A ("eIF-5A1") with antisense oligonucleotides and siRNAs as anti-inflammatory therapeutics |
JP2008522591A (ja) * | 2004-12-03 | 2008-07-03 | セネスコ テクノロジーズ,インコーポレイティド | アポトーシス特異的eif‐5aおよびそれをコードするポリヌクレオチド |
-
2009
- 2009-03-09 US US12/400,742 patent/US8703929B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2009-03-09 WO PCT/US2009/036583 patent/WO2009114487A2/en active Application Filing
- 2009-03-09 CA CA2717637A patent/CA2717637A1/en not_active Abandoned
- 2009-03-09 CN CN2009801162123A patent/CN102282259A/zh active Pending
- 2009-03-09 EP EP09720567A patent/EP2265717A4/en not_active Withdrawn
- 2009-03-09 AU AU2009223615A patent/AU2009223615B2/en not_active Ceased
-
2014
- 2014-02-26 US US14/190,884 patent/US20140296320A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007070824A2 (en) * | 2005-12-13 | 2007-06-21 | Senesco Technologies, Inc. | Use of eif-5a to kill multiple myeloma cells |
Non-Patent Citations (1)
Title |
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ACHIM AIGNER: "Gene silencing through RNA interference (RNAi) in vivo:Strategies based on the diredct application of siRNAs", 《JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY》 * |
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