CN114703154A - 一种多肽、含有其的蛋白及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种多肽、含有其的蛋白及应用。多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.13、SEQ ID No.20和SEQ ID No.27所示中的至少一种，其具有细胞膜粘附功能。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种具有细胞膜粘附功能的多肽。
背景技术
活性氧(ROS)是细胞代谢中已知的有毒产物。它主要由大多数哺乳动物细胞中的线粒体产生，充当信号分子，并在各种病毒感染期间参与氧化应激。
对于脊椎动物和无脊椎动物来说，生物体在正常状况下，细胞会陆续的产生ROS，也在不断地清除活性氧，因而不会造成自由基对机体的损伤。但是当生物体ROS含量过高时，会造成包括蛋白质，脂质和核酸在内的生物分子的氧化损伤，进而可能会导致细胞功能障碍和行为改变，例如：加速衰老，异常增殖，炎症反应失调等，严重的通常导致细胞死亡，例如：肿瘤，凋亡和自噬。现有技术发现，通过SODs可以降解过量的ROS，以使ROS保持在正常的水平下，维持细胞的稳态。然而，现有的SODs均需要ROS释放到细胞外才可实现降解，这会导致ROS被SODs降解到正常的水平前造成对周围细胞的不利影响。
发明内容
本发明之一提供了一种多肽，其氨基酸序列如SEQ ID No.13、SEQ ID No.20和SEQID No.27所示中的至少一种。
本发明之二提供了一种含有如本发明之一所述多肽的蛋白，其氨基酸序列如SEQID No.1、SEQ ID No.5和SEQ ID No.9所示中的至少一种。
本发明之三提供了一种编码如本发明之一所述的多肽的核酸。
在一个具体实施方式中，所述核酸的碱基序列如SEQ ID No.14、SEQ ID No.21和SEQ ID No.28所示中的至少一种。
本发明之四提供了一种编码如本发明之二所述的蛋白的核酸。
在一个具体实施方式中，所述核酸的碱基序列如SEQ ID No.2、SEQ ID No.6和SEQID No.10所示中的至少一种。
本发明之五提供了根据本发明之一所述的多肽、本发明之二所述的蛋白、本发明之三和本发明之四中任意一项所述的核酸中的一种在用于细胞膜粘附中的应用。该细胞膜粘附功能，可以用于昆虫、昆虫细胞、动物、动物细胞、人或人源细胞，因此，当将其用于动物或人时，也可以表述为根据本发明之一所述的多肽、本发明之二所述的蛋白、本发明之三和本发明之四中任意一项所述的核酸中的一种在用于制备用于细胞膜粘附的药物中的应用。
本发明之六提供了根据本发明之二所述的蛋白或本发明之四中所述的核酸在用于制备降解存在于细胞内的ROS的药物中的应用。
本发明的有益效果：
本发明首次发现MbSOD49、MbSOD58或MbSOD67可以将含量过高的ROS降解在细胞内，以使ROS保持在正常的水平下，维持细胞的稳态。
本发明进一步发现MbSOD49、MbSOD58或MbSOD67之所以能够将ROS降解在细胞内是由于MbSOD49、MbSOD58或MbSOD67上的一段多肽能够粘附在细胞膜上，从而使MbSOD49、MbSOD58或MbSOD67整个蛋白粘附在细胞膜上，并进一步通过MbSOD49、MbSOD58或MbSOD67蛋白中膜结合区域以外的部分将含量过高ROS降解在细胞内。
附图说明
图1显示了pIZT/V5-His-MbSOD49重组质粒、pIZT/V5-His-MbSOD58和pIZT/V5-His-MbSOD67重组质粒在High Five细胞中表达的Western blot。
图2显示了免疫荧光实验检测MbSOD49、MbSOD58和MbSOD67在High Five细胞中的表达情况。图中显示随着时间的延长三种蛋白在细胞质中的量逐渐减少。
图3显示了MbSOD49 Spli221细胞膜蛋白的Western blot。
图4显示了MbSOD58 Spli221细胞膜蛋白的Western blot。
图5显示了MbSOD67 Spli221细胞膜蛋白的Western blot。
图6显示了MbSOD49、MbSOD58、MbSOD67对MbBV感染的Spli221细胞中胞内ROS的降解情况。
图7 Western Blot检测pIZT/V5-His–MbSOD49ΔBIg、pIZT/V5-His–MbSOD58ΔBIg、pIZT/V5-His–MbSOD67ΔBIg的表达及表达蛋白的分泌性。
图8显示了MbSOD49ΔBIg Spli221、MbSOD58ΔBIg Spli221、MbSOD67ΔBIg Spli221细胞膜蛋白的Western blot。
图9显示了MbSOD49ΔBIg、MbSOD58ΔBIg和MbSOD67ΔBIg对MbBV感染的Spli221细胞中胞内ROS的降解情况。
图10显示了MbSOD49、MbSOD58和MbSOD67转录水平的qRT-PCR检测图。
图11显示了沉默MbSOD49、MbSOD58和MbSOD67后斜纹夜蛾幼虫血淋巴细胞中的ROS含量。
图12显示了MbSOD49、MbSOD58和MbSOD67在人正常肺上皮(BEAS 2B)细胞中的表达。
图13显示了MbSOD49、MbSOD58、MbSOD67对CBX刺激宣威肺癌细胞产生的胞内ROS的降解情况。
具体实施方式
以下通过优选的实施案例的形式对本发明的上述内容作进一步的详细说明，但其不构成对本发明的限制。
如无特别说明，本发明的实施例中的试剂均可通过商业途径购买。
实施例1
1.MbSOD49、MbSOD58和MbSOD67全长的克隆
双斑侧沟茧蜂的MbSOD49蛋白共172个氨基酸，如SEQ ID No.1所示；MbSOD49的cDNA共531bp，如SEQ ID No.2所示。扩增MbSOD49全长的特异引物为49-F(如SEQ ID No.3所示)和49-R(如SEQ ID No.4所示)。
双斑侧沟茧蜂的MbSOD58蛋白共205个氨基酸，如SEQ ID No.5所示；MbSOD58的cDNA共630bp，如SEQ ID No.6所示。扩增MbSOD58全长的特异引物为58-F(如SEQ ID No.7所示)和58-R(如SEQ ID No.8所示)。
双斑侧沟茧蜂的MbSOD67蛋白共173个氨基酸，如SEQ ID No.9所示；MbSOD67的cDNA共534bp，如SEQ ID No.10所示。扩增MbSOD67全长的特异引物为67-F(如SEQ ID No.11所示)和67-R(如SEQ ID No.12所示)。
提取10头双斑侧沟茧蜂3日龄幼虫的总RNA，然后用PrimeScriptTMRT reagent Kitwith gDNA Eraser试剂盒(货号RR047A)进行反转录，得到cDNA。
以所得的cDNA为模板，以49-F和49-R为引物对MbSOD49进行PCR扩增，得到MbSOD49PCR产物。将MbSOD49 PCR产物检测后，连接到克隆载体pBM16A-T上，转化大肠杆菌DH5α，挑取单菌落，经质粒提取、Kpn I和EcoR I双酶切所提取的质粒及PCR扩增并测序鉴定正确后，得到含有靶标片段的pBM16A-MbSOD49重组质粒及DH5α/pBM16A-MbSOD49重组菌株。
以所得的cDNA为模板，以58-F和58-R为引物对MbSOD58进行PCR扩增，得到MbSOD58PCR产物。将MbSOD58 PCR产物检测后，连接到克隆载体pBM16A-T上，转化大肠杆菌DH5α中，挑取单菌落，经质粒提取、Kpn I和EcoR I双酶切所提取的质粒及PCR扩增并测序鉴定正确后，得到含有靶标片段的pBM16A-MbSOD58重组质粒及DH5α/pBM16A-MbSOD58重组菌株。
以所得的cDNA为模板，以67-F和67-R为引物对MbSOD67进行PCR扩增，得到MbSOD67PCR产物。将MbSOD67 PCR产物检测后，连接到克隆载体pBM16A-T上，转化大肠杆菌DH5α中，挑取单菌落，经质粒提取、Kpn I和EcoR I双酶切所提取的质粒及PCR扩增并测序鉴定正确后，得到含有靶标片段的pBM16A-MbSOD67重组质粒及DH5α/pBM16A-MbSOD67重组菌株。
从DH5α/pBM16A-MbSOD49重组菌株中提取pBM16A-MbSOD49重组质粒，将pBM16A-MbSOD49用Kpn I和EcoR I双酶切后使用胶回收试剂盒(货号D2500-02-200)回收MbSOD49基因片段；将pIZT/V5-His质粒(Thermo fisher，包含6个组氨酸标签)同样用Kpn I和EcoR I双酶切后用胶回收试剂盒(货号D2500-02-200)回收pIZT/V5-His载体线性片段。将回收的MbSOD49基因片段与回收的pIZT/V5-His载体线性片段利用T4连接酶连接12h，转化大肠杆菌DH5α中，挑取单菌落，经提取质粒、Kpn I和EcoR I双酶切所提取的质粒及PCR扩增并测序鉴定正确后，得到阳性pIZT/V5-His-MbSOD49重组质粒及DH5α/pIZT/V5-His-MbSOD49重组菌株。
从DH5α/pBM16A-MbSOD58重组菌株中提取pBM16A-MbSOD58重组质粒，将pBM16A-MbSOD58用Kpn I和Sac II双酶切后使用胶回收试剂盒(货号D2500-02-200)回收MbSOD58基因片段；将pIZT/V5-His质粒(Thermo fisher，包含6个组氨酸标签)同样用Kpn I和Sac II双酶切后使用胶回收试剂盒(货号D2500-02-200)回收pIZT/V5-His载体线性片段。将回收的MbSOD58基因片段与回收的pIZT/V5-His载体线性片段利用T4连接酶连接12h，转化大肠杆菌DH5α中，挑取单菌落，经提取质粒、Kpn I和Sac II双酶切所提取的质粒及PCR扩增并测序鉴定正确后，得到阳性pIZT/V5-His-MbSOD58重组质粒及DH5α/pIZT/V5-His-MbSOD58重组菌株。
从DH5α/pBM16A-MbSOD67重组菌株中提取pBM16A-MbSOD67重组质粒，将pBM16A-MbSOD67用Kpn I和EcoR I双酶切后使用胶试剂盒(货号D2500-02-200)回收MbSOD67基因片段；将pIZT/V5-His质粒(Thermo fisher，包含6个组氨酸标签)同样用Kpn I和EcoR I双酶切后使用胶回收试剂盒(货号D2500-02-200)回收pIZT/V5-His载体线性片段。将回收的MbSOD67基因片段与回收的pIZT/V5-His载体线性片段利用T4连接酶连接12h，转化大肠杆菌DH5α中，挑取单菌落，经提取质粒、Kpn I和EcoR I双酶切所提取的质粒及PCR扩增并测序鉴定正确后，得到阳性pIZT/V5-His-MbSOD67重组质粒及DH5α/pIZT/V5-His-MbSOD67重组菌株。
2.pIZT/V5-His-MbSOD49转染High Five与总蛋白的提取
1)质粒提取
按照E.Z.N.A.Endo-free Plasmid DNA Mini Kit I(货号D6950-01B)说明书分别从DH5α/pIZT/V5-His-MbSOD49重组菌株中提取pIZT/V5-His-MbSOD49重组质粒。
2)转染High Five细胞
使用25cm2培养瓶培养High Five细胞，当High Five细胞生长密度达到80％-90％时，移除旧培养基，加入5mL新的培养基，用枪头轻轻吹打悬浮细胞，随后取90μL细胞悬液加10μL台盼蓝，轻轻混匀，静置3min，用血细胞计数板计数；计数后，分别取2×105个细胞加入到五个直径为60mm的培养皿中，27℃贴壁培养2h以上直至细胞贴壁、状态良好。待细胞贴壁完全后用双无培养基饥饿处理High Five细胞30min。
配制转染试剂复合物：吸取100μL的双无培养基置于1.5ml离心管中，然后向其中加入2μg步骤1)中提取的pIZT/V5-His-MbSOD49重组质粒，得到转染质粒稀释液；取100μL的双无培养基置于另一个1.5ml离心管中，然后向其中加入5μl转染试剂Cell fection II，震荡混匀，得到转染试剂稀释液；将转染试剂稀释液加入到转染质粒稀释液中，混合均匀，之后室温静置45min，且每15分钟震荡几下，从而得到转染试剂复合物。向转染试剂复合物中加入800μl双无培养基，混匀，将其逐滴加入到培养有饥饿处理30min的High Five细胞的60mm培养皿中，放到摇床上轻轻晃动，使混合均匀，然后27℃继续培养5小时，弃去培养液，得到High Five/pIZT/V5-His-MbSOD49重组瞬时表达细胞。随后向其中加入含有10％血清的培养基，培养72h。
3)总蛋白的提取
具体步骤如下：
(1)在High Five/pIZT/V5-His-MbSOD49重组瞬时表达细胞培养72小时后，吸去培养基，用1ml的1×PBS清洗3次后，再加入1ml的1×PBS；
(2)将细胞从贴壁状态吹下，转移至1.5ml EP管中，冰上放置，5000rcf离心5min，弃上清；
(3)加入80μL RIPA混合液(RIPA：PMSF＝100：1)，每隔5min震荡一次，共三次，然后4℃13000rcf离心10min；
(4)将上清转移至新的EP管中，得到总蛋白提取液，总蛋白提取液中含有融合有V5和His标签的MbSOD49融合蛋白；
(5)利用BCA蛋白定量试剂盒测定总蛋白提取液中的总蛋白浓度。
3.pIZT/V5-His-MbSOD58转染High Five与总蛋白的提取
以本实施例第2小节相同的操作将pIZT/V5-His-MbSOD58重组质粒转染至HighFive细胞中，得到High Five/pIZT/V5-His-MbSOD58重组瞬时表达细胞。然后提取总蛋白，得到总蛋白提取液，其中，总蛋白提取液中含有融合有V5和His标签的MbSOD58的融合蛋白，利用BCA蛋白定量试剂盒测定总蛋白提取液中的总蛋白浓度。
4.pIZT/V5-His-MbSOD67转染High Five与总蛋白的提取
以本实施例第2小节相同的操作将pIZT/V5-His-MbSOD67重组质粒转染至HighFive细胞中，得到High Five/pIZT/V5-His-MbSOD67重组瞬时表达细胞。然后提取总蛋白，得到总蛋白提取液，其中，总蛋白提取液中含有融合有V5和His标签的MbSOD67的融合蛋白。利用BCA蛋白定量试剂盒测定总蛋白提取液中的总蛋白浓度。
5.pIZT/V5-His转染High Five与总蛋白的提取
以本实施例第2小节相同的操作将pIZT/V5-His空载体转染至High Five细胞中，得到High Five/pIZT/V5-His重组瞬时表达细胞。然后提取总蛋白，得到总蛋白提取液，作为阴性对照组(以“pIZT/V5-His”表示)，将提取的总蛋白称为阴性对照总蛋白。利用BCA蛋白定量试剂盒测定总蛋白提取液中的总蛋白浓度。
6.High Five细胞总蛋白的提取
以本实施例第2小节相同的操作提取High Five细胞的总蛋白，得到总蛋白提取液，作为空白对照组(以“Ctrl”表示)，将提取的总蛋白称为空白对照总蛋白。利用BCA蛋白定量试剂盒测定总蛋白提取液中的总蛋白浓度。
7.Western blot检测
在将High Five细胞(“Ctrl”)、High Five/pIZT/V5-His(阴性对照)、High Five/pIZT-His-MbSOD49、High Five/pIZT-His-MbSOD58和High Five/pIZT-His-MbSOD67的总蛋白SDS-PAGE之后进行PVDF转膜。将10mL 1×PBS与5μl Anti-V5(R960-25，购买于Invirotrogen)混合，得到Anti-V5一抗稀释液，使用其孵育转膜后的PVDF膜12小时，回收Anti-V5一抗稀释液，用1×PBST(10L 1×PBS:5ml吐温)清洗三次，每次5分钟；随后将HRP标记山羊抗鼠IgG(H+L)(A0208、购买于Beyotime)作为二抗，取1μl加入到0.15g牛奶与5mlPBST的混合液中，得到二抗稀释液，将PVDF膜在二抗稀释液中孵育1小时，弃除二抗稀释液，用1×PBST清洗三次，每次5分钟；使用辣根过氧化物酶(HRP)化学发光底物进行化学发光，将PVDF膜在Flour Chem EFE0511中曝光成像，见图1。接着，将10mL 1×PBS与5μl内参微管蛋白抗体Anti-Tubulin(M1000130，购买于Solarbio)混合，得到Anti-Tubulin一抗稀释液，使用其孵育经Anti-V5成像后的PVDF膜12小时，回收Anti-Tubulin一抗稀释液，用1×PBST清洗三次，每次5分钟；随后用HRP标记山羊抗鼠IgG(H+L)(A0208、购买于Beyotime)作为二抗，取1μl加入到0.15g牛奶与5ml PBST的混合液中，得到二抗稀释液，将PVDF膜用其孵育1小时，弃除二抗稀释液，1×PBST清洗三次，每次5分钟；使用辣根过氧化物酶(HRP)化学发光底物进行化学发光，将PVDF膜在FlourChem EFE0511中曝光成像，见图1。
由图1可知，MbSOD49、MbSOD58、MbSOD67在High Five细胞中成功表达。
实施例2
免疫荧光实验检测MbSOD49、MbSOD58和MbSOD67的分泌性
1)与实施例1第2小节的不同之处在于：将60mm的培养皿替换为六孔板，每个孔加入计数后的细胞的数量为2×105个，并以一个孔作为一个处理；得到High Five/pIZT/V5-His-MbSOD49重组瞬时表达细胞后向其中加入含有10％血清的培养基，培养24h，得到24hHigh Five/pIZT/V5-His-MbSOD49细胞。
其他同实施例1第2小节。
2)仅培养时间由24小时变为48小时，其他同上述第1)小节，最后获得48h HighFive/pIZT/V5-His-MbSOD49细胞。
3)仅培养时间由24小时变为72小时，其他同上述第1)小节，最后获得72h HighFive/pIZT/V5-His-MbSOD49细胞。
4)仅pIZT/V5-His-MbSOD49重组质粒替换为pIZT/V5-His-MbSOD58，其他同上述第1)小节，最后获得24h High Five/pIZT/V5-His-MbSOD58细胞。
5)仅培养时间由24小时变为48小时，其他同上述第4)小节，最后获得48h HighFive/pIZT/V5-His-MbSOD58细胞。
6)仅培养时间由24小时变为72小时，其他同上述第4)小节，最后获得72h HighFive/pIZT/V5-His-MbSOD58细胞。
7)仅pIZT/V5-His-MbSOD49重组质粒替换为pIZT/V5-His-MbSOD67，其他同上述第1)小节，最后获得24h High Five/pIZT/V5-His-MbSOD67细胞。
8)仅培养时间由24小时变为48小时，其他同上述第7)小节，最后获得48h HighFive/pIZT/V5-His-MbSOD67细胞。
9)仅培养时间由24小时变为72小时，其他同上述第7)小节，最后获得72h HighFive/pIZT/V5-His-MbSOD67细胞。
将上述细胞进行免疫荧光实验。其中，以Anti-V5(Anti-V5：1×PBS＝1:1000)为一抗；以Alexa FluorR568 Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(用1×PBS以1:1000稀释)为二抗(显示为红色)；用鬼笔环肽(用1×PBS以1:1000稀释)染色，使细胞骨架呈绿色；用DAPI(用1×PBS以1:1000稀释)染色，使细胞核呈蓝色。最后制作爬片，向载玻片上滴加防荧光淬灭剂，将爬片放上载玻片(避免产生气泡)，用指甲油进行固定，进行荧光拍照，然后将红色、绿色和蓝色荧光叠加，得到图2。
利用LAS X软件对目的蛋白的红色荧光图片进行荧光强度分析后利用GraphPadPrism 6对荧光强度值数据进行统计，数据分析使用t检验，p<0.001，***表示差异很显著，p<0.0001，****表示差异极显著。结果见图2。
由图2可以看出，与24小时相比较，在48小时和72小时，蛋白MbSOD49、MbSOD58、MbSOD67在细胞质中逐渐减少，但其并没有进入细胞核，说明蛋白MbSOD49、MbSOD58、MbSOD67分泌到了细胞外。
实施例3
1.MbSOD49、MbSOD58和MbSOD67的细胞膜黏附
1)以实施例1第2小节相同的操作将pIZT/V5-His-MbSOD49重组质粒转染至HighFive细胞中，得到High Five/pIZT/V5-His-MbSOD49重组瞬时表达细胞，随后向其中加入含有10％血清的培养基，培养72h，然后将培养液与细胞分离，将分离得到的培养液记作培养液MbSOD49。
2)仅pIZT/V5-His-MbSOD49重组质粒替换为pIZT/V5-His-MbSOD58，其他同上述第1)小节，最后获得培养液MbSOD58。
3)仅pIZT/V5-His-MbSOD49重组质粒替换为pIZT/V5-His-MbSOD67，其他同上述第1)小节，最后获得培养液MbSOD67。
使用25cm2培养瓶培养Spli221细胞，当Spli221细胞生长密度达到80％-90％时，移除旧培养基，加入5mL新的培养基，用枪头轻轻吹打悬浮细胞，得到细胞悬液，随后取90μL细胞悬液加10μL台盼蓝，轻轻混匀，静置3min，用血细胞计数板计数；计数后，取4×105个细胞加入到4个60mm培养皿中，27℃贴壁培养2h以上进行饥饿处理直至细胞贴壁、状态良好。待细胞贴壁完全后进行以下平行处理：
向一个60mm的皿中用含有10％血清的培养基孵育Spli221细胞48h，提取Spli2221的细胞膜蛋白，作为空白对照，用“Ctrl”表示。
向剩余的三个60mm的皿中依次加入上述培养液MbSOD49、MbSOD58和MbSOD67，孵育Spli221细胞48h，记作MbSOD49 Spli221、MbSOD58 Spli221、MbSOD67 Spli221。根据MinuteTM质膜蛋白提取试剂盒(目录号为SM-005)分别提取MbSOD49 Spli221、MbSOD58Spli221、MbSOD67 Spli221的细胞膜蛋白。
将上述得到的细胞膜蛋白以Anti-V5作为一抗进行Western Blot检测，操作过程同实施例1第7小节，将PVDF膜在FlourChem EFE0511中曝光成像，结果见图3至图5。接着用抗体-ATPβchain(自制)用于检测内参，操作过程同实施例1第7小节，将PVDF膜在FlourChemEFE0511中曝光成像，结果见图3至图5。
由图3至图5可知，MbSOD49、MbSOD58和MbSOD67具有细胞膜黏附性，即此三种蛋白均可分泌到细胞外黏附在细胞膜上。
2.MbSOD49、MbSOD58和MbSOD67降解胞内ROS的检测
以本实施例第1小节相同的操作制备得到培养液MbSOD49、培养液MbSOD58和培养液MbSOD67，三者总称为培养液MbSODs。
使用25cm2培养瓶培养Spli221细胞，当Spli221细胞生长密度达到80％-90％时，移除旧培养基，加入5mL新的培养基，用枪头轻轻吹打悬浮细胞，得到细胞悬液，随后取90μL细胞悬液加10μL台盼蓝，轻轻混匀，静置3min，用血细胞计数板计数；计数后，取1×105个细胞加入到1个12孔板中，27℃贴壁培养2h以上进行饥饿处理直至细胞贴壁、状态良好。待细胞贴壁完全后进行以下平行处理：
1)向12孔板的3个孔中加入MbBV和含有10％血清的培养基，感染48小时，得到病毒感染的Spli221细胞。然后分别加入培养液MbSOD49、MbSOD58和MbSOD67孵育3个病毒感染的Spli221细胞48小时，记作MbSOD49处理组、MbSOD58处理组和MbSOD67处理组。
2)在得到上述病毒感染的Spli221细胞时，向12孔板的1个孔中加入含有10％血清的培养基孵育Spli221细胞48h，作为空白对照，用“Ctrl”表示。
3)在得到上述病毒感染的Spli221细胞时，向12孔板的1个孔中加入MbBV和含有10％血清的培养基，感染Spli221细胞48小时，作为阴性对照组。
使用活性氧检测试剂盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit，S0033S)检测MbSOD49处理组、MbSOD58处理组和MbSOD67处理组、阴性对照组和空白对照组的ROS。利用Image J软件对绿色荧光进行荧光强度分析后用GraphPad Prism 6对荧光强度值数据进行统计，数据分析使用t检验，p<0.01，**表示差异显著，p<0.001，***表示差异很显著，p<0.0001，****表示差异极显著。结果见图6。其中“+”表示加入MbBV或培养液MbSODs，“—”表示未加MbBV或培养液MbSODs。
由图6可知，阴性对照组在经MbBV刺激48小时后，与空白对照组相比活性氧(ROS)显著升高；而MbSOD49处理组、MbSOD58处理组和MbSOD67处理组的活性氧(ROS)与阴性对照组相比含量降低。
综合图3至图6可知，双斑侧沟茧蜂分泌的MbSOD49、MbSOD58和MbSOD67均可通过黏附在细胞膜上降解细胞内的ROS，从而避免了ROS释放到细胞外。
实施例4
1.缺失MbSOD49ΔBIg、MbSOD58ΔBIg和MbSOD67ΔBIg的克隆
将MbSOD49中的13个氨基酸(如SEQ ID No.13所示，编码其的cDNA 39bp，如SEQ IDNo.14所示)进行缺失，缺失后的蛋白以MbSOD49ΔBig表示。基于重叠PCR原理，以pIZT/V5-His-MbSOD49质粒为第一轮PCR的模板，以特异引物对49-F1(如SEQ ID No.15所示)和49-R1(如(SEQ ID No.16所示)，以及49-F2(如SEQ ID No.17所示)和49-R2(如SEQ ID No.18所示)分别为第一轮PCR的引物对进行PCR，然后以两个第一轮的PCR产物混合物为模板，以49-F1和49-R2为引物对进行第二轮PCR，得到MbSOD49ΔBIg DNA片段(如SEQ ID No.19所示)，将其连接到克隆载体pBM16A-T(Takara)上，经测序确定正确，得到含有靶标片段的pBM16A-MbSOD49ΔBIg重组质粒。
将MbSOD58中的17个氨基酸(如SEQ ID No.20所示，编码其的cDNA 51bp，如SEQ IDNo.21所示)进行缺失，缺失后的蛋白以MbSOD58ΔBIg表示.基于重叠PCR原理，以pIZT/V5-His-MbSOD58质粒为第一轮PCR的模板，利用特异引物对58-F1(如SEQ ID No.22所示)和58-R1(如SEQ ID No.23所示)，以及58-F2(如SEQ ID No.24所示)和58-R2(如SEQ ID No.25所示)分别为第一轮PCR的引物对进行PCR，然后以两个第一轮的PCR产物混合物为模板，以58-F1和58-R2为引物对进行第二轮PCR，得到MbSOD58ΔBig DNA片段(如SEQ ID No.26所示)，将其连接到克隆载体pBM16A-T(Takara)上，经测序确定正确，得到含有靶标片段的pBM16A-MbSOD58ΔBIg重组质粒。
将MbSOD67中的8个氨基酸(如(SEQ ID No.27所示，编码其的cDNA序列共24bp，如SEQ ID No.28所示)进行缺失，缺失后的蛋白以MbSOD67ΔBIg表示.以pIZT/V5-His-MbSOD67质粒为PCR的模板，利用特异引物对为67-F(如SEQ ID No.29所示)和67-R(如SEQ ID No.30所示)进行PCR扩增，得到MbSOD67ΔBig DNA片段(如SEQ ID No.31所示)，将其连接到克隆载体pBM16A-T(Takara)上，经测序确定正确，得到含有靶标片段的pBM16A-MbSOD67ΔBIg重组质粒。
将pBM16A-MbSOD49ΔBIg用Kpn I和EcoR I双酶切后回收MbSOD49ΔBIg基因片段；将pIZT/V5-His质粒(Thermo fisher，包含6个组氨酸标签)用Kpn I和EcoR I双酶切后回收pIZT/V5-His载体线性片段。将回收的MbSOD49ΔBIg基因片段与回收的pIZT/V5-His载体线性片段利用T4连接酶连接，得到阳性pIZT/V5-His-MbSOD49ΔBIg重组质粒。
将pBM16A-MbSOD58ΔBIg用Kpn I和Sac II双酶切后回收MbSOD58ΔBIg基因片段；将pIZT/V5-His质粒(Thermo fisher，包含6个组氨酸标签)用Kpn I和Sac II双酶切后回收pIZT/V5-His载体线性片段。将回收的MbSOD58ΔBIg基因片段与回收的pIZT/V5-His载体线性片段利用T4连接酶连接，得到阳性pIZT/V5-His-MbSOD58ΔBIg重组质粒。
将pBM16A-MbSOD67ΔBIg用Kpn I和EcoR I双酶切后回收MbSOD67ΔBIg基因片段；将pIZT/V5-His质粒(Thermo fisher，包含6个组氨酸标签)用Kpn I和EcoR I双酶切后回收pIZT/V5-His载体线性片段。将回收的DOHH基因片段与回收的pIZT/V5-His载体线性片段利用T4连接酶连接，得到阳性pIZT/V5-His-MbSOD67ΔBIg重组质粒。
2.pIZT/V5-His-MbSOD49ΔBIg转染High Five细胞后总蛋白和培养液的获得
以实施例1第2小节相同的操作将pIZT/V5-His-MbSOD49ΔBIg转染至High Five细胞中，得到High Five/pIZT/V5-His-SOD49ΔBIg重组瞬时表达细胞。随后向其中加入含有10％血清的培养基，培养72h，然后将培养液与细胞分离，将分离得到的培养液记作MbSOD49ΔBIg培养液；并采用实施例1第2小节中总蛋白提取相同的操作，提取分离出的细胞的总蛋白，记作MbSOD49ΔBIg细胞总蛋白。
3.pIZT/V5-His–MbSOD58ΔBIg转染High Five细胞后总蛋白和培养液的获得
仅pIZT/V5-His-MbSOD49ΔBIg重组质粒替换为pIZT/V5-His-MbSOD58ΔBIg，其他同上述第2小节，最后分别获得MbSOD58ΔBIg培养液，MbSOD58ΔBIg细胞总蛋白。
4.pIZT/V5-His–MbSOD67ΔBIg转染High Five细胞后总蛋白和培养液的获得
仅pIZT/V5-His-MbSOD49ΔBIg重组质粒替换为pIZT/V5-His-MbSOD67ΔBIg，其他同上述第2小节，最后分别获得MbSOD67ΔBIg培养液，MbSOD67ΔBIg细胞总蛋白。
5.pIZT/V5-His转染High Five后与总蛋白的提取。
以实施例1第2小节相同的操作将pIZT/V5-His空载体转染至High Five细胞中，得到High Five/pIZT/V5-His重组细胞。然后提取总蛋白，得到总蛋白提取液，作为阴性对照组(以“pIZT/V5-His”表示)，因此将提取的总蛋白称为阴性对照总蛋白。
6.High Five细胞总蛋白的提取。
以实施例1第2小节相同的操作提取High Five细胞的总蛋白，得到总蛋白提取液，作为空白对照组(以“Ctrl”表示)，因此将提取的总蛋白称为空白对照总蛋白。
7.Western Blot检测pIZT/V5-His–MbSOD49ΔBIg、pIZT/V5-His–MbSOD58ΔBIg、pIZT/V5-His–MbSOD67ΔBIg的表达及表达蛋白的分泌性
将上述第2小节至第6小节得到的空白对照总蛋白(以“Ctrl”表示)、阴性对照总蛋白、MbSOD49ΔBIg细胞总蛋白、培养液MbSOD49ΔBIg、MbSOD58ΔBIg细胞总蛋白、培养液MbSOD58ΔBIg、MbSOD67ΔBIg细胞总蛋白及培养液MbSOD67ΔBIg作为样品，以Anti-V5为一抗进行Westernblot检测，其他操作同实施1第7小节，将PVDF膜在FlourChem EFE0511中曝光成像，结果如图5所示。接着用微管蛋白抗体Anti-GAPDH(YM3215，购买于Immunoway)用于检测内参，操作过程同实施1第7小节，将PVDF膜在FlourChem EFE0511中曝光成像，结果见图7。
由图7可知，MbSOD49ΔBIg、MbSOD58ΔBIg、MbSOD67ΔBIg在High Five细胞中依然正常表达且不影响分泌性。
8.pIZT/V5-His–MbSOD49ΔBIg、pIZT/V5-His–MbSOD58ΔBIg、pIZT/V5-His–MbSOD67ΔBIg的细胞膜黏附
以实施例3第1小节相同的操作将pIZT/V5-His–MbSOD49ΔBIg、pIZT/V5-His–MbSOD58ΔBIg、pIZT/V5-His–MbSOD67ΔBIg转染进High Five细胞后，收取培养液MbSOD49ΔBIg、培养液MbSOD58ΔBIg、培养液MbSOD67ΔBIg，分别用于孵育Spli221细胞后得到MbSOD49ΔBIgSpli221、MbSOD58ΔBIg Spli221、MbSOD67ΔBIg Spli221。然后分别提取MbSOD49ΔBIg Spli221、MbSOD58ΔBIg Spli221、MbSOD67ΔBIg Spli221细胞膜蛋白，作为处理组。
以实施例3第1小节相同的操作获得的MbSOD49 Spli221、MbSOD58 Spli221、MbSOD67 Spli221的细胞膜蛋白作为阳性对照组。
以实施例3第1小节相同的操作用含有10％血清的培养基孵育Spli221细胞48h，提取Spli221细胞膜蛋白，作为空白对照组，用(“Ctrl”)表示。
将上述三组膜蛋白以Anti-V5作为一抗进行Western blot检测，操作过程同实施例3第1小节，将PVDF膜在FlourChem EFE0511中曝光成像的结果见图8。
从图8可知，阳性对照组能够检测到目标条带，而MbSOD49ΔBIg、MbSOD58ΔBIg、MbSOD67ΔBIg处理组与空白对照没有检测到目的条带。说明MbSOD49ΔBIg、MbSOD58ΔBIg、MbSOD67ΔBIg不黏附在细胞膜上，进而说明缺失的多肽片段具有膜粘附的功能。
9.MbSOD49ΔBIg、MbSOD58ΔBIg、MbSOD67ΔBIg对胞内ROS的降解
以实施例3第2小节相同的操作检测获得空白对照(用“Ctrl”表示)、阴性对照组、MbSOD49ΔBIg、MbSOD58ΔBIg和MbSOD67ΔBIg处理组，使用活性氧检测试剂盒(Reactive OxygenSpecies Assay Kit，S0033S)以检测MbSOD49ΔBIg、MbSOD58ΔBIg、MbSOD67ΔBIg对ROS的降解。不同之处在于，将培养液MbSOD49替换为培养液MbSOD49ΔBig，将培养液MbSOD58替换为培养液MbSOD58ΔBig，将培养液MbSOD67替换为培养液MbSOD67ΔBig。
利用Image J软件对绿色荧光进行荧光强度分析后用GraphPad Prism 6对荧光强度值数据进行统计，数据分析使用t检验，NS表示无差异，p<0.1，*表示有差异，p<0.01，**表示差异显著，p<0.001，***表示差异很显著，结果见图9。其中“+”表示加入MbBV、培养液MbSODs或培养液MbSODsΔBig，“—”表示未加MbBV、培养液MbSODs或培养液MbSODsΔBig。
综合图7、图8和图9可知，虽然MbSOD49ΔBIg、MbSOD58ΔBIg、MbSOD67ΔBIg成功表达且不影响分泌性，但MbSOD49ΔBIg、MbSOD58ΔBIg、MbSOD67ΔBIg不能黏附在细胞膜上且不能降解细胞内的ROS。
实施例5
1.干扰载体L4440-MbSOD49、L4440-MbSOD58和L4440-MbSOD67的构建
将实施例1中第1小节获得的pBM16A-MbSOD49用限制性内切酶Kpn I和EcoR I双酶切获得MbSOD49基因片段。与此同时，将L4440质粒用相同的限制性内切酶Kpn I和EcoR I双酶切获取L4440载体线性片段，将回收的MbSOD49基因片段与回收的L4440载体线性片段利用T4连接酶连接，转化大肠杆菌HT115中，挑取单菌落，鉴定得到阳性L4440-MbSOD49重组质粒及相应的HT115/L4440-MbSOD49重组菌株。
将实施例1中第1小节获得的pBM16A-MbSOD58用限制性内切酶Kpn I和Sac II双酶切获得MbSOD58基因片段。与此同时，将L4440质粒用相同的限制性内切酶Kpn I和Sac II双酶切获取L4440载体线性片段，将回收的MbSOD58基因片段与回收的L4440载体线性片段利用T4连接酶连接，转化大肠杆菌HT115中，挑取单菌落，鉴定得到阳性L4440-MbSOD58重组质粒及相应的HT115/L4440-MbSOD58重组菌株。
将实施例1中第1小节获得的pBM16A-MbSOD67用限制性内切酶Kpn I和EcoR I双酶切获得MbSOD67基因片段。与此同时，将L4440质粒用相同的限制性内切酶Kpn I和EcoR I双酶切获取L4440载体线性片段，将回收的MbSOD67基因片段与回收的L4440载体线性片段利用T4连接酶连接，转化大肠杆菌HT115中，挑取单菌落，鉴定得到阳性L4440-MbSOD67重组质粒及相应的HT115/L4440-MbSOD67重组菌株。
以构建L4440-MbSOD49相同的方式构建得到L4440-EGFP及相应的HT115/L4440-EGFP重组菌株，以用于对照。
2.MbSOD49、MbSOD58、MbSOD67和EGFP dsRNA的饲喂
1)dsRNA的制备
将HT115/L4440-MbSOD49、HT115/L4440-MbSOD58和HT115/L4440-MbSOD67干扰菌株分别在含氨苄青霉素浓度为100μg/mL和四环素浓度为10μg/mL的液体培养基400ml中摇菌至OD值为0.6，加IPTG至终浓度为0.4mmol/mL，离心，分别得到HT115/L4440-MbSOD49、HT115/L4440-MbSOD58和HT115/L4440-MbSOD67菌体，分别加入5ml蒸馏水将菌体悬浮，分别得到MbSOD49 dsRNA、MbSOD58 dsRNA和MbSOD67 dsRNA菌悬液；同时阴性对照HT115/L4440-EGFP也进行相同的处理，最后得到EGFP dsRNA菌悬液。
2)配制饲料
A.营养物质(1份的量)：黄豆粉5.0g、麦麸5.0g、酵母提取物2.0g、琼脂粉1.0g、干酪素1.0g。准确称量上述营养物，然后装入200mL的保鲜盒中。
B.混合粉末(1份的量)：尼泊金甲酯0.125g、山梨酸0.125g、抗坏血酸0.2g、胆固醇0.5g、氯化胆碱0.0425g、六合维生素丸(碾碎)半粒。准确称量上述试剂，装于1.5mL的离心管中。
向每一份A中的营养物质中加入45mL的蒸馏水，经过120℃ 30分钟高温灭菌后，降温至50℃后加入一份B中的混合粉末，制得45mL饲料。
向一份45mL的饲料中加入步骤1)所得的5mL MbSOD49 dsRNA菌悬液，得到MbSOD49dsRNA混合饲料。
向一份45mL的饲料中加入步骤1)所得的5mL MbSOD58 dsRNA菌悬液，得到MbSOD58dsRNA混合饲料。
向一份45mL的饲料中加入步骤1)所得的5mL MbSOD67 dsRNA菌悬液，得到MbSOD67dsRNA混合饲料。
向一份45mL的饲料中加入步骤1)所得的5mL EGFP dsRNA菌悬液，得到EGFP dsRNA混合饲料，以用作阴性对照。
向一份45ml的饲料中加入50ml灭菌水，得到不添加dsRNA的饲料，以用作空白对照，用“Ctrl”表示。
3)MbSOD49 dsRNA、MbSOD58 dsRNA、MbSOD67 dsRNA的饲喂
取适量已消毒的斜纹夜蛾的卵片，放入标记好的培养器具中，置于温度为27℃，湿度为60％的养虫室。幼虫孵出24小时，将其放入双斑侧沟茧蜂蜂箱进行寄生，24小时后拿出，然后分别用MbSOD49、MbSOD58、MbSOD67 dsRNA混合饲料饲喂，每天进行新饲料与旧饲料的更换，且新饲料中含有相同浓度的菌悬液。以EGFP dsRNA混合饲料进行相同的处理作为阴性对照。以不添加dsRNA的饲料进行相同的处理作为空白对照，以“Ctrl”表示。
4)饲喂MbSOD49 dsRNA、MbSOD58 dsRNA、MbSOD67 dsRNA之后的qRT-PCR检测
在利用分别饲喂MbSOD49、MbSOD58、MbSOD67 dsRNA混合饲料和不添加dsRNA饲料六天后，分别提取空白对照组(“Ctrl”)、阴性对照组和处理组的幼虫血淋巴的总RNA，然后逆转录得到cDNA。
以所得cDNA为模板，以qPCR MbSOD49-F(如SEQ ID No.32所示)和qPCR MbSOD49-R(如(SEQ ID No.33所示)为引物进行qRT-PCR。
以所得cDNA为模板，以qPCR MbSOD58-F(如SEQ ID No.34所示)和qPCR MbSOD58-R(如(SEQ ID No.35所示)为引物进行qRT-PCR。
以所得cDNA为模板，以qPCR MbSOD67-F(如SEQ ID No.36所示)和qPCR MbSOD67-R(如SEQ ID No.37所示)为引物进行qRT-PCR。
结果如图10所示，其中，数据分析使用t检验，NS表示无差异，p<0.1，*表示有差异，p<0.01，**表示差异显著，p<0.001，***表示差异极显著。从图11可以看出，与阴性对照组相比，MbSOD49、MbSOD58、MbSOD67基因分别被沉默后，相应的转录水平均显著降低，说明MbSOD49、MbSOD58、MbSOD67被成功沉默。
5)饲喂MbSOD49 dsRNA、MbSOD58 dsRNA、MbSOD67 dsRNA之后的ROS检测
在利用分别饲喂MbSOD49、MbSOD58、MbSOD67 dsRNA混合饲料和不添加dsRNA的饲料六天后，分别提取空白对照组(“Ctrl”)阴性对照组和处理组的幼虫血淋巴，放在含有无血清培养基的12孔板中静止15分钟，使用ROS检测试剂盒(Reactive Oxygen SpeciesAssay Kit，S0033S)进行检测。以不添加dsRNA的饲料进行相同的处理作为空白对照(“Ctrl”)，EGFP dsRNA混合饲料进行相同的处理作为阴性对照。
利用Image J软件对ROS图片进行荧光强度分析后利用GraphPad Prism 6对荧光强度值数据进行统计，数据分析使用t检验，NS表示无差异，p<0.1，*表示有差异，p<0.01，**表示差异显著，结果见图11。
由图11可知，与阴性对照相比，将MbSOD49、MbSOD58或MbSOD67沉默，斜纹夜蛾幼虫血淋巴细胞中ROS的含量均不再显著下降。
实施例6
1.表达载体pcDNA3.1-MbSOD49-V5-His、pcDNA3.1-MbSOD58-V5-His和pcDNA3.1-MbSOD67-V5-His的构建
将实施例1中第1小节获得的pIZT/V5-His-MbSOD49以引物MbSOD49-V5/His-F(如SEQ ID No.38所示)和MbSOD49-V5/His-R(如SEQ ID No.39所示)扩增，得到MbSOD49-V5/His PCR产物。将MbSOD49-V5/His PCR产物回收后，连接到克隆载体pBM16A-T上，转化大肠杆菌DH5α，挑取单菌落，经质粒提取、Kpn I和Xho I双酶切及PCR扩增并测序鉴定正确后，得到含有靶标片段的pBM16A-MbSOD49-V5/His重组质粒及DH5α/pBM16A-MbSOD49-V5/His重组菌株。
将实施例1中第1小节获得的pIZT/V5-His-MbSOD58以引物MbSOD58-V5/His-F(如SEQ ID No.40所示)和MbSOD58-V5/His-R(如SEQ ID No.41所示)扩增，得到MbSOD58-V5/His PCR产物。将MbSOD58-V5/His PCR产物回收后，连接到克隆载体pBM16A-T上，转化大肠杆菌DH5α，挑取单菌落，经质粒提取、Kpn I和Xho I双酶切及PCR扩增并测序鉴定正确后，得到含有靶标片段的pBM16A-MbSOD58-V5/His重组质粒及DH5α/pBM16A-MbSOD58-V5/His重组菌株。
将实施例1中第1小节获得的pIZT/V5-His-MbSOD67以引物MbSOD67-V5/His-F(如SEQ ID No.42所示)和MbSOD67-V5/His-R(如SEQ ID No.43所示)扩增，得到MbSOD67-V5/His PCR产物。将MbSOD67-V5/His PCR产物回收后，连接到克隆载体pBM16A-T上，转化大肠杆菌DH5α，挑取单菌落，经质粒提取、Kpn I和Xho I双酶切及PCR扩增并测序鉴定正确后，得到含有靶标片段的pBM16A-MbSOD67-V5/His重组质粒及DH5α/pBM16A-MbSOD67-V5/His重组菌株。
从DH5α/pBM16A-MbSOD49-V5/His重组菌株中提取pBM16A-MbSOD49-V5/His重组质粒，将pBM16A-MbSOD49-V5/His用Kpn I和Xho I双酶切后使用胶回收试剂盒(货号D2500-02-200)回收MbSOD49-V5/His基因片段；将pcDNA3.1质粒同样用Kpn I和Xho I双酶切后用胶回收试剂盒(货号D2500-02-200)回收pcDNA3.1载体线性片段。将回收的MbSOD49-V5/His基因片段与回收的pcDNA3.1载体线性片段利用T4连接酶连接12h，转化大肠杆菌DH5α中，挑取单菌落，经提取质粒、Kpn I和EcoR I双酶切及PCR扩增并测序鉴定正确后，得到阳性pcDNA3.1-MbSOD49-V5/His重组质粒及DH5α/pcDNA3.1-MbSOD49-V5/His重组菌株。
从DH5α/pBM16A-MbSOD58-V5/His重组菌株中提取pBM16A-MbSOD58-V5/His重组质粒，将pBM16A-MbSOD58-V5/His用Kpn I和Xho I双酶切后使用胶回收试剂盒(货号D2500-02-200)回收MbSOD58-V5/His基因片段；将pcDNA3.1质粒同样用Kpn I和Xho I双酶切后用胶回收试剂盒(货号D2500-02-200)回收pcDNA3.1载体线性片段。将回收的MbSOD58-V5/His基因片段与回收的pcDNA3.1载体线性片段利用T4连接酶连接12h，转化大肠杆菌DH5α中，挑取单菌落，经提取质粒、Kpn I和EcoR I双酶切及PCR扩增并测序鉴定正确后，得到阳性pcDNA3.1-MbSOD58-V5/His重组质粒及DH5α/pcDNA3.1-MbSOD58-V5/His重组菌株。
从DH5α/pBM16A-MbSOD67-V5/His重组菌株中提取pBM16A-MbSOD67-V5/His重组质粒，将pBM16A-MbSOD67-V5/His用Kpn I和Xho I双酶切后使用胶回收试剂盒(货号D2500-02-200)回收MbSOD67-V5/His基因片段；将pcDNA3.1质粒同样用Kpn I和Xho I双酶切后用胶回收试剂盒(货号D2500-02-200)回收pcDNA3.1载体线性片段。将回收的MbSOD67-V5/His基因片段与回收的pcDNA3.1载体线性片段利用T4连接酶连接12h，转化大肠杆菌DH5α中，挑取单菌落，经提取质粒、Kpn I和EcoR I双酶切及PCR扩增并测序鉴定正确后，得到阳性pcDNA3.1-MbSOD67-V5/His重组质粒及DH5α/pcDNA3.1-MbSOD67-V5/His重组菌株。
2.pcDNA3.1-MbSOD49-V5/His转染人正常肺上皮细胞(BEAS 2B)总蛋白的提取和培养液(CM)的获得
使用直径为100mm培养皿培养BEAS 2B细胞，当BEAS 2B细胞生长密度达到80％-90％时，移除旧培养基，加入3.5ml胰酶消化，加入3.5mL含有10％血清的培养基终止消化，用枪头轻轻吹打悬浮细胞，得到细胞悬浮液，随后取90μL细胞悬液加10μL台盼蓝，轻轻混匀，静置3min，用血细胞计数板计数；计数后，分别取2×105个细胞加入到4个直径为60mm的培养皿中，27℃贴壁培养2h以上直至细胞贴壁、状态良好。待细胞贴壁完全后用双无培养基饥饿处理细胞30min。
配制转染试剂复合物：吸取176μL的灭菌蒸馏水和24μL的2M氯化钙置于1500μL EP管中，然后向其中加入4μg的pcDNA3.1-MbSOD49-V5/His重组质粒，得到转染质粒A液；取200μL的Hepes置于另一个1500μL EP管中，得到B液，一边轻轻涡旋B液，一边逐滴加入A液，得到转染复合物。震荡2min，至溶液呈现稍微雾面，然后静置30min。将400μL转染试剂复合物逐滴加入已载有培养基的直径为60mm皿中，以此时的时间点记作零，然后37℃继续培养9小时，弃去培养液，换入新的含有10％血清的培养液继续培养72小时得到BEAS 2B/pcDNA3.1-MbSOD49-V5/His重组细胞。然后将细胞和培养液分离，得到分离后的培养液MbSOD49-V5/His，以实施例1第2小节相同的操作提取含有MbSOD49-V5/His的细胞总蛋白。
3.pcDNA3.1-MbSOD58-V5/His转染人正常肺上皮细胞(BEAS 2B)总蛋白的提取和培养液(CM)的获得
以本实施例第2小节相同的操作将pcDNA3.1-MbSOD58-V5/His转染至BEAS 2B细胞中，得到BEAS2B/pcDNA3.1-MbSOD58-V5/His重组细胞。然后将细胞和培养液分离，得到分离后的培养液MbSOD58-V5/His，以实施例1第2小节相同的操作提取含有MbSOD58-V5/His的细胞总蛋白。
4.pcDNA3.1-MbSOD67-V5/His转染人正常肺上皮细胞(BEAS 2B)总蛋白的提取和培养液(CM)的获得
以本实施例第2小节相同的操作将pcDNA3.1-MbSOD67-V5/His转染至BEAS 2B细胞中，得到BEAS2B/pcDNA3.1-MbSOD67-V5/His重组细胞。然后将细胞和培养液分离，得到分离后的培养液MbSOD67-V5/His，以实施例1第2小节相同的操作提取含有MbSOD67-V5/His的细胞总蛋白。
5.人正常肺上皮细胞(BEAS 2B)总蛋白的提取
以本实施例第2小节相同的操作提取BEAS 2B细胞总蛋白，作为空白对照组，以“Ctrl”表示。
6.Western Blot
将上述第2小节至第4小节得到的MbSOD49-V5/His细胞总蛋白、培养液MbSOD49-V5/His、MbSOD58-V5/His细胞总蛋白、培养液MbSOD58-V5/His、MbSOD67-V5/His细胞总蛋白及培养液MbSOD67-V5/His作为样品，以多克隆抗体Anti-SOD3(A6984，购买于ABclonal)为一抗进行Western blot检测，其他操作同实施1第7小节，将PVDF膜在Flour Chem EFE0511中曝光成像，结果如图12所示。接着用微管蛋白抗体Anti-GAPDH(YM3215，购买于Immunoway)用于检测内参，操作过程同实施1第7小节，将PVDF膜在FlourChem EFE0511中曝光成像，结果见图12。
由图12可知，MbSOD49-V5/His、MbSOD58-V5/His和MbSOD67-V5/His成功在人正常肺上皮(BEAS2B)细胞中表达且分泌到培养基中。
7.MbSOD49-V5/His、MbSOD58-V5/His和MbSOD67-V5/His降解CBX刺激的宣威肺癌细胞(XWLC)中产生的胞内ROS检测
该实验主要是检测宣威肺癌细胞内的ROS含量变化。
1)使用直径为100mm培养皿培养宣威肺癌细胞(XWLC)细胞，当宣威肺癌细胞(XWLC)生长密度达到80％-90％时，移除旧培养基，加入3.5ml胰酶消化，加入3.5mL含有10％血清的培养基终止消化，用枪头轻轻吹打悬浮细胞，得到细胞悬浮液，随后取90μL细胞悬液加10μL台盼蓝，轻轻混匀，静置3min，用血细胞计数板计数；计数后向1个12孔板的每个孔中分别加入0.5×105个细胞。27℃贴壁培养2h以上直至细胞贴壁、状态良好。
2)待细胞状态良好后，向12孔板的9个孔中加入酐珀酸(CBX)，刺激48小时，得到CBX刺激的CBX细胞，剩余的三个孔不作任何处理。
3)以本实施例第2至4小节相同的操作获得BEAS 2B/pcDNA3.1-MbSOD49-V5/His重组瞬时表达细胞、BEAS 2B/pcDNA3.1-MbSOD58-V5/His重组瞬时表达细胞和BEAS 2B/pcDNA3.1-MbSOD67-V5/His重组瞬时表达细胞，培养72小时，分别收取含有培养液MbSOD49-V5/His、培养液MbSOD58-V5/His、培养液MbSOD67-V5/His。
4)用培养液MbSOD49-V5/His、培养液MbSOD58-V5/His、培养液MbSOD67-V5/His分别孵育CBX刺激的XWLC细胞48小时，作为MbSOD49-V5/His处理组、MbSOD58-V5/His处理组和MbSOD67-V5/His处理组。与此同时，向剩余的未经任何处理的3个孔中的2个孔中加入CBX刺激48小时，作为阴性对照组，其余1个孔不做任何处理，作为空白对照组，用“Ctrl”表示。
使用活性氧检测试剂盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit，S0033S)检测处理组、阴性对照组和空白对照组的ROS。结果见图13。
由图13可知，阴性对照组在经CBX刺激48小时后活性氧(ROS)升高；而MbSOD49-V5/His处理组、MbSOD49-V5/His处理组和MbSOD49-V5/His处理组的活性氧(ROS)含量降低。
利用Image J软件对图13进行荧光强度分析后利用GraphPad Prism 6对荧光强度值数据进行统计，数据分析使用t检验，***表示差异很显著，p<0.0001，****表示差异极显著。结果见图13。
综合图12和图13可知，双斑侧沟茧蜂的分泌型蛋白MbSOD49、MbSOD58和MbSOD67降解哺乳动物宣威肺癌细胞内的ROS。
序列表
<110> 云南大学
<120> 一种多肽、含有其的蛋白及应用
<130> LHA2260219
<160> 43
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 172
<212> PRT
<213> 双斑侧沟茧蜂(Microplitis bicoloratus)
<400> 1
Met Lys Ser Val Ile Leu Leu Leu Ala Leu Val Ala Val Ala Ala Ser
1 5 10 15
Lys Asp Ile Val Ala Val Val Lys Leu Met Pro His Asp Ser Thr Lys
20 25 30
Phe Val Thr Gly Asn Ile Lys Phe Val Gln Ser Asn Pro Thr Gly Pro
35 40 45
Val Thr Val Thr Gly Thr Ile Asn Gly Leu Thr Gln Gly Lys His Gly
50 55 60
Phe His Ile His Glu Lys Gly Asp Leu Thr Asp Asn Cys Thr Ser Thr
65 70 75 80
Gly Gly His Tyr Asn Pro Ala Asn Gln Glu His Gly Ala Pro Thr Asp
85 90 95
Thr Val Arg His Ile Gly Asp Leu Gly Asn Ile Glu Ala Thr Ala Gln
100 105 110
Gly Val Ala Asn Val Asn Ile Val Asp Lys Met Ile Ser Leu Ser Gly
115 120 125
Pro Tyr Ser Ile Ile Gly Arg Ala Val Val Val His Ser Gly Val Asp
130 135 140
Asp Phe Gly Lys Gly Gly His Glu Leu Ser Lys Thr Thr Gly Asn Ala
145 150 155 160
Gly Thr Arg Trp Ser Cys Gly Val Ile Gly Ile Met
165 170
<210> 2
<211> 519
<212> DNA
<213> 双斑侧沟茧蜂(Microplitis bicoloratus)
<400> 2
atgaaatcag tcatattgct gttggccctt gtcgccgtgg cagctagtaa agatattgtt 60
gcagttgtga aactcatgcc acacgacagt accaaatttg tcactggaaa tattaaattt 120
gttcaaagta atccaactgg gcctgtaaca gttactggaa caattaatgg acttactcag 180
ggtaaacatg gattccacat tcatgagaaa ggagatctta ccgacaactg tacttccact 240
ggtggacact ataatcccgc aaatcaagaa catggagcac caacagacac tgtaagacat 300
attggagatc ttggaaatat tgaagcaaca gctcaaggtg ttgccaacgt aaatattgtt 360
gacaaaatga tctctctatc tggaccatat agcattattg gacgtgctgt tgttgtccat 420
tcaggtgttg atgattttgg taaaggagga cacgagttat caaaaacaac tggaaatgcc 480
ggaactcgtt ggagctgtgg tgttattgga attatgtaa 519
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
ggtaccatga aatcagtcat attgc 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
gaattcataa ttccaataac accac 25
<210> 5
<211> 205
<212> PRT
<213> 双斑侧沟茧蜂(Microplitis bicoloratus)
<400> 5
Met Lys Ser Ile Val Leu Leu Leu Ala Phe Ala Ala Val Ala Val Gly
1 5 10 15
Glu Asp Ile Ile Ala Thr Val Glu Leu Leu Pro His Asp Asn Thr Asn
20 25 30
Pro Val Thr Gly Asn Ile Arg Leu Phe Gln Ser Asp Ser Ser Gly Pro
35 40 45
Val Thr Val Thr Gly Thr Ile Thr Gly Leu Thr Pro Gly Lys His Gly
50 55 60
Phe His Ile His Glu Lys Gly Asp Leu Ser Asn Lys Cys Leu Ser Thr
65 70 75 80
Gly Gly His Phe Asn Pro Thr Asn Gln Val His Gly Ala Pro Thr Asp
85 90 95
Thr Val Arg His Val Gly Asp Leu Gly Asn Ile Glu Ala Asn Ala Asp
100 105 110
Gly Val Ala Asn Ile Asn Ile Val Asp Asn Val Ile Ser Leu Val Gly
115 120 125
Thr Asn Asn Ile Ile Gly Arg Gly Val Val Val His Ser Gly Val Asp
130 135 140
Asp Leu Gly Lys Gly Gly His Glu Leu Ser Pro Ile Thr Gly Asn Ala
145 150 155 160
Gly Ser Arg Val Ser Cys Gly Ile Ile Glu Leu Glu Ser Pro Glu Gly
165 170 175
Ser Phe Pro Ser Ser Gly Ser Ser Ile Ser Ile Asp His Arg Thr Val
180 185 190
Leu Leu Pro Leu Ile Leu Phe Val Phe Lys Tyr Tyr Asn
195 200 205
<210> 6
<211> 618
<212> DNA
<213> 双斑侧沟茧蜂(Microplitis bicoloratus)
<400> 6
atgaaatcaa tcgttttatt gctggcattt gccgctgtcg cagttggtga agatattatt 60
gcaactgtgg agcttttacc acatgacaat accaaccctg tcactggaaa cattagatta 120
tttcaaagtg attcttctgg acccgtaact gtaactggaa caattactgg actcactccg 180
ggaaaacacg ggtttcatat tcatgagaaa ggcgatcttt ctaataagtg ccttagcact 240
ggtggacact ttaatcctac aaatcaagta catggagcac caacagatac tgtgagacat 300
gttggggatc ttggaaatat tgaagctaac gctgatggtg ttgctaacat aaatattgtt 360
gataatgtga tttcgttagt tggaacaaac aatatcattg gacgtggtgt tgttgttcat 420
tcaggtgttg atgatctcgg caaaggagga catgagctat cacccattac tggaaatgct 480
gggtcacgtg taagctgtgg aattattgaa cttgaatctc ctgaaggaag ttttccatct 540
tcgggatcgt caatttccat tgaccatcgg accgtactac tgccacttat tttatttgtc 600
ttcaaatatt acaactag 618
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
ggtaccatga aatcaatcgt ttta 24
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
ccgcgggttg taatatttga 20
<210> 9
<211> 173
<212> PRT
<213> 双斑侧沟茧蜂(Microplitis bicoloratus)
<400> 9
Met Lys Ser Ile Val Ile Leu Val Ala Phe Ala Thr Val Val Ala Gly
1 5 10 15
Lys Asp Ile Val Ala Val Ser Arg Leu Tyr Pro Asn Asn Ala Thr Asn
20 25 30
Ser Val Ser Gly Ile Val Lys Leu Val Gln Arg Gly Asn Gly Pro Val
35 40 45
Val Val Thr Gly Thr Ile Thr Gly Leu Lys Pro Gly Lys His Gly Phe
50 55 60
His Val His Glu Phe Gly Asn Ile Thr Asn Gly Cys Ser Ser Ala Gly
65 70 75 80
Glu His Tyr Asn Pro Thr Asn Val Thr His Gly Ala Pro Thr Asp Tyr
85 90 95
Ile Arg His Val Gly Asp Leu Gly Asn Ile Glu Thr Asp Lys Asn Gly
100 105 110
Val Thr Lys Ile Tyr Ile Val Asp Asn Ile Ile Ser Leu Thr Gly Pro
115 120 125
Asn Ser Ile Ile Gly Arg Ser Leu Val Val His Leu Gly Glu Asp Asp
130 135 140
Tyr Gly Arg Gly Gly Thr His Glu Ser Cys Thr Gly Gly Thr Ser Gly
145 150 155 160
Gln Arg Ala Ser Cys Gly Val Ile Gly Ile Gly Ser Ser
165 170
<210> 10
<211> 522
<212> DNA
<213> 双斑侧沟茧蜂(Microplitis bicoloratus)
<400> 10
atgaaatcaa tcgttatatt agtggccttt gccactgtcg tagctggtaa agatattgtt 60
gcagtttcga gactatatcc aaataacgcc actaactctg tcagtggaat tgttaaactt 120
gttcaaaggg gtaatgggcc cgtagttgtg actggaacaa tcactggact gaaaccggga 180
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ggtgatcttg gaaatattga aactgacaaa aatggtgtta ctaaaatata tattgttgat 360
aatataattt ctctaactgg accaaatagt atcattggac gttctttagt tgttcatttg 420
ggtgaagatg attatggcag aggaggaact catgaatcat gcacaggcgg aacttctgga 480
caacgcgcga gctgtggagt cattggaatc ggatcctctt aa 522
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
ggtaccatga aatcaatcgt tata 24
<210> 12
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 12
gaattcgagg atccgattc 19
<210> 13
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 13
Tyr Ser Ile Ile Gly Arg Ala Val Val Val His Ser Gly
1 5 10
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<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 14
agcattattg gacgtgctgt tgttgtccat tcaggtgtt 39
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 15
ggtaccatga aatcagtcat attgc 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 16
caaaatcatc atatggtcca gatagagag 29
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 17
tggaccatat gatgattttg gtaaaggagg 30
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 18
gaattcataa ttccaataac accac 25
<210> 19
<211> 480
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 19
atgaaatcag tcatattgct gttggccctt gtcgccgtgg cagctagtaa agatattgtt 60
gcagttgtga aactcatgcc acacgacagt accaaatttg tcactggaaa tattaaattt 120
gttcaaagta atccaactgg gcctgtaaca gttactggaa caattaatgg acttactcag 180
ggtaaacatg gattccacat tcatgagaaa ggagatctta ccgacaactg tacttccact 240
ggtggacact ataatcccgc aaatcaagaa catggagcac caacagacac tgtaagacat 300
attggagatc ttggaaatat tgaagcaaca gctcaaggtg ttgccaacgt aaatattgtt 360
gacaaaatga tctctctatc tggaccatat gatgattttg gtaaaggagg acacgagtta 420
tcaaaaacaa ctggaaatgc cggaactcgt tggagctgtg gtgttattgg aattatgtaa 480
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 20
Ile Ser Leu Val Gly Thr Asn Asn Ile Ile Gly Arg Gly Val Val Val
1 5 10 15
His
<210> 21
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 21
tcgttagttg gaacaaacaa tatcattgga cgtggtgttg ttgttcattc a 51
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 22
ggtaccatga aatcaatcgt ttta 24
<210> 23
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 23
catcaacacc aatcacatta tcaacaatat ttatgttag 39
<210> 24
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 24
taatgtgatt ggtgttgatg atctcggc 28
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 25
ccgcgggttg taatatttga 20
<210> 26
<211> 567
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 26
atgaaatcaa tcgttttatt gctggcattt gccgctgtcg cagttggtga agatattatt 60
gcaactgtgg agcttttacc acatgacaat accaaccctg tcactggaaa cattagatta 120
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ggaaaacacg ggtttcatat tcatgagaaa ggcgatcttt ctaataagtg ccttagcact 240
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gttggggatc ttggaaatat tgaagctaac gctgatggtg ttgctaacat aaatattgtt 360
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ggaaatgctg ggtcacgtgt aagctgtgga attattgaac ttgaatctcc tgaaggaagt 480
tttccatctt cgggatcgtc aatttccatt gaccatcgga ccgtactact gccacttatt 540
ttatttgtct tcaaatatta caactag 567
<210> 27
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 27
Met Lys Ser Ile Val Ile Leu Val
1 5
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 28
atgaaatcaa tcgttatatt agtg 24
<210> 29
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 29
gggtacccat ggcctttg 18
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 30
ggaattcctt aagaggatcc 20
<210> 31
<211> 501
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 31
atggcctttg ccactgtcgt agctggtaaa gatattgttg cagtttcgag actatatcca 60
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gtagttgtga ctggaacaat cactggactg aaaccgggaa aacacgggtt ccatgttcat 180
gagtttggaa atattaccaa tggttgcagt agcgctggtg aacactacaa tcctacaaac 240
gtaacacatg gagcaccaac agattatata agacatgttg gtgatcttgg aaatattgaa 300
actgacaaaa atggtgttac taaaatatat attgttgata atataatttc tctaactgga 360
ccaaatagta tcattggacg ttctttagtt gttcatttgg gtgaagatga ttatggcaga 420
ggaggaactc atgaatcatg cacaggcgga acttctggac aacgcgcgag ctgtggagtc 480
attggaatcg gatcctctta a 501
<210> 32
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 32
tctagaatga aatcagtcat attgc 25
<210> 33
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 33
gtcgacataa ttccaataac accac 25
<210> 34
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 34
ggtaccatga aatcaatcgt ttta 24
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 35
ccgcgggttg taatatttga 20
<210> 36
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 36
gctctagaat gaaatcaatc gttata 26
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 37
cccaagcttt taagaggatc cg 22
<210> 38
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 38
ggggtaccat gaaatcagtc atattgctg 29
<210> 39
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 39
ccgctcgaga tggtgatggt gatgatgacc g 31
<210> 40
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 40
ggggtaccat gaaatcaatc gttttattgc tg 32
<210> 41
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 41
ccgctcgaga tggtgatggt gatgatgacc ggt 33
<210> 42
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 42
ggggtaccat gaaatcaatc gttatattag tggc 34
<210> 43
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 43
ccgctcgaga tggtgatggt gatgatgac 29
Claims (8)
1.一种多肽，其氨基酸序列如SEQ ID No.13、SEQ ID No.20和SEQ ID No.27所示中的至少一种。
2.一种含有如权利要求1所述多肽的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.5和SEQ ID No.9所示中的至少一种。
3.一种编码如权利要求1所述的多肽的核酸。
4.根据权利要求3所述的核酸，其特征在于，所述核酸的碱基序列如SEQ ID No.14、SEQID No.21和SEQ ID No.28所示中的至少一种。
5.一种编码如权利要求2所述的蛋白的核酸。
6.根据权利要求5所述的核酸，其特征在于，所述核酸的碱基序列如SEQ ID No.2、SEQID No.6和SEQ ID No.10所示中的至少一种。
7.根据权利要求1所述的多肽、权利要求2所述的蛋白、权利要求3至6中任意一项所述的核酸中的一种在用于细胞膜粘附中的应用。
8.根据权利要求2所述的蛋白或权利要求5或6中所述的核酸在用于制备降解存在于细胞内的ROS的药物中的应用。
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| CN114703154B (zh) | 2024-01-09 |
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