CN115073573A

CN115073573A - 甘薯抗逆相关蛋白IbNAC087及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN115073573A
Application number: CN202210498190.9A
Authority: CN
Inventors: 何绍贞; 张欢; 刘庆昌; 翟红; 高少培; 赵宁; 李旭
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2022-05-09
Filing date: 2022-05-09
Publication date: 2022-09-20
Anticipated expiration: 2042-05-09
Also published as: CN115073573B

Abstract

本发明公开了甘薯抗逆相关蛋白IbNAC087及其编码基因与应用。本发明具体地公开了氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质、编码基因、相关生物材料，及其在调控植物抗逆性中的应用。本发明通过将来源于甘薯的IbNAC087基因导入受体甘薯中，得到过表达IbNAC087基因的转基因甘薯植株，离体耐盐抗旱性鉴定和各项生理生化指标测定结果表明，与未转基因的对照甘薯品种栗子香(WT)相比，过表达IbNAC087基因的转基因甘薯植株在盐胁迫和/或干旱胁迫条件下，均显著提高了甘薯的抗逆性，本发明所提供的IbNAC087蛋白及其编码基因在调控甘薯耐盐抗旱性中具有重要的理论意义和应用价值。

Description

甘薯抗逆相关蛋白IbNAC087及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及甘薯抗逆相关蛋白IbNAC087及其编码基因与应用。

背景技术

甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam)是重要的粮食作物和新型能源作物，对保障我国粮食和能源安全起着重要的作用。随着耕地面积的不断减少和能源压力的不断增大，很多作物包括甘薯都种植在干旱、盐渍、低温等逆境环境中，逆境胁迫使当前推广的一些主栽品种产量和品质受到很大影响，给甘薯生产的进一步发展带来极大的困难。耕地的干旱盐碱化以及对粮食产量的要求，使得增产、高抗成为当下研究的重中之重。因此挖掘并克隆影响产量和植物耐盐抗旱性的关键基因、培育耐盐抗旱作物新品种、提高作物产量是解决土壤盐渍和干旱并确保粮食安全的重要途径。

甘薯具有遗传基础复杂、杂交不亲和性、种质资源匮乏、病虫害严重等问题，因此常规育种难以满足品质改良的需求。通过现代生物技术方法从分子水平上定向改良甘薯性状，增强甘薯对盐碱地的适应性，是目前培育优质甘薯品种的一种可行途径，对甘薯的实际生产具有重要意义。挖掘重要的抗逆相关基因，对于培育耐盐抗旱植物新品种起着关键的作用，耐盐抗旱植物的开发和利用具有重要的生态效益、经济效益和社会效益。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何调控植物(如甘薯)的抗逆性。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质的应用，所述应用可为下述任一种：

D1)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在调控植物抗逆性中的应用；

D2)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在制备调控植物抗逆性的产品中的应用；

D3)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在培育抗逆植物中的应用；

D4)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在制备培育抗逆植物的产品中的应用；

D5)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在植物育种中的应用；

所述蛋白质名称为IbNAC087，可为下述任一种：

A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；

A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。

为了使A1)中的蛋白质便于纯化或检测，可在由序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接标签蛋白。

所述标签蛋白包括但不限于：GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、His6标签蛋白(His-tag)、MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、Flag标签蛋白、SUMO标签蛋白、HA标签蛋白、Myc标签蛋白、eGFP(增强型绿色荧光蛋白)、eCFP(增强型青色荧光蛋白)、eYFP(增强型黄绿色荧光蛋白)、mCherry(单体红色荧光蛋白)或AviTag标签蛋白。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质IbNAC087的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质IbNAC087的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质IbNAC087且具有蛋白质IbNAC087功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

本文中，调控所述蛋白质活性和/或含量的物质可为调控基因表达的物质，所述基因编码所述蛋白质IbNAC087。

上文中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。

所述调控基因表达的物质具体可为本文B1)-B3)中任一所述的生物材料。

进一步地，所述调控基因表达的物质可为提高或上调所述蛋白质IbNAC087的编码基因表达的物质(包括核酸分子或载体)。

进一步地，所述调控基因表达的物质还可为抑制或降低或下调所述蛋白质IbNAC087的编码基因表达的物质(包括核酸分子或载体)。

上述应用中，所述蛋白质IbNAC087可来源于甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam.)。

进一步地，所述蛋白质IbNAC087可为甘薯抗逆相关蛋白IbNAC087。

进一步地，所述蛋白质IbNAC087可为甘薯耐盐抗旱相关蛋白IbNAC087。

本发明还提供了与所述蛋白质IbNAC087相关的生物材料的应用，所述应用可为下述任一种：

E1)与所述蛋白质IbNAC087相关的生物材料在调控植物抗逆性中的应用；

E2)与所述蛋白质IbNAC087相关的生物材料在制备调控植物抗逆性的产品中的应用；

E3)与所述蛋白质IbNAC087相关的生物材料在培育抗逆植物中的应用；

E4)与所述蛋白质IbNAC087相关的生物材料在制备培育抗逆植物的产品中的应用；

E5)与所述蛋白质IbNAC087相关的生物材料在植物育种中的应用；

所述生物材料可为下述B1)至B7)中的任一种：

B1)编码所述蛋白质IbNAC087的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官。

上述应用中，B1)所述核酸分子可为下述任一种：

C1)编码序列是SEQ ID No.2的DNA分子；

C2)核苷酸序列是SEQ ID No.2的DNA分子。

SEQ ID No.2所示的DNA分子(IbNAC087基因)编码氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质IbNAC087。

SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列为蛋白质IbNAC087编码基因(CDS)的核苷酸序列。

B1)所述核酸分子还可包括在SEQ ID No.2所示核苷酸序列基础上经密码子偏好性改造得到的核酸分子。

B1)所述核酸分子还包括与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列一致性为95％以上且来源相同种属的核酸分子。

本发明所述的蛋白质IbNAC087的基因(IbNAC087基因)可以为任意能够编码蛋白质IbNAC087的核苷酸序列。考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

所述表达盒包括启动子、编码所述蛋白IbNAC087的核酸分子和终止子，所述启动子可为CaMV35S启动子、NOS启动子或OCS启动子，所述终止子可为NOS终止子或OCS polyA终止子。

本文所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如gRNA、mRNA、siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。

本文所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、Ti质粒或病毒载体。具体可为pMD19-T载体和/或pCAMBIA1307载体。

可用现有的植物表达载体构建含有IbNAC087基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括但不限于如双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端，如包括但不限于农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮藏蛋白基因)3'端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用IbNAC087基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，包括但不限于如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入包括但不限于可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、荧光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除草剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的IbNAC087基因或基因的片段导入植物细胞或受体植物，可获得抗逆性高于所述受体植物的抗逆植物。携带IbNAC087基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

本文所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia)，欧文氏菌(Erwinia)，根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)，产碱菌属(Alcaligenes)，假单胞菌属(Pseudomonas)，芽孢杆菌属(Bacillus)等。具体可为根癌农杆菌EHA105。

所述重组载体具体可为重组载体pCB-IbNAC087。

所述重组载体pCB-IbNAC087是将pCAMBIA1307载体的限制性内切酶Kpn I和Sal I识别位点间的片段(小片段)替换为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的DNA片段，保持pCAMBIA1307载体的其他序列不变，得到的重组表达载体。重组载体pCB-IbNAC087表达序列表中SEQ ID No.1所示的IbNAC087蛋白。

所述重组微生物可通过将所述重组载体导入出发微生物得到。

所述重组微生物具体可为重组农杆菌EHA105/pCB-IbNAC087。

所述重组农杆菌EHA105/pCB-IbNAC087是将所述重组载体pCB-IbNAC087导入根癌农杆菌EHA105得到的重组菌。

本发明还提供了一种培育抗逆植物的方法，所述方法包括提高目的植物中所述蛋白质IbNAC087的含量和/或活性，得到抗逆性高于所述目的植物的抗逆植物。

上述方法中，所述提高目的植物中所述蛋白质IbNAC087的含量和/或活性可通过提高目的植物中所述蛋白质IbNAC087的编码基因的表达量实现。

上述方法中，所述提高目的植物中所述蛋白质IbNAC087的编码基因的表达量可通过将所述蛋白质IbNAC087的编码基因导入所述目的植物实现。

上述方法中，所述抗逆植物可为抗逆性(如耐盐性和/或抗旱性)提高(上调)的植物。

上述方法中，所述蛋白质IbNAC087的编码基因可为下述任一种：

F1)编码序列是SEQ ID No.2的DNA分子；

F2)核苷酸序列是SEQ ID No.2的DNA分子。

具体地，在本发明的一个实施方案中，所述提高目的植物中所述蛋白质IbNAC087的编码基因的表达量通过将SEQ ID No.2所示的DNA分子导入所述目的植物实现。

在本发明的一个实施方案中，所述培育抗逆植物的方法包括如下步骤：

(1)构建包含SEQ ID NO.2所示DNA分子的重组载体；

(2)将步骤(1)构建的重组载体导入目的植物(如作物或甘薯)中；

(3)经筛选和鉴定获得所述抗逆植物。

所述导入指通过重组手段，包括但不限于农杆菌(Agrobacterium)介导的转化、生物射弹(biolistic)方法、电穿孔或in planta技术。

上述方法中，所述植物可为下述任一种：

G1)单子叶植物或双子叶植物；

G2)旋花科植物；

G3)甘薯属植物；

G4)甘薯组植物；

G5)甘薯。

所述甘薯具体可为甘薯品种栗子香。

所述蛋白质IbNAC087，和/或，所述生物材料也在本发明的保护范围内。

本文中，所述抗逆性可为耐盐性和/或抗旱性。

本文中，所述植物可为作物(如农作物)。

本发明还提供了所述培育抗逆植物的方法在创制抗逆植物中的应用，和/或，在植物育种或植物种质资源改良中的应用。

本文所述植物育种可为作物抗逆育种。

所述抗逆植物可为抗旱植物、耐盐植物等但不限于此。

本文所述调控植物抗逆性可为上调(提高)或下调(降低)植物抗逆性。

进一步地，所述调控植物抗逆性可为上调(提高)或下调(降低)甘薯的耐盐性和/或抗旱性。

本文中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述IbNAC087基因转化目的植物或将所述IbNAC087基因敲除得到的第一代转基因植物，也包括其子代。可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

本发明通过将来源于甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam)的调控植物抗逆性的IbNAC087基因导入到受体植物甘薯品种栗子香中，得到了过表达IbNAC087基因的转基因甘薯植株，将转基因植株进行耐盐抗旱性鉴定，综合各项生理生化指标测定结果表明，与未转基因的对照甘薯品种栗子香(WT)相比，过表达IbNAC087基因的转基因甘薯植株在盐胁迫和/或干旱胁迫条件下，均显著提高了甘薯的抗逆性，即过表达IbNAC087基因的转基因甘薯植株的耐盐抗旱性显著提高。

实验证明，本发明的IbNAC087蛋白及其编码基因IbNAC087可以调控植物的抗逆性(如耐盐性和/或抗旱性)。利用本发明提供的耐盐抗旱相关蛋白IbNAC087及其编码基因能提高植物的抗逆性：在甘薯中过表达IbNAC087基因可提高甘薯的耐盐抗旱性。因此，耐盐抗旱相关蛋白IbNAC087及其编码基因在调控植物耐盐抗旱性中具有重要的理论意义和实用价值。

附图说明

图1为甘薯拟转基因植株的PCR扩增结果。(M为DNA分子Marker，W为阴性对照，P为阳性对照，WT为甘薯品种栗子香野生型植株的幼嫩叶片的基因组DNA，其余均为甘薯拟转基因植株。

图2为IbNAC087基因在甘薯转基因阳性植株中的表达情况。

图3为甘薯植株的生长状态。

图4为甘薯植株的表型指标统计结果。

图5为甘薯植株的DAB染色和NBT染色结果图。

图6为甘薯植株生化指标的测定结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的甘薯耐盐突变体ND98记载于如下文献中：张欢.甘薯耐盐转录组的分析及抗逆相关基因IbBBX24和IbCPK28的克隆与功能鉴定.中国农业大学博士学位论文，2017。公众可从中国农业大学甘薯遗传育种研究室获得，以重复本实验。

下述实施例中的甘薯品种栗子香记载于如下文献中：王玉萍，刘庆昌，李爱贤，翟红，张松树，刘保利.甘薯耐旱突变体的离体筛选与鉴定.中国农业科学，2003，36(9)：1000-1005.公众可从中国农业大学甘薯遗传育种研究室获得，以重复本实验。

下述实施例中的克隆载体pMD19-T为宝生物工程(大连)公司产品，产品目录号为6013。载体pCAMBIA1307为Cambia公司产品。

植物总RNA提取试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司产品，目录号为DP432。PrimeScript^TM 1st Strand cDNA Synthesis Kit为宝生物工程(大连)有限公司的产品，产品目录号为6110A。

1/2霍格兰营养液成分如下表：

下述实施例采用SPSS统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用Student t-test检验，P＜0.05(*)表示具有显著性差异，P＜0.01(**)表示具有极显著性差异，下述实施例中的定量试验，如无特别说明，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、IbNAC087基因的获得

IbNAC087基因的获得的步骤如下：

1、模板的获得

用植物总RNA提取试剂盒提取甘薯耐盐突变体ND98的幼嫩叶片的总RNA，将该总RNA用PrimeScript^TM 1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录出第一链cDNA。

2、根据甘薯耐盐突变体ND98的转录组数据，获得序列表中SEQ ID No.3所示的参考序列。根据参考序列的核苷酸序列，设计并人工合成引物F1和引物F2，引物F1和引物F2的序列如下所示：

引物F1：5’-ATGGAAACAGTCCCGGAAACT-3’，

引物F2：5’-TCAGTAGTAATTCAAAAACGAATAATAAC-3’。

3、完成步骤2后，以步骤1获得的cDNA为模板，以步骤2合成的F1和F2为引物，利用同源克隆的方法扩增获得约900bp的片段，将片段和克隆载体pMD19-T连接，得到重组质粒1。将重组质粒1进行测序，获得PCR扩增片段的核苷酸序列。

结果表明，步骤3获得的PCR扩增产物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示，将该序列所示的基因命名为IbNAC087基因，其编码的蛋白命名为IbNAC087蛋白或蛋白质IbNAC087，氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示。

实施例2、IbNAC087蛋白在调控甘薯抗逆性中的应用

一、重组质粒pCB-IbNAC087的构建

1、人工合成序列表的SEQ ID NO.2所示的双链DNA分子。以该双链DNA分子为模板，以pCAMBIA1307-IbNAC087-F(Kpn I)：5’-ACGGGGGACGAGCTCGGTACCATGGAAACAGTCCCGGAAACT-3’(下划线为限制性内切酶Kpn I的识别序列)和pCAMBIA1307-IbNAC087-R(Sal I)：5’-GCCCTTGCTCACCATGTCGACGTAGTAATTCAAAAACGAATAATAAC-3’(下划线为限制性内切酶Sal I的识别序列)为引物进行PCR扩增，得到N端含有限制性内切酶Kpn I识别序列和C端含有限制性内切酶Sal I识别序列的双链DNA分子，回收约993bp的片段1。

2、用限制性内切酶Kpn I和Sal I双酶切载体pCAMBIA1307，回收约11256bp的载体骨架1。

3、将片段1与载体骨架1连接，得到重组质粒pCB-IbNAC087。

根据测序结果，对重组质粒pCB-IbNAC087进行结构描述如下：

重组质粒pCB-IbNAC087是将pCAMBIA1307载体的限制性内切酶Kpn I和Sal I识别位点间的片段(小片段)替换为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的DNA片段，保持pCAMBIA1307载体的其他序列不变，得到的重组表达载体。重组质粒pCB-IbNAC087表达序列表中SEQ ID No.1所示的IbNAC087蛋白。

二、重组农杆菌的获得和甘薯过表达转基因植株的再生

1、将重组质粒pCB-IbNAC087转化根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌甲，将重组农杆菌甲命名为EHA105/pCB-IbNAC087。

2、剥取长约0.5mm的栗子香的茎尖分生组织，置于胚性愈伤组织诱导固体培养基(含2.0mg/L 2，4-D和3.0％蔗糖的MS固体培养基)上，27±1℃培养8周，得到胚性愈伤组织，然后将胚性愈伤组织置于胚性愈伤组织诱导液体培养基(含2.0mg/L 2，4-D和3.0％蔗糖的MS液体培养基)中，水平摇床上振荡光暗交替培养3天(具体条件为：100r/min；27℃；光暗交替培养的周期为：光照时间为13h，黑暗时间11h；光照强度为500lx)，得到直径为0.7-1.3mm的胚性细胞团。

3、完成步骤2后，采用农杆菌介导的方法将EHA105/pCB-IbNAC087转化胚性细胞团，然后置于共培养基(含30mg/L AS、2.0mg/L 2，4-D的MS固体培养基)上，28℃暗培养3天。

4、完成步骤3后，将胚性细胞团用含900mg/L头孢噻肟钠(cefotaxime sodium，CS)和2.0mg/L 2，4-D的MS液体培养基洗涤2次，然后置于选择培养基(含2.0mg/L2，4-D、300mg/L CS和5mg/L、11mg/L潮霉素(hyg)的固体MS培养基)上，27±1℃暗培养10-12周(每2周需更换一次选择培养基)。

5、完成步骤4后，将胚性细胞团置于体细胞胚诱导培养基(含有1.0mg/L ABA、300mg/L CS和0.5mg/L PPT的MS固体培养基)上，27±1℃光暗交替培养(光暗交替培养的周期为：光照时间为13h，黑暗时间11h；光照强度为3000lx)2-4周，得到抗性愈伤组织。

6、完成步骤5后，将抗性愈伤组织置于MS固体培养基上，27±1℃光暗交替培养(光照时间为13h，黑暗时间11h；光照强度为3000lx)4-8周，即获得108株甘薯拟转基因植株，依次命名为1至108。

7、分别提取步骤6获得的甘薯拟转基因植株的幼嫩叶片的基因组DNA，并以该基因组DNA为模板，以pCM1307-HA-F：5’-ATGGGCGACTACAAAGACCATG-3’和pCM1307-HA-R：5’-CATGAGCGAAACCCTATAAG-3’为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；如果PCR扩增产物中含有约1000bp的条带，则相应的甘薯拟转基因植株即为甘薯转基因阳性植株。用等体积水代替甘薯拟转基因植株的幼嫩叶片的基因组DNA，进行PCR扩增，作为阴性对照。用甘薯品种栗子香野生型植株的幼嫩叶片的基因组DNA代替甘薯拟转基因植株的幼嫩叶片的基因组DNA，进行PCR扩增，作为对照。用重组质粒pCB-IbNAC087代替甘薯拟转基因植株的幼嫩叶片的基因组DNA，进行PCR扩增，作为阳性对照。

实验结果见图1(M为DNA分子Marker，W为阴性对照，P为阳性对照，WT为甘薯品种栗子香野生型植株的幼嫩叶片的基因组DNA，其余均为甘薯拟转基因植株)。结果表明，共有25株转基因阳性植株。将阳性植株重新编号为OE-N1至OE-N25。

采用无性繁殖的方法扩繁甘薯过表达转基因阳性植株，由一株转基因幼苗扩繁得到的植株作为一个株系。

8、检测IbNAC087基因的相对表达量

将所有阳性转基因植株和对照植株进行继代培养，注意所有植株的培养环境和培养条件要保持一致。一段时间后取整株或相同部位的叶片提取RNA，对其进行反转录，对各株系进行IbNAC087基因表达量的qRT-PCR测定。统一稀释各样品cDNA的浓度到100ng/μL，qRT-PCR所采用的设备为QuantStudio 6Fiex(操作软件为QuantStudio Real-Time PCRSoftware)。利用2x HQ SYBR qPCR Mix(ZF502)(ZoMANBIO，Lot#22AA02G)进行反应体系的配制。

用于检测IbNAC087基因的引物如下：

qIbNAC087-F:5’-ACGCCGTATCAAGGATCGAC-3’，

qIbNAC087-R:5’-CGGGTTGTCGTCGGAGTAAT-3’。

用于检测Actin基因的引物如下：

IbActin-F:5’-AGCAGCATGAAGATTAAGGTTGTAGCAC-3’，

IbActin-R:5’-TGGAAAATTAGAAGCACTTCCTGTGAAC-3’。

IbNAC087基因的相对表达量的测定结果见图2。结果表明，过表达IbNAC087基因转基因甘薯中IbNAC087基因的表达量显著高于野生型(受体对照)甘薯栗子香(WT)，差异具有显著性。外源基因IbNAC087基因不但已顺利整合到受体的基因组上，而且能够在转基因甘薯中正常转录表达。

五、抗逆性鉴定

1、耐盐抗旱性离体鉴定

甘薯植株为甘薯品种栗子香的野生型植株(WT)、OE-N3的植株、OE-N4的植株、OE-N7的植株、OE-N9的植株，OE-N19的植株。

为减少实验误差，每个株系重复三次，步骤如下：

(1)选择生长状况相近的野生型植株和阳性转基因甘薯植株，取相同部位分别继代于含有20％PEG 6000的MS固体培养基上进行PEG模拟干旱胁迫处理，培养条件为27±1℃，每天13h、3000lux光照30天后，观察野生型植株和转基因植株的生长状态。

(2)完成步骤(1)后，将所有植株从培养基中取出，测量并统计表型指标(如单株根长(cm)、单株根数、株高和鲜重)。

按照上述方法，将步骤(2)中的含20％PEG 6000的MS固体培养基换成含200mMNaCl的MS培养基，其它步骤均不变，作为NaCl胁迫处理。

按照上述方法，将步骤(2)中的含20％PEG 6000的MS固体培养基换成MS培养基，其它步骤均不变，作为空白对照处理。

甘薯植株的生长状态见图3。其中图3中第1-3排为甘薯植株在玻璃瓶中生长状况，第4-6排为从玻璃瓶中取出洗净后的甘薯植株。甘薯植株的表型指标统计结果见图4(图4中A为根长统计结果，图4中B为根数统计结果；图4中C为株高统计结果，图4中D为鲜重统计结果)。离体鉴定结果表明，PEG胁迫和NaCl胁迫处理4周后，过表达植株生长状态良好，表型指标均优于野生型植株，说明转基因植株的抗旱性和耐盐性均显著提高。因此，在甘薯中过表达IbNAC087基因可显著提高甘薯的耐盐抗旱性。IbNAC087基因或蛋白质IbNAC087可以调控植物的耐盐性和/或抗旱性。

2、生理生化指标的测定

为减少实验误差，每个株系重复三次。

(1)DAB染色和NBT染色

采用参考文献(Zhang H，Gao XR，Zhi YH，Li X，Zhang Q，Niu JB，Wang J，Zhai H，Zhao N，Li JG，Liu QC，He SZ.A non-tandem CCCH-type zinc-finger protein，IbC3H18，functions as a nuclear transcriptional activator and enhances abiotic stresstolerance in sweet potato.New Phytologist.2019，223:1918-1936.)的方法，对胁迫处理后植株的叶片分别进行NBT和DAB染色对叶片中O^2-的产生和H₂O₂的积累进行观察。甘薯植株为步骤1空白对照中处理4周的甘薯植株、步骤1中PEG6000胁迫处理4周的甘薯植株、步骤1中NaCl胁迫处理4周的甘薯植株。

实验结果见图5。在正常培养条件下，IbNAC087过表达植株中O^2-和H₂O₂积累的与对照相比没有显著差异，但在PEG和NaCl处理条件下，IbNAC087过表达植株中蓝色和褐色斑点积累较少。

(2)H₂O₂含量测定

植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使H₂O₂发生累积。H₂O₂可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体。因此，H₂O₂的含量越高，植物遭受逆境伤害的程度越大。

采用参考文献(Zhang H，Gao XR，Zhi YH，Li X，Zhang Q，Niu JB，Wang J，Zhai H，Zhao N，Li JG，Liu QC，He SZ.A non-tandem CCCH-type zinc-finger protein，IbC3H18，functions as a nuclear transcriptional activator and enhances abiotic stresstolerance in sweet potato.New Phytologist.2019，223:1918-1936.)的方法，检测甘薯植株的H₂O₂含量。甘薯植株为步骤1空白对照中处理4周的甘薯植株、步骤1中PEG6000胁迫处理4周的甘薯植株、步骤1中NaCl胁迫处理4周的甘薯植株。

实验结果见图6中A。结果表明，与野生型植株相比，OE-N3的植株、OE-N4的植株、OE-N7的植株、OE-N9的植株和OE-N19的植株的H₂O₂含量显著降低。说明在200mM NaCl的盐胁迫处理和20％PEG6000模拟干旱胁迫处理后，过表达IbNAC087基因的转基因植株的抗逆性显著提高了。

(3)丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量测定

植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，MDA是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度，即MDA的含量越高，植物遭受逆境伤害的程度越大。

采用参考文献(Gao S，Yuan L，Zhai H，Liu CL，He SZ，Liu QC.Transgenicsweetpotato plants expressing an LOS5 gene are tolerant to salt stress.PlantCell Tissue Organ Cult，2011，107：205-213)的方法，检测甘薯植株的MDA含量。甘薯植株为步骤1空白对照中处理4周的甘薯植株、步骤1中PEG6000胁迫处理4周的甘薯植株、步骤1中NaCl胁迫处理4周的甘薯植株。

实验需重复三次，结果取平均值。

实验结果见图6中B。结果表明，PEG6000胁迫处理下，OE-N3的植株、OE-N7的植株、OE-N9的植株的MDA含量显著低于对照植株；NaCl胁迫处理下，OE-N4的植株、OE-N7的植株、OE-N9的植株和OE-N19的植株的MDA含量显著低于对照植株。说明在200mM NaCl的盐胁迫处理和20％PEG6000模拟干旱胁迫处理后，过表达IbNAC087基因的转基因植株的抗逆性显著提高了。

(4)超氧化物歧化酶(Superoxidase，SOD)活性测定

SOD活性可以作为植物抗逆性的一项生化指标。SOD的活性越低，植物遭受逆境伤害的程度越大。

采用参考文献(He SZ，Han YF，Wang YP，Zhai H，Liu QC.In vitro selectionand identification of sweetpotato(Ipomoea batatas(L.)Lam.)plants tolerant toNaCl.Plant Cell Tissue Organ Cult，2009，96：69-74)的方法，检测甘薯植株的SOD活性。甘薯植株为步骤1空白对照中处理4周的甘薯植株、步骤1中PEG6000胁迫处理4周的甘薯植株、步骤1中NaCl胁迫处理4周的甘薯植株。

实验需重复三次，结果取平均值。

实验结果见图6中C。结果表明，PEG6000胁迫处理下，OE-N3的植株、OE-N4的植株、OE-N19的植株的SOD活性显著高于对照植株；NaCl胁迫处理下，OE-N3的植株、OE-N4的植株、OE-N7的植株和OE-N19的植株的SOD活性显著高于对照植株。说明在200mM NaCl的盐胁迫处理和20％PEG6000模拟干旱胁迫处理后，过表达IbNAC087基因的转基因植株提高了抗氧化酶类的活性，从而减轻了逆境胁迫对转基因植株造成的氧化损伤，提高了转基因植株对逆境胁迫的耐受性。

(5)过氧化氢酶(Catalase，CAT)活性测定

CAT活性可以作为植物抗逆性的一项生化指标。CAT的活性越低，植物遭受逆境伤害的程度越大。

采用参考文献(Tao LI，Duan D，Yang Q.Effects of Inoculation ofArbuscular Mycorrhizal Fungi Glomus mosseae on SOD and CAT Activity in Suaedasalsa Seedlings under Salt Stress[J].农业科学与技术(英文版)，2008)的方法，检测甘薯植株的CAT活性。甘薯植株为步骤1空白对照中处理4周的甘薯植株、步骤1中PEG6000胁迫处理4周的甘薯植株、步骤1中NaCl胁迫处理4周的甘薯植株。

实验需重复三次，结果取平均值。

实验结果见图6中D。结果表明，PEG6000胁迫处理下，OE-N3的植株、OE-N4的植株、OE-N7的植株、OE-N9的植株、OE-N19的植株的CAT活性显著高于对照植株；NaCl胁迫处理下，OE-N3的植株、OE-N4的植株、OE-N7的植株、OE-N9的植株、OE-N19的植株的CAT活性显著高于对照植株。说明在200mM NaCl的盐胁迫处理和20％PEG6000模拟干旱胁迫处理后，过表达IbNAC087基因的转基因植株提高了抗氧化酶类的活性，从而减轻了逆境胁迫对转基因植株造成的氧化损伤，提高了转基因植株对逆境胁迫的耐受性。

综上，在200mM NaCl的盐胁迫处理和20％PEG6000模拟干旱胁迫处理条件下，过表达IbNAC087基因显著降低了H₂O₂和MDA含量、提高了POD和CAT活性，显著降低了盐胁迫和干旱胁迫对转基因植株造成的逆境损伤，大大提高了转基因植株对逆境胁迫的耐受性。

上述结果表明，在甘薯中过表达IbNAC087基因可提高甘薯的耐盐抗旱性。本发明的IbNAC087蛋白及其编码基因IbNAC087可以调控植物的抗逆性(如耐盐性和/或抗旱性)，通过提高目的植物中IbNAC087蛋白质的含量和/或活性(如过表达IbNAC087基因)可以显著提高目的植物的抗逆性。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业大学

<120> 甘薯抗逆相关蛋白IbNAC087及其编码基因与应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 318

<212> PRT

<213> 甘薯（Ipomoea batatas (L.) Lam）

<400> 1

Met Glu Thr Val Pro Glu Thr Ala Ser Phe Asp Pro Leu Val Asp His

1 5 10 15

Gly Gly Ala Asp Thr Glu Gln Ala Ala Glu Ala Val Val Tyr Leu Pro

20 25 30

Pro Gly Phe Arg Phe His Pro Thr Asp Glu Glu Ile Ile Val Asp Tyr

35 40 45

Leu Lys Lys Lys Val Thr Asp Ile Ala Phe Ser Ser Val Ala Ile Gly

50 55 60

Glu Val Asp Leu Asn Lys Cys Glu Pro Trp Asp Leu Pro Arg Lys Ala

65 70 75 80

Lys Met Met Gly Lys Lys Glu Trp Phe Phe Phe Trp Gln Lys Asp Arg

85 90 95

Lys Tyr Pro Thr Gly Thr Arg Thr Asn Arg Ala Thr Glu Ser Gly Tyr

100 105 110

Trp Lys Ala Thr Gly Lys Asp Lys Glu Ile Phe Gln Ser Gly Arg Gly

115 120 125

Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ile Val Gly Met Lys Lys Thr Leu Val Phe

130 135 140

Tyr Lys Gly Arg Ala Pro Lys Gly Gln Lys Thr Asn Trp Ile Met His

145 150 155 160

Glu Tyr Arg Leu His Gly Thr Gln Phe Tyr Asn Thr Thr Arg Glu Glu

165 170 175

Trp Val Val Cys Arg Val Phe His Lys Gln Thr Thr Gly Val Val Tyr

180 185 190

Met Arg Arg Ser Pro Pro Arg Asn Asp Ala Val Ser Arg Ile Asp Ser

195 200 205

Ile Ser Val Ala Asp His Leu Leu Pro Pro Leu Thr Asp Phe Pro Asp

210 215 220

Tyr Ser Asp Asp Lys Pro Pro Ala Pro Pro Leu Leu Pro Cys Ser Leu

225 230 235 240

Thr Phe Gln Asn Pro Pro Ser Ala Val Phe Tyr Pro Pro Asn Pro Asn

245 250 255

Ser Asp Thr Ala Thr Ala Ala Leu Lys Ala Glu Ser Val Ser Gln Asp

260 265 270

Ala Ala Gly Val Val Ser Pro Asp Val Thr Pro Thr Glu Ile Ser Trp

275 280 285

Glu Leu Pro Asp Gly Gly Gly Ala Leu Gly Gly Leu Tyr Asp Asp Ser

290 295 300

Met Ala Asp Leu Asp Arg Tyr Tyr Ser Phe Leu Asn Tyr Tyr

305 310 315

<210> 2

<211> 957

<212> DNA

<213> 甘薯（Ipomoea batatas (L.) Lam）

<400> 2

atggaaacag tcccggaaac tgcgagtttt gacccgctgg tggatcacgg aggagcagac 60

acagaacagg cggcggaggc ggtggtttac cttccaccgg gtttcaggtt ccaccccaca 120

gacgaagaga tcatcgttga ttatcttaag aagaaagtaa cggacatcgc gttcagctcc 180

gtggccattg gagaggtcga tctcaacaaa tgcgagcctt gggatttacc caggaaagct 240

aagatgatgg ggaagaagga gtggttcttc ttttggcaga aggacaggaa gtatccgacc 300

gggacgagga cgaaccgggc cacggagtcc ggctactgga aggccaccgg aaaagataag 360

gagattttcc agtccggcag agggagtagt agtagtggta gtattgttgg gatgaagaaa 420

acccttgttt tctacaaagg cagagctccc aaaggacaga aaaccaattg gatcatgcat 480

gaatacagac tccatggcac ccaattttac aacacaacaa gggaagaatg ggttgtatgc 540

agagtgtttc acaagcagac cacaggagtt gtgtacatga gaagaagtcc gcctcgcaac 600

gacgccgtat caaggatcga ctccatctcc gtcgctgatc acctactccc acctctaacc 660

gatttcccag attactccga cgacaaaccg ccggcgccgc cgcttcttcc ctgctctctc 720

accttccaga atccgccctc cgccgtcttc taccctccaa accctaactc cgacaccgcc 780

acggcggcgc tgaaggcgga gagcgtttct caggacgccg ccggcgtggt cagccctgac 840

gtcacgccca cggagatatc gtgggagctg ccggacggcg gcggggctct cggcggtctg 900

tacgatgata gcatggccga tctcgatcgt tattattcgt ttttgaatta ctactga 957

<210> 3

<211> 966

<212> DNA

<213> 甘薯（Ipomoea batatas (L.) Lam）

<400> 3

atggaaactg cgagttttga cccgctggtg agtcacggag gagcagacac aggacaggcg 60

gcggaggcgg cggtggttta ccttccaccg ggtttcaggt tccatcccac agacgaagag 120

atcatcgttg attatcttaa gaagaaagcc acggacatcg cgttcagctc cgtggccatt 180

ggagaggtcg atctcaacaa atgcgagcct tgggatttac ccaggaaagc taagatgatg 240

gggaagaagg aatggttctt cttttggcag aaggacagga agtatccgac ggggacgagg 300

acgaaccggg ccacggagtc cggttactgg aaggccaccg gaaaagataa ggagattttc 360

cagtccggca gagggagtag tagtagtagt ggtagtattg ttgggatgaa gaaaaccctt 420

gttttctaca aaggcagagc tcccaaagga cagaaaacca attggatcat gcatgaatac 480

agactccatg gcacccaatt ttacaacaca acaagggaag aatgggttgt atgcagagtg 540

tttcacaagc agaccacagg agttgtgtac atgagaagaa gtccgcctcg caacgacgcc 600

gtatcaagga tcgactccat ctccgtcgct gatcacctac tccaaacccc ttcaaagctc 660

ccacctctaa ccgatttccc agattactcc gacgacaaac cgccggcgcc gcctcttctt 720

ccctgctctc tcaccctcca gaatccgccc tccgccctct tctaccctcc aaaccctaac 780

tccgacaccg ccacggcggc gctgaaggcg gagagcgttt ctcaggacgc cggcgccggg 840

gtcagccctg acgtcacgcc cacggagata tcgtgggagc tgccggacgg cggcggggct 900

ctcggcggtc tgtacgatga tagcatggcc gatctcgatc gttattattc gtttttgaat 960

tactac 966

Claims

1.蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质的应用，其特征在于，所述应用为下述任一种：

所述蛋白质为下述任一种：

A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蛋白质来源于甘薯。

3.应用，其特征在于，所述应用为下述任一种：

E1)与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料在调控植物抗逆性中的应用；

E2)与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料在制备调控植物抗逆性的产品中的应用；

E3)与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料在培育抗逆植物中的应用；

E4)与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料在制备培育抗逆植物的产品中的应用；

E5)与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料在植物育种中的应用；

所述生物材料为下述B1)至B7)中的任一种：

B1)编码权利要求1或2中所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，B1)所述核酸分子为下述任一种：

C1)编码序列是SEQ ID No.2的DNA分子；

C2)核苷酸序列是SEQ ID No.2的DNA分子。

5.一种培育抗逆植物的方法，其特征在于，所述方法包括提高目的植物中权利要求1或2中所述蛋白质的含量和/或活性，得到抗逆性高于所述目的植物的抗逆植物。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述提高目的植物中权利要求1或2中所述蛋白质的含量和/或活性通过提高目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达量实现。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述提高目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达量通过将权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因导入所述目的植物实现。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述蛋白质的编码基因为下述任一种：

F1)编码序列是SEQ ID No.2的DNA分子；

F2)核苷酸序列是SEQ ID No.2的DNA分子。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述植物为下述任一种：

G1)单子叶植物或双子叶植物；

G2)旋花科植物；

G3)甘薯属植物；

G4)甘薯组植物；

G5)甘薯。

10.权利要求1或2中所述蛋白质，和/或，权利要求3中所述的生物材料。