CN114456247B

CN114456247B - 水稻OsBBR2基因及其编码的蛋白与应用

Info

Publication number: CN114456247B
Application number: CN202210228067.5A
Authority: CN
Inventors: 周永力; 李健敏; 卢家玲; 冯远航; 赵璞
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2022-03-07
Filing date: 2022-03-07
Publication date: 2023-06-13
Anticipated expiration: 2042-03-07
Also published as: CN114456247A

Abstract

本发明公开了水稻OsBBR2基因及其编码的蛋白与应用。该编码的蛋白为如下任一所示蛋白质：(a1)氨基酸序列为SEQ ID No.6的蛋白质；(a2)将SEQ ID No.6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；(a3)与(a1)‑(a2)中任一所限定的氨基酸序列具有80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；(a4)在(a1)‑(a3)中任一所限定的蛋白质的末端连接标签后得到的融合蛋白。水稻OsBBR2基因具有正向调控水稻抗白叶枯病的功能，通过在水稻中转入OsBBR2的基因过表达序列能够显著提高水稻对白叶枯病的抗性。

Description

水稻OsBBR2基因及其编码的蛋白与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及水稻OsBBR2基因及其编码的蛋白与应用。

背景技术

水稻白叶枯病是全球稻作栽培中一种重要的细菌性病害，在我国华南和东南亚稻区危害严重。一般年份可导致水稻减产10％左右，严重时减产50％-60％。利用抗性基因培育抗病品种是目前防治水稻白叶枯病最经济有效的措施迄今，国内外已报道46个水稻白叶枯病抗性基因(http://www.shigen.nig.ac.jp/rice/oryzabase/gene/list)。然而，来源于野生稻的抗病基因难以利用；部分抗性基因仅具有成株期抗性；大多抗性基因的抗谱较窄。水稻白叶枯病菌具有复杂的多样性和高度的变异性，生产实践表明携带单一主效基因的抗病品种大面积推广种植后，潜在的毒性小种上升为优势小种或病菌变异出现新的毒性小种，极易导致品种抗性丧失。

随着分子生物学技术的发展，可以将抗病基因通过杂交或转基因导入感病品种，可以提高改良植物抗病性；也可以通过基因编辑感病基因提高植物抗病性。因此，鉴定水稻白叶枯病抗病或感病基因，对于改良水稻抗性具有重要的意义。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供水稻基因OsBBR2及其编码的蛋白在调控植物抗病性中的应用。

本发明提供了OsBBR2蛋白或其相关生物材料在如下任一中的应用，

(1)调控植物抗病性；

(2)提高植物抗病性的遗传育种；

(3)改良植物种质资源抗病性；

所述OsBBR2蛋白为如下任一所示蛋白质：

(a1)氨基酸序列为SEQ ID No.6的蛋白质；

(a2)将SEQ ID No.6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质，例如本领域技术人员可根据如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列以及氨基酸的保守性替换等本领域常规技术手段，在不影响其活性的前提下，通过取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到与如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列具有相同功能的OsBBR2蛋白突变体；

(a3)与(a1)-(a2)中任一所限定的氨基酸序列具有80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；

(a4)在(a1)-(a3)中任一所限定的蛋白质的末端连接标签后得到的融合蛋白。

可选地，根据上述的应用，所述相关生物材料为所述生物材料为如下任一种：

c1)编码上述OsBBR2蛋白的核酸分子；

c2)含有c1)所述核酸分子的表达盒；

c3)含有c1)所述核酸分子的重组载体、或含有c2)所述表达盒的重组载体；

c4)含有c1)所述核酸分子的重组微生物、或含有c2)所述表达盒的重组微生物、或含有c3)所述重组载体的重组微生物；

c5)含有c1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有c2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

c6)含有c1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有c2)所述表达盒的转基因植物组织；

c7)含有c1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有c2)所述表达盒的转基因植物器官。

可选地，根据上述的应用，

c1)所述核酸分子为如下任一所示的DNA分子：

d1)核苷酸序列是SEQ ID NO.4所示的DNA分子；

d2)编码区序列是序列表中SEQ ID NO.5所示的DNA分子；

d3)与d1)或d2)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性，来源于水稻且编码上述OsBBR2蛋白的DNA分子；

d4)在严格条件下与d1)或d2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述OsBBR2蛋白的DNA分子。

可选地，c3)所述重组载体为具有SEQ ID No.4或SEQ ID No.5所示DNA分子的质粒，例如下述实施例制备的pMDC43-OsBBR2。

本发明还提供了调控LOC_Os03g40194^Hap1蛋白编码基因表达的物质或下述sgRNA的靶序列作为敲除靶点在如下任一中的应用，

(1)调控植物抗病性；

(2)提高植物抗病性的遗传育种；

(3)改良植物种质资源抗病性；

所述LOC_Os03g40194^Hap1蛋白为如下任一所示蛋白质：

(b1)氨基酸序列为SEQ ID No.3的蛋白质；

(b2)将SEQ ID No.3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(b3)与(b1)-(b2)中任一所限定的氨基酸序列具有80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；

(b4)在(b1)-(b3)中任一所限定的蛋白质的末端连接标签后得到的融合蛋白。

可选地，根据上述的应用，所述调控LOC_Os03g40194^Hap1蛋白编码基因表达的物质为敲除LRR结构域编码基因表达的物质；所述物质为如下任一种：

e1)抑制或降低所述LOC_Os03g40194^Hap1蛋白编码基因表达的核酸分子；

e2)含有e1)所述核酸分子的表达盒；

e3)含有e1)所述核酸分子的重组载体、或含有e2)所述表达盒的重组载体；

e4)含有e1)所述核酸分子的重组微生物、或含有e2)所述表达盒的重组微生物、或含有e3)所述重组载体的重组微生物；

e5)含有e1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有e2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

e6)含有e1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有e2)所述表达盒的转基因植物组织；

e7)含有e1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有e2)所述表达盒的转基因植物器官。

可选地，根据上述的应用，所述e1)的核酸分子为利用CRISPR/cas9编辑植物LOC_Os03g40194^Hap1基因的sgRNA或其sgRNA的编码基因。所述sgRNA的靶序列可如SEQ ID No.9和/或SEQ ID No.10所示。所述sgRNA的编码基因可如SEQ ID No.12和/或SEQ IDNo.14所示。

上述sgRNA可与CRISRP/cas9基因编辑工具配合作用，实现水稻LOC_Os03g40194^Hap1基因的高效定点敲除，破坏水稻LOC_Os03g40194^Hap1基因的LRR结构域的生物学功能。

可选地，e2)所述的表达盒为具有SEQ ID No.12和/或SEQ ID No.14所示DNA分子的表达盒，例如所述表达盒序列如SEQ ID No.11和/或SEQ ID No.13所示。

可选地，e3)所述的重组载体为具有SEQ ID No.12和/或SEQ ID No.14所示DNA分子的重组载体，例如下述实施例所制备的CRISPR/Cas9-03g40194。

本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。

本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

本文中，所述90％以上的同一性可为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

所述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃条件下杂交并洗膜。

可选地，根据上述的应用，所述抗病性为植物对白叶枯病的抗性。

上述调控植物抗病性可为提高植物抗病性，例如表现为水稻白枯病的病斑长度缩短。

本发明还提供了抗白叶枯病植物的选育方法，包括提高和/或增加出发植物中上述OsBBR2蛋白的编码基因的表达和/或上述OsBBR2蛋白的含量和/或活性。

OsBBR2蛋白的编码基因可为上述c1)核酸分子。

抗白叶枯病植物的选育方法可为将OsBBR2蛋白的编码基因或包含OsBBR2蛋白的编码基因的载体导入植物。

作为本发明的一种实施方案，所述抗白叶枯病植物的选育方法包括如下步骤：

(1)构建含有如SEQ ID NO.4所示的OsBBR2基因或含有如SEQ ID NO.5所示的OsBBR2基因编码区的表达载体；

(2)将步骤(1)构建的表达载体导入植物中；

(3)经筛选和鉴定获得抗白叶枯病植物。

本发明还提供了创制白叶枯病抗性提高的植物的方法，所述方法为M1、M2或M3。

M1包括抑制或降低出发植物中上述LOC_Os03g40194^Hap1蛋白的编码基因表达，得到白叶枯病抗性提高的植物。

抑制或降低所述LOC_Os03g40194^Hap1蛋白编码基因表达具体可为抑制或降低所述LOC_Os03g40194^Hap1蛋白中LRR结构域编码基因表达。

M1可为将抑制或降低所述LOC_Os03g40194^Hap1蛋白编码基因的物质导入植物，得到白叶枯病抗性提高的植物。抑制或降低所述LOC_Os03g40194^Hap1蛋白编码基因的物质可为上述调控LOC_Os03g40194^Hap1蛋白编码基因表达的物质。

作为本发明的一种实施方案，M1包括将含有表达靶向LOC_Os03g40194编码基因的sgRNA的CRISPR-Cas9系统导入植物，得到白叶枯病抗性提高的植物。

M2包括用序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID No.5所示DNA替换植物基因组DNA中的LOC_Os03g40194^Hap3编码基因中的SEQ ID No.7所示DNA或LOC_Os03g40194^Hap1编码基因中的SEQ ID NO.1或SEQ ID No.2所示DNA，得到白叶枯病抗性提高的植物。

M3包括用“GCTGTGGATGGCTAAATATGG”替换植物基因组DNA中的LOC_Os03g40194^Hap1中的“GCTGTGGATGGCTAATGATATGG”，且用“GGCATAGCAACGTCAGCTGCTGG”替换植物基因组DNA中的LOC_Os03g40194^Hap1中的“GGCATAGCAACGTCAGCATGCTGG”，得到白叶枯病抗性提高的植物。

所述替换可为纯合型替换，即同源染色体中发生相同的替换。

所述植物可为N1)或N2)或N3)或N4)：N1)单子叶植物或双子叶植物；N2)禾本科植物；N3)稻属植物；N4)水稻。

上述OsBBR2蛋白、其生物材料、上述调控LOC_Os03g40194^Hap1蛋白编码基因表达的物质或上述sgRNA的靶序列也属于本发明保护范围。

上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述蛋白质中，所述标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

本文中，所述导入可为通过化学转化法或电击转化法等任何已知的转化方法将携带本发明DNA分子的载体转化宿主菌。导入的DNA分子可以是单拷贝也可以是多拷贝。所述导入可以是将外源基因整合到宿主染色体中，也可以是由质粒在染色体外表达。

本发明实施例克隆了OsBBR2基因，通过转基因过表达表达该基因，显著提高水稻对白叶枯病的抗性。本发明实施例还将LOC_Os03g40194^Hap1编码蛋白的LRR结构域片段敲除，仅保留NB-ARC结构域，显著提高水稻对白叶枯病的抗性。

本发明发现水稻OsBBR2基因具有正向调控水稻抗白叶枯病的功能，通过在水稻中转入OsBBR2的基因过表达序列能够显著提高水稻对白叶枯病的抗性；而通过基因编辑破坏LOC_Os03g40194^Hap1基因LRR结构域的生物学功能也提高水稻对白叶枯病的抗性。OsBBR2基因可用于改良水稻对白叶枯病的抗性，对于培育抗白叶枯病水稻新品种具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例4中OsBBR2基因过表达转基因植株的PCR鉴定结果；其中，M为DNA分子量标准(DL2000+DNA marker)，CK为阴性对照，V为阳性对照，OE-1-5为OsBBR2过表达转基因植株。

图2为本发明实施例4中OsBBR2基因过表达转基因植株的表达量分型结果。

图3为本发明实施例4中LOC_Os03g40194^Hap1基因编辑株系KO的测序峰图。

图4为本发明实施例4中LOC_Os03g40194^Hap1基因编辑株系KO与日本晴的氨基酸序列比较。

图5为本发明实施例5中IRIS_313-11878(CK)和OsBBR2基因过表达转基因株系的病斑长度。

图6为本发明实施例5中日本晴和LOC_Os03g40194^Hap1基因编辑株系的病斑长度。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5’末端核苷酸，末位均为相应DNA的3’末端核苷酸。

载体pGWC：来自BioVector NTCC典型培养物保藏中心。

载体pMDC43：来自BioVector NTCC典型培养物保藏中心。

根癌农杆菌EHA105：来自BioVector NTCC典型培养物保藏中心。

pYLsgRNA-OsU6a载体(Ma X,Zhang Q,Zhu Q.et al.ARobust CRISPR/Cas9System for Convenient,High-Efficiency Multiplex Genome Editing in MonocotandDicot Plants,Mol Plant.2015,8(8):1274-1284)经华南农业大学刘耀光老师同意后公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

pYLsgRNA-OsU6b载体(Ma X,Zhang Q,Zhu Q.et al.A Robust CRISPR/Cas9System for Convenient,High-Efficiency Multiplex Genome Editing in MonocotandDicot Plants,Mol Plant.2015,8(8):1274-1284)经华南农业大学刘耀光老师同意后公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体(Ma X,Zhang Q,Zhu Q.et al.A Robust CRISPR/Cas9 System for Convenient,High-Efficiency Multiplex Genome Editing inMonocotand Dicot Plants,Mol Plant.2015,8(8):1274-1284)经华南农业大学刘耀光老师同意后公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

白叶枯病菌菌株OS198，记载在“方中达，许志刚，过崇俭，殷尚智，伍尚忠，徐羡明，章琦.中国水稻白叶枯病菌致病型的研究.植物病理学报，1990,20(2):81-88”一文中，公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。

水稻品种日本晴、IRIS_313-11878、IRIS_313-11057(Wang W,Mauleon R,Hu Z,etal.Genomic variationin 3010diverse accessions of Asian cultivated rice,Nature,2018,557(7703):43-49.)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

LOC_Os03g40194在3K种质资源中主要存在3种编码蛋白长度不同的单倍型，分别为LOC_Os03g40194^Hap1、LOC_Os03g40194^Hap2和LOC_Os03g40194^Hap3。LOC_Os03g40194^Hap1序列如SEQ ID No.1所示，编码区序列如SEQ ID No.2所示，编码的蛋白序列如SEQ ID No.3所示，具有NB-ARC和LRR结构域。SEQ ID No.2中，第286-1044位编码NB-ARC结构域，第1498-1566位编码LRR结构域。LOC_Os03g40194^Hap2序列如SEQ ID No.4所示，编码区序列如SEQ IDNo.5所示，编码的蛋白序列如SEQ ID No.6所示，仅具有NB-ARC结构域。LOC_Os03g40194^Hap3编码区序列如SEQ ID No.7所示，编码的蛋白序列如SEQ ID No.8所示，不具有任何功能结构域。将LOC_Os03g40194^Hap2命名为OsBBR2。

实施例1、水稻LOC_Os03g40194基因的克隆

1.水稻LOC_Os03g40194基因的编码区序列的获得

提取水稻品种日本晴、IRIS_313-11057和IRIS_313-11878的叶片总RNA，采用FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix(Code:KR118，TIANGEN)合成cDNA，以此cDNA为模板，利用引物OsBBR2-CDS-F：5’-ATGACACTAAGATTTTCAAT-3’(SEQ ID No.15)和OsBBR2-CDS-R：5’-CTAATCTAACCTGCACGATGGAC-3’(SEQ ID No.16)，采用PrimeSTAR GXL DNAPolymerase(Code：R050A，Takara)进行PCR扩增，得到扩增产物(即LOC_Os03g40194基因的编码区)。LOC_Os03g40194基因在Hap1代表品种日本晴的编码区序列如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，序列分析发现其含有1个NB-ARC结构域和LRR结构域，其中SEQ ID NO.2第286-1044位编码NB-ARC结构域，第1498-1566位编码LRR结构域；在Hap2代表品种IRIS_313-11057中的编码区序列如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，序列分析发现其只含有1个NB-ARC结构域；在Hap3代表品种IRIS_313-11878中的编码区序列如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列，编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，序列分析发现其不包含NB-ARC结构域和LRR结构域。

实施例2、水稻抗病基因OsBBR2代表品种表达载体和基因编辑载体的构建

1.OsBBR2基因表达载体的构建

将IRIS_313-11057中OsBBR2基因的CDS序列通过Gateway系统构建到表达载体pMDC43上，得到含有OsBBR2基因的表达载体pMDC43-OsBBR2。操作步骤如下：

(1)提取水稻品种IRIS_313-11057的总RNA，反转录得到cDNA，以该cDNA为模板，利用正向引物OsBBR2-CDS-F：5’-ATGACACTAAGATTTTCAAT-3’和反向引物OsBBR2-CDS-R2：5’-TCAGATCTCTTTTCCAGCAGCTGACG-3’(SEQ ID No.17)，进行PCR扩增，得到扩增产物(即OsBBR2的CDS序列，SEQ ID NO.5)，并进行切胶回收。

(2)将步骤(1)得到的切胶回收产物进行加A处理，具体步骤为：将20μL回收产物和20μL PCR SuperMix(Code：AS111-11，TRANSGEN BIOTECH)进行混合，进行PCR反应。反应程序：95℃5min，72℃20min，4℃保存。随后对PCR产物用普通DNA产物纯化试剂盒(Code：DP204-02，TIANGEN)纯化回收。

(3)将步骤(2)得到的回收产物与入门载体pGWC经Eam105酶切得到的载体骨架进行TA克隆连接，得到含有SEQ ID NO.5所示的DNA片段的序列正确的重组载体命名为阳性入门克隆质粒pGWC-OsBBR2。

(4)步骤(3)得到的阳性入门克隆质粒pGWC-OsBBR2，与目的载体pMDC43进行LR反应，得到含有SEQ ID NO.5所示的DNA片段的序列正确的重组载体命名pMDC43-OsBBR2。

LR反应体系：pGWC-OsBBR2 1μL(50-100ng)，载体pMDC43 1μL(50-100ng)，LRenzymemix 0.5μL。

LR反应条件：25℃孵育6h，反应体系转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，得到正确的含有OsBBR2基因的表达载体pMDC43-OsBBR2。pMDC43-OsBBR2含有序列表中SEQ ID NO.5所示的OsBBR2基因CDS序列以及35S启动子，能表达SEQ ID NO.6所示的OsBBR2蛋白质与GFP的融合蛋白质，该蛋白质的表达由35S启动子驱动。

2.LOC_Os03g40194^Hap1基因LRR结构域敲除载体的构建

构建利用CRISPR/Cas9方法编辑LOC_Os03g40194^Hap1基因的重组载体，所用靶序列为靶序列1和靶序列2。

靶序列1：GCTGTGGATGGCTAATGATA(序列表中SEQ ID NO.1的第2227-2246位，即SEQID NO.9)；将CRISPR/Cas9方法中靶向靶序列1的sgRNA记为sgRNA1；

靶序列2：GGCATAGCAACGTCAGCTGC(序列表中SEQ ID NO.1的第2375-2394位，即SEQID NO.10)；将CRISPR/Cas9方法中靶向靶序列2的sgRNA记为sgRNA2。

sgRNA表达盒构建：

以pYLsgRNA-OsU6a载体为模板，使用引物U-F(5’-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3’(SEQ ID No.18))和U6a-03g40194-R(5’-TATCATTAGCCATCCACAGCGGCAGCCAAGCCAGCA-3’(SEQ ID No.19))进行PCR扩增，将序列正确的DNA片段命名为U6a-03g40194；以pYLsgRNA-OsU6a载体为模板，使用引物gR-03g40194-1F(5’-CTGTGGATGGCTAATGATAGTTTTAGAGCTAGAAAT-3’(SEQ IDNo.20))和gR-R(5’-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3’(SEQ ID No.21))进行PCR扩增，将序列正确的DNA片段命名为sgRNA-03g40194-1。采用overlapping PCR方法将U6a-03g40194和sgRNA-03g40194-1连在一起，随后用Pps-GGL(5’-TTCAGAGGTCTCTCTCGACTAGTATGGAATCGGCAGCAAAGG-3’(SEQ ID No.22))和Pgs-GG2(5’-AGCGTGGGTCTCGTCAGGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3’(SEQ ID No.23))进行PCR扩增加上infusion接头，将得到的序列正确的DNA片段命名为U6a-sgRNA-03g40194，U6a-sgRNA-03g40194即为sgRNA1表达盒。U6a-sgRNA-03g40194的序列为序列表中SEQ ID NO.11，SEQ ID NO.11的第44-490位为U6a启动子，第491-593位为sgRNA1的编码序列。U6a-sgRNA-OsBBR2能编码sgRNA1，sgRNA1的编码序列为序列表中SEQ ID NO.12。

以pYLsgRNA-OsU6b载体为模板，使用引物U-F(5’-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3’)和U6b-03g40194-R(5’-GCAGCTGACGTTGCTATGCCAACACAAGCGGCAGC-3’(SEQ IDNo.24))进行PCR扩增，将序列正确的DNA片段命名为U6b-03g40194；以pYLsgRNA-OsU6b载体为模板，使用引物gR-03g40194-2F(5’-GCATAGCAACGTCAGCTGCGTTTTAGAGCTAGAAAT-3’(SEQ ID No.25))和gR-R(5’-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3’)进行PCR扩增，将序列正确的DNA片段命名为sgRNA-03g40194-2。采用overlapping PCR方法将U6b-03g40194和sgRNA-03g40194-2连在一起，随后用Pps-GG2(5’-TTCAGAGGTCTCTCTGACACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3’(SEQ ID No.26))和Pgs-GGR(5’-AGCGTGGGTCTCGACCGACGCGTATCCATCCACTCCAAGCTC-3’(SEQ ID No.27))扩增加上infusion接头，将得到的序列正确的DNA片段命名为U6b-sgRNA-03g40194，U6b-sgRNA-03g40194即为sgRNA2表达盒。U6b-sgRNA-03g40194的序列为序列表中SEQ ID NO.13，SEQID NO.13的第40-372位为U6b启动子，第373-474位为sgRNA2的编码序列。U6b-sgRNA-03g40194能编码sgRNA2，sgRNA2的编码序列为序列表中SEQ ID NO.14。

重组载体的构建：

将上述U6a-sgRNA-03g40194和U6b-sgRNA-03g40194分别与pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体经BsaI酶切得到的载体骨架进行同源重组连接反应，得到OsBBR2基因敲除载体CRISPR/Cas9-03g40194。

同源重组反应体系：U6a-sgRNA-03g40194(10-15ng)、U6b-sgRNA-03g40194(10-15ng)，已被BsaI酶切的pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体(60-80ng)，10×CutSmart Buffer 1.5μL，10mM ATP1.5μL，BsaI-HF 10U，T4 DNA ligase 35U，加ddH₂O补充至15μL。

酶切-连接反应体程序：37℃10min，10℃5min，20℃5min，进行3个循环；37℃3min，10℃5min，20℃5min，进行10个循环。反应体系转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，将得到的序列正确的重组载体命名为CRISPR/Cas9-03g40194，CRISPR/Cas9-03g40194含有sgRNA1表达盒和sgRNA2表达盒，能表达sgRNA1和sgRNA2以及Cas9。

实施例3、转基因水稻的获得

分别利用实施例2的pMDC43-OsBBR2与CRISPR/Cas9-03g40194制备转基因水稻。分别利用IRIS_313-11878、日本晴作为出发植物制备转基因水稻，其中水稻品种IRIS_313-11878和日本晴对中国白叶枯病菌株OS198表现感病。具体步骤如下：

(1)取出植物的成熟种子，去壳，挑取饱满光洁无菌斑的种子进行消毒。

(2)将消毒后的种子接种到诱导培养基上，28℃、暗培养14天左右，选取外观良好，生长力好的愈伤组织。

(3)取实施例2中构建的重组载体导入根癌农杆菌EHA105，得到重组菌。

(4)取步骤(3)得到的重组菌，用侵染培养基重悬菌体，得到菌悬液。

(5)将步骤(2)的IRIS_313-11878愈伤组织浸泡于步骤(4)制备的EHA105/pMDC43-OsBBR2菌悬液中，将步骤(2)的日本晴愈伤组织浸泡于步骤(4)制备的EHA105/CRISPR/Cas9-03g40194菌悬液中，侵染20min。侵染后将菌悬液倒掉，取愈伤组织，用无菌滤纸吸干水分，然后置于共培养培养基上，培养28℃暗培养50-55h。

(6)完成步骤(5)后，挑选表面没有明显农杆菌的愈伤组织移至抑菌培养基中，28℃暗培养3-4天。

(7)完成步骤(6)后，将愈伤组织移至筛选培养基上28℃暗培养培养30天，每10天继代一次。

(8)完成步骤(7)后，取新鲜潮霉素抗性的愈伤组织，接于预再生培养基中，28℃暗培养7天，然后置于光照培养间(12h光照/12h黑暗)继续培养7天后转入再生培养基上，继续光照培养，直至生长出再生植株，得到转基因植株。

将利用重组载体pMDC43-OsBBR2得到的转基因植株记为OsBBR2转基因植株。

按照上述方法，将IRIS_313-11878替换为日本晴，将pMDC43-OsBBR2替换为CRISPR/Cas9-03g40194，其他步骤均不变，得到转基因植株。将利用重组载体CRISPR/Cas9-03g40194得到的转基因植株记为03g40194基因LRR结构域敲除植株。

遗传转化所用培养基及配方：

诱导培养基：CaCl₂·2H₂O 440mg，KH₂PO₄ 170mg，MgSO₄·7H₂O 370mg，NH₄NO₃1650mg，KNO₃ 1900mg，KI 0.83mg，CoCl₂·6H₂O 0.025mg，H₃BO₃ 6.2mg，Na₂MoO₄·2H₂O0.25mg，MnSO₄·4H₂O 22.3mg，CuSO₄·5H₂O 0.025mg，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg，Na₂-EDTA·2H₂O37.3mg，FeSO₄·7H₂O 27.8mg，VB1 0.1mg，VB6 0.5mg，烟酸0.5mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，2，4-D 2mg，水解酪蛋白2g，麦芽糖30g，琼脂3g，去离子水加至1L。

侵染培养基：配制方法参见参考文献：Hiei Y,Ohta S,Komari T,etal.Efficient transformation of rice(Oryza sativa,L.)mediated byAgrobacterium,and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA[J].PlantJournal,1994,6(2):271-282.。将参考文献中乙酰丁香酮的浓度替换为200μM。

共培养培养基：在诱导培养基中加入乙酰丁香酮和葡萄糖，使乙酰丁香酮在培养基中的终浓度为200μM，葡萄糖在培养基中的终浓度为10g/L。

抑菌培养基：在诱导培养基中加入头孢霉素，使头孢霉素在培养基中的终浓度为500mg/L。

筛选培养基：在诱导培养基中加入潮霉素和头孢霉素，使潮霉素在培养基中的终浓度为65mg/L，头孢霉素在培养基中的终浓度为500mg/L。

预再生培养基：CaCl₂·2H₂O 440mg，KH₂PO₄ 170mg，MgSO₄·7H₂O 370mg，NH₄NO₃1650mg，KNO₃ 1900mg，KI 0.83mg，CoCl₂·6H₂O 0.025mg，H₃BO₃ 6.2mg，Na₂MoO₄·2H₂O0.25mg，MnSO₄·4H₂O 22.3mg，CuSO₄·5H₂O 0.025mg，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg，Na₂-EDTA·2H₂O37.3mg，FeSO₄·7H₂O 27.8mg，VB1 0.1mg，VB6 0.5mg，烟酸0.5mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，水解酪蛋白2g，麦芽糖30g，琼脂3g，激动素2mg，萘乙酸1mg，去离子水加至1L；倒平板之前加入潮霉素并使其浓度为50mg/L。

再生培养基：CaCl₂·2H₂O 440mg，KH₂PO₄ 170mg，MgSO₄·7H₂O 370mg，NH₄NO₃1650mg，KNO₃ 1900mg，KI 0.83mg，CoCl₂·6H₂O 0.025mg，H₃BO₃ 6.2mg，Na₂MoO₄·2H₂O0.25mg，MnSO₄·4H₂O 22.3mg，CuSO₄·5H₂O 0.025mg，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg，Na₂-EDTA·2H₂O37.3mg，FeSO₄·7H₂O 27.8mg，VB1 0.1mg，VB6 0.5mg，烟酸0.5mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，水解酪蛋白2g，麦芽糖30g，琼脂6g，激动素2mg，萘乙酸1mg，去离子水加至1L；倒平板之前加入潮霉素并使其浓度为50mg/L。

实施例4、转基因水稻的鉴定

1、阳性OsBBR2过表达转基因植株的筛选与鉴定

待测植株：IRIS_313-11878(CK)以及实施例3得到的OsBBR2过表达转基因植株。

提取待测植株基因组DNA，以基因组DNA为模板，利用pMDC43-TF(5’-AGACAACCATTACCTGTCC-3’(SEQ ID No.28))和OsBBR2-R3(5’-TGCATCAAATTGGCGAGATA-3’(SEQ ID No.29))组成的引物对进行PCR扩增，用pMDC43-OsBBR2质粒作为阳性对照，用受体品种IRIS_313-11878作为阴性对照。

将PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，阳性对照(V)和阳性OsBBR2过表达转基因植株均显示492bp的条带，阴性对照(CK)不能扩增出任何条带。部分样品的电泳图见图1。选取五株阳性OsBBR2过表达转基因植株分别记为OE-1、OE-2、OE-3、OE-4、OE-5。

2、过表达转基因水稻在RNA水平上的鉴定

提取阳性OsBBR2过表达转基因植株(OE-1、OE-2、OE-3、OE-4、OE-5)以及野生型IRIS_313-11878的总RNA，并进行反转录，采用qRT-PCR检测OsBBR2基因在RNA水平上的表达情况，所用引物F：5’-GATCACCGGCCAACTTAATG-3’(SEQ ID No.32)和R：5’-CTTGAGGCCTTCATGCTTGT-3’(SEQ ID No.33)。采用引物Actin-F：5’-GACTCTGGTGATGGTGTCAGC-3’(SEQ ID No.34)和引物Actin-R：5’-GGCTGGAAGAGGACCTCAGG-3’(SEQ ID No.35)检测内参基因。

结果如图2所示，OE-1、OE-2、OE-3、OE-4、OE-5中OsBBR2基因的表达量相对于野生型IRIS_313-11878(CK)均显著上调，表达量为野生型的3倍以上。

3、LOC_Os03g40194^Hap1基因LRR结构域敲除植株的鉴定

待测植株：受体品种日本晴(Nip)以及实施例3得到的LOC_Os03g40194^Hap1基因LRR结构域敲除植株。

提取待测植株的基因组DNA，以基因组DNA为模板，以OsBBR2-TF(5’-GCTCATCCAGGTTGGTCAAT-3’(SEQ ID No.30))和OsBBR2-TR(5’-CCTCTGGAAGCGACGTTATC-3’(SEQ ID No.31))为引物进行PCR扩增，以受体品种日本晴作为阴性对照。

将得到的PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，阴性对照显示782bp的条带。

将PCR扩增产物进行测序，将LOC_Os03g40194^Hap1基因LRR结构域敲除植株的PCR扩增产物序列与阴性对照进行比对，敲除株系KO(即阳性LOC_Os03g40194^Hap1基因LRR结构域敲除植株)在序列表中SEQ ID No.1的第2242位缺失核苷酸T、第2243位缺失核苷酸G、第2391至2392位间插入核苷酸A，LOC_Os03g40194^Hap1基因其他序列不变。敲除株系的测序峰图如图3所示，序列变化情况如图4所示。敲除株系KO是将受体品种日本晴LOC_Os03g40194^Hap1基因中的LRR结构域编码区敲除，仅保留NB-ARC结构域编码区获得的。

实施例5、转基因株系的抗白叶枯病鉴定

待测植株为：IRIS_313-11878，阳性OsBBR2过表达转基因植株OE-1、OE-2、OE-3、OE-4、OE-5，日本晴，阳性LOC_Os03g40194^Hap1基因LRR结构域敲除植株KO。

1、将各待测植株在温室中培养约25天后移栽至网室中进行种植，单株种植，每种植株种植20株。

2、在步骤1水稻植株的分蘖盛期，用中国白叶枯病菌菌株OS198进行接种，采用剪叶法对水稻植株进行人工接种，每株接种5张叶片(菌液浓度为1×10⁹cfu/mL)，每个叶片的接种量均相等，均为40μL。

3、接菌约14天后测量各植株叶片的病斑长度，每个叶片沿叶脉有一个病斑，每个植株测量3张接种叶片的病斑长度，计算平均值。

统计结果如图5和图6所示。IRIS_313-11878(CK)的病斑长度为11.2cm，阳性OsBBR2过表达转基因植株OE-1、OE-2、OE-3、OE-4、OE-5植株的病斑长度分别为4.8cm、4.6cm、5.8cm、6.1cm、5.7cm，均显著短于IRIS_313-11878的病斑长度，表明OsBBR2基因能够提高水稻对白叶枯病的抗病性。CRISPR/Cas9敲除载体的受体植物日本晴(Nip)的病斑长度为5.8cm，阳性LOC_Os03g40194^Hap1基因LRR结构域敲除植株KO的病斑长度为4.2cm，显著短于日本晴的病斑长度，表明敲除LOC_Os03g40194^Hap1基因LRR结构域编码区能够提高水稻对白叶枯病的抗病性。

以上结果表明，OsBBR2基因能正向调控水稻对白叶枯病的抗性。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 水稻OsBBR2基因及其编码的蛋白与应用

<160> 35

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3865

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aaagtagtaa caagacatag ttatcctttc tatgttaata tccatgctat ctatgtaaat 60

gctagatttt ttatttttat aatactcata aagttttctg atactccaag taaatataca 120

cactagaaaa tattgctttt tataatatta tttttcttat tttcagagag ttattttgat 180

actaaaataa taaaaaaaac atgtttcttt ccttaatata gtgtagtaat agataccatt 240

ttccttaata attaagatag atataaatga actttaccac ccatgagaaa gcaacattaa 300

cactcggata aatagaaaca atatgacaaa tttggtatac cattaaaaag tagcaattgc 360

gatcttactg ctactttaaa ctccaatggt gattccacca ctactttttc taactttgtg 420

attttgccgt ctctgttttt ttaactaatg cttgagcttt atccccattt tgttgtctcc 480

tcttaacaat gtccaaaatc atataaaaac aggggcaaaa ttcatttgaa gattgtgttt 540

gccctcatct tttcaaatcg aatatgtgaa aattcaagtg aaaaccgggc aaaaattcat 600

gtcaaaatgc ttgatgtcaa accaagggca aaatcacaaa aatattaaga aaagtatgtg 660

caaatctgca agagcatacg ttcctttgac accgttaaga tgacacggaa tgggggcaag 720

cacaagcttc agttcaaaaa aatgagggca aaatcacaaa gttagaaaag caggggtaaa 780

atcatcattt gagttgaaaa taagggggat aatgcagttg cctctctata aaaacctttt 840

ttttcttcta atttatcttt gaactgacgt gctctctatc ttcaaatata cctaaagaac 900

atatcatggt tttatgagtt tgttgccatt tttttaatat ttattcatgg accgatgtgc 960

ttttgatatt aaaatatgcc taacttgtga caagtgacaa gtctacgata atatgtcaag 1020

ctagagtttt ttttttgtac tcaatgatgt ctaatttggc taacggtcat cgttggcagg 1080

acagaacaac aaagatatga cactaagatt ttcaatggct gagttgaggt tactcacctt 1140

caaagttgag catctactgg aggagttgag atgggaggct cagcacaaca aggctttggt 1200

tgacgggcac aggaacagga tgatgcgcaa catgtatatt ccattagttc ttcctcgaag 1260

catgaagagg aagcttaaaa tgatcaccgg ccaacttaat gcactaggtg cagagatcaa 1320

tggcttcatc aaccacgtgc cattggtaat gcaaaataat attgtgggaa gggtgcatga 1380

gaagcaagag ataaagcaaa aactattctg tctggacaga tacaagcatg aaggcctcaa 1440

ggtcctatgt gtagttggca ttgaaggagt gggaaaaact gccttggttc aattaatctt 1500

tgatgaagtc aatgtgaagg aatatttctc attgtgcata tgggtgaatg tatctcgcca 1560

atttgatgca atgagaatca caaaacggat tattgaggtt gcaacctgtg agccattgga 1620

gacacaaatg gatcacaagg aagagaagga gttgcaatcc tacctccaga acattttaca 1680

tgaaagaagg tttttgctcg tcttagatga tgtttgtgat gagaacacca atggctggga 1740

agaactcaga acctcactgg catctggagc atcagggagc acggtcattg tgacgacccg 1800

tgaactttgt gttgcaagaa ccttagaagc acctgcatct ggcatcattg agctgggacc 1860

aatgagtgat gatgagatat ggtccataat gaggcagcga atgttatgtg gcctagatga 1920

caaacccgag ctcatccagg ttggtcaatc cctcgtgcaa aagtgtcatg gaattcctct 1980

agctgctgta acactcgggg atttgctgag aaagaaggga acctctaatg aatggtctag 2040

tgtcatagaa gctgccaatg aatggttggc tcttgcagaa agcgatatgc tgaccacgac 2100

ggcaggtgta gcctcggtcg cacttcagat gagctatgag cacttgcaac cagacaccaa 2160

gaggtgcttt gcattctgtg ctttatttcc tgaagctttt gaagtggatg gtgatatgct 2220

gatccagctg tggatggcta atgatatggt atggtacgat actgaaggta tgggggcttg 2280

gatgttagat aggctacagt caagatcatt tcttcaagat gtcagtcaac cttacaatgg 2340

agtaacaatc tataagatgc accctcttgt tcatggcata gcaacgtcag ctgctggaaa 2400

agagatccga atcctacatc aaggccacca acttacagaa gtgatgccag agctccatca 2460

cttgtcagtg gttggttcag ggttagatgt tgatatgatt ctacccaatg catggggtat 2520

ccacacactg ttgtcacaag gagaaggatg tcgaataagt gtgtctaatc ctgatttttg 2580

gaaatccaac tccttgagag cgttagacct gcatggtctc ttgtccgcca gtgttccatt 2640

tagttgccaa gatatgaagc atctcaggta ccttgatctg tcaagaagtt ggataacgtc 2700

gcttccagag gactttttca tgatctataa cctgcaaact ctgaggctct ccgattgttt 2760

ttacctaaag caacttccag aaaacatgag gtttatggag aatttaaggc acatttatat 2820

cgatggctgc ttccgattag aaaacatgcc gtcaaatatg ggacaattgc agaaccttca 2880

aacactgaca acttacatag tgggcaatgg tgatgggtat ggaattgaag agatcaagag 2940

catggatctc ggtgggcggc ttgaaatata taatctgaag aacgtgaggg acaaatcaaa 3000

agccgaggcc gcaaatttat ctctaaaaac aagaatgtcc aatatgttgt tgtgttgggg 3060

tatgtttagg aatgacgagg taaatgcata caatgccgag gaagtgatgg aggctcttag 3120

aacccctatg tgtgtacaga cactcaaggt ttggcgatac cctggtagca tacttccaat 3180

ttggtggcca ggtcaaactc ttgctaatct ggttaaacta accatcaaag attgcgcaag 3240

atgtaagagg cttcctcctg tgcagtattt tccatcactt gaggtcctac atcttgaagg 3300

aatggacagt ctcacacttt tttgcgacaa tgtatcgatg gacaacattg aggtcagcta 3360

ttatcgattc ttctggaggt tgaagagtct tatcctgtgt gatatgccaa gcttggaaaa 3420

gtggcaagaa gatgaggtga tagaagtatt cacaattcca gtgcttgaag aaatgaaatt 3480

gatcaactgt ccaaagttgg tgacaattcc aaatgttcct atgctcagat gttttattgt 3540

agaagggcaa aacaaacaac agttatattc tctggcacca tcgtcgtcca aaagtaaagg 3600

tccatcgtgc aggttagatt agccttaggc tcccattttg taagaaaagt aagtacacta 3660

tccaaagtag catttggaga aactatttta cgttggggtc atgtatactg taattagaac 3720

tactttctta gctggacact gtgaagaagc ccaataagat tggatctttc ttacaatact 3780

aagagaattt ttttttatct aagtgcaaat gcattgacat ggataaatag aggaaatttc 3840

gaagtcagaa agaaatgact gaaga 3865

<210> 2

<211> 2526

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgacactaa gattttcaat ggctgagttg aggttactca ccttcaaagt tgagcatcta 60

ctggaggagt tgagatggga ggctcagcac aacaaggctt tggttgacgg gcacaggaac 120

aggatgatgc gcaacatgta tattccatta gttcttcctc gaagcatgaa gaggaagctt 180

aaaatgatca ccggccaact taatgcacta ggtgcagaga tcaatggctt catcaaccac 240

gtgccattgg taatgcaaaa taatattgtg ggaagggtgc atgagaagca agagataaag 300

caaaaactat tctgtctgga cagatacaag catgaaggcc tcaaggtcct atgtgtagtt 360

ggcattgaag gagtgggaaa aactgccttg gttcaattaa tctttgatga agtcaatgtg 420

aaggaatatt tctcattgtg catatgggtg aatgtatctc gccaatttga tgcaatgaga 480

atcacaaaac ggattattga ggttgcaacc tgtgagccat tggagacaca aatggatcac 540

aaggaagaga aggagttgca atcctacctc cagaacattt tacatgaaag aaggtttttg 600

ctcgtcttag atgatgtttg tgatgagaac accaatggct gggaagaact cagaacctca 660

ctggcatctg gagcatcagg gagcacggtc attgtgacga cccgtgaact ttgtgttgca 720

agaaccttag aagcacctgc atctggcatc attgagctgg gaccaatgag tgatgatgag 780

atatggtcca taatgaggca gcgaatgtta tgtggcctag atgacaaacc cgagctcatc 840

caggttggtc aatccctcgt gcaaaagtgt catggaattc ctctagctgc tgtaacactc 900

ggggatttgc tgagaaagaa gggaacctct aatgaatggt ctagtgtcat agaagctgcc 960

aatgaatggt tggctcttgc agaaagcgat atgctgacca cgacggcagg tgtagcctcg 1020

gtcgcacttc agatgagcta tgagcacttg caaccagaca ccaagaggtg ctttgcattc 1080

tgtgctttat ttcctgaagc ttttgaagtg gatggtgata tgctgatcca gctgtggatg 1140

gctaatgata tggtatggta cgatactgaa ggtatggggg cttggatgtt agataggcta 1200

cagtcaagat catttcttca agatgtcagt caaccttaca atggagtaac aatctataag 1260

atgcaccctc ttgttcatgg catagcaacg tcagctgctg gaaaagagat ccgaatccta 1320

catcaaggcc accaacttac agaagtgatg ccagagctcc atcacttgtc agtggttggt 1380

tcagggttag atgttgatat gattctaccc aatgcatggg gtatccacac actgttgtca 1440

caaggagaag gatgtcgaat aagtgtgtct aatcctgatt tttggaaatc caactccttg 1500

agagcgttag acctgcatgg tctcttgtcc gccagtgttc catttagttg ccaagatatg 1560

aagcatctca ggtaccttga tctgtcaaga agttggataa cgtcgcttcc agaggacttt 1620

ttcatgatct ataacctgca aactctgagg ctctccgatt gtttttacct aaagcaactt 1680

ccagaaaaca tgaggtttat ggagaattta aggcacattt atatcgatgg ctgcttccga 1740

ttagaaaaca tgccgtcaaa tatgggacaa ttgcagaacc ttcaaacact gacaacttac 1800

atagtgggca atggtgatgg gtatggaatt gaagagatca agagcatgga tctcggtggg 1860

cggcttgaaa tatataatct gaagaacgtg agggacaaat caaaagccga ggccgcaaat 1920

ttatctctaa aaacaagaat gtccaatatg ttgttgtgtt ggggtatgtt taggaatgac 1980

gaggtaaatg catacaatgc cgaggaagtg atggaggctc ttagaacccc tatgtgtgta 2040

cagacactca aggtttggcg ataccctggt agcatacttc caatttggtg gccaggtcaa 2100

actcttgcta atctggttaa actaaccatc aaagattgcg caagatgtaa gaggcttcct 2160

cctgtgcagt attttccatc acttgaggtc ctacatcttg aaggaatgga cagtctcaca 2220

cttttttgcg acaatgtatc gatggacaac attgaggtca gctattatcg attcttctgg 2280

aggttgaaga gtcttatcct gtgtgatatg ccaagcttgg aaaagtggca agaagatgag 2340

gtgatagaag tattcacaat tccagtgctt gaagaaatga aattgatcaa ctgtccaaag 2400

ttggtgacaa ttccaaatgt tcctatgctc agatgtttta ttgtagaagg gcaaaacaaa 2460

caacagttat attctctggc accatcgtcg tccaaaagta aaggtccatc gtgcaggtta 2520

gattag 2526

<210> 3

<211> 841

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Thr Leu Arg Phe Ser Met Ala Glu Leu Arg Leu Leu Thr Phe Lys

1 5 10 15

Val Glu His Leu Leu Glu Glu Leu Arg Trp Glu Ala Gln His Asn Lys

20 25 30

Ala Leu Val Asp Gly His Arg Asn Arg Met Met Arg Asn Met Tyr Ile

35 40 45

Pro Leu Val Leu Pro Arg Ser Met Lys Arg Lys Leu Lys Met Ile Thr

50 55 60

Gly Gln Leu Asn Ala Leu Gly Ala Glu Ile Asn Gly Phe Ile Asn His

65 70 75 80

Val Pro Leu Val Met Gln Asn Asn Ile Val Gly Arg Val His Glu Lys

85 90 95

Gln Glu Ile Lys Gln Lys Leu Phe Cys Leu Asp Arg Tyr Lys His Glu

100 105 110

Gly Leu Lys Val Leu Cys Val Val Gly Ile Glu Gly Val Gly Lys Thr

115 120 125

Ala Leu Val Gln Leu Ile Phe Asp Glu Val Asn Val Lys Glu Tyr Phe

130 135 140

Ser Leu Cys Ile Trp Val Asn Val Ser Arg Gln Phe Asp Ala Met Arg

145 150 155 160

Ile Thr Lys Arg Ile Ile Glu Val Ala Thr Cys Glu Pro Leu Glu Thr

165 170 175

Gln Met Asp His Lys Glu Glu Lys Glu Leu Gln Ser Tyr Leu Gln Asn

180 185 190

Ile Leu His Glu Arg Arg Phe Leu Leu Val Leu Asp Asp Val Cys Asp

195 200 205

Glu Asn Thr Asn Gly Trp Glu Glu Leu Arg Thr Ser Leu Ala Ser Gly

210 215 220

Ala Ser Gly Ser Thr Val Ile Val Thr Thr Arg Glu Leu Cys Val Ala

225 230 235 240

Arg Thr Leu Glu Ala Pro Ala Ser Gly Ile Ile Glu Leu Gly Pro Met

245 250 255

Ser Asp Asp Glu Ile Trp Ser Ile Met Arg Gln Arg Met Leu Cys Gly

260 265 270

Leu Asp Asp Lys Pro Glu Leu Ile Gln Val Gly Gln Ser Leu Val Gln

275 280 285

Lys Cys His Gly Ile Pro Leu Ala Ala Val Thr Leu Gly Asp Leu Leu

290 295 300

Arg Lys Lys Gly Thr Ser Asn Glu Trp Ser Ser Val Ile Glu Ala Ala

305 310 315 320

Asn Glu Trp Leu Ala Leu Ala Glu Ser Asp Met Leu Thr Thr Thr Ala

325 330 335

Gly Val Ala Ser Val Ala Leu Gln Met Ser Tyr Glu His Leu Gln Pro

340 345 350

Asp Thr Lys Arg Cys Phe Ala Phe Cys Ala Leu Phe Pro Glu Ala Phe

355 360 365

Glu Val Asp Gly Asp Met Leu Ile Gln Leu Trp Met Ala Asn Asp Met

370 375 380

Val Trp Tyr Asp Thr Glu Gly Met Gly Ala Trp Met Leu Asp Arg Leu

385 390 395 400

Gln Ser Arg Ser Phe Leu Gln Asp Val Ser Gln Pro Tyr Asn Gly Val

405 410 415

Thr Ile Tyr Lys Met His Pro Leu Val His Gly Ile Ala Thr Ser Ala

420 425 430

Ala Gly Lys Glu Ile Arg Ile Leu His Gln Gly His Gln Leu Thr Glu

435 440 445

Val Met Pro Glu Leu His His Leu Ser Val Val Gly Ser Gly Leu Asp

450 455 460

Val Asp Met Ile Leu Pro Asn Ala Trp Gly Ile His Thr Leu Leu Ser

465 470 475 480

Gln Gly Glu Gly Cys Arg Ile Ser Val Ser Asn Pro Asp Phe Trp Lys

485 490 495

Ser Asn Ser Leu Arg Ala Leu Asp Leu His Gly Leu Leu Ser Ala Ser

500 505 510

Val Pro Phe Ser Cys Gln Asp Met Lys His Leu Arg Tyr Leu Asp Leu

515 520 525

Ser Arg Ser Trp Ile Thr Ser Leu Pro Glu Asp Phe Phe Met Ile Tyr

530 535 540

Asn Leu Gln Thr Leu Arg Leu Ser Asp Cys Phe Tyr Leu Lys Gln Leu

545 550 555 560

Pro Glu Asn Met Arg Phe Met Glu Asn Leu Arg His Ile Tyr Ile Asp

565 570 575

Gly Cys Phe Arg Leu Glu Asn Met Pro Ser Asn Met Gly Gln Leu Gln

580 585 590

Asn Leu Gln Thr Leu Thr Thr Tyr Ile Val Gly Asn Gly Asp Gly Tyr

595 600 605

Gly Ile Glu Glu Ile Lys Ser Met Asp Leu Gly Gly Arg Leu Glu Ile

610 615 620

Tyr Asn Leu Lys Asn Val Arg Asp Lys Ser Lys Ala Glu Ala Ala Asn

625 630 635 640

Leu Ser Leu Lys Thr Arg Met Ser Asn Met Leu Leu Cys Trp Gly Met

645 650 655

Phe Arg Asn Asp Glu Val Asn Ala Tyr Asn Ala Glu Glu Val Met Glu

660 665 670

Ala Leu Arg Thr Pro Met Cys Val Gln Thr Leu Lys Val Trp Arg Tyr

675 680 685

Pro Gly Ser Ile Leu Pro Ile Trp Trp Pro Gly Gln Thr Leu Ala Asn

690 695 700

Leu Val Lys Leu Thr Ile Lys Asp Cys Ala Arg Cys Lys Arg Leu Pro

705 710 715 720

Pro Val Gln Tyr Phe Pro Ser Leu Glu Val Leu His Leu Glu Gly Met

725 730 735

Asp Ser Leu Thr Leu Phe Cys Asp Asn Val Ser Met Asp Asn Ile Glu

740 745 750

Val Ser Tyr Tyr Arg Phe Phe Trp Arg Leu Lys Ser Leu Ile Leu Cys

755 760 765

Asp Met Pro Ser Leu Glu Lys Trp Gln Glu Asp Glu Val Ile Glu Val

770 775 780

Phe Thr Ile Pro Val Leu Glu Glu Met Lys Leu Ile Asn Cys Pro Lys

785 790 795 800

Leu Val Thr Ile Pro Asn Val Pro Met Leu Arg Cys Phe Ile Val Glu

805 810 815

Gly Gln Asn Lys Gln Gln Leu Tyr Ser Leu Ala Pro Ser Ser Ser Lys

820 825 830

Ser Lys Gly Pro Ser Cys Arg Leu Asp

835 840

<210> 4

<211> 3865

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaagtagtaa caagacatag ttatcctttc tatgttaata tccatgctat ctatgtaaat 60

gctagatttt ttatttttat aatactcata aagttttctg atactccaag taaatataca 120

cactagaaaa tattgctttt tataatatta tttttcttat tttcagagag ttattttgat 180

actaaaataa taaaaaaaca tgtttctttt cttaatatag tgtagtaata gataccattt 240

tccttaataa ttaagataga tataaatgaa ctttaccacc catgagaaag caacattaac 300

actcggataa atagaaacaa tatgacaaat ttggtatacc attaaaaagt agcaattgcg 360

atcttactgc tactttaaac tccaatggtg attccaccac tactttttct aactttgtga 420

ttttgccgtc tctgtttttt taactaatgc ttgagcttta tccccatttt gttgtctcct 480

cttaacaatg tccaaaatca tataaaaaca ggggaaaaat tcatttgaag attgtgtttg 540

ccctcatctt ttcaaatcga atttgtgaaa attcaagtga aaaccgggca aaaattcatg 600

tcaaaatgct tgatgtcaaa ccaagggcaa aatcacaaaa atattaagaa aagtatgtgc 660

aaatctgcaa gagcatacgt tcctttgaca ccgttaagat gacacagaat gggggcaagc 720

acaagcttca gttcaaaaaa atgagggcaa aatcacaaag ttagaaaagc aggggtaaaa 780

tcatcatttg agttgaaaat aagggggata atgcagttgc ctctctataa aaaccttttt 840

ttttcttcta atctatcttt gaactgacgt gctctctatc ttcaaatata cctaaagaac 900

atatcatggt tttatgagtt tgttgccatt tttctaatat ttattcatgg accgatgtgc 960

ttttgatatt aaaatatgcc taacttgtga caagtgacaa gtctacgata atatgtcaag 1020

ctagagtttt ttttttgtac tcaatgatgt ctaatttggc taacggtcat cgttggcagg 1080

acagaacaac aaagatatga cactaagatt ttcaatggct gagttgaggt tactcacctt 1140

caaagttgag catctactgg aggagttgag atgggaggct catcacaaca aggctttggt 1200

tgacgggcac aggaacagga tgatgcgcaa catgtatatt ccattagttc ttcctcgaag 1260

catgaagagg aagcttaaaa tgatcaccgg ccaacttaat gcactaggtg cagagatcaa 1320

tggcttcatc aaccacgtgc cattggtaat gcaaaataat attgtgggaa gggtgcatga 1380

gaagcaagag ataaagcaaa aactattctg tctggacaga tacaagcatg aaggcctcaa 1440

ggtcctatgt gtagttggca ttgaaggagt gggaaaaact gccttggttc aattaatctt 1500

tgatgaagtc aatgtgaagg aatatttctc attgtgcata tgggtgaatg tatctcgcca 1560

atttgatgca atgagaatca caaaacggat aattgaggtt gcaacctgtg agccattgga 1620

gacacaaatg gatcacaagg aagagaagga gttgcaatcc tacctccaga acattttaca 1680

tgaaagaagg tttttgctcg tcttagatga tgtttgtgat gagaacacca atggctggga 1740

agaactcaga acctcactgg catctggagc atcagggagc acggtcattg tgacgacccg 1800

tgaactttgt gttgcaagaa ccttagaagc acctgcatct ggcatcattg agctgggacc 1860

aatgagtgat gatgagatat ggtccataat gaggcagcga atgttatgtg gcctagatga 1920

caaacccgag ctcatccagg ttggtcaatc cctcgtgcaa aagtgtcatg gaattcctct 1980

agctgctgta acactcgggg atttgctaag aaagaaggga acctctaatg aatggtctag 2040

tgtcatagaa gctgccaatg aatggttggc tcttgcagaa agcgatatgc tgaccacgac 2100

ggcaggtgta gcctcggtcg cacttcagat gagctatgag cacttgcaac cagacaccaa 2160

gaggtgcttt gcattctgtg ctttatttca tgaagctttt gaagtggatg gtgatatgct 2220

gatccagctg tggatggcta atgatatggt atggtacgat actgaaggta tgggggcttg 2280

gatgttagat aggctacagt caagatcatt tcttcaagat gtcagtcaac cttacaatgg 2340

agtaacaatc tataagatgc accctcttgt tcatggcata gcaacgtcag ctgctggaaa 2400

agagatctga atcctacatc aaggccacca acttacagaa gtgatgccag agctccatca 2460

cttgtcagtg gttggttcag ggttagatgt tgatatgatt ctacccaatg cacggggtat 2520

ccacacactg ttgtcacaag gagaaggatg tcgaataagt gtgtctaatc ctgatttttg 2580

gaaatccaac tccttgagag cgttagacct gcatggtctc ttgtccgcca gtgttccatt 2640

tagttgccaa gatatgaagc atctcaggta ccttgatctg tcaagaagtt ggataacgtc 2700

gcttccggag gactttttca tgatctataa cctgcaaact ctgaggctct ccgattgttt 2760

ttacctaaag caacttccag aaaacatgag gtttatggag aatttaaggc acatttatat 2820

cgatggctgc ttccgattag aaaacatgcc gtcaaatatg ggacaattgc agaaccttca 2880

aacactgaca acttacatag tgggcaatgg tgatgggtat ggaattgaag agatcaagag 2940

catggatctc ggtgggcggc ttgaaatata taatctgaag aacgtgaggg acaaatcaaa 3000

agccgaggcc gcaaatttat ctctaaaaac aagaatgtcc aatatgttgt tgtgttgggg 3060

tatgtttagg gatgacgagg taaatgcata cgatgccgag gaagtgatgg aggctcttag 3120

aacccctatg tgtgtacaga cactcaaggt ttggcgatac cctggtagca tacttccaat 3180

ttggtggcca ggtcaaactc ttgctaatct ggttaaacta accatcaaag attgcgcaag 3240

atgtaagagg cttcctcctg tgcagtattt tccatcactt gaggtcctac atcttgaagg 3300

aatggacagt ctcacacttt tttgcgacaa tgtatcgatg gacaacattg aggtcagcta 3360

ttatcgattc ttctggaggt tgaagagtct tatcctgtgt gatatgctaa gcttggaaaa 3420

gtggcaagaa gatgaggtga tagaagtatt cacaattcca gtgcttgaag aaatgaaatt 3480

gatcaactgt ccaaagttgg tgacaattcc aaatgttcct atgctcagat gttttattgt 3540

agaagggcaa aacaaacaac agttatattc tctggcacca tcgtcgtcca aaagtaaagg 3600

tccatcgtgc aggttagatt agccttaggc tcccattttg taagaaaagt aagtacacta 3660

tccaaagtag catttggaga aactatttta cattggggtc atgtatactg taattagaac 3720

tactttctta gctggacact gtgaagaagc ccaataagat tggatctttc ttacaatact 3780

aagagaattt ttttttatct aagtgcaaat gcattgacat ggataaatag aggaaatttc 3840

gaagtcagaa agaaatgact gaaga 3865

<210> 5

<211> 1314

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgacactaa gattttcaat ggctgagttg aggttactca ccttcaaagt tgagcatcta 60

ctggaggagt tgagatggga ggctcatcac aacaaggctt tggttgacgg gcacaggaac 120

aggatgatgc gcaacatgta tattccatta gttcttcctc gaagcatgaa gaggaagctt 180

aaaatgatca ccggccaact taatgcacta ggtgcagaga tcaatggctt catcaaccac 240

gtgccattgg taatgcaaaa taatattgtg ggaagggtgc atgagaagca agagataaag 300

caaaaactat tctgtctgga cagatacaag catgaaggcc tcaaggtcct atgtgtagtt 360

ggcattgaag gagtgggaaa aactgccttg gttcaattaa tctttgatga agtcaatgtg 420

aaggaatatt tctcattgtg catatgggtg aatgtatctc gccaatttga tgcaatgaga 480

atcacaaaac ggataattga ggttgcaacc tgtgagccat tggagacaca aatggatcac 540

aaggaagaga aggagttgca atcctacctc cagaacattt tacatgaaag aaggtttttg 600

ctcgtcttag atgatgtttg tgatgagaac accaatggct gggaagaact cagaacctca 660

ctggcatctg gagcatcagg gagcacggtc attgtgacga cccgtgaact ttgtgttgca 720

agaaccttag aagcacctgc atctggcatc attgagctgg gaccaatgag tgatgatgag 780

atatggtcca taatgaggca gcgaatgtta tgtggcctag atgacaaacc cgagctcatc 840

caggttggtc aatccctcgt gcaaaagtgt catggaattc ctctagctgc tgtaacactc 900

ggggatttgc taagaaagaa gggaacctct aatgaatggt ctagtgtcat agaagctgcc 960

aatgaatggt tggctcttgc agaaagcgat atgctgacca cgacggcagg tgtagcctcg 1020

gtcgcacttc agatgagcta tgagcacttg caaccagaca ccaagaggtg ctttgcattc 1080

tgtgctttat ttcatgaagc ttttgaagtg gatggtgata tgctgatcca gctgtggatg 1140

gctaatgata tggtatggta cgatactgaa ggtatggggg cttggatgtt agataggcta 1200

cagtcaagat catttcttca agatgtcagt caaccttaca atggagtaac aatctataag 1260

atgcaccctc ttgttcatgg catagcaacg tcagctgctg gaaaagagat ctga 1314

<210> 6

<211> 437

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Thr Leu Arg Phe Ser Met Ala Glu Leu Arg Leu Leu Thr Phe Lys

1 5 10 15

Val Glu His Leu Leu Glu Glu Leu Arg Trp Glu Ala His His Asn Lys

20 25 30

Ala Leu Val Asp Gly His Arg Asn Arg Met Met Arg Asn Met Tyr Ile

35 40 45

Pro Leu Val Leu Pro Arg Ser Met Lys Arg Lys Leu Lys Met Ile Thr

50 55 60

Gly Gln Leu Asn Ala Leu Gly Ala Glu Ile Asn Gly Phe Ile Asn His

65 70 75 80

Val Pro Leu Val Met Gln Asn Asn Ile Val Gly Arg Val His Glu Lys

85 90 95

Gln Glu Ile Lys Gln Lys Leu Phe Cys Leu Asp Arg Tyr Lys His Glu

100 105 110

Gly Leu Lys Val Leu Cys Val Val Gly Ile Glu Gly Val Gly Lys Thr

115 120 125

Ala Leu Val Gln Leu Ile Phe Asp Glu Val Asn Val Lys Glu Tyr Phe

130 135 140

Ser Leu Cys Ile Trp Val Asn Val Ser Arg Gln Phe Asp Ala Met Arg

145 150 155 160

Ile Thr Lys Arg Ile Ile Glu Val Ala Thr Cys Glu Pro Leu Glu Thr

165 170 175

Gln Met Asp His Lys Glu Glu Lys Glu Leu Gln Ser Tyr Leu Gln Asn

180 185 190

Ile Leu His Glu Arg Arg Phe Leu Leu Val Leu Asp Asp Val Cys Asp

195 200 205

Glu Asn Thr Asn Gly Trp Glu Glu Leu Arg Thr Ser Leu Ala Ser Gly

210 215 220

Ala Ser Gly Ser Thr Val Ile Val Thr Thr Arg Glu Leu Cys Val Ala

225 230 235 240

Arg Thr Leu Glu Ala Pro Ala Ser Gly Ile Ile Glu Leu Gly Pro Met

245 250 255

Ser Asp Asp Glu Ile Trp Ser Ile Met Arg Gln Arg Met Leu Cys Gly

260 265 270

Leu Asp Asp Lys Pro Glu Leu Ile Gln Val Gly Gln Ser Leu Val Gln

275 280 285

Lys Cys His Gly Ile Pro Leu Ala Ala Val Thr Leu Gly Asp Leu Leu

290 295 300

Arg Lys Lys Gly Thr Ser Asn Glu Trp Ser Ser Val Ile Glu Ala Ala

305 310 315 320

Asn Glu Trp Leu Ala Leu Ala Glu Ser Asp Met Leu Thr Thr Thr Ala

325 330 335

Gly Val Ala Ser Val Ala Leu Gln Met Ser Tyr Glu His Leu Gln Pro

340 345 350

Asp Thr Lys Arg Cys Phe Ala Phe Cys Ala Leu Phe His Glu Ala Phe

355 360 365

Glu Val Asp Gly Asp Met Leu Ile Gln Leu Trp Met Ala Asn Asp Met

370 375 380

Val Trp Tyr Asp Thr Glu Gly Met Gly Ala Trp Met Leu Asp Arg Leu

385 390 395 400

Gln Ser Arg Ser Phe Leu Gln Asp Val Ser Gln Pro Tyr Asn Gly Val

405 410 415

Thr Ile Tyr Lys Met His Pro Leu Val His Gly Ile Ala Thr Ser Ala

420 425 430

Ala Gly Lys Glu Ile

435

<210> 7

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgacactaa gattttcaat ggctgagttg aggttactca ccttcaaagt tgagcatcta 60

ctggaggagt tgagatggga ggctcatcac aacaaggctt tggttgacgg gcacaggaac 120

aggatgatgc gcaacatgta tattccatta gttcttcctc gaagcatgaa gaggaagctt 180

aaaatgatca ccggccaact taatgcacta ggtgcagaga tcaatggctt catcaaccac 240

gtgccattgg taatgcaaaa taatattgtg ggaagggtgc atgagaagca agagataaag 300

caaaaactat tctgtctgga cagatacaag catgaaggcc tcaaggtcct atga 354

<210> 8

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Met Thr Leu Arg Phe Ser Met Ala Glu Leu Arg Leu Leu Thr Phe Lys

1 5 10 15

Val Glu His Leu Leu Glu Glu Leu Arg Trp Glu Ala His His Asn Lys

20 25 30

Ala Leu Val Asp Gly His Arg Asn Arg Met Met Arg Asn Met Tyr Ile

35 40 45

Pro Leu Val Leu Pro Arg Ser Met Lys Arg Lys Leu Lys Met Ile Thr

50 55 60

Gly Gln Leu Asn Ala Leu Gly Ala Glu Ile Asn Gly Phe Ile Asn His

65 70 75 80

Val Pro Leu Val Met Gln Asn Asn Ile Val Gly Arg Val His Glu Lys

85 90 95

Gln Glu Ile Lys Gln Lys Leu Phe Cys Leu Asp Arg Tyr Lys His Glu

100 105 110

Gly Leu Lys Val Leu

115

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gctgtggatg gctaatgata 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggcatagcaa cgtcagctgc 20

<210> 11

<211> 633

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ttcagaggtc tctctcgact agtatggaat cggcagcaaa ggattttttc ctgtagtttt 60

cccacaacca ttttttacca tccgaatgat aggataggaa aaatatccaa gtgaacagta 120

ttcctataaa attcccgtaa aaagcctgca atccgaatga gccctgaagt ctgaactagc 180

cggtcacctg tacaggctat cgagatgcca tacaagagac ggtagtagga actaggaaga 240

cgatggttga ttcgtcaggc gaaatcgtcg tcctgcagtc gcatctatgg gcctggacgg 300

aataggggaa aaagttggcc ggataggagg gaaaggccca ggtgcttacg tgcgaggtag 360

gcctgggctc tcagcacttc gattcgttgg caccggggta ggatgcaata gagagcaacg 420

tttagtacca cctcgcttag ctagagcaaa ctggactgcc ttatatgcgc gggtgctggc 480

ttggctgccg gctgtggatg gctaatgata gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat 540

aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt tttcaagagc 600

ttggagtgga tggaccctga cgagacccac gct 633

<210> 12

<211> 103

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gctgtggatg gctaatgata gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt ttt 103

<210> 13

<211> 519

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ttcagaggtc tctctgacac tggaatcggc agcaaaggat gcaagaacga actaagccgg 60

acaaaaaaaa aaggagcaca tatacaaacc ggttttattc atgaatggtc acgatggatg 120

atggggctca gacttgagct acgaggccgc aggcgagaga agcctagtgt gctctctgct 180

tgtttgggcc gtaacggagg atacggccca cgagcgtgta ctaccgcgcg ggatgccgct 240

gggcgctgcg ggggccgttg gatggggatc ggtgggtcgc gggagcgttg aggggagaca 300

ggtttagtac cacctcgcct accgaacaat gaagaaccca ccttataacc ccgcgcgctg 360

ccgcttgtgt tggcatagca acgtcagctg cgttttagag ctagaaatag caagttaaaa 420

taaggctagt ccgttatcaa cttgaaaaag tggcaccgag tcggtgcttt ttttcaagag 480

cttggagtgg atggatacgc gtcggtcgag acccacgct 519

<210> 14

<211> 102

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gcatagcaac gtcagctgcg ttttagagct agaaatagca agttaaaata aggctagtcc 60

gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcttttt tt 102

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atgacactaa gattttcaat 20

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ctaatctaac ctgcacgatg gac 23

<210> 17

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tcagatctct tttccagcag ctgacg 26

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ctccgtttta cctgtggaat cg 22

<210> 19

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tatcattagc catccacagc ggcagccaag ccagca 36

<210> 20

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ctgtggatgg ctaatgatag ttttagagct agaaat 36

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

cggaggaaaa ttccatccac 20

<210> 22

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ttcagaggtc tctctcgact agtatggaat cggcagcaaa gg 42

<210> 23

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

agcgtgggtc tcgtcagggt ccatccactc caagctc 37

<210> 24

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gcagctgacg ttgctatgcc aacacaagcg gcagc 35

<210> 25

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gcatagcaac gtcagctgcg ttttagagct agaaat 36

<210> 26

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

ttcagaggtc tctctgacac tggaatcggc agcaaagg 38

<210> 27

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

agcgtgggtc tcgaccgacg cgtatccatc cactccaagc tc 42

<210> 28

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

agacaaccat tacctgtcc 19

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

tgcatcaaat tggcgagata 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

gctcatccag gttggtcaat 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

cctctggaag cgacgttatc 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

gatcaccggc caacttaatg 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

cttgaggcct tcatgcttgt 20

<210> 34

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

gactctggtg atggtgtcag c 21

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

ggctggaaga ggacctcagg 20

Claims

1. OsBBR2蛋白表达量的提高或其相关生物材料在如下任一中的应用，

（1）提高植物抗病性；

（2）提高植物抗病性的遗传育种；

（3）改良植物种质资源抗病性；

所述OsBBR2蛋白为如下任一所示蛋白质：

（a1）氨基酸序列为SEQ ID No.6的蛋白质；

（a2）在（a1）所限定的蛋白质的末端连接标签后得到的融合蛋白；

所述相关生物材料为如下任一种：

c1）编码所述OsBBR2蛋白的核酸分子；

c2）含有c1）所述核酸分子的表达盒；

c3）含有c1）所述核酸分子的重组载体、或含有c2）所述表达盒的重组载体；

c4）含有c1）所述核酸分子的重组微生物、或含有c2）所述表达盒的重组微生物、或含有c3）所述重组载体的重组微生物；

c5）含有c1）所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有c2）所述表达盒的转基因植物细胞系；

c6）含有c1）所述核酸分子的转基因植物组织、或含有c2）所述表达盒的转基因植物组织；

c7）含有c1）所述核酸分子的转基因植物器官、或含有c2）所述表达盒的转基因植物器官；

所述抗病性为植物对白叶枯病的抗性；

所述植物为水稻。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

c1）所述核酸分子为如下任一所示的DNA分子：

d1）核苷酸序列是SEQ ID NO.4所示的DNA分子；

d2）编码区序列是序列表中SEQ ID NO.5所示的DNA分子。

3.调控LOC_Os03g40194Hap1蛋白编码基因表达的物质在如下任一中的应用，

（1）提高植物抗病性；

（2）提高植物抗病性的遗传育种；

（3）改良植物种质资源抗病性；

所述LOC_Os03g40194Hap1蛋白为如下任一所示蛋白质：

（b1）氨基酸序列为SEQ ID No.3的蛋白质；

（b2）在（b1）所限定的蛋白质的末端连接标签后得到的融合蛋白；

所述调控LOC_Os03g40194Hap1蛋白编码基因表达的物质为利用CRISPR/cas9编辑植物LOC_Os03g40194Hap1基因的sgRNA或其sgRNA的编码基因；所述sgRNA的靶序列如SEQ IDNo.9和SEQ ID No.10所示；所述sgRNA与CRISRP/cas9基因编辑工具配合作用，实现水稻LOC_Os03g40194^Hap1基因的定点敲除，破坏水稻LOC_Os03g40194^Hap1基因的LRR结构域的生物学功能；

所述抗病性为植物对白叶枯病的抗性；

所述植物为水稻。

4.抗白叶枯病水稻的选育方法，其特征在于：包括提高和/或增加出发水稻中OsBBR2蛋白的编码基因的表达和/或所述OsBBR2蛋白的含量和/或活性；

所述OsBBR2蛋白为如下任一所示蛋白质：

（a1）氨基酸序列为SEQ ID No.6的蛋白质；

（a2）在（a1）所限定的蛋白质的末端连接标签后得到的融合蛋白。

5.创制白叶枯病抗性提高的水稻的方法，其特征在于：所述方法为M1或M2，

M1包括用序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID No.5所示DNA替换水稻基因组DNA中的LOC_Os03g40194Hap3编码基因中的SEQ ID No.7所示DNA或LOC_Os03g40194Hap1编码基因中的SEQ ID NO.1或SEQ ID No.2所示DNA，得到白叶枯病抗性提高的水稻；

M2包括用“GCTGTGGATGGCTAAATATGG”替换水稻基因组DNA中的LOC_Os03g40194Hap1中的“GCTGTGGATGGCTAATGATATGG”，且用“GGCATAGCAACGTCAGCATGCTGG”替换水稻基因组DNA中的LOC_Os03g40194Hap1中的“GGCATAGCAACGTCAGCTGCTGG”，得到白叶枯病抗性提高的水稻。