CN115947813A - SlVQ15基因在提高番茄南方根结线虫病抗性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了SlVQ15基因在提高番茄南方根结线虫病抗性中的应用。具体地公开了氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质SlVQ15或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质、以及蛋白质SlVQ15的编码基因(SlVQ15基因)在调控植物根结线虫病抗性中的应用。本发明通过将来源于番茄的SlVQ15基因导入到受体番茄中，得到SlVQ15基因过表达番茄。实验证明，SlVQ15基因过表达番茄的根结指数显著降低，表明过表达SlWRKY30基因可以显著提高番茄对南方根结线虫病的抗性。本发明的SlVQ15基因及其编码蛋白在番茄育种中具有广泛的应用前景，对于保证番茄的高产稳产具有潜在的价值。

Description

SlVQ15基因在提高番茄南方根结线虫病抗性中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及SlVQ15基因在提高番茄南方根结线虫病抗性中的应用。

背景技术

番茄(Solanum lycopersicum)是我国广泛种植的一种蔬菜，在人们的日常生活中占有重要地位，具有较高的经济价值。植物寄生线虫南方根结线虫(Meloidogyneincognita)是危害番茄栽培最为严重的土传病害之一。目前，物理、化学和生物防治方法都具有一定的局限性。近些年，利用番茄自身免疫系统提高其抗性成为研究的热点。挖掘和鉴定番茄中与抗根结线虫相关的基因，将为培育抗性新品种提供重要的基因资源，对于保证番茄的品质和高产稳产具有重要的意义，在番茄分子育种领域具有一定的应用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高植物对南方根结线虫病的抗性(如提高番茄对南方根结线虫病的抗性)。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质的应用，所述应用可为下述任一种：

A1)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在调控植物根结线虫病抗性中的应用；

A2)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在制备调控植物根结线虫病抗性的产品中的应用；

A3)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在培育抗根结线虫病植物中的应用；

A4)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在制备培育抗根结线虫病植物的产品中的应用；

A5)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在植物育种或植物种质资源改良中的应用；

所述蛋白质名称为SlVQ15，可为下述任一种：

B1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；

B2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

B3)在B1)或B2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。

上述应用中，所述蛋白质可来源于番茄(Solanum lycopersicum)。

为了使B1)中的蛋白质便于纯化或检测，可在由序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接标签蛋白。

所述标签蛋白包括但不限于：GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、His6标签蛋白(His-tag)、MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、Flag标签蛋白、SUMO标签蛋白、HA标签蛋白、Myc标签蛋白、eGFP(增强型绿色荧光蛋白)、eCFP(增强型青色荧光蛋白)、eYFP(增强型黄绿色荧光蛋白)、mCherry(单体红色荧光蛋白)或AviTag标签蛋白。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质SlVQ15的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质SlVQ15的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质SlVQ15且具有蛋白质SlVQ15功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gapcost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。所述95％以上的同一性可为至少95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

本文中，调控所述蛋白质活性和/或含量的物质可为调控基因表达的物质，所述基因编码所述蛋白质SlVQ15。

上文中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(包括对所述基因的转录产物的修饰、剪接和/或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(包括对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(包括对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控，如对蛋白质前体的加工、蛋白质的转运、蛋白质的降解和/或蛋白质的折叠等进行的调控)。

所述调控基因表达的物质具体可为本文D1)-D3)中任一所述的生物材料。

进一步地，所述调控基因表达的物质可为提高或上调所述蛋白质SlVQ15的编码基因表达的物质(包括核酸分子或载体)。

进一步地，所述调控基因表达的物质还可为降低或下调所述蛋白质SlVQ15的编码基因表达的物质(包括核酸分子或载体)。

本发明还提供了与所述蛋白质SlVQ15相关的生物材料的应用，所述应用可为下述任一种：

C1)与所述蛋白质SlVQ15相关的生物材料在调控植物根结线虫病抗性中的应用；

C2)与所述蛋白质SlVQ15相关的生物材料在制备调控植物根结线虫病抗性的产品中的应用；

C3)与所述蛋白质SlVQ15相关的生物材料在培育抗根结线虫病植物中的应用；

C4)与所述蛋白质SlVQ15相关的生物材料在制备培育抗根结线虫病植物的产品中的应用；

C5)与所述蛋白质SlVQ15相关的生物材料在植物育种或植物种质资源改良中的应用；

所述生物材料可为下述任一种：

D1)编码所述蛋白质SlVQ15的核酸分子；

D2)含有D1)所述核酸分子的表达盒；

D3)含有D1)所述核酸分子的重组载体、或含有D2)所述表达盒的重组载体；

D4)含有D1)所述核酸分子的重组微生物、或含有D2)所述表达盒的重组微生物、或含有D3)所述重组载体的重组微生物；

D5)含有D1)所述核酸分子的重组宿主细胞、或含有D2)所述表达盒的重组宿主细胞、或含有D3)所述重组载体的重组宿主细胞；

D6)含有D1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有D2)所述表达盒的转基因植物组织；

D7)含有D1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有D2)所述表达盒的转基因植物器官。

进一步地，D2)所述表达盒、D3)所述重组载体、D4)所述重组微生物、D5)所述重组宿主细胞、D6)所述转基因植物组织和D7)所述转基因植物器官表达D1)所述核酸分子。

上述应用中，D1)所述核酸分子可为下述任一种：

E1)编码序列是SEQ ID No.2的DNA分子；

E2)核苷酸序列是SEQ ID No.2的DNA分子。

SEQ ID No.2所示的DNA分子可为SlVQ15基因的编码序列(CDS)。

SEQ ID No.2所示的DNA分子编码氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质SlVQ15。

SEQ ID No.2所示的DNA分子可为SlVQ15基因的基因组核苷酸序列。

D1)所述核酸分子还可包括在SEQ ID No.2所示核苷酸序列基础上经密码子偏好性改造得到的核酸分子。

D1)所述核酸分子还包括与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列一致性为95％以上且来源相同种属的核酸分子。

本发明所述的蛋白质SlVQ15基因的编码序列(CDS)可以为任意能够编码蛋白质SlVQ15的核苷酸序列。考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

本文所述表达盒包括启动子、编码所述蛋白SlVQ15的核酸分子和终止子，所述启动子可为CaMV35S启动子、NOS启动子或OCS启动子，所述终止子可为NOS终止子或OCS polyA终止子。

本文所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如gRNA、mRNA、siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。

本文所述载体是指能够把外源DNA或目的基因运载进入宿主细胞进行扩增和表达的载体，所述载体可以是克隆载体也可以是表达载体，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、Ti质粒、病毒载体(如逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒等)。在本发明的一个或多个实施方案中，所述载体为改造后的pCAMBIA1300载体(Huang Huang,Wenchao Zhao,HuiQiao,Chonghua Li,Lulu Sun,RuiYang,Xuechun Ma,Jilin Ma,Susheng Song,andShaohui Wang.SlWRKY45 interacts withjasmonate-ZIM domain proteins to negativelyregulate defense against the root-knot nematode Meloidogyne incognita in tomato.2022.Horticulture Research,9:uhac197)。

可用现有的植物表达载体构建含有SlVQ15基因编码序列(CDS)的重组表达载体。所述植物表达载体包括但不限于如双元农杆菌载体和可用于基因枪转化法的载体等。使用SlVQ15基因编码序列(CDS)构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，包括但不限于如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入包括但不限于可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、荧光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除草剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的SlVQ15基因的编码DNA导入植物细胞或受体植物，可获得根结线虫病抗性高于所述受体植物的抗根结线虫病植物。携带SlVQ15基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

本文所述微生物可为细菌、真菌、放线菌、原生动物、藻类或病毒。其中，所述细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia sp.)、欧文氏菌属(Erwinia sp.)、土壤杆菌属(Agrobacterium sp.)、黄杆菌属(Flavobacterium sp.)、产碱菌属(Alcaligenes sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、芽胞杆菌属(Bacillus sp.)等但不限于此，例如所述细菌可为大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。所述真菌可为酵母，所述酵母可来自酵母属(如酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae)、克鲁维酵母属(如乳酸克鲁维酵母Kluyveromyces lactis)、毕赤酵母属(如巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris)、裂殖酵母属(如非洲粟酒裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe)、汉逊酵母属(如多态汉逊酵母Hansenula polymorpha)等但不限于此。所述真菌还可来自镰刀菌属(Fusarium sp.)、丝核菌属(Rhizoctonia sp.)、轮枝菌属(Verticillium sp.)、青霉属(Penicillium sp.)、曲霉属(Aspergillus sp.)、头孢霉属(Cephalosporium sp.)等但不限于此。所述放线菌可来自链霉菌属(Streptomycessp.)、诺卡菌属(Nocardia sp.)、小单孢菌属(Micromonospora sp.)、链孢囊菌属(Streptosporangium sp.)、游动放线菌属(Actinoplanes sp.)、高温放线菌属(Thermoactinomyces sp.)等但不限于此。所述藻类可来自墨角藻属(Fucus sp.)、曲壳藻属(Achnanthes sp.)、茧形藻属(Amphiprora sp.)、双眉藻属(Amphora sp.)、纤维藻属(Ankistrodesmus sp.)、星胞藻属(Asteromonas sp.)、黄金色藻属(Boekeloviasp.)等但不限于此。所述病毒可为轮状病毒、疱疹病毒、流感病毒、腺病毒等但不限于此。在本发明的一个或多个实施方案中，所述微生物为根癌农杆菌GV3101。

本文所述宿主细胞(也称为受体细胞)可为植物细胞或动物细胞。所述宿主细胞可理解为不仅是指特定的受体细胞，而且也指这种细胞的后代，且由于天然的、偶然的或有意的突变和/或改变，该子代可以不必与原始的亲代细胞完全一致，但仍包括在宿主细胞的范围中。合适的宿主细胞为本领域已知的，其中：所述植物细胞可为拟南芥(Arabidopsisthaliana)、烟草(Nicotiana tabacum)、玉米(Zea mays)、水稻(Oryzasativa)、小麦(Triticum aestivum)等植物细胞但不限于此；所述动物细胞可为哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)、幼仓鼠肾细胞(BHK细胞)、小鼠乳腺癌细胞(C127细胞)、人胚胎肾细胞(HEK293细胞)、人HeLa细胞、成纤维细胞、骨髓细胞系、T细胞或NK细胞等)、禽类细胞(例如鸡或鸭细胞)、两栖类细胞(例如非洲爪蟾(Xenopuslaevis)细胞或大鲵(Andriasdavidianus)细胞)、鱼类细胞(例如草鱼、鲤鱼、虹鳟鱼或鲶鱼细胞)、昆虫细胞(例如Sf21细胞或Sf-9细胞)等但不限于此。

本文所述重组载体是指将外源目的基因与载体在体外连接构建而成的重组体DNA分子，可以任何合适的方式构建，只要构建的重组载体可携带外源目的基因进入受体细胞、并为外源目的基因提供在受体细胞的复制、整合、扩增和/或表达能力即可。

本文所述重组微生物(或重组宿主细胞)是指对目的微生物(或目的宿主细胞)的基因进行操作和修饰，从而得到功能发生变化的重组微生物(或功能发生变化的重组宿主细胞)。如将外源目的基因或重组载体导入目的微生物(或目的宿主细胞)后得到的重组微生物(或重组宿主细胞)，或直接对目的微生物(或目的宿主细胞)的内源基因进行基因编辑后得到的重组微生物(或重组宿主细胞)。所述重组微生物(或重组宿主细胞)可理解为不仅是指特定的重组微生物(或重组宿主细胞)，而且也指这种细胞的后代，且由于天然的、偶然的或有意的突变和/或改变，该子代可以不必与原始的亲代细胞完全一致，但仍包括在重组微生物(或重组宿主细胞)的范围中。

本文D3)所述重组载体可为重组载体flag-SlVQ15-OE。

所述重组载体flag-SlVQ15-OE是将改造后的pCAMBIA1300载体的Sal I和Spe I识别位点间的片段(小片段)替换为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2所示的DNA片段，保持该改造后的pCAMBIA1300载体的其他核苷酸序列不变，得到的重组表达载体。重组载体flag-SlVQ15-OE表达氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的SlVQ15蛋白。

本文D4)所述重组微生物可为重组农杆菌GV3101/flag-SlVQ15-OE。

所述重组农杆菌GV3101/flag-SlVQ15-OE是将所述重组载体flag-SlVQ15-OE导入根癌农杆菌GV3101得到的重组微生物，其含有SEQ ID No.2所示的DNA分子。

所述导入可为通过重组手段，包括但不限于农杆菌介导的转化，生物射弹(biolistic)方法，电穿孔，in planta技术，冻融法等等导入。

本发明还提供了一种培育抗根结线虫病植物的方法，所述方法可包括提高目的植物中所述蛋白质SlVQ15的含量和/或活性，得到根结线虫病抗性高于所述目的植物的抗根结线虫病植物。

上述方法中，所述提高目的植物中所述蛋白质SlVQ15的含量和/或活性可通过提高目的植物中所述蛋白质SlVQ15的编码基因的表达量实现。

上述方法中，所述提高目的植物中所述蛋白质SlVQ15的编码基因的表达量可通过将所述蛋白质SlVQ15的编码基因导入所述目的植物实现。

上述方法中，所述蛋白质的编码基因可为下述任一种：

F1)编码序列是SEQ ID No.2的DNA分子；

F2)核苷酸序列是SEQ ID No.2的DNA分子。

进一步地，所述提高目的植物中所述蛋白质SlVQ15的编码基因的表达量可通过将SEQ ID No.2所示的DNA分子导入番茄中实现。

所述培育抗根结线虫病植物的方法可包括如下步骤：

(1)构建包含SEQ ID No.2所示DNA分子的重组载体；

(2)将步骤(1)构建的重组载体导入目的植物(如作物)中；

(3)经筛选和鉴定获得所述抗根结线虫病植物。

上述方法中，所述重组载体可为本文所述重组载体flag-SlVQ15-OE。

进一步地，所述导入指通过重组手段，包括但不限于农杆菌(Agrobacterium)介导的转化、生物射弹(biolistic)方法、电穿孔或in planta技术。

上述方法中，所述植物可为下述任一种：

G1)单子叶植物或双子叶植物；

G2)茄科植物；

G3)茄属植物；

G4)番茄。

进一步地，所述番茄具体可为番茄品种Solanum lycopersicum cv Castlemart(CM)。

本文中，所述抗根结线虫病植物可为根结线虫病抗性提高(上调)的植物。

本文所述根结线虫可为南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫或北方根结线虫。

根结线虫病抗性提高(上调)体现为：提高受体植物(目的植物)中所述SlVQ15蛋白的表达量和/或活性后，植株的根结指数减少(降低)。

上述方法中，所述抗根结线虫病植物可为抗南方根结线虫病植物。

进一步地，所述抗根结线虫病植物可为抗根结线虫病番茄，具体可为抗南方根结线虫病番茄。

本发明还提供了培育抗根结线虫病植物的方法在创制抗根结线虫病植物和/或植物育种中的应用。

本文中，所述植物可为作物(如农作物)。

本文所述植物育种可为作物抗根结线虫病育种，具体可为番茄抗南方根结线虫病育种，所述育种的目的是为了选育抗南方根结线虫病能力提高的番茄。

本文所述植物育种可为利用本发明所述SlVQ15基因和/或蛋白SlVQ15提高植物(如作物)根结线虫病抗性的分子育种。

本文所述调控植物根结线虫病抗性可为提高(上调)植物根结线虫病抗性或降低(下调)植物根结线虫病抗性。

本文所述抗根结线虫病可为抗南方根结线虫(Meloidogyne incognita)病。

所述根结线虫病抗性可为对南方根结线虫病的抗性、对爪哇根结线虫病的抗性、对花生根结线虫病的抗性或对北方根结线虫病的抗性。

本文所述根结线虫病可为南方根结线虫病、爪哇根结线虫病、花生根结线虫病或北方根结线虫病，具体可为南方根结线虫(Meloidogyne incognita)病。

具体地，本文所述调控植物根结线虫病抗性包括提高(上调)植物的根结线虫病抗性或降低(下调)植物的根结线虫病抗性。进一步地，本文所述调控植物根结线虫病抗性可为调控植物的南方根结线虫病抗性，包括提高(上调)植物的南方根结线虫病抗性或降低(下调)植物的南方根结线虫病抗性。

所述调控植物根结线虫病抗性可通过过表达番茄SlVQ15基因的方式实现。

本文中，所述抗根结线虫病植物理解为不仅包含将所述SlVQ15基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述抗根结线虫病植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

本发明鉴定到的SlVQ15基因及其编码的SlVQ15蛋白可以调控植物的根结线虫病抗性(如提高或降低植物对根结线虫病的抗性)，通过提高目的植物中SlVQ15蛋白质的含量和/或活性(如过表达SlVQ15基因)可以显著提高目的植物的根结线虫病抗性。通过降低目的植物中SlVQ15蛋白质的含量和/或活性(如抑制SlVQ15基因的表达)可以显著降低目的植物的根结线虫病抗性。

本发明通过将来源于番茄(Solanum lycopersicum)的调控植物根结线虫病抗性的SlVQ15基因导入到受体植物野生型番茄(WT)中，得到了转SlVQ15基因的过表达植株(flag-SlVQ15-OE番茄)，进一步通过接种南方根结线虫(Meloidogyne incognita)分析SlVQ15基因过表达前后番茄野生型CM植株对南方根结线虫病抗性差异来鉴定SlVQ15基因过表达植物的抗虫性。实验证明，南方根结线虫胁迫以后，与未转基因受体对照相比，过表达SlVQ15基因的转基因番茄(flag-SlVQ15-OE过表达植株)对南方根结线虫病的敏感性减低，根结指数显著降低(减少)，表明过表达SlVQ15基因可以显著提高番茄对南方根结线虫病的抗性。

为了选育南方根结线虫病抗病能力提高的番茄，在生物逆境中提高产量，本发明首次将SlVQ15基因用于番茄抗南方根结线虫病育种，为番茄的抗根结线虫病育种提供了一个良好的基因资源，为SlVQ15基因的应用开拓了一个新的领域，丰富了番茄调控南方根结线虫病抗性的相关基因。本发明的调控植物根结线虫病抗性的SlVQ15基因及其编码蛋白在番茄育种中具有广泛的应用前景，对于保证番茄的高产稳产具有潜在的价值。

附图说明

图1为利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测flag-SlVQ15-OE过表达植株中SlVQ15基因的表达量。CM为番茄野生型植株；flag-SlVQ15-OE为SlVQ15基因过表达植株。不同小写字母之间表示差异显著。

图2为不同番茄株系接种南方根结线虫7天后根系酸性品红染色结果图。CM为番茄野生型植株；flag-SlVQ15-OE为SlVQ15基因过表达植株。

图3为不同番茄株系接种南方根结线虫7天后根结指数统计图。CM为番茄野生型植株；flag-SlVQ15-OE为SlVQ15基因过表达植株。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的番茄品种Solanum lycopersicum cv Castlemart(CM)和改造的pCAMBIA1300载体记载于如下文献中：Huang Huang,Wenchao Zhao,Hui Qiao,ChonghuaLi,Lulu Sun,Rui Yang,Xuechun Ma,Jilin Ma,Susheng Song,andShaohuiWang.SlWRKY45 interacts with jasmonate-ZIM domain proteins tonegatively regulatedefense against the root-knot nematode Meloidogyneincognita in tomato.2022.Horticulture Research,9:uhac197。公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的KT为激动素(Kinetin)，2，4-D为2，4二氯苯氧乙酸，IAA为吲哚-3-乙酸(Indole-3-acetic acid)，ZT为玉米素(Zeatin)。

下述实施例中的Kan为卡那霉素(kanamycin)，Rif为利福霉素(rifampicin)，Hyg为潮霉素B(Hygromycin B)。

下述实施例中的A1培养基为含有1mg/L IAA和1.75mg/L ZT的MS固体培养基，A2抗性培养基为含有1.0mg/L IAA、1.75mg/L ZT和5mg/L Hyg的MS固体培养基，A3培养基为含有1.0mg/L IAA、1.75mg/L ZT和5mg/L Hyg的MS固体培养基，A4培养基为含有5mg/L Hyg的MS固体培养基。

下述实施例中所涉及的序列如表1。

表1、SlVQ15基因相关序列

实施例1、构建过表达SlVQ15基因番茄

本申请的发明人经过广泛而深入的研究，从野生型(WT)番茄品种Solanumlycopersicum cv Castlemart(CM)中分离克隆出一个番茄基因，将其命名为SlVQ15。SlVQ15基因组的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示(无内含子)，全长483bp，SlVQ15基因的编码序列(CDS)的核苷酸序列也为SEQ ID No.2，并编码160个氨基酸，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。SlVQ15基因编码的蛋白质命名为SlVQ15蛋白(SEQ ID No.1)。

一、flag-SlVQ15-OE重组载体的构建

取番茄野生型CM，用Trizol法提取RNA，使用全式金的反转录试剂盒AT311进行反转录为cDNA，以cDNA为模板，设计SlVQ15基因克隆引物(SlVQ15-F和SlVQ15-R)将含有483bp片段(SEQ ID No.2)的DNA分子通过PCR扩增出来。得到的扩增片段是在483bp片段的SlVQ15基因的编码序列的5′端和3′端分别添加了Sal I和Spe I限制性内切酶的识别位点。引物序列如下所示：

引物SlVQ15-F：5’-acgcgtcgacatgttctccgatgccacaattg-3’(下划线序列为限制性内切酶Sal I位点)，

引物SlVQ15-R：5’-cggactagtttagaaggtgaaattattttccg-3’(下划线序列为限制性内切酶Spe I位点)。

使用Sal I和Spe I双酶切改造的pCAMBIA1300载体，1％琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒回收线性化载体骨架。

将上述得到的扩增片段和线性化载体骨架连接，经由生工生物工程(上海)股份有限公司测序比对序列，证明载体连接成功。将经测序表明在改造的pCAMBIA1300载体的SalI和Spe I酶切位点之间插入SEQ ID No.2所示DNA片段的重组质粒(重组载体)命名为flag-SlVQ15-OE。

重组载体flag-SlVQ15-OE是将改造的pCAMBIA1300载体的Sal I和Spe I识别位点间的片段(小片段)替换为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2所示的DNA片段，保持改造的pCAMBIA1300载体的其他核苷酸序列不变，得到的重组表达载体。重组载体flag-SlVQ15-OE表达氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的SlVQ15蛋白。

二、转化农杆菌

将连接成功的载体质粒flag-SlVQ15-OE转化根癌农杆菌GV3101菌株，得到重组农杆菌GV3101/flag-SlVQ15-OE，菌液PCR验证无误后保菌备用。

三、番茄遗传转化

1、播种

使用75％乙醇消毒处理种子4分钟，然后使用无菌水清洗4-5遍，用3％次氯酸钠溶液消毒8分钟左右，然后用无菌水冲洗8-10遍，将种子播在1/2MS培养基中，在组培室中培养5-7d至子叶展开而未冒出真叶。

2、外植体剪切

用灭菌的镊子和剪刀剪去子叶尖端和末端部分，形成1cm左右的外植体，将剪好的外植体放入MS液(加入1mg/L KT和1mg/L 2，4-D)中浸泡0.5h，转移到A1培养基(MS固体培养基+1mg/L IAA+1.75mg/L ZT)上，正面朝上，预培养1-2d。

3、侵染菌液的准备

选择单克隆阳性菌落(重组农杆菌GV3101/flag-SlVQ15-OE)，使用2mL含有抗生素(50mg/L Kan和50mg/L Rif)的YEB液体培养基培养，侵染当天，使用20mL含有抗生素(50mg/L Kan和50mg/L Rif)的YEB液体培养基加入上述小摇的菌液(菌液大约OD600＝1)，在28℃摇床，200rpm约4h扩大培养，得到农杆菌菌液，OD600＝1-2。

4、侵染外植体

步骤3中得到的农杆菌菌液4000rpm，室温离心10min弃上清，收集菌体后使用YEB液体培养基悬浮，4000rpm离心10min，弃上清后用MS盐溶液再次重悬菌体，调节OD600＝0.3-0.5，将外植体浸泡在重悬液中培养15min，无菌滤纸吸干多余液体后，将外植体移至A1培养基中，外植体背面朝上，暗培养2d。

5、培养

共培养(暗培养)两天后，将子叶转到A2抗性培养基(MS固体培养基+1.0mg/LIAA+1.75mg/L ZT+5mg/L Hyg)上，26℃(16h光照)/18℃(8h黑暗)培养。每周更换新鲜培养基，直至形成愈伤。愈伤形成后，将其转移到A3培养基(MS固体培养基+1.0mg/L IAA+1.75mg/L ZT+5mg/L Hyg)上诱导出芽成苗。将小苗转移到A4培养基(MS固体培养基+5mg/L Hyg)上进行生根筛选。最终获得T0代转基因番茄植株(即过表达SlVQ15基因番茄)。

6、鉴定

取T0代转基因番茄植株叶片提取DNA，PCR扩增，送生工测序筛选阳性转化苗(即flag-SlVQ15-OE阳性苗)，鉴定引物如下：

flag-SlVQ15-F：5’-GAACACGGGGGACTCTAGA-3’，

SlVQ15-R：5’-CGGACTAGTTTAGAAGGTGAAATTATTTTCCG-3’。

PCR扩增产物含有目的片段(400bp)鉴定为flag-SlVQ15-OE阳性苗(即flag-SlVQ15-OE番茄)。

四、利用qRT-PCR检测flag-SlVQ15-OE阳性苗中SlVQ15基因表达量

对长势一致的植株(flag-SlVQ15-OE阳性苗和CM野生型)取样，提取RNA后进行反转录成cDNA，使用SlVQ15RT-F和SlVQ15RT-R引物进行qRT-PCR检测所取样植株中SlVQ15基因的表达量。对照内参基因采用Sl-Actin2，引物为Sl-Actin2-F和Sl-Actin2-R。

SlVQ15RT-F：5’-GTAGTTAGAGCTCCAGATCACC-3’；

SlVQ15RT-R：5’-TTAATACGGTAGTTGGGGTACG-3’。

Sl-Actin2-F：5’-TTGCTGACCGTATGAGCAAG-3’；

Sl-Actin2-R：5’-GGACAATGGATGGACCAGAC-3’。

结果如图1所示，可见与对照组(CM)相比，试验组(flag-SlVQ15-OE)番茄植株中的SlVQ15基因的表达量显著升高。

实施例2、过表达SlVQ15基因番茄对南方根结线虫病抗性鉴定

供试番茄：实施例1中获得的对照组(CM)番茄和经过qRT-PCR鉴定阳性(即SlVQ15过表达株系)的试验组flag-SlVQ15-OE番茄。

1、不同株系接种根结线虫

待试验苗长至“四叶一心”接种根结线虫。将苗盆基质湿润，围绕番茄根部1.5cm处打4个孔，用移液枪将预先计数的南方根结线虫(M.incognita)悬浮液均匀注入4个孔内，每株接种400头南方根结线虫。

2、根结指数的测定

接种7天后取样，对试验苗根部进行鲜重测定，并统计每个植株的根结总数。

按以下公式进行计算根结指数：

根结指数(Gall Index)＝根结数(个)/根系鲜重(克)

结果如图2和图3所示。试验组(flag-SlVQ15-OE番茄)的根结指数显著低于对照组(CM)，表明过表达SlVQ15基因可以显著提高番茄对南方根结线虫的抗性。

综上，本发明鉴定到的SlVQ15基因及其编码的SlVQ15蛋白可以调控植物的根结线虫病抗性(如提高或降低植物对根结线虫病的抗性)，通过提高目的植物中SlVQ15蛋白质的含量和/或活性(如过表达SlVQ15基因)可以显著提高目的植物的根结线虫病抗性。通过降低目的植物中SlVQ15蛋白质的含量和/或活性(如抑制SlVQ15基因的表达)可以显著降低目的植物的根结线虫病抗性。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质的应用，其特征在于，所述应用为下述任一种：

A1)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在调控植物根结线虫病抗性中的应用；

A2)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在制备调控植物根结线虫病抗性的产品中的应用；

A3)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在培育抗根结线虫病植物中的应用；

A4)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在制备培育抗根结线虫病植物的产品中的应用；

A5)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在植物育种或植物种质资源改良中的应用；

所述蛋白质为下述任一种：

B1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；

B2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

B3)在B1)或B2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蛋白质来源于番茄。

3.与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料的应用，其特征在于，所述应用为下述任一种：

C1)与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料在调控植物根结线虫病抗性中的应用；

C2)与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料在制备调控植物根结线虫病抗性的产品中的应用；

C3)与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料在培育抗根结线虫病植物中的应用；

C4)与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料在制备培育抗根结线虫病植物的产品中的应用；

C5)与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料在植物育种或植物种质资源改良中的应用；

所述生物材料为下述任一种：

D1)编码权利要求1或2中所述蛋白质的核酸分子；

D2)含有D1)所述核酸分子的表达盒；

D3)含有D1)所述核酸分子的重组载体、或含有D2)所述表达盒的重组载体；

D4)含有D1)所述核酸分子的重组微生物、或含有D2)所述表达盒的重组微生物、或含有D3)所述重组载体的重组微生物；

D5)含有D1)所述核酸分子的重组宿主细胞、或含有D2)所述表达盒的重组宿主细胞、或含有D3)所述重组载体的重组宿主细胞；

D6)含有D1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有D2)所述表达盒的转基因植物组织；

D7)含有D1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有D2)所述表达盒的转基因植物器官。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，D1)所述核酸分子为下述任一种：

E1)编码序列是SEQ ID No.2的DNA分子；

E2)核苷酸序列是SEQ ID No.2的DNA分子。

5.一种培育抗根结线虫病植物的方法，其特征在于，所述方法包括提高目的植物中权利要求1或2中所述蛋白质的含量和/或活性，得到根结线虫病抗性高于所述目的植物的抗根结线虫病植物。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述提高目的植物中权利要求1或2中所述蛋白质的含量和/或活性为通过提高目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达量实现。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述提高目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达量为通过将权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因导入所述目的植物实现。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述蛋白质的编码基因为下述任一种：

F1)编码序列是SEQ ID No.2的DNA分子；

F2)核苷酸序列是SEQ ID No.2的DNA分子。

9.根据权利要求5-8中任一所述的方法，其特征在于，所述植物为下述任一种：

G1)单子叶植物或双子叶植物；

G2)茄科植物；

G3)茄属植物；

G4)番茄。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述抗根结线虫病植物为抗南方根结线 虫病植物。

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