CN114410651A

CN114410651A - 玉米灰斑病抗性相关蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN114410651A
Application number: CN202210012417.4A
Authority: CN
Inventors: 徐明良; 钟涛; 朱芒; 郭晨煜; 房正; 张晓辉
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2022-01-06
Filing date: 2022-01-06
Publication date: 2022-04-29
Anticipated expiration: 2042-01-06
Also published as: CN114410651B

Abstract

本发明公开了玉米灰斑病抗性相关蛋白及其编码基因与应用。具体地公开了氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质ZmHRL及其编码基因ZmHRL(SEQ ID No.2)在调控植物抗病性中的应用、以及培育抗病植物尤其是抗灰斑病植物的方法。实验证明，过表达ZmHRL基因的玉米转基因株系中，转基因植株的病情指数显著降低，转基因植株的抗病性显著增强，说明ZmHRL基因具有抗灰斑病功能，正调控玉米灰斑病抗病性。本发明为调控玉米灰斑病抗病性提供了良好的基因资源，对于玉米的抗灰斑病育种具有重大的应用价值，对于保证玉米的高产稳产具有重要的意义。

Description

玉米灰斑病抗性相关蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及玉米灰斑病抗性相关蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

玉米灰斑病(gray leaf spot of maize，GLS)是由玉蜀黍尾孢菌(Cercosporazeae-maydis)和玉米尾胞菌(Cercospora zeina)引起的一种严重的真菌性叶部病害，发病严重时可导致整株玉米枯死，已成为我国玉米生产上的主要病害之一，对我国玉米的稳产高产构成严重威胁。

目前，在生产上针对玉米灰斑病多采用化学防治的方法，但是该方法既增加成本，又危害生态环境。长期的生产实践表明培育和推广抗病品种是控制玉米病害最有效、最经济的措施，因此选用抗灰斑病的品种是防治灰斑病的根本措施。但是目前生产上推广的高抗灰斑病玉米品种仍然较少，而且抗病品种的培育很大程度上依赖于对病害抗性生理的了解和对抗性遗传机理的把握。因此挖掘和鉴定抗灰斑病基因，解析抗灰斑病的遗传基础，结合生物技术进行抗病分子设计育种，可以从根本上防控玉米灰斑病的危害，加速抗灰斑病玉米品种选育，促进商业化玉米育种进程，有效解决生产中抗病品种匮乏的问题。通过遗传手段改良玉米的灰斑病抗性不但是最经济有效的解决办法，而且对于保证玉米的品质和高产稳产具有重要的意义，同时在玉米分子育种领域有着广泛的应用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何调控植物的抗病性(如提高或降低植物的灰斑病抗性)。所要解决的技术问题不限于如所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质的应用，所述应用可为下述任一种：

D1)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在调控植物抗病性中的应用；

D2)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在制备调控植物抗病性的产品中的应用；

D3)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在培育抗病植物中的应用；

D4)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在制备培育抗病植物的产品中的应用；

D5)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在植物育种中的应用；

所述蛋白质名称为ZmHRL，可为下述任一种：

A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；

A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。

为了使A1)中的蛋白质便于纯化或检测，可在由序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接标签蛋白。

所述标签蛋白包括但不限于：GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、His6标签蛋白(His-tag)、MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、Flag标签蛋白、SUMO标签蛋白、HA标签蛋白、Myc标签蛋白、eGFP(增强型绿色荧光蛋白)、eCFP(增强型青色荧光蛋白)、eYFP(增强型黄绿色荧光蛋白)、mCherry(单体红色荧光蛋白)或AviTag标签蛋白。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质ZmHRL的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质ZmHRL的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质ZmHRL且具有蛋白质ZmHRL的功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

本文中，调控所述蛋白质活性和/或含量的物质可为调控基因表达的物质，所述基因编码所述蛋白质ZmHRL。

上文中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。

所述调控基因表达的物质具体可为下述B1)-B3)中任一所述的生物材料。

上述应用中，所述蛋白质可来源于玉米(Zea mays)。

本发明还提供了与所述蛋白质ZmHRL相关的生物材料的应用，所述应用可为下述任一种：

E1)与所述蛋白质ZmHRL相关的生物材料在调控植物抗病性中的应用；

E2)与所述蛋白质ZmHRL相关的生物材料在制备调控植物抗病性的产品中的应用；

E3)与所述蛋白质ZmHRL相关的生物材料在培育抗病植物中的应用；

E4)与所述蛋白质ZmHRL相关的生物材料在制备培育抗病植物的产品中的应用；

E5)与所述蛋白质ZmHRL相关的生物材料在植物育种中的应用；

所述生物材料可为下述B1)至B7)中的任一种：

B1)编码所述蛋白质ZmHRL的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官。

上述应用中，B1)所述核酸分子可为下述任一种：

C1)编码序列是SEQ ID No.2的DNA分子；

C2)核苷酸序列是SEQ ID No.2的DNA分子。

SEQ ID No.2所示的DNA分子(即玉米抗灰斑病基因ZmHRL)编码氨基酸序列是SEQID No.1的蛋白质ZmHRL。所述蛋白质ZmHRL为促进类过敏性坏死病斑形成的蛋白(HR-likelesion-inducing protein-related，HRL)

SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列为蛋白质ZmHRL基因(ZmHRL基因)的核苷酸序列。本发明所述的蛋白质ZmHRL的基因(ZmHRL基因)可以为任意能够编码蛋白质ZmHRL的核苷酸序列。考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

B1)所述核酸分子还可包括在SEQ ID No.2所示核苷酸序列基础上经密码子偏好性改造得到的核酸分子。

所述核酸分子还包括与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列一致性为95％以上且来源相同种属的核酸分子。

本文所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如gRNA、mRNA、siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。

本文所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、Ti质粒或病毒载体。具体可为pBCXUN载体或pBUE411载体。

可用现有的植物表达载体构建含有ZmHRL基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括但不限于如双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端，如包括但不限于农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮藏蛋白基因)3'端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用ZmHRL基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，包括但不限于如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子,包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入包括但不限于可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、荧光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除草剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的ZmHRL基因或基因的片段导入植物细胞或受体植物，可获得灰斑病抗性提高的转基因细胞系及转基因植株。携带ZmHRL基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织,并将转化的植物组织培育成植株。

本文所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia),欧文氏菌(Erwinia),根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium),产碱菌属(Alcaligenes),假单胞菌属(Pseudomonas),芽胞杆菌属(Bacillus)等。具体可为农杆菌EHA105。

所述重组载体具体可为重组载体pBCXUN-ZmHRL，所述重组载体pBCXUN-ZmHRL是将pBCXUN载体的两个Xcm I识别位点间的片段(小片段)替换为核苷酸序列是序列表中SEQ IDNo.2的DNA片段，保持pBCXUN载体的其他序列不变，得到的重组表达载体。

所述重组微生物具体可为重组农杆菌EHA105/pBCXUN-ZmHRL，所述重组农杆菌EHA105/pBCXUN-ZmHRL含有SEQ ID No.2所示的DNA分子，表达氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质。所述重组农杆菌EHA105/pBCXUN-ZmHRL是将所述重组载体pBCXUN-ZmHRL导入根癌农杆菌EHA105得到的重组菌。

本发明还提供了一种培育抗病植物的方法，所述方法包括提高目的植物中所述蛋白质ZmHRL的含量和/或活性，得到抗病性高于所述目的植物的抗病植物。

上述方法中，所述提高目的植物中所述蛋白质ZmHRL的含量和/或活性通过提高目的植物中所述蛋白质ZmHRL的编码基因的表达量实现。

上述方法中，所述提高目的植物中所述蛋白质ZmHRL的编码基因的表达量通过将所述蛋白质ZmHRL的编码基因导入所述目的植物实现。

上述方法中，所述蛋白质ZmHRL的编码基因为编码序列可为SEQ ID No.2的DNA分子。

具体地，在本发明的一个实施方案中，所述提高目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达量通过将SEQ ID No.2所示的DNA分子导入所述目的植物实现。

在本发明的一个实施方案中，所述培育抗病植物的方法包括如下步骤：

(1)构建包含SEQ ID NO.2所示DNA分子的重组载体；

(2)将步骤(1)构建的重组载体转入目的植物(如作物或玉米)中；

(3)经筛选和鉴定获得抗病性高于所述目的植物的抗病植物。

上述方法中，所述植物可为G1)、G2)或G3)：

G1)单子叶植物或双子叶植物；

G2)禾本科植物；

G3)玉蜀黍属植物。

所述玉蜀黍属植物具体可为玉米。例如玉米自交系B73或玉米自交系Y32。

本文中，所述植物可为作物(如农作物)。

本发明还保护一种制备抗病植物的方法，包括如下步骤：在出发植物中导入所述核酸分子，得到灰斑病抗病性增强的转基因植物。所述核酸分子具体可通过以上任一所述重组载体导入所述出发植物。携带有所述核酸分子的重组载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到出发植物中。将所述转基因植物与现有玉米品种进行杂交(包括单次杂交和多次杂交，例如连续杂交三次)，得到的转基因后代植株同样为灰斑病抗病性增强的转基因植物。所述现有玉米品种具体可为玉米自交系B73。

本发明还保护一种植物育种方法，包括如下步骤：增加目的植物中ZmHRL蛋白的含量和/或活性，从而提高目的植物的灰斑病抗病性。

所述蛋白质ZmHRL，和/或，所述生物材料也在本发明的保护范围内。

本发明还提供了所述培育抗病植物的方法在创制抗病植物和/或植物育种中的应用。

所述植物育种可为作物抗病转基因育种，具体可为玉米抗灰斑病转基因育种。

所述抗病可为抗灰斑病，所述抗病性可为灰斑病抗性。

所述调控植物抗病性可为提高植物抗病性或降低植物抗病性。

具体地，本文所述调控植物抗病性可为调控植物的灰斑病抗病性，包括提高植物的灰斑病抗病性或降低植物的灰斑病抗病性。

以上任一所述灰斑病具体可为玉米尾孢菌引起的灰斑病。

本发明中，所述抗病植物理解为不仅包含将所述ZmHRL基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述抗病植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

本发明通过将来源于玉米(Zea mays)的抗玉米灰斑病基因ZmHRL导入到受体植物(如玉米)中，得到了转基因玉米(过表达ZmHRL基因的玉米)，实验证明，与未转基因受体对照野生型玉米(玉米自交系B73)相比：过表达ZmHRL基因的玉米转基因株系中ZmHRL基因的表达量显著提高，相应的转基因植株的发病等级显著降低，转基因植株的抗病性显著增强；而利用基因编辑技术对ZmHRL基因进行敲除的实验结果表明，相对于野生型玉米自交系B73植株，基因编辑植株的发病等级显著增加，转基因植株的抗病性显著降低。

综上，本发明鉴定到的抗玉米灰斑病的基因ZmHRL可以调控植物的抗病性，转基因过表达和CRISPR敲除实验证明了ZmHRL基因的抗灰斑病功能；转基因过表达实验证明了ZmHRL基因的抗灰斑病功能；ZmHRL基因正调控玉米灰斑病抗病性，ZmHRL基因的过表达能够提高受体植物中蛋白质ZmHRL的含量和/或活性，进而增强转基因植株对灰斑病的抗病性；ZmHRL基因过表达后田间抗性表型优异，可用于转基因育种，提高玉米品种的灰斑病抗性。本发明为调控玉米灰斑病抗病性提供了良好的基因资源，对于玉米的抗灰斑病育种具有重大的应用价值，对于保证玉米的高产稳产具有重要的意义。

附图说明

图1为玉米灰斑病抗病等级。

图2为ZmHRL基因过表达植株PCR鉴定结果。

图3为过表达转基因植株ZmHRL基因表达量分析。

图4为ZmHRL基因过表达植株灰斑病抗性鉴定。

图5为ZmHRL基因CRISPR转基因敲除类型。

图6为ZmHRL基因敲除植株灰斑病抗性鉴定。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的玉米尾孢菌(Cercospora zeina)，记载于如下文献：FirstReport of Gray Leaf Spot of Maize Caused by Cercospora zeina in China，PlantDisease/Vol.97 No.12。

下述实施例中的pBCXUN载体(pBCXUN vector)，记载于如下文献：ZmHAK5 andZmHAK1 function in K+uptake and distribution in maize under low K+conditions.Journal of Intergrative Plant Biology(2018)doi:10.1111/jipb.12756。

下述实施例中的pBUE411载体(pBUE411 vector),记载于如下文献：ZmCCT9enhances maize adaptation to higher latitudes.Huang ect.,PNAS(2018)115(2):E334-E341 DOI:10.1073/pnas.1718058115。

实施例1、ZmHRL蛋白及其编码基因的获得

本申请的发明人经过广泛而深入的研究，从玉米自交系Y32中分离鉴定出一个调控植物抗病性的基因，将其命名为ZmHRL基因(其编码的蛋白质名称为ZmHRL)。ZmHRL基因的编码序列(CDS)如SEQ ID No.2所示，其编码的蛋白质ZmHRL的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其DNA序列如SEQ ID No.7所示。

实施例2、ZmHRL基因过表达植物的获得和鉴定

一、重组过表达载体的构建

1、取抗灰斑病自交系Y32的新鲜叶片，提取总RNA，反转录得到cDNA。

2、以步骤1得到的cDNA为模板，采用ZmHRL-OE-F和ZmHRL-OE-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

ZmHRL-OE-F：5’-ATGGAAGACCGACTCGACCA-3’(SEQ ID No.3)；

ZmHRL-OE-R：5’-TCAGTTTGTCTTGGTTTTTG-3’(SEQ ID No.4)。

PCR扩增反应体系如表1所示：

表1 PCR扩增反应体系

RT-PCR程序如表2所示：

表2 RT-PCR程序

扩增完后，1％琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR产物。

3、取pBCXUN载体，采用限制性内切酶XcmI进行酶切，1％琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒回收线性化pBCXUN载体骨架。

4、将步骤2得到的PCR扩增产物和步骤3得到的线性化pBCXUN载体骨架利用T4连接酶(全式金FL101-01)连接，连接反应的原理为线性化的载体末端为T/A，HiFi扩增片段末端同样为T/A，可直接利用T4连接酶连接。连接体系如表3所示：

表3连接体系

其中外源片段与载体摩尔比最佳为3:1，10ul体系总DNA量为100ng。

16℃过夜孵育连接反应混合物，得到连接产物，即重组载体pBCXUN-ZmHRL。所述重组载体pBCXUN-ZmHRL是将pBCXUN载体的两个XcmI识别位点间的片段(小片段)替换为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的DNA片段，保持pBCXUN载体的其他序列不变，得到的重组表达载体。

二、过表达植物的获得

1、将重组载体pBCXUN-ZmHRL导入根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌EHA105/pBCXUN-ZmHRL。

2、取步骤1得到的重组农杆菌EHA105/pBCXUN-ZmHRL，采用农杆菌介导法对玉米自交系B73的幼胚进行遗传转化，得到T₀代植株。

3、将T₀代植株进行PCR鉴定。

PCR鉴定方法：取植株叶片，提取基因组DNA，采用BAR-F和BAR-R组成的引物对进行PCR扩增，如果得到约357bp的扩增产物、PCR鉴定为阳性、该植株为转基因植株，如果没有得到扩增产物、PCR鉴定为阴性、该植株为非转基因植株。PCR鉴定引物序列如下：

BAR-F：5’-GGTGGACGGCGAGGTCGCCG-3’；

BAR-R：5’-TCGGTGACGGGCAGGACCGG-3’。

4、获得纯合的ZmHRL基因过表达转基因株系

随机选取步骤3中PCR检测阳性的转基因植株进一步通过自交繁代种植，并在每一代进行抗性筛选，直至在T₂代中筛选到完全能正常生长的纯合株系。在B73遗传背景下，获得了7个独立的纯合的ZmHRL基因过表达转基因株系，分别命名为：HRL OE1、HRL OE3、HRLOE8、HRL OE10、HRL OE12、HRL OE13和HRL OE14，其PCR鉴定结果如图2所示。

三、ZmHRL基因过表达转基因植株的抗病性鉴定

供试植株为：T₂代ZmHRL基因过表达转基因植株HRL OE1、HRL OE3、HRL OE8、HRLOE10、HRL OE12、HRL OE13、HRL OE14，以及野生型玉米自交系B73。每个株系至少30株。

1、基因表达水平鉴定

提取供试植株叶片的总RNA并反转录得到cDNA，以GAPDH基因为内参基因，通过qPCR检测ZmHRL基因的相对表达水平。结果如图3所示，ZmHRL基因过表达转基因植株HRLOE1、HRL OE3、HRL OE8、HRL OE10、HRL OE12、HRL OE13、HRL OE14中，ZmHRL基因的表达量相对于野生型玉米自交系B73均显著上调。

用于检测ZmHRL基因的引物对：

ZmHRL-F：5’-CACGACCATGGGCTTTATCT-3’；

ZmHRL-R：5’-GTCCACCGTCATTTCCAAATTC-3’。

用于检测GAPDH基因的引物对：

ZmGAPDH-F：5’-ATCAACGGCTTCGGAAGGAT-3’；

ZmGAPDH-R：5’-CCGTGGACGGTGTCGTACTT-3’。

2、抗病性鉴定

本申请所用的所有转基因材料均种植于北京市海淀区中国农业大学上庄试验站，通过人工接种玉米尾孢菌(Cercospora zeina)进行抗性鉴定。

采用菌液灌心的方法在玉米喇叭口期进行接种鉴定。接种一个月后可观察到下部叶片有褪绿斑。授粉完成后一周在穗位叶有可见病斑，开始第一次调查，之后间隔一周再次调查。根据发病程度不同分为1，3，5，7，9等级(图1)，后续利用发病等级判断植株的抗病性。

发病等级的分级标准(X代表病斑面积占叶片面积的百分比)：

1级：X≤5％；

3级：5％＜X≤10％；

5级：10％＜X≤30％；

7级：30％＜X≤70％；

9级：70％＜X≤100％。

菌液的配制方法：将分离的菌株接种至PDA培养基上，室温放置培养2周。再将培养基表面的菌体洗下，制成分生孢子悬液，内加适量吐温-20，用注射器注入喇叭口中(10叶期)，每株5mL。

(1)ZmHRL基因过表达转基因植株的抗病性鉴定

灰斑病致病菌：玉米尾孢菌(Cercospora zeina)。

正常培养供试植株，喇叭口期接种致病菌，然后继续正常培养，授粉两周后进行表型调查，计算发病等级。

接种致病菌的具体方法(菌液灌心法)：用无菌水悬浮灰斑病致病菌的孢子，得到孢子浓度为2-4×10⁵cfu/mL的孢子悬液，利用注射器将孢子悬液灌注于玉米喇叭口中，每株玉米灌注5ml。于授粉后3周依据发病等级标准鉴定抗病性，抗病性鉴定结果如图4所示。结果表明，与非转基因植株(野生型玉米自交系B73)相比，ZmHRL基因过表达转基因植株的发病面积和发病等级显著降低。其中非转基因植株(野生型玉米自交系B73)的发病等级为7.0，转基因纯系HRL OE1的发病等级为3.8；HRL OE3的发病等级为3.9；HRL OE8的发病等级为3.7；HRL OE10的发病等级为3.5；HRL OE12的发病等级为3.2；HRL OE13的发病等级为4.0；HRL OE14的发病等级为3.6。

实施例3、ZmHRL基因编辑植株的获得和鉴定

一、基因编辑载体的构建

构建CRISPR/Cas9重组载体对ZmHRL基因进行基因敲除。设计基因编辑的靶点序列为：5’-TCCCTGTCTTCCAGAGACA-3’(SEQ ID No.5)；

构建重组基因编辑载体pBUE411-ZmHRLsgRNA。所述重组载体pBUE411-ZmHRLsgRNA是在pBUE411载体的BsaI识别位点间插入序列表的SEQ ID No.5所示的双链DNA分子后得到的重组基因编辑载体。重组载体pBUE411-ZmHRLsgRNA含有编辑靶点(SEQ ID No.5)基因和Cas9蛋白的编码基因，导入受体植物后，转录的向导RNA(sgRNA)的靶序列结合区的序列如SEQ ID No.6所示，所述sgRNA通过碱基互补配对可以靶向受体植物基因组PAM附近的目标序列，即靶向ZmHRL基因。重组载体pBUE411-ZmHRLsgRNA中的Cas9基因表达得到Cas9蛋白。构建的重组载体pBUE411-ZmHRLsgRNA用于对ZmHRL基因进行基因敲除。

二、基因编辑植株的获得

1、将基因编辑载体pBUE411-ZmHRLsgRNA导入根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌EHA105/pBUE411-ZmHRLsgRNA。

2、取步骤1得到的重组农杆菌EHA105/pBUE411-ZmHRLsgRNA，采用农杆菌介导法对玉米自交系B73的幼胚进行遗传转化，得到T₀代植株。

3、从T₀代植株中筛选目标序列发生变异的植株。

具体方法：取植株叶片，提取基因组DNA，采用HRLcas-F和HRLcas-R组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物并进行测序，将测序结果与野生型序列进行比较(野生型序列如序列表的SEQ ID No.2所示)，筛选得到具有差异序列的植株。

HRLcas-F：5’-AAGACCGACTCGACCAGACA-3’；

HRLcas-R：5’-GCCGACGAACGAGATAAAGC-3’。

4、取步骤3筛选的T₀代植株，自交并收获籽粒，将籽粒培育为植株，即为T₁代植株。

5、从T₁代植株中筛选基因编辑植株。

(1)将植株进行以基因编辑载体中的bar基因为靶标的PCR鉴定。PCR鉴定方法：取植株叶片，提取基因组DNA，采用BAR-F和BAR-R组成的引物对进行PCR扩增，如果没有得到扩增产物、PCR鉴定为阴性。

(2)将植株进行以基因编辑目标区域为靶标的鉴定。鉴定方法同步骤3。

如果某一植株步骤(1)PCR鉴定为阴性，且步骤(2)的鉴定结果显示与野生型序列具有差异且为纯合型(且两条染色体一致)，该植株为纯合突变基因编辑植株。

在T₁代转基因植株中鉴定到3种编辑类型，获得了三种纯合突变基因编辑株系，分别命名为HRL KO1、HRL KO2、HRL KO3。每个株系选取至少30个植株进行基因敲除的功能验证。

三种基因编辑类型如图5所示。与野生型玉米自交系B73(WT)相比，两条同源染色体中ZmHRL基因均发生突变：

HRL KO1株系的突变类型是在野生型植株的序列SEQ ID No.2的第96位缺失了核苷酸(C)和第98位缺失了核苷酸(G)；

HRL KO2株系的突变类型是在野生型植株的序列SEQ ID No.2的第96-100之间缺失了5个核苷酸(CTGTC)；

HRL KO3株系的突变类型是在野生型植株的序列SEQ ID No.2的第89-101位之间缺失了13个核苷酸(CCCCTCCCTGTCT)；

三种突变均造成移码突变，从而将ZmHRL基因敲除。

6、将步骤5中的3种基因编辑类型的转基因植株进行连续自交获得了B73遗传背景的ZmHRL基因敲除纯系材料(HRL KO1、HRL KO2和HRL KO3)。

三、基因编辑植株的抗病性鉴定

供试植株为：纯系材料(HRL KO1、HRL KO2和HRL KO3)、玉米自交系B73植株。

方法同实施例2的步骤三的2。

抗病性鉴定结果见图6。结果显示，相对于玉米自交系B73植株，基因编辑植株的发病等级显著增加，玉米自交系B73的发病等级为5.9，基因敲除材料HRL KO1的发病等级为6.7、HRL KO2的发病等级为6.7和HRL KO3的发病等级为6.9。结果表明ZmHRL基因被敲除后，基因敲除的玉米材料对灰斑病的抗性显著降低。

综上，本发明鉴定到的抗玉米灰斑病的基因ZmHRL可以调控植物的抗病性，该基因过表达后田间抗性表型优异，可用于转基因育种，提高玉米品种的灰斑病抗性。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业大学

<120> 玉米灰斑病抗性相关蛋白及其编码基因与应用

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 209

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 1

Met Glu Asp Arg Leu Asp Gln Thr Lys Gln Gln Pro Ile Pro Pro Val

1 5 10 15

Cys Gly Leu Pro Leu Pro Cys Leu Leu Val Ser Ser Val Ser Pro Pro

20 25 30

Cys Leu Pro Glu Thr Gln Ser Arg Ala Leu Phe Gly Arg Arg Arg Ser

35 40 45

Ala Thr Thr Thr Met Gly Phe Ile Ser Phe Val Gly Arg Val Leu Phe

50 55 60

Ala Ser Leu Phe Leu Leu Ser Ala Tyr Gln Glu Phe Ile Glu Phe Gly

65 70 75 80

Asn Asp Gly Gly Pro Ala Ala Lys Thr Leu Lys Pro Lys Phe Asn Leu

85 90 95

Phe Val Lys Leu Val Ser Lys Asn Thr Gly Leu Gly Val Pro His Ile

100 105 110

Asp Ile Lys Thr Val Ile Ala Ala Thr Met Phe Leu Lys Gly Phe Gly

115 120 125

Gly Leu Leu Phe Ile Val Ser Ser Ser Phe Gly Ala Phe Leu Leu Leu

130 135 140

Ile Tyr Leu Ala Phe Ile Thr Pro Ile Val Tyr Asp Phe Tyr Asn His

145 150 155 160

Glu Met Glu Ser Thr Leu Phe Val Asp Leu Phe Phe Lys Phe Ile Gln

165 170 175

Asn Leu Ala Phe Met Gly Ala Leu Leu Phe Phe Leu Gly Met Lys Asn

180 185 190

Ser Ile Pro Lys Arg Arg Ser Lys Gly Arg Thr Thr Lys Thr Lys Thr

195 200 205

Asn

<210> 2

<211> 630

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 2

atggaagacc gactcgacca gacaaaacag cagcccatcc ccccagtctg cggtctcccc 60

ctcccctgcc tcctcgtctc ctcggtctcc cctccctgtc ttccagagac acagagcagg 120

gcgctcttcg gtcggaggag aagcgcgacc acgaccatgg gctttatctc gttcgtcggc 180

cgggttctct tcgcctccct cttcctcctc tcggcctacc aagagttcat tgaatttgga 240

aatgacggtg gacctgcagc gaagaccttg aagccaaagt tcaatttgtt cgtcaagcta 300

gtgtccaaga atactggatt gggggtgccg catattgata taaaaactgt cattgcagct 360

accatgtttc ttaaaggctt tggtggtctt ctgttcatag tcagcagctc atttggagca 420

ttcctcctgc tcatttactt ggcgtttata acccctattg tgtatgactt ctacaaccat 480

gaaatggagt caacactgtt tgtcgatctt tttttcaagt tcatacagaa cttggcgttt 540

atgggtgccc tgcttttctt ccttgggatg aagaactcaa ttccaaaacg tcgctccaag 600

ggaaggacaa caaaaaccaa gacaaactga 630

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 3

atggaagacc gactcgacca 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 4

tcagtttgtc ttggtttttg 20

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 5

tccctgtctt ccagagaca 19

<210> 6

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 6

ucccugucuu ccagagaca 19

<210> 7

<211> 5753

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 7

gactgcgagc acatggaaga ccgactcgac cagacaaaac agcagcccat ccccccagtc 60

tgcggtctcc ccctcccctg cctcctcgtc tcctcggtct cccctccctg tcttccagag 120

acacagagca gggcgctctt cggtcggagg agaagcgcga ccacgaccat gggctttatc 180

tcgttcgtcg gccgggttct cttcgcctcc ctcttcctcc tctcggccta ccaagagtat 240

gtctcccccc ttcttccccg tcttgctcgc acacccctca gatcccatct cgtcttagta 300

tcctctgctc gtcgccaaat cgaggccgct cctttcccgc tgggccgcct ctccgttggt 360

tgctttcgtc tggatctggc cctggtggct cgtgttcgga cgtgctcaat cgaaatcctt 420

cctctgcggt gcggagatgc gagttgagat cggtgcgttt tttttttttt tggaatttga 480

tgcggtagat ccgacggtca gttaaggtac ccggactttt accccgcggc gagcctgcga 540

accgacgaag gagtggaatt ctagagatgg acgggattgg atcaaaccag atgctgcgcg 600

cacggtgcac agaatgattt gtactacact agatctctct gctctactat atcagtgcat 660

cgcacattcg catccctgaa ctagtttccg tgtacacctg catctttatg tactccaggt 720

atcacaatga tacgagtttt accattagtc gtaggtgtat actgcgtaca aatgaaaaag 780

tttgtgcagt catactcgat tttgaggaca accaaatgta tatcatatgt gtgccaggat 840

ttgtatttac acatatgttg acgttgtata atgtatgtgt caggattcct tttcacatac 900

atgttgacgg acatcagtgt atatatcaaa atatattgtt caaaacgtaa acataatatt 960

atataacatt tactacactc caataaaata gactcgaagg tctttaacct ttcaacatac 1020

ttaaacaaaa actgtaacga caaaattccc ataggcactt gactgttgaa cacaagcctt 1080

agaactcttc aaacttatcg aagaactcca ctacatcaaa agcttctaaa caacatatta 1140

ggtaaatgta agtacacttt ggtaagtaat tgggagaaaa aataaggctt tcaaagagag 1200

tctgattggt ctatagcggt tagcatttta gttgatcact tgatcatatt ttattagcat 1260

tcatctaatt attggatata agtatatata tcaacccact taagcataaa agaattaacc 1320

aacacttgtg acttatctca aaaccaagaa aacccaattt agttccatct tttagtttag 1380

ttatcatgtg aggttatata ctgctcttaa ccatcagtac tagtgtacga ctgatatgtt 1440

agttttacac tctgtagagg tagttcactt ttaccataaa ttgtgtctcc cttgtagtct 1500

gggattggaa agcccttaaa tattgtcgag gtgaatgact agggattcat tatgaggttt 1560

tcaccaagat ttacttaata caaaataatc tgttaaggtt tcaagtcatg gtggagcaca 1620

aatcctcctt aaagggcgca gtatactacc caaagagaac cgatatatac cccatcaatc 1680

ctacccgtct tgcccttttc aggtaagatt atcaagcact aagtttatca agttaatagc 1740

caaaatcaga gccatgtgac aattatggtt gcattgtttt ctcgagtagt tctccatgtt 1800

tcaattatta tctatgatct tgtgattatc aaaagcatac caaaaaatat atttgccatt 1860

gtttgttata aaccacaaag aactaaatta taaaaactaa tatatctatt caactttgaa 1920

agataaacct aggttgacaa ggtaggaccc atcaaggcat caattgtgta atacaataca 1980

aaagtaaagt gtattactat gctaagttta tcaagttaat agccaaaatc agagccatgt 2040

gacaattatg gttgcatcgt tttctcgagt agttctccgt gtttcaatta ttatatatga 2100

tcttgtgatt atcaaaagca taccaaaaaa tatatttgtc attgtttgtt ataaaccaca 2160

aagaactaaa ttataaaaac taatatatct attcaacttt aaaagataaa cctaggttga 2220

caaggtagga cccatcaagg catcaattgt gtaatacaat acaaaagtaa agtgtattac 2280

tatgctattc ttggttgaaa agaatatgca tgggtaaatc cacttgcctt ttccgtaaat 2340

ctgttgtggt tctgctgagc ttgtaaattc tgtatggagg cgatgagatt ctgcagtaac 2400

tgcatttggg ttgctatgaa ctgttccatt ttcggattta gtggtggagg tggtaattca 2460

gtacgtcttt gattcaaaaa tattctgtcg tactccggtc ctaccttctg gtttattaga 2520

gaggtggagt ttcagacaag aaaggggaac ttgataaagc taataaaata gataagtggg 2580

acaagctttg aacttaacta gactttaact tatttatcta atgatgcatt tgtggccatc 2640

acttcacaaa acatcacaat cattacaatg gctcaaatca aacatttgtt aactcaaaag 2700

cattacattg cacgtcctca caagaacggt tctagtcgaa acatccgatt aagataacca 2760

atcctaagag cctggtctag aagactggtg atggaacaaa gtgatccata aaggagcttc 2820

ttacaaagtg gtgatatggc agggcaggaa acatcatccg taaccttccg tggatcctgt 2880

ccagcgagct gagcctctag ctgagcaacc tggcatgagc atcctgtagc tctccatggg 2940

tctttgctag ctctgaggtg gcgccgtcga ggtcggtgtt gagggcagca actactcggg 3000

tgagagtgtt gatgcgatcc tctctagctt ctcccaataa gatggcactg tttgtaattt 3060

ttgttgcctc attgggacag cagctagcac tgttggtgca aaatccttga ttgagcaacc 3120

caataactac ttgtcacacc aaaataaagt agaatgccat tgctgaccat tgattccata 3180

gctatattga acaaagccag ggctttagaa ttagttggga tttcaagacc tgtccatggc 3240

cgattatggt cagtttctgg agccataacc agcaaatctg cagtgcccaa ctcataactt 3300

caaccgctgt tcatatcatc ctatccaata aaaacacaat ccttaacttc ggttgcatgg 3360

ttatggtctt atcattaacg cgttatgcat tctctccttt tggcttgtgc ttttggtgaa 3420

gatccatttt ttattgtaaa actgatgtat ccctttaaac atatcactct gctaactgct 3480

agtgttgttt tttggtgtcc aaccagatat ttcaaatact gaagttatgg tttgctaacc 3540

aaaaactgat acatgggagt gggagaaaat gcattaaaaa caactgagca gtactagctt 3600

gtatgccaca tttggcttgt gcttttggtg aagatccatt ttttattgta aaactgatgt 3660

atccctttaa acatatgact ctgctaactg cttatcagat atttcaaata ctgaagttat 3720

ggtttgctaa ccaaaaactg atacatggct gagttgaaga gaaattctgt tgttactatt 3780

atattgctca tttttcttat gtttgtctgc caaaaaaatg cataccatta atgaggtagt 3840

aagatttcta tgcagcttac acttaattag acccataatc tttttatcat caagacctgt 3900

gcacttttgg gtttcatttt tgactgttac aactcttggg tcttcaccaa tgatctttag 3960

tgccaaagtt atgtgcatct atgttctcca atctccaaga tgcttgtagt ttctctcttt 4020

cgattgtcgc acaattactt cgttcttttg atgcaccagt ttattgttga gaatgttgaa 4080

ataatgcttt tcggtcatat atttaggttc attgaatttg gaaatgacgg tggacctgca 4140

gcgaagacct tgaagccaaa gttcaatttg ttcgtcaagc tagtgtccaa gaatactgga 4200

ttgggggtgc cgcatattga tgtaggaatg ctgtttggtt taatccaatt ctgttttgga 4260

atctattgaa cccagtttga tatttacttt gttttttttt cagataaaaa ctgtcattgc 4320

agctaccatg tttcttaaag gctttggtgg tcttctgttc atagtcagca gctcatttgg 4380

agcattcctc ctggttagca tctaagtatt gtttttttct gccatgctta atgtcttgtg 4440

ttttaaaaaa ataaagggct tatagaggta attgcaaaaa aaggtactaa atatactctc 4500

atatgtaatt tactaattga gtactctggc gcatttctcc aagtgaacat ctggatgtca 4560

agatttcttg tagcatgtct tctctaacat caaaactatt tggtaatttg aacatcattt 4620

atgtctggca ctctggcatt ttaggcttgc tgcattatac attacttttg ctggtccttg 4680

gtatatcaag gttttagcat cttctccctt tgccatgaat aaatattttg ttttggcaca 4740

gtcatcgatt ttagacattc accattgttt tttttccaca acttgcatta cttaataatt 4800

gttacaaaat gtatattgtg taaaagcttc tttgaaacac aattcatcta taatttttat 4860

aagttgacta attgatggtc aatatataga aagtttgaac ttctcaatac aaaatatgcc 4920

ttataaattt caatggaggt aatagaaatg gaaggctcaa aaagaatgtt catgatatgc 4980

tgtggcatgt cacaatagtt gatccacttg ggagaaccca tatgtgattt ttggaggggt 5040

gtgattcgct ccattataaa cctgtattta tatagttata tgggattaag tttggattct 5100

cataaataca tctttgcatc atatttctgt gtagcacagc tgcacaggta caatggtaga 5160

tttgttattc tgatgttttg atgttgctca tctgcacagc tcatttactt ggcgtttata 5220

acccctattg tgtatgactt ctacaaccat gaaatggagt caacactgtt tgtcgatctt 5280

tttttcaagt tcatacaggt ttgttagcct gcctccatac tgccttacaa aagattaaat 5340

tggaaaatat tccctttgtt actattgaac gtgacaagct cttctcttcg taccctttta 5400

gaacttggcg tttatgggtg ccctgctttt cttccttggg atgaagaact caattccaaa 5460

acgtcgctcc aagggaagga caacaaaaac caagacaaac tgatgtcagt ggttgtagga 5520

ggggaagcaa ttgggctcat tatgtttgca tactatacag gaatagatgt cccacttttg 5580

ttcttggtgc gccaattgaa ttgtgaattg ggacttacag aacttagcat gtaggatatt 5640

taagttatct tgcgcaattt tattttctta tgttgcgatg tgttcttatg tcacatttca 5700

ttttgctaca agaactgctt tgacagtaaa aaaatattaa gtcgcatagt cta 5753

Claims

1.蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质的应用，其特征在于，所述应用为下述任一种：

所述蛋白质为下述任一种：

A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蛋白质来源于玉米。

3.与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料的应用，其特征在于，所述应用为下述任一种：

E1)与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料在调控植物抗病性中的应用；

E2)与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料在制备调控植物抗病性的产品中的应用；

E3)与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料在培育抗病植物中的应用；

E4)与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料在制备培育抗病植物的产品中的应用；

E5)与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料在植物育种中的应用；

所述生物材料为下述B1)至B7)中的任一种：

B1)编码权利要求1或2中所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，B1)所述核酸分子为下述任一种：

C1)编码序列是SEQ ID No.2的DNA分子；

C2)核苷酸序列是SEQ ID No.2的DNA分子。

5.一种培育抗病植物的方法，其特征在于，所述方法包括提高目的植物中权利要求1或2中所述蛋白质的含量和/或活性，得到抗病性高于所述目的植物的抗病植物。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述提高目的植物中权利要求1或2中所述蛋白质的含量和/或活性通过提高目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达量实现。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述提高目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达量通过将权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因导入所述目的植物实现。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述蛋白质的编码基因为编码序列是SEQID No.2的DNA分子。

9.根据权利要求5-8中任一所述的方法，其特征在于，所述植物为G1)、G2)或G3)：

G1)单子叶植物或双子叶植物；

G2)禾本科植物；

G3)玉蜀黍属植物。

10.权利要求1中所述的蛋白质，和/或，权利要求3中所述的生物材料。