CN114854712A

CN114854712A - 玉米ZmWAK02基因在提高玉米灰斑病抗性中的应用

Info

Publication number: CN114854712A
Application number: CN202210642762.6A
Authority: CN
Inventors: 赖志兵; 戴智康; 胡龙; 李秉辰
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2022-06-08
Filing date: 2022-06-08
Publication date: 2022-08-05
Anticipated expiration: 2042-06-08
Also published as: CN114854712B

Abstract

本发明提供了玉米ZmWAK02基因在提高玉米灰斑病抗性中的应用，属于分子生物学技术领域。本发明提供了与灰斑病抗病性相关的蛋白质及其编码基因。本发明的蛋白质是一种细胞壁相关激酶(Wall‑associatedkinase)，其可通过基因ZmWAK02编码得到。本发明还提供了植物抗灰斑病的方法，包括：提高植物中ZmWAK02的活性和/或含量，从而提高目的植物对灰斑病的抗病性。转基因材料表型分析显示：导入ZmWAK02基因能够提高感病玉米自交系超过30％的灰斑病抗病性。ZmWAK02的遗传转化研究可为玉米抗灰斑病育种提供基因资源和理论支撑。

Description

玉米ZmWAK02基因在提高玉米灰斑病抗性中的应用

技术领域

本发明属于分子生物学育种技术领域，具体涉及玉米ZmWAK02基因在提高玉米灰斑病抗性中的应用。

背景技术

玉米(Zea mays L.)是世界重要粮食作物之一，全球总产量超过10亿吨，其不仅可以作为口粮，也是动物饲料和生物能源的主要原料，并在工业生产上具有非常广泛的用途。

灰斑病是玉米最常见的病害之一，大面积爆发可造成减产超过50％；近年来，灰斑病在玉米产区持续流行，已经成为严重威胁玉米产量和品质的主要病害，并有向更大范围扩散的趋势。灰斑病的防治主要依赖于抗病品种的选育，筛选可用的抗病种质资源并利用分子标记辅助选择育种(Molecular marker-assisted selection,MAS)是实现快速培育抗灰斑病玉米新品种的有效途径。前人研究通过田间表型考察筛选得到了一部分抗灰斑病的玉米种质资源，并进一步运用多种遗传分析手段鉴定到了大量与玉米抗灰斑病相关的数量性状位点(Quantitative trait loci,QTL)，然而在实际育种过程中，其中很多抗病QTL由于效应小和区间过大等原因难以被利用。目前已有的研究成果还远远无法满足当前针对玉米抗灰斑病分子育种的需求。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供玉米ZmWAK02基因在提高玉米灰斑病抗性中的应用，ZmWAK02基因为玉米主效抗灰斑病基因，ZmWAK02基因能够有效提高玉米灰斑病抗性。

本发明提供了与灰斑病抗病性相关的蛋白质，包括a1)～a3)所述蛋白质中的一种或几种：

a1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质；

a2)将a1)所述的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物灰斑病抗病性相关的蛋白质；

a3)来源于玉米且与a1)所述的蛋白质具有95％以上同一性且与植物灰斑病抗病性相关的蛋白质。

本发明还提供了编码上述方案所述蛋白质的核酸分子。

优选的，所述核酸分子包括b1)～b3)所述核酸分子中的一种或几种：

bl)ZmWAK02基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

b2)来源于玉米且与bl)具有95％以上同一性的核酸分子；

b3)与bl)或b2)限定的核苷酸序列杂交的核酸分子。

本发明还提供了含有上述方案所述核酸分子的DNA分子、表达盒、重组载体或重组微生物。

本发明还提供了上述方案所述蛋白质或者所述的核酸分子或者所述的DNA分子、表达盒、重组载体或重组微生物的在调控植物的灰斑病抗病性中的应用；优选的，所述植物包括玉米。

优选的，所述调控植物的灰斑病抗病性包括提高植物的灰斑病抗病性。

本发明还提供了一种用于检测玉米灰斑病抗病性的引物组，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的下游引物。

本发明还提供了一种植物转基因育种的方法，包括如下步骤：在出发植物中导入上述方案所述的核酸分子或者所述的DNA分子、表达盒、重组载体或重组微生物，得到灰斑病抗病性增强的转基因植物。

优选的，所述出发植物优选的包括玉米。

本发明还提供了一种植物育种方法，包括如下步骤：增加目的植物中上述方案所述蛋白质的含量和/或活性；所述目的植物优选的包括玉米。

本发明提供了与灰斑病抗病性相关的蛋白质。本发明的蛋白质是一种细胞壁相关激酶(Wall-associated kinase)，其可通过基因ZmWAK02编码得到。基因ZmWAK02是利用遗传学的方法在玉米第1号染色体上分离的主效抗灰斑病基因。转基因材料表型分析显示：导入ZmWAK02基因能够提高感病玉米自交系超过30％的灰斑病抗病性。ZmWAK02的遗传转化研究可为玉米抗灰斑病育种提供基因资源和理论支撑。

附图说明

图1为PMB2362表达载体的物理图谱；

图2为转基因互补试验表型；其中，A为转基因玉米的抗灰斑病表型比较(整株)；左边为转基因阳性材料，包含ZmWAK02基因并表现为抗灰斑病表型；右边为转基因阴性材料，不包含ZmWAK02基因并表现为感灰斑病表型；B为转基因玉米的抗灰斑病表型比较结果(单个叶片)；上方为转基因阳性材料，包含ZmWAK02基因并表现为抗灰斑病表型；下方为转基因阴性材料，不包含ZmWAK02基因并表现为感灰斑病表型；C为转基因植株灰斑病病情评分，对来自两个独立家系(L1和L2)的阳性和阴性植株评分，数据以平均值±标准差表示，每一列顶部的数字表示用于比较的样本量，学生t检验(双尾检验)表明，阳性和阴性植株的灰斑病抗性存在显著差异，****P<0.0001，每个灰点或灰色方块代表单个植株的病情严重程度；

图3为实施例1中扩增片段1电泳图；

图4为实施例1中扩增片段2电泳图；

图5为实施例1中阳性克隆电泳结果；

图6为玉米灰斑病病情分级标准。

具体实施方式

a1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质，具体为：

本发明的蛋白质是一种细胞壁相关激酶(Wall-associated kinase)，，在玉米自然群体中非常稀有，其可通过基因ZmWAK02编码得到。

本发明还提供了编码上述方案所述蛋白质的核酸分子。

在本发明中，所述核酸分子包括b1)～b3)所述核酸分子中的一种或几种：

bl)ZmWAK02基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：

gtgcgcgttt tcttcgactg gaaggactac ctcaggttct acgacatggg cacgtactggccctacacgc cctccatcca gctcctctac ggcctccgca ccgcgctcga cctcatcttc gaggaagggctggacaacgt cgtgaggagg cacaaccgcc ttgggacagc caccaggctc gccgtcgagg cgtgggggctcagcaactgc tgccagaagg aggagtggtt cagcgacacc gtcaccgccg tcgtcgtgcc gcccaacatcgacagcgccg aggtcgtcag gcacgcgtgg aagcggtaca acctcagcct cggcctcggc ctcaacaaggtcgccgggaa ggtcttcagg atcggccatc tcggcaacct caacgaggta ctgcactgca gagtttggcaattcgtttaa ttaattaatc agtgcaacgt actatatctt gatgctccca aacattattt tttttttcttcttctttgtc agctgcaact tctgggatgt ctgagcggtg tggagatggt gctcaaggat gtggggtacccagtgaaact aggtagcggc gtggcagccg cggcggcgta cctgtcaaac tccacgccgc tcatcccatctaggatctga gaacaatgta aggggaggat atcgcaaaca aggccagcga caacgagtgg gcagacgaacgaacaaagcg ttgctacata gtactctctt agaatgtaaa gttaaatttc acacccagct gttgctacatagtagtatag ttttatgaat tacaggtttg attaaacttc aaattaatct acatgtatag ccctgcccagatttaactat attgggaccg tattacttac cgatcaactc tgctttacag tagtagtctt tttgtttctgaaatcagatc ataagacatg ccattctcac aaacagaaaa aaaacactct cacaagtcac aaatcaccagtatgtattgc tggtatcaag tcaagtcttt gcgcgatcat agaataaaac tgtttcgaaa aacgaagtacatatactgta actcaatgta aaattggcga aaaaatcagt aacgaaaccg aaaaacttca agcgaagtactggctgttgc gctgaagaac atcaggcagc tttggcgagc tccctgtcga cggcgacctt gaggaagctgccttcgtcta ggaccatctg cacggggagg aagccgaggc cgttggccac gccgagcatc acctccttcatctccgcgcg gaactcgtgc cggtccacca tgccgctgcc gtccctgtcg aaccgcgcga acaggccgcggtacagcgcc ccgagctcct ccggcgccac cgcggcctcg tccacgccga agtgcctctc cagcacccgcaggctaatgt gagctccccg gccatctcgg cgtaggtgag caggccgtcg tggtcggcgt ccagcgcgacgaagcggccg tccaccgagg agttgaaggc gcgctcgtct tctacgaagc tccgcaccgt gctcctgtccaggatctcca cgctcatctt cgggttcctc tcgctgttcg tgttccttgg atgtgttggt gtgagagtttgctctgggct ctaggctctg ggctctgact ttttttatag ggtcgcgact ggacgtacct ggaaggggcgcctgggccga cggtttctgc agacgggttg ggctgggccg gtggattttg acgccggtca gatgccgtggacgcgagttg tgtggcgggt gcttgggaac tacgcgaagt ggcccgttca gccgtcgttt catcgtgccattactgggtc tattctatgg agaaaacgtg tgccaggtcg gttgttggtt gacggacagt agtaaactggctagtagaca ccgcttggca ataaatagaa ctgacatggt tcaaaaagtg atacgatcat cgcaaactaattttctagat taattgtctg gtaggtatat tccgagcaat ggaaacgata cataaactac atctacataaccaaaaaaaa aactaagcga agccatttta aagttaaatt tagagagaga aaaattataa taaggttaaagggcatctct tcaacgagcc attaaaataa aataacaggt tttacacctc ggtggcgaca agccgacaatagatatataa actaatgtta ataatgatgt aggtcgttaa taatgaagtt tctcttttgc cattgtgtttacgccaaaac tttccttgaa ggacagaacg aactccagat gtgtgcttgg accatagcga atgaatccatgtcaccaaaa caaagaatca gcatcgagtt cttaaaaaag agcatgaatc agtgtaatcc catgcttgcaatattcatat ttacctaata tagaatttct tttgattttt taagtgataa aaatatcaaa attctacttttcaatgctat tacatactcc aaatctcaag tttatttcaa tactaataca aattccaaat ctcaagtgtattacaactat atattatgat tggttttaga aactattaca attagagtac caaatttgta atcaaaacaaaactaaaaca cattacagtt tgaaatacgg aaattacatt atatgtaaac atagcaatgt catatatattatatacatat acgcaccata tataccatag tcttatgcga agggaacaaa atataccata tagttcctctctgaaaatag atggttacta tagatgtgtc caacatccaa gcaaatacca agttagcgaa ccatactggatgctgccgca agttcttgct ccaaactgta gcacccagac atcattggaa ttgttaaatg ttcctcattataaattggat tgatacgttc atgtgggtgc tgagcttcta cgcataacaa aggttccatt tctccacccttttcaatcaa aagatgtgtt ttattccgta gcctctttgt tcttagacat tgcaatctca tatctacttctttcatgctt ggtctatgcc ctcctttgga tcttaagcac gtttctataa gtgaggagat atcattaatctcttcttggt ctgcctcttc cacaacttga gaatctatta tttccatgag agccccttcc tgtagtccttcaatgaagta atgagataag ttttgtttgg cactcgattc attgataaaa attggtttct ttcttgtcaaaagttccaca agtatcactc caaaactata cacatcactc ttctcagtta gagaaccagt ataatagtactctggatcta aataaccaaa tgttccttgg acaattgtca ccacatgtgt ttcatcaagg gatagagatcttgaagcacc aaaatctgaa acctttacag tgaagttgtc gtccaagagt atattagaag acttcacatctctatggaaa attggtattg cagcagctga gtgtagataa gcaagtgctc ctgatgcttc cgttgcaatcctaattcgat catcccatga caacaagcat tttgttgcaa tattttcatg aagaatgtca tacaaagtgccattcgatat gaactcatag actagcaagg gtacctcatc ttctaggcaa caaccaaaaa gcttcaccacattgcggtga atgatttgag ataaaatagc aacctcattg atgaactgat ctatctctat ttgctccactattttagatt tttttatagc cacgacacgc tgatcagcca aaatcccttt gtaaacagtg ccatgcccaccatgacctag aacacgagta gcatcaaact tgttggttgc ttcctctaat tcatccaaag tgaatatctttgttttgttt gtagcatttt cattcgatat tagttgctcc aagagtagac cttgattttt cttgaagtactctcttcgaa ttctcctttg gatacctttt ttccacttac cggtgagtac aattgcacca agtgcaaaacttatggatcc aagaccacaa acaagcccaa ttacaatccc tacatccatt aaatgagacc atgaatatttcatgtctttt aatttgttgc ataaagtcat gactcaccaa aaattagaat aagctgctta gctgacatgacacatttttg cttttttgga tcatactctt tcccatgagg gcaacttgta caattgaagc ctccatcaaaattgtggcat attccattgc atttatttgg aataaagcac tcattaatat ctgtatcaat aagatggttgtaaaggttgg tgggggcaag taaagcatgc atgcatttat tgtcgtttcc aaaaaaagta atacaatatgtgatcaactg atcatgtaga accattggtg ataccagtag ttgtctgact ctagccctct atttatagacaacaatagct atgtaattag taaatagtca acaaccctac aaatctatat ctaagttact cgcttttacccaaaatatag tataaagtaa atccttaatt ttcttactat tttctcacct ctaccatttt gtttactcactggtgcgtgc gtgtgtgatc aggatagaga atataatgcg aatcatatag tatggctaaa attaaattttagcatgttta ttaataccct caccagatag attattgtta gagaaacaag aaacctggcg gaaataagttgacataaaga gagaggaata taacctgtac agttattatg aaggtatggg tttccttgga agccatcggaacacttgcag cggtacccat cacgtatatt ccctcgcatg acatctttgc atatactgtt gtcacttacgcacgcatatg tagcattatt ttgcattgct ttctgacaag ttatgtttgc tataaaccat tttattgttgtatcctcctg agagaaatca taattaccat ccacaacgtc ctcatcggtt gaatagaagc cgttctggtagtaaccgtca tagttagtga tgactaccct ctccatattg ttgaagcttg tggcattcag catgtttgtaaccatcaaaa gcccatcatc aagtgacaaa ttggtcacat gatattgtgc gtaccgtcga tcaagaataagagtgccgtt gcttgtgcag ttgagtcgta ggttatcatt tgcgtagcag ccttcttcaa tcccaaaaggaaatggaacg cttatgtttc cacataatct catacagttc ctaatactcg gtgcctctgg gttataatatgcttcatata tggtagacaa agcgaggagt taggattgat ccaaggcatg gaaaaacgag caaaaaggaagcagcagaga ggcaccaacc tatgcagcca tctttaatat aggggttgcc ctctatttga ccagggcagaagcaaatgta gcctccttga acgtcgtagc agatgctttc actagtgcat gcgtaggtat ccttgttctcttgggactgg gcactcgcgc agcttggttg gtccgtgatt gcaatgtcaa gtactatgcc ataaacattgcttgtattca cccaacttgc ataaacatca tcagtaacga attcatagta ttccgaaaag ataatcttgacactggagag cgcttcaccg agctgtggaa tggtactatt gaggcgacct agtttgagag tgaagccttggccgccacgc attagaatgc tgcagcagcc taaccctgca caggcactat aagctggcgt gtttgccctctccatgatct ctctgttatc tgtgcaaata ctcgtgcaat aaccaatgat atctgtcata ttatcaccgaacacgtagac gtagacacca catccaacag tgtacagaaa attatgatct gaataaaacc tgacaccagtggcagtaggg gcctcccaag acttggtgta ggtgtccacg cctgcgctca tggtgacgtt gaacccaacagctgaagccc aaaccctact gatgccgata tgtacagaag tcacctggat cgagctgttc cccgacacgaagaagagcct gggagaagga gctgtgtgat cgcaggtgac ctcgaagcct tgacggaagc agcccagccctatcccgaac gggtaggaga tttggacatc cccgcaccaa gaggggcagt gcgacaggga ggcgttggtagggatagcaa ggagcccatc cccggtgccg gcggcagcat ggaccttgct cggcgctcgc gccaaggcggccaaacacac aagcacaacg cctgtgcgaa ctagcagcac tgcagtggag cacatcgcgc tgcaggtagcttgtttatgt agacagaaga tggtgtgctt tcctgtgtgt tgtgtgtgtc tacatatact agtttaattaatttatatgc tgtaacagct agcgcgcgcc agaagaaaac aaaaaacaat aaaaaaaatc tcacttgcagttgcgtgggg caagctagca ttctgctagc tagtggaagg agaaggacgg cctggacttg gactttcagggcaacagtag catctgatgt tacggtcgtc gctgcggcca acaagacttg ccaaatcaga cgtacctagactgtggtgtg gagtattctc ctcctgtttt ttctttgatg catcatgcat ggaaacaacg agtggagactggagaattta tatcacgggg agactggaga gaccaccgcc atgcatactc aaaactagtg gagcttgaccggtgttaagt cttctcacga gttatccgag atgttttcca aagcgaattt tcaagtatgc tcggtgttttttttcttctt gaaaacgata tctgagaaaa gaatagtatt tgactataac tgtgatctct cgatgcttcctaactcaaat cagttggaca aagtctactc cgatcctagt aactatcatc gaccaattct tctacttaaatgccacttga tagatgtgac cactcctatc atggagtaac tatcatcgac caattcaggt agcctttaattcgttgagga gtttgataaa gctagtgttc agatctctcg taaaatttct tatcctttgt cttgataggctcgtgattgc caatcccgtc taacccgtct atgttcttat accaagaaca gatcaactga agatatgttaactgatattt ggccttggag agacataaag agccatttga atcaagtttt ctaccgtcaa taaagttggtcggaaaatat ttctagctca tgaattgcac aacctacccg tgcatcatta cgaaatggct cgaaaacaaactctgatttt cccccttttg tagtgagttg cgaccatccc acgacagcac aggtgaaact agttcagaaaaacctcgcga taactgaaat aaacgaccgt ttggctaaca cacccaccgt agtattaata aatcgggagagagactgaga gagagagaga gtggaggcat taccgtagtg aggatgacct cgagcttgcg gtagcggaggccatgggcgg agaagagaat ggggtcgacg acgaggctct ggcgctgcag gcgcgggcgg cgcgggcggcggccatgccg acagcgtgcg gaacacacca ggggtcgctc gctcccacgg acgtcgctgc gcagtcaccacggctcgtcg ttgcggatcc aacggtagcc caaccaaagt catgtgacag gccagtttgg gcggcccattccagcccaca gcggagcgcc atccgttcat gcatgatgca tctatgagta cgcgttttgt acgtgactagtaattagcgc gcgccccacg cgcgcgaaga gaaaagtgta acggcctaac gggagctagg gatgaaaacgggacggcaaa ttcctgtatc gtcccgtttc gaatactgtt ttttcccgat cgttttcgaa ttgtttgtgaaccgattaga aatggtacga aaacggttta gctagttttt cgatcgtttt cgtattttcc gtttccgagtcgtgctaata ccgttttata taatatgaga tagatctagc atataattta tttaagttat agacttttgttgtgttcaag tgaatgaata agcgaaaagc aaatgttata attactctaa ctaatattaa tgatgaaaaagagttgtttg tgtatttcta aatcttaaaa attaggcaat acatcacttt attatggttt tgtgaaaactacaaaatagt tatccttcca actatagttt atcgttttcg atcattttcg aataaccgac aatttcgatcccgtatttcg accattgttt ttcgctttcg ttttcgttcc tgcaaaaaaa tatgaaaaca aaaacaatttagatgttttt tcgatcgttt tcgaccgttt tcatccctaa cgggagcgcc ctaccgagcg tgttttaaattgatactaat ttgattggta agtggctaga tataagaaat aaagagaggg aataattcat aattagctactatagagtaa acacataaaa agttggtcat atatgtacct tatacaaaaa ggaaaatgaa tgtaattccaagaaaaagat ttaaaacgat catgtgaaaa agggagcaaa tgtaaaagta atattgaaat gcgtacctattttgcaatgt ggctgcctta gggtgatcag tagagcaata agatgttcat gtcacacaga gtgatgggaaaacttttaga tttccatcgc ttgcatttaa aaaaacacta atgcaagtga cagttcatta ggaaagggaaaataaaatag tataaacgtt catattttat ataaatctat ctctctttaa aacgtcgctt cagtactggaaatgtccttc aagtacaaca caaatagatt tgaaaaagtt agtggtaatt aactactatg taacatgtacacgtacaaca tgaatcagac ttactgtacc ataggaaaag aaatataata gtaagacatg aatacttggctaggaaagca taaggttctc caaacgttct tttggtcacc tttgtacttc agaaactacc cattccaaaaatatggagca tatgctcaac ctttaaatag tctcctctta tgttcttggc aaaccgtacg tcatcatctaaatatcacta ccggaaacga gtgctttgcc gagtgcccga agcactcggc aaagccttaa aaacactcggcaaaggcttt gccgagtgtc acactcggca aagaaggctc agcaaacagt gcatcggcaa agccttctttgccgagtact ttttctcgga gcactcggca aagaaaagca gccgttacgg cgacgggtga cggagacggcgtctttgccg agtgtcacgg atgacactcg gcaaa；

b2)来源于玉米且与bl)具有95％以上同一性的核酸分子；

b3)与bl)或b2)限定的核苷酸序列杂交的核酸分子。

在本发明中，SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列包含了启动子和终止子。

在本发明中，基因ZmWAK02是利用遗传学的方法在玉米第1号染色体上分离的主效抗灰斑病基因。转基因材料表型分析显示：导入ZmWAK02基因能够提高感病玉米自交系超过30％的灰斑病抗病性。ZmWAK02的遗传转化研究可为玉米抗灰斑病育种提供基因资源和理论支撑。

在本发明中，所述重组载体的原始载体优选的包括转基因载体pZZ01523，插入位点为图1所示载体图谱上的2865～12200bp。

本发明对构建所述DNA分子、表达盒、重组载体或重组微生物的方法没有特殊限制，采用本领域的常规方法即可。

本发明还提供了上述方案所述蛋白质或者所述的核酸分子或者所述的DNA分子、表达盒、重组载体或重组微生物的在调控植物的灰斑病抗病性中的应用。

在本发明中，所述调控植物的灰斑病抗病性包括提高植物的灰斑病抗病性。

在本发明中，所述植物优选的包括玉米，更优选的包括高感灰斑病的玉米；在本发明具体实施过程中，所述高感灰斑病的玉米为玉米自交系KN5585。本发明运用转基因技术，在高感灰斑病的高感灰斑病的玉米中表达ZmWAK02抗病基因能够提高玉米灰斑病的抗性。

在本发明中，所述出发植物优选的包括玉米，更优选的包括高感灰斑病的玉米；在本发明具体实施过程中，所述高感灰斑病的玉米为玉米自交系KN5585。

本发明还提供了一种植物育种方法，包括如下步骤：增加目的植物中上述方案所述蛋白质的含量和/或活性；所述目的植物优选的包括玉米，更优选的包括高感灰斑病的玉米；在本发明具体实施过程中，所述高感灰斑病的玉米为玉米自交系KN5585。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1：

ZmWAK02克隆

构建ZmWAK基因组互补载体：以SB12基因组DNA为模板克隆了ZmWAK基因的基因组序列(包含其自身约3kb启动子和约2kb终止子)，并将它构建到转基因载体pZZ01523中(图1)；由于克隆的基因序列过长，利用高保真DNA聚合酶难以直接扩增全长，因此我们将全长基因分为两段分别进行扩增，最终利用多片段一步法连接试剂盒(

MultiSOne Step Cloning Kit)将两个片段同时克隆到转基因载体pZZ01523中。

具体如下所示：

1.载体pZZ01523酶切：

SmaⅠ酶切位点：

CCC|GGG(SEQ ID NO.3)

反应条件:30℃、14h～16h；

酶切后的载体纯化回收。

2.目的片段扩增：使用高保真DNA聚合酶(

Max Super-Fidelity DNAPolymerase)

植株(SB12；抗病亲本)叶片总DNA的提取采用CTAB法，PCR扩增程序为：95℃预变性3min，然后以95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸3min，进行34个循环，最后72℃延伸5min。

PCR扩增体系为：

扩增片段1：4178bp，电泳图参见图3。

引物序列

F:AGCTTATGGCGCGCCTTCCCTTTGCCGAGTGTCATCCGT(SEQ ID NO.4)；

R:CAATCCCAAAAGGAAATGGAACG(SEQ ID NO.5)；

扩增片段2：5180bp，电泳图参见图4。

引物序列

F:TTTAAACGCACTAGTATCCCATGGTGCTCAAGGATGTGGG(SEQ ID NO.6)；

R:CGTTCCATTTCCTTTTGGGATTG(SEQ ID NO.7)。

3.连接；使用多片段一步法连接试剂盒(

MultiS One StepCloning Kit)

连接体系：

连接程序：37℃30min。

4阳性克隆检测:使用高保真DNA聚合酶(Vazyme 2×

Max Master Mix)

特异性引物

F:GAGAGGGCAAACACGCCAGC(SEQ ID NO.8)；

R:CAGTTCCTAATACTCGGTGC(SEQ ID NO.9)。

PCR扩增程序为：94℃预变性5min，然后以94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸1min，进行34个循环，最后72℃延伸5min。PCR扩增体系为：

成分	体积(μL)
		2×Buffer	7.5
Forwardprimer(10μM)	0.5
		Reverseprimer(10μM)	0.5
DNA(50ng/μL)	1
		ddH<sub>2</sub>O	5.5
Total	15

扩增片段大小528bp。电泳结果参见图5，由图5可以看出，获得阳性克隆；并进一步通过sanger测序确认目的基因的序列完全正确。

实施例2：ZmWAK02在玉米中的遗传转化

将构建好的转基因载体送至江苏未米生物科技有限公司进行转化，转基因受体玉米自交系KN5585易感灰斑病；2020年，在湖北鄂州基地播种从江苏未米生物科技有限公司获得的T₁代转基因玉米种子，进行基因型鉴定并全部自交授粉；2021年，在海南三亚基地对T₂代的不同转基因事件中分离产生的阴性和阳性材料分别自交，获得T₃代的转基因家系；2021年，对T₃代转基因家系进行抗灰斑病表型的鉴定分析，自然条件下发病，不需要人工接种致病菌。抗病表型鉴定依据1～9的等级评分标准，参见表1和图6，1为高抗表型，9为高感表型。

表1玉米灰斑病病情分级标准

结果显示：导入ZmWAK02能够显著提升玉米的抗灰斑病能力；在两个独立的转基因互补事件中，导入ZmWAK02分别提高了36.5％和48％的抗病性，说明ZmWAK02基因具有很高的效应。因此本发明为玉米抗灰斑病改良提供了新的基因资源。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 玉米ZmWAK02基因在提高玉米灰斑病抗性中的应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 960

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Cys Ser Thr Ala Val Leu Leu Val Arg Thr Gly Val Val Leu Val

1 5 10 15

Cys Leu Ala Ala Leu Ala Arg Ala Pro Ser Lys Val His Ala Ala Ala

20 25 30

Gly Thr Gly Asp Gly Leu Leu Ala Ile Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser

35 40 45

His Cys Pro Ser Trp Cys Gly Asp Val Gln Ile Ser Tyr Pro Phe Gly

50 55 60

Ile Gly Leu Gly Cys Phe Arg Gln Gly Phe Glu Val Thr Cys Asp His

65 70 75 80

Thr Ala Pro Ser Pro Arg Leu Phe Phe Val Ser Gly Asn Ser Ser Ile

85 90 95

Gln Val Thr Ser Val His Ile Gly Ile Ser Arg Val Trp Ala Ser Ala

100 105 110

Val Gly Phe Asn Val Thr Met Ser Ala Gly Val Asp Thr Tyr Thr Lys

115 120 125

Ser Trp Glu Ala Pro Thr Ala Thr Gly Val Arg Phe Tyr Ser Asp His

130 135 140

Asn Phe Leu Tyr Thr Val Gly Cys Gly Val Tyr Val Tyr Val Phe Gly

145 150 155 160

Asp Asn Met Thr Asp Ile Ile Gly Tyr Cys Thr Ser Ile Cys Thr Asp

165 170 175

Asn Arg Glu Ile Met Glu Arg Ala Asn Thr Pro Ala Tyr Ser Ala Cys

180 185 190

Ala Gly Leu Gly Cys Cys Ser Ile Leu Met Arg Gly Gly Gln Gly Phe

195 200 205

Thr Leu Lys Leu Gly Arg Leu Asn Ser Thr Ile Pro Gln Leu Gly Glu

210 215 220

Ala Leu Ser Ser Val Lys Ile Ile Phe Ser Glu Tyr Tyr Glu Phe Val

225 230 235 240

Thr Asp Asp Val Tyr Ala Ser Trp Val Asn Thr Ser Asn Val Tyr Gly

245 250 255

Ile Val Leu Asp Ile Ala Ile Thr Asp Gln Pro Ser Cys Ala Ser Ala

260 265 270

Gln Ser Gln Glu Asn Lys Asp Thr Tyr Ala Cys Thr Ser Glu Ser Ile

275 280 285

Cys Tyr Asp Val Gln Gly Gly Tyr Ile Cys Phe Cys Pro Gly Gln Ile

290 295 300

Glu Gly Asn Pro Tyr Ile Lys Asp Gly Cys Ile Ala Tyr Tyr Asn Pro

305 310 315 320

Glu Ala Pro Ser Ile Arg Asn Cys Met Arg Leu Cys Gly Asn Ile Ser

325 330 335

Val Pro Phe Pro Phe Gly Ile Glu Glu Gly Cys Tyr Ala Asn Asp Asn

340 345 350

Leu Arg Leu Asn Cys Thr Ser Asn Gly Thr Leu Ile Leu Asp Arg Arg

355 360 365

Tyr Ala Gln Tyr His Val Thr Asn Leu Ser Leu Asp Asp Gly Leu Leu

370 375 380

Met Val Thr Asn Met Leu Asn Ala Thr Ser Phe Asn Asn Met Glu Arg

385 390 395 400

Val Val Ile Thr Asn Tyr Asp Gly Tyr Tyr Gln Asn Gly Phe Tyr Ser

405 410 415

Thr Asp Glu Asp Val Val Asp Gly Asn Tyr Asp Phe Ser Gln Glu Asp

420 425 430

Thr Thr Ile Lys Trp Phe Ile Ala Asn Ile Thr Cys Gln Lys Ala Met

435 440 445

Gln Asn Asn Ala Thr Tyr Ala Cys Val Ser Asp Asn Ser Ile Cys Lys

450 455 460

Asp Val Met Arg Gly Asn Ile Arg Asp Gly Tyr Arg Cys Lys Cys Ser

465 470 475 480

Asp Gly Phe Gln Gly Asn Pro Tyr Leu His Asn Asn Cys Thr Asp Ile

485 490 495

Asn Glu Cys Phe Ile Pro Asn Lys Cys Asn Gly Ile Cys His Asn Phe

500 505 510

Asp Gly Gly Phe Asn Cys Thr Ser Cys Pro His Gly Lys Glu Tyr Asp

515 520 525

Pro Lys Lys Gln Lys Cys Val Met Ser Ala Lys Gln Leu Ile Leu Ile

530 535 540

Phe Gly Ile Val Ile Gly Leu Val Cys Gly Leu Gly Ser Ile Ser Phe

545 550 555 560

Ala Leu Gly Ala Ile Val Leu Thr Gly Lys Trp Lys Lys Gly Ile Gln

565 570 575

Arg Arg Ile Arg Arg Glu Tyr Phe Lys Lys Asn Gln Gly Leu Leu Leu

580 585 590

Glu Gln Leu Ile Ser Asn Glu Asn Ala Thr Asn Lys Thr Lys Ile Phe

595 600 605

Thr Leu Asp Glu Leu Glu Glu Ala Thr Asn Lys Phe Asp Ala Thr Arg

610 615 620

Val Leu Gly His Gly Gly His Gly Thr Val Tyr Lys Gly Ile Leu Ala

625 630 635 640

Asp Gln Arg Val Val Ala Ile Lys Lys Ser Lys Ile Val Glu Gln Ile

645 650 655

Glu Ile Asp Gln Phe Ile Asn Glu Val Ala Ile Leu Ser Gln Ile Ile

660 665 670

His Arg Asn Val Val Lys Leu Phe Gly Cys Cys Leu Glu Asp Glu Val

675 680 685

Pro Leu Leu Val Tyr Glu Phe Ile Ser Asn Gly Thr Leu Tyr Asp Ile

690 695 700

Leu His Glu Asn Ile Ala Thr Lys Cys Leu Leu Ser Trp Asp Asp Arg

705 710 715 720

Ile Arg Ile Ala Thr Glu Ala Ser Gly Ala Leu Ala Tyr Leu His Ser

725 730 735

Ala Ala Ala Ile Pro Ile Phe His Arg Asp Val Lys Ser Ser Asn Ile

740 745 750

Leu Leu Asp Asp Asn Phe Thr Val Lys Val Ser Asp Phe Gly Ala Ser

755 760 765

Arg Ser Leu Ser Leu Asp Glu Thr His Val Val Thr Ile Val Gln Gly

770 775 780

Thr Phe Gly Tyr Leu Asp Pro Glu Tyr Tyr Tyr Thr Gly Ser Leu Thr

785 790 795 800

Glu Lys Ser Asp Val Tyr Ser Phe Gly Val Ile Leu Val Glu Leu Leu

805 810 815

Thr Arg Lys Lys Pro Ile Phe Ile Asn Glu Ser Ser Ala Lys Gln Asn

820 825 830

Leu Ser His Tyr Phe Ile Glu Gly Leu Gln Glu Gly Ala Leu Met Glu

835 840 845

Ile Ile Asp Ser Gln Val Val Glu Glu Ala Asp Gln Glu Glu Ile Asn

850 855 860

Asp Ile Ser Ser Leu Ile Glu Thr Cys Leu Arg Ser Lys Gly Gly His

865 870 875 880

Arg Pro Ser Met Lys Glu Val Asp Met Arg Leu Gln Cys Leu Arg Thr

885 890 895

Lys Arg Leu Arg Asn Lys Thr His Leu Leu Ile Glu Lys Gly Gly Glu

900 905 910

Met Glu Pro Leu Leu Cys Val Glu Ala Gln His Pro His Glu Arg Ile

915 920 925

Asn Pro Ile Tyr Asn Glu Glu His Leu Thr Ile Pro Met Met Ser Gly

930 935 940

Cys Tyr Ser Leu Glu Gln Glu Leu Ala Ala Ala Ser Ser Met Val Arg

945 950 955 960

<210> 2

<211> 9335

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtgcgcgttt tcttcgactg gaaggactac ctcaggttct acgacatggg cacgtactgg 60

ccctacacgc cctccatcca gctcctctac ggcctccgca ccgcgctcga cctcatcttc 120

gaggaagggc tggacaacgt cgtgaggagg cacaaccgcc ttgggacagc caccaggctc 180

gccgtcgagg cgtgggggct cagcaactgc tgccagaagg aggagtggtt cagcgacacc 240

gtcaccgccg tcgtcgtgcc gcccaacatc gacagcgccg aggtcgtcag gcacgcgtgg 300

aagcggtaca acctcagcct cggcctcggc ctcaacaagg tcgccgggaa ggtcttcagg 360

atcggccatc tcggcaacct caacgaggta ctgcactgca gagtttggca attcgtttaa 420

ttaattaatc agtgcaacgt actatatctt gatgctccca aacattattt tttttttctt 480

cttctttgtc agctgcaact tctgggatgt ctgagcggtg tggagatggt gctcaaggat 540

gtggggtacc cagtgaaact aggtagcggc gtggcagccg cggcggcgta cctgtcaaac 600

tccacgccgc tcatcccatc taggatctga gaacaatgta aggggaggat atcgcaaaca 660

aggccagcga caacgagtgg gcagacgaac gaacaaagcg ttgctacata gtactctctt 720

agaatgtaaa gttaaatttc acacccagct gttgctacat agtagtatag ttttatgaat 780

tacaggtttg attaaacttc aaattaatct acatgtatag ccctgcccag atttaactat 840

attgggaccg tattacttac cgatcaactc tgctttacag tagtagtctt tttgtttctg 900

aaatcagatc ataagacatg ccattctcac aaacagaaaa aaaacactct cacaagtcac 960

aaatcaccag tatgtattgc tggtatcaag tcaagtcttt gcgcgatcat agaataaaac 1020

tgtttcgaaa aacgaagtac atatactgta actcaatgta aaattggcga aaaaatcagt 1080

aacgaaaccg aaaaacttca agcgaagtac tggctgttgc gctgaagaac atcaggcagc 1140

tttggcgagc tccctgtcga cggcgacctt gaggaagctg ccttcgtcta ggaccatctg 1200

cacggggagg aagccgaggc cgttggccac gccgagcatc acctccttca tctccgcgcg 1260

gaactcgtgc cggtccacca tgccgctgcc gtccctgtcg aaccgcgcga acaggccgcg 1320

gtacagcgcc ccgagctcct ccggcgccac cgcggcctcg tccacgccga agtgcctctc 1380

cagcacccgc aggctaatgt gagctccccg gccatctcgg cgtaggtgag caggccgtcg 1440

tggtcggcgt ccagcgcgac gaagcggccg tccaccgagg agttgaaggc gcgctcgtct 1500

tctacgaagc tccgcaccgt gctcctgtcc aggatctcca cgctcatctt cgggttcctc 1560

tcgctgttcg tgttccttgg atgtgttggt gtgagagttt gctctgggct ctaggctctg 1620

ggctctgact ttttttatag ggtcgcgact ggacgtacct ggaaggggcg cctgggccga 1680

cggtttctgc agacgggttg ggctgggccg gtggattttg acgccggtca gatgccgtgg 1740

acgcgagttg tgtggcgggt gcttgggaac tacgcgaagt ggcccgttca gccgtcgttt 1800

catcgtgcca ttactgggtc tattctatgg agaaaacgtg tgccaggtcg gttgttggtt 1860

gacggacagt agtaaactgg ctagtagaca ccgcttggca ataaatagaa ctgacatggt 1920

tcaaaaagtg atacgatcat cgcaaactaa ttttctagat taattgtctg gtaggtatat 1980

tccgagcaat ggaaacgata cataaactac atctacataa ccaaaaaaaa aactaagcga 2040

agccatttta aagttaaatt tagagagaga aaaattataa taaggttaaa gggcatctct 2100

tcaacgagcc attaaaataa aataacaggt tttacacctc ggtggcgaca agccgacaat 2160

agatatataa actaatgtta ataatgatgt aggtcgttaa taatgaagtt tctcttttgc 2220

cattgtgttt acgccaaaac tttccttgaa ggacagaacg aactccagat gtgtgcttgg 2280

accatagcga atgaatccat gtcaccaaaa caaagaatca gcatcgagtt cttaaaaaag 2340

agcatgaatc agtgtaatcc catgcttgca atattcatat ttacctaata tagaatttct 2400

tttgattttt taagtgataa aaatatcaaa attctacttt tcaatgctat tacatactcc 2460

aaatctcaag tttatttcaa tactaataca aattccaaat ctcaagtgta ttacaactat 2520

atattatgat tggttttaga aactattaca attagagtac caaatttgta atcaaaacaa 2580

aactaaaaca cattacagtt tgaaatacgg aaattacatt atatgtaaac atagcaatgt 2640

catatatatt atatacatat acgcaccata tataccatag tcttatgcga agggaacaaa 2700

atataccata tagttcctct ctgaaaatag atggttacta tagatgtgtc caacatccaa 2760

gcaaatacca agttagcgaa ccatactgga tgctgccgca agttcttgct ccaaactgta 2820

gcacccagac atcattggaa ttgttaaatg ttcctcatta taaattggat tgatacgttc 2880

atgtgggtgc tgagcttcta cgcataacaa aggttccatt tctccaccct tttcaatcaa 2940

aagatgtgtt ttattccgta gcctctttgt tcttagacat tgcaatctca tatctacttc 3000

tttcatgctt ggtctatgcc ctcctttgga tcttaagcac gtttctataa gtgaggagat 3060

atcattaatc tcttcttggt ctgcctcttc cacaacttga gaatctatta tttccatgag 3120

agccccttcc tgtagtcctt caatgaagta atgagataag ttttgtttgg cactcgattc 3180

attgataaaa attggtttct ttcttgtcaa aagttccaca agtatcactc caaaactata 3240

cacatcactc ttctcagtta gagaaccagt ataatagtac tctggatcta aataaccaaa 3300

tgttccttgg acaattgtca ccacatgtgt ttcatcaagg gatagagatc ttgaagcacc 3360

aaaatctgaa acctttacag tgaagttgtc gtccaagagt atattagaag acttcacatc 3420

tctatggaaa attggtattg cagcagctga gtgtagataa gcaagtgctc ctgatgcttc 3480

cgttgcaatc ctaattcgat catcccatga caacaagcat tttgttgcaa tattttcatg 3540

aagaatgtca tacaaagtgc cattcgatat gaactcatag actagcaagg gtacctcatc 3600

ttctaggcaa caaccaaaaa gcttcaccac attgcggtga atgatttgag ataaaatagc 3660

aacctcattg atgaactgat ctatctctat ttgctccact attttagatt tttttatagc 3720

cacgacacgc tgatcagcca aaatcccttt gtaaacagtg ccatgcccac catgacctag 3780

aacacgagta gcatcaaact tgttggttgc ttcctctaat tcatccaaag tgaatatctt 3840

tgttttgttt gtagcatttt cattcgatat tagttgctcc aagagtagac cttgattttt 3900

cttgaagtac tctcttcgaa ttctcctttg gatacctttt ttccacttac cggtgagtac 3960

aattgcacca agtgcaaaac ttatggatcc aagaccacaa acaagcccaa ttacaatccc 4020

tacatccatt aaatgagacc atgaatattt catgtctttt aatttgttgc ataaagtcat 4080

gactcaccaa aaattagaat aagctgctta gctgacatga cacatttttg cttttttgga 4140

tcatactctt tcccatgagg gcaacttgta caattgaagc ctccatcaaa attgtggcat 4200

attccattgc atttatttgg aataaagcac tcattaatat ctgtatcaat aagatggttg 4260

taaaggttgg tgggggcaag taaagcatgc atgcatttat tgtcgtttcc aaaaaaagta 4320

atacaatatg tgatcaactg atcatgtaga accattggtg ataccagtag ttgtctgact 4380

ctagccctct atttatagac aacaatagct atgtaattag taaatagtca acaaccctac 4440

aaatctatat ctaagttact cgcttttacc caaaatatag tataaagtaa atccttaatt 4500

ttcttactat tttctcacct ctaccatttt gtttactcac tggtgcgtgc gtgtgtgatc 4560

aggatagaga atataatgcg aatcatatag tatggctaaa attaaatttt agcatgttta 4620

ttaataccct caccagatag attattgtta gagaaacaag aaacctggcg gaaataagtt 4680

gacataaaga gagaggaata taacctgtac agttattatg aaggtatggg tttccttgga 4740

agccatcgga acacttgcag cggtacccat cacgtatatt ccctcgcatg acatctttgc 4800

atatactgtt gtcacttacg cacgcatatg tagcattatt ttgcattgct ttctgacaag 4860

ttatgtttgc tataaaccat tttattgttg tatcctcctg agagaaatca taattaccat 4920

ccacaacgtc ctcatcggtt gaatagaagc cgttctggta gtaaccgtca tagttagtga 4980

tgactaccct ctccatattg ttgaagcttg tggcattcag catgtttgta accatcaaaa 5040

gcccatcatc aagtgacaaa ttggtcacat gatattgtgc gtaccgtcga tcaagaataa 5100

gagtgccgtt gcttgtgcag ttgagtcgta ggttatcatt tgcgtagcag ccttcttcaa 5160

tcccaaaagg aaatggaacg cttatgtttc cacataatct catacagttc ctaatactcg 5220

gtgcctctgg gttataatat gcttcatata tggtagacaa agcgaggagt taggattgat 5280

ccaaggcatg gaaaaacgag caaaaaggaa gcagcagaga ggcaccaacc tatgcagcca 5340

tctttaatat aggggttgcc ctctatttga ccagggcaga agcaaatgta gcctccttga 5400

acgtcgtagc agatgctttc actagtgcat gcgtaggtat ccttgttctc ttgggactgg 5460

gcactcgcgc agcttggttg gtccgtgatt gcaatgtcaa gtactatgcc ataaacattg 5520

cttgtattca cccaacttgc ataaacatca tcagtaacga attcatagta ttccgaaaag 5580

ataatcttga cactggagag cgcttcaccg agctgtggaa tggtactatt gaggcgacct 5640

agtttgagag tgaagccttg gccgccacgc attagaatgc tgcagcagcc taaccctgca 5700

caggcactat aagctggcgt gtttgccctc tccatgatct ctctgttatc tgtgcaaata 5760

ctcgtgcaat aaccaatgat atctgtcata ttatcaccga acacgtagac gtagacacca 5820

catccaacag tgtacagaaa attatgatct gaataaaacc tgacaccagt ggcagtaggg 5880

gcctcccaag acttggtgta ggtgtccacg cctgcgctca tggtgacgtt gaacccaaca 5940

gctgaagccc aaaccctact gatgccgata tgtacagaag tcacctggat cgagctgttc 6000

cccgacacga agaagagcct gggagaagga gctgtgtgat cgcaggtgac ctcgaagcct 6060

tgacggaagc agcccagccc tatcccgaac gggtaggaga tttggacatc cccgcaccaa 6120

gaggggcagt gcgacaggga ggcgttggta gggatagcaa ggagcccatc cccggtgccg 6180

gcggcagcat ggaccttgct cggcgctcgc gccaaggcgg ccaaacacac aagcacaacg 6240

cctgtgcgaa ctagcagcac tgcagtggag cacatcgcgc tgcaggtagc ttgtttatgt 6300

agacagaaga tggtgtgctt tcctgtgtgt tgtgtgtgtc tacatatact agtttaatta 6360

atttatatgc tgtaacagct agcgcgcgcc agaagaaaac aaaaaacaat aaaaaaaatc 6420

tcacttgcag ttgcgtgggg caagctagca ttctgctagc tagtggaagg agaaggacgg 6480

cctggacttg gactttcagg gcaacagtag catctgatgt tacggtcgtc gctgcggcca 6540

acaagacttg ccaaatcaga cgtacctaga ctgtggtgtg gagtattctc ctcctgtttt 6600

ttctttgatg catcatgcat ggaaacaacg agtggagact ggagaattta tatcacgggg 6660

agactggaga gaccaccgcc atgcatactc aaaactagtg gagcttgacc ggtgttaagt 6720

cttctcacga gttatccgag atgttttcca aagcgaattt tcaagtatgc tcggtgtttt 6780

ttttcttctt gaaaacgata tctgagaaaa gaatagtatt tgactataac tgtgatctct 6840

cgatgcttcc taactcaaat cagttggaca aagtctactc cgatcctagt aactatcatc 6900

gaccaattct tctacttaaa tgccacttga tagatgtgac cactcctatc atggagtaac 6960

tatcatcgac caattcaggt agcctttaat tcgttgagga gtttgataaa gctagtgttc 7020

agatctctcg taaaatttct tatcctttgt cttgataggc tcgtgattgc caatcccgtc 7080

taacccgtct atgttcttat accaagaaca gatcaactga agatatgtta actgatattt 7140

ggccttggag agacataaag agccatttga atcaagtttt ctaccgtcaa taaagttggt 7200

cggaaaatat ttctagctca tgaattgcac aacctacccg tgcatcatta cgaaatggct 7260

cgaaaacaaa ctctgatttt cccccttttg tagtgagttg cgaccatccc acgacagcac 7320

aggtgaaact agttcagaaa aacctcgcga taactgaaat aaacgaccgt ttggctaaca 7380

cacccaccgt agtattaata aatcgggaga gagactgaga gagagagaga gtggaggcat 7440

taccgtagtg aggatgacct cgagcttgcg gtagcggagg ccatgggcgg agaagagaat 7500

ggggtcgacg acgaggctct ggcgctgcag gcgcgggcgg cgcgggcggc ggccatgccg 7560

acagcgtgcg gaacacacca ggggtcgctc gctcccacgg acgtcgctgc gcagtcacca 7620

cggctcgtcg ttgcggatcc aacggtagcc caaccaaagt catgtgacag gccagtttgg 7680

gcggcccatt ccagcccaca gcggagcgcc atccgttcat gcatgatgca tctatgagta 7740

cgcgttttgt acgtgactag taattagcgc gcgccccacg cgcgcgaaga gaaaagtgta 7800

acggcctaac gggagctagg gatgaaaacg ggacggcaaa ttcctgtatc gtcccgtttc 7860

gaatactgtt ttttcccgat cgttttcgaa ttgtttgtga accgattaga aatggtacga 7920

aaacggttta gctagttttt cgatcgtttt cgtattttcc gtttccgagt cgtgctaata 7980

ccgttttata taatatgaga tagatctagc atataattta tttaagttat agacttttgt 8040

tgtgttcaag tgaatgaata agcgaaaagc aaatgttata attactctaa ctaatattaa 8100

tgatgaaaaa gagttgtttg tgtatttcta aatcttaaaa attaggcaat acatcacttt 8160

attatggttt tgtgaaaact acaaaatagt tatccttcca actatagttt atcgttttcg 8220

atcattttcg aataaccgac aatttcgatc ccgtatttcg accattgttt ttcgctttcg 8280

ttttcgttcc tgcaaaaaaa tatgaaaaca aaaacaattt agatgttttt tcgatcgttt 8340

tcgaccgttt tcatccctaa cgggagcgcc ctaccgagcg tgttttaaat tgatactaat 8400

ttgattggta agtggctaga tataagaaat aaagagaggg aataattcat aattagctac 8460

tatagagtaa acacataaaa agttggtcat atatgtacct tatacaaaaa ggaaaatgaa 8520

tgtaattcca agaaaaagat ttaaaacgat catgtgaaaa agggagcaaa tgtaaaagta 8580

atattgaaat gcgtacctat tttgcaatgt ggctgcctta gggtgatcag tagagcaata 8640

agatgttcat gtcacacaga gtgatgggaa aacttttaga tttccatcgc ttgcatttaa 8700

aaaaacacta atgcaagtga cagttcatta ggaaagggaa aataaaatag tataaacgtt 8760

catattttat ataaatctat ctctctttaa aacgtcgctt cagtactgga aatgtccttc 8820

aagtacaaca caaatagatt tgaaaaagtt agtggtaatt aactactatg taacatgtac 8880

acgtacaaca tgaatcagac ttactgtacc ataggaaaag aaatataata gtaagacatg 8940

aatacttggc taggaaagca taaggttctc caaacgttct tttggtcacc tttgtacttc 9000

agaaactacc cattccaaaa atatggagca tatgctcaac ctttaaatag tctcctctta 9060

tgttcttggc aaaccgtacg tcatcatcta aatatcacta ccggaaacga gtgctttgcc 9120

gagtgcccga agcactcggc aaagccttaa aaacactcgg caaaggcttt gccgagtgtc 9180

acactcggca aagaaggctc agcaaacagt gcatcggcaa agccttcttt gccgagtact 9240

ttttctcgga gcactcggca aagaaaagca gccgttacgg cgacgggtga cggagacggc 9300

gtctttgccg agtgtcacgg atgacactcg gcaaa 9335

<210> 3

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cccggg 6

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agcttatggc gcgccttccc tttgccgagt gtcatccgt 39

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caatcccaaa aggaaatgga acg 23

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tttaaacgca ctagtatccc atggtgctca aggatgtggg 40

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgttccattt ccttttggga ttg 23

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gagagggcaa acacgccagc 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cagttcctaa tactcggtgc 20

Claims

1.与灰斑病抗病性相关的蛋白质，包括a1)～a3)所述蛋白质中的一种或几种：

a1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质；

2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括b1)～b3)所述核酸分子中的一种或几种：

bl)ZmWAK02基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

b2)来源于玉米且与bl)具有95％以上同一性的核酸分子；

b3)与bl)或b2)限定的核苷酸序列杂交的核酸分子。

4.含有权利要求2或3所述核酸分子的DNA分子、表达盒、重组载体或重组微生物。

5.权利要求1所述蛋白质或者权利要求2或3所述的核酸分子或者权利要求4所述的DNA分子、表达盒、重组载体或重组微生物的在调控植物的灰斑病抗病性中的应用；优选的，所述植物包括玉米。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述调控植物的灰斑病抗病性包括提高植物的灰斑病抗病性。

7.一种用于检测玉米灰斑病抗病性的引物组，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的下游引物。

8.一种植物转基因育种的方法，包括如下步骤：在出发植物中导入权利要求2或3所述的核酸分子或者权利要求4所述的DNA分子、表达盒、重组载体或重组微生物，得到灰斑病抗病性增强的转基因植物。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述出发植物包括玉米。

10.一种植物育种方法，包括如下步骤：增加目的植物中权利要求1所述蛋白质的含量和/或活性；

所述目的植物优选的包括玉米。