CN111269915A - 白叶枯病抗性相关基因Xa39(t)及其相关生物材料与培育抗白叶枯病水稻的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水稻白叶枯病抗性基因Xa39(t)的DNA分子及其相关生物材料与培育抗病水稻的方法。所述DNA分子具体可为如下1)或2)所示的DNA分子：1)序列表中序列2所示的DNA分子；2)序列表中序列1所示的DNA分子。Xa39(t)的DNA分子可用于提高水稻对白叶枯病的抗性。

Description

白叶枯病抗性相关基因Xa39(t)及其相关生物材料与培育抗 白叶枯病水稻的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域中白叶枯病抗性相关基因Xa39(t)及其相关生物材料与培育抗白叶枯病水稻的方法。

背景技术

水稻白叶枯病是由革兰氏阴性菌黄单胞杆菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzaepv.oryzae,Xoo)引起的一种重要的细菌性病害，发病范围遍及世界各稻区。一般年份可导致水稻减产10％左右，严重时减产50％-60％。利用抗性基因培育抗病品种是目前防治水稻白叶枯病最经济有效的措施。迄今，国内外已报道45个水稻白叶枯病抗性基因(http:// www.shigen.nig.ac.jp/rice/oryzabase/gene/list)。然而，来源于野生稻的抗病基因难以利用；部分抗性基因仅具有成株期抗性；大多抗性基因的抗谱较窄。在已鉴定的水稻白叶枯病抗性基因中，仅Xa3、Xa4、Xa21和Xa23等基因在生产中得以广泛应用。由于水稻白叶枯病菌具有高度的变异性，携带单一主效基因的抗病品种大面积推广种植后，潜在的毒性小种变为优势小种或病菌变异出现新的毒性小种，极易导致品种抗性丧失。

鉴定新的水稻抗病相关基因有助于进一步培育抗病品种，更好地控制和降低水稻白叶枯病的危害，增强植物的抗病性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何调控水稻对白叶枯病的抗性，特别是调控全生育期水稻对水稻白叶枯病的抗性。

为了解决以上技术问题，本发明提供了一种水稻白叶枯病抗性相关基因Xa39(t)的DNA分子，所述Xa39(t)基因，来源于水稻(Oryza sativa L.)；所述DNA分子具体可为如下1)或2)所示的DNA分子：

1)序列表中序列2所示的DNA分子；

2)序列表中序列1所示的DNA分子。

与所述的DNA分子相关的生物材料也属于本发明的保护范围。

本发明所提供的与所述的DNA分子相关的生物材料，为下述B1)至B8)中的任一种：

B1)含有所述的DNA分子的表达盒；

B2)含有所述的DNA分子的重组载体、或含有B1)所述表达盒的重组载体；

B3)含有所述的DNA分子的重组微生物、或含有B1)所述表达盒的重组微生物、或含有B2)所述重组载体的重组微生物；

B4)含有所述的DNA分子的转基因植物细胞系、或含有B1)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B5)含有所述的DNA分子的转基因植物组织、或含有B1)所述表达盒的转基因植物组织；

B6)含有所述的DNA分子的转基因植物器官、或含有B1)所述表达盒的转基因植物器官；

B7)降低所述的DNA分子表达的核酸分子；

B8)含有B7)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物、转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官。

上述生物材料中，B2)所述的含有所述的DNA分子的表达盒(Xa39(t)基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达Xa39(t)的DNA，该DNA不但可包括启动Xa39(t)基因转录的启动子，还可包括终止Xa39(t)转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiology 120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I⁹⁸⁵)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。

可用现有的植物表达载体构建含有所述Xa39(t)基因表达盒的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pWMB123、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述生物材料中，所述重组微生物具体可为酵母，细菌，藻和真菌。

上述的DNA分子、或上述生物材料的下述P1-P5中的任一种应用也属于本发明的保护范围：

P1、所述的DNA分子或所述生物材料在调控水稻对白叶枯病抗性中的应用；

P2、所述的DNA分子或所述生物材料在制备提高水稻对白叶枯病抗性的产品中的应用；

P3、所述的DNA分子或所述生物材料在培育抗白叶枯病水稻中的应用；

P4、所述的DNA分子或所述生物材料在制备抗白叶枯病水稻产品中的应用；

P5、所述的DNA分子或所述生物材料在水稻育种中的应用。

上述应用中，所述调控水稻对白叶枯病抗性可为调控水稻全生育期对白叶枯病的抗性。

上述应用中，提高水稻对白叶枯病抗性可为提高水稻在全生育期对白叶枯病的抗性。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了植物抗病剂。

本发明所提供的植物抗病剂含有所述的DNA分子或/和所述的DNA分子相关的生物材料。

上述植物抗病剂的活性成分可为所述的DNA分子或所述的DNA分子相关的生物材料，上述植物抗病剂的活性成分还可含有其他生物成分或/和非生物成分，上述药剂的其他活性成分本领域技术人员可根据植物的抗病效果确定。

上述植物抗病剂中，所述植物抗病剂可为抗水稻白叶枯病的药剂。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育抗病水稻的方法。

本发明所提供的培育抗白叶枯病水稻的方法，包括将所述的DNA分子导入目的水稻中，得到抗白叶枯病水稻；所述抗白叶枯病水稻对白叶枯病的抗病性高于所述目的水稻对白叶枯病的抗病性。

所述目的水稻可为不含所述的DNA分子的水稻，如粳稻。

上述方法中，其中所述的DNA分子可先进行如下修饰，再导入目的水稻中，以达到更好的表达效果：

1)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

2)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

3)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

4)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。

所述的DNA分子可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998，Method for Plant MolecularBiology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463；Geiserson and Corey,1998,PlantMolecular Biology(2nd Edition)。

上述方法中，所述抗病水稻可为转基因水稻，也可为通过杂交等常规育种技术获得的水稻。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育抗病性降低的转基因水稻的方法。

本发明所提供的培育抗病性降低的转基因水稻的方法，包括敲除目的水稻中所述的DNA分子，得到抗病性低于所述目的水稻的转基因水稻；所述抗病性为对水稻白叶枯病的抗性。

上述方法中，所述敲除目的水稻中所述的DNA分子可为通过CRISPR/Cas9方法实现。

所述CRISPR/Cas9方法，其的靶序列为位于Xa39(t)基因中任一包括XXXNGG的核苷酸序列上；其中，XXX为所述的DNA分子序列中任意19-20bp的核酸序列，N为A、T、G、C中的任意一个碱基。

具体的靶序列可为序列表中序列1的第699-717位和/或序列表中序列1的第731-750位的反向互补序列。

在本发明的具体的实施方式中，利用CRISPR/Cas9技术制备的重组载体包括如下任一种重组载体(即CRISRP/Cas9基因编辑质粒)：

重组载体CRISPR/Cas9-Xa39(t)含有U6a-sgRNA-Xa39(t)、U6b-sgRNA-Xa39(t)和cas9编码基因；U6a-sgRNA-Xa39(t)具有103个核苷酸组成的sgRNA1的编码序列，对应所述的DNA分子的位置为序列1的第699-717位；U6b-sgRNA-Xa39(t)具有103个核苷酸组成的sgRNA2的编码序列，对应所述的DNA分子的位置为序列1的第731-750位的反向互补序列。

上述方法中，所述转基因水稻理解为不仅包含第一代到第二代转基因水稻，也包括其子代。对于转基因水稻，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因水稻包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

上文中，所述抗病性可为抗水稻白叶枯病。

上文中，所述水稻白叶枯病可由革兰氏阴性菌黄单胞杆菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)引起。

将Xa39(t)基因导入水稻的转基因实验证明，由自身启动驱动表达Xa39(t)基因的转基因水稻与受体水稻相比，对水稻白叶枯病的抗性显著提高，说明Xa39(t)基因是与水稻白叶枯病相关的基因，Xa39(t)基因可用于提高水稻对水稻白叶枯病的抗性。

附图说明

图1为Xa39(t)互补转基因植株的PCR鉴定结果。M为DNA分子量标准(DL2000DNAmarker)，1为阴性对照，2为阳性对照，3为Xa39(t)互补转基因阳性株系CP-1，4为Xa39(t)互补转基因阳性株系CP-2，5为Xa39(t)互补转基因阳性株系株系CP-3。

图2为日本晴(NIP)和Xa39(t)互补转基因阳性株系的病斑长度。

图3为利用CRISPR/Cas9的Xa39(t)基因敲除株系KO-1、KO-2和KO-3的测序峰图。

图4为利用CRISPR/Cas9的Xa39(t)基因敲除株系KO-1、KO-2和KO-3的序列变化情况。

图5为FF329和Xa39(t)基因敲除株系的病斑长度。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为常规生化试剂，可从商业途径得到。

1载体

下述实施例中的载体pCAMBIA1300为BioVector NTCC典型培养物保藏中心产品。

下述实施例中pYLCRISPR/Cas9系统载体(包括pYLsgRNA-OsU6a、pYLsgRNA-OsU6b和pYLCRISPR/Cas9P_ubi-H等载体):记载过该材料的非专利文献是“Ma X.,Zhang Q.,ZhuQ.,Liu W.,Chen Y.,Qiu R.,Wang B.,Yang Z.,Li H.,Lin Y.,Xie Y.,Shen R.,Chen S.,Wang Z.,Chen Y.,Guo J.,Chen L.,Zhao X.,Dong Z.,and Liu Y.-G.(2015).A RobustCRISPR/Cas9 System for ConIVenient,High-Effificiency Multiplex Genome Editingin Monocot and Dicot Plants.Mol.Plant.8,1274–1284.”。公众可从华南农业大学获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

2菌株

下述实施例中的根癌农杆菌EHA105属于根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)，购自BioVectorNTCC典型培养物保藏中心(BTN12-153y)。

下述实施例中的水稻白叶枯病菌菌株PXO99A：记载于非专利文献“Salzberg S L,Sommer D D,Schatz M C,Phillippy A M,Rabinowicz P D,Tsuge S,Furutani A,OchiaiH,Delcher A L,Kelley D,Madupu R,Puiu D,Radune D,Shumway M,Trapnell C,AparnaG,Jha G,Pandey A,Patil P B,Ishihara H,Meyer D F,Szurek B,Verdier V,Koebnik R,Dow J M,Ryan R P,Hirata H,Tsuyumu S,Won Lee S,Ronald P C,Sonti R V,Van SluysM-A,Leach J E,White F F,Bogdanove A J(2008)Genome sequence and rapidevolution of the rice pathogen Xanthomonas oryzae pv.oryzae PXO99A.BMCGenomics 9(1):204.”，公众可从国际水稻研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

3水稻品系

下述实施例中的水稻FF329为籼稻回交导入系，对包括PXO99A在内的水稻白叶枯病菌菌株表现抗性。记载于非专利文献“Zhang F,Zhuo D L,Zhang F,Huang L Y,Wang WS,Xu J L,Vera Cruz C,Li Z K,Zhou Y L(2015)Xa39,a novel dominant geneconferring broad-spectrum resistance toXanthomonas oryzaepv.oryzaeinrice.Plant Pathology 64(3):568-575.”，公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的水稻日本晴(Nipponbare,Oryza sativa ssp.Japonica)：记载于非专利文献“Zhang F,Zeng D,Huang L,Shi Y,Chen T,Zhang F,Zhou Y(2019)Stress-Activated Protein Kinase OsSAPK9 Regulates Tolerance to Salt Stress andResistance to Bacterial Blight in Rice.Rice 12(1):80”，公众可从中国农业科学作物科学研究所获得，该材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。

下述实施例中的所有数据均采用R中的ggpubr package进行显著性分析。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、水稻白叶枯病抗性相关基因Xa39(t)的获得

本发明的发明人发现籼稻回交导入系FF329对包括PXO99A在内的水稻白叶枯病菌菌株表现抗性。利用FF329与黄华占构建的F₂分离群体，采用鉴别菌株PXO99A接种，通过抗病遗传分析发现FF329对白叶枯病的抗性符合显性单基因的分离规律，将该基因定位在水稻第11染色体上，与侧翼共显性标记RM26985和显性标记DM13的遗传距离分别为0.36cM和0.15cM。与已知水稻白叶枯病抗性基因进行物理位置比较和抗谱分析，发现该基因是一个新的白叶枯病抗性基因，命名为Xa39(Zhang F,Zhuo D L,Zhang F,Huang L Y,Wang W S,Xu J L,Vera Cruz C,Li Z K,Zhou Y L(2015)Xa39,a novel dominant gene conferringbroad-spectrum resistance to Xanthomonas oryzae pv.oryzae in rice.PlantPathology 64(3):568-575)。由于在Xa39的定位区间内富含重复序列，籼稻和粳稻在这一区段的序列差异可能较大。以粳稻日本晴为参考基因组，通过PCR扩增的方法，难以获得抗病候选基因。为了克隆抗病基因Xa39，委托华中农业大学罗美中老师，利用pIndigoBAC536-S载体，参照Luo MZ和Wing RA的(Luo MZ&Wing RA，2003，An improved method for plantBAC library construction,Methods in Molecylar Biology,Humana Press,Inc.,Totowa,NJ,236)方法，构建携带Xa39的籼稻导入系FF329的BAC文库。BAC文库一共有39936个克隆，保存在104个384孔板中，平均插入片段大小约112kb。随机抽选50个板进行检测，未检测到空载。以水稻基因组440Mb计算，该文库对水稻基因组的覆盖度为10倍。利用与Xa39连锁的分子标记RM26985和DM13筛选BAC文库，获得3个阳性BAC克隆BAC98、BAC50和BAC92。

由南京椰壳生物科技有限公司利用Illumina&Pacbio进行BAC克隆BAC98、BAC50和BAC92的基因组测序。采用FGENESH(参考物种：水稻)软件对序列进行基因预测，利用Blastp软件进行基因注释(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。根据生物信息学分析，预测BAC92上的第5个基因可能为Xa39的候选基因，将它命名为Xa39(t)。根据预测的BAC92上的第5个基因的序列设计引物：

Xa39(t)-F：5’-AGCGGTTGGCGCTGAGGTTG-3’

Xa39(t)-R：5’-GTTCGTTCCGTCGCCGTGATC-3’

提取水稻FF329叶片的基因组DNA作为基因克隆的模板，以Xa39(t)-F和Xa39(t)-R为引物，用PrimeSTAR G×L DNA Polymerase(产品目录号:R050A，Takara公司)进行PCR扩增，扩增程序为：先95℃预变性5分钟；然后98℃变性10秒，60℃复性15秒，68℃延伸120秒，共30个循环；68℃延伸5分钟；PCR反应结束后，经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的PCR条带。

将PCR产物测序，结果表明，水稻白叶枯病抗性相关基因Xa39(t)的基因组全长序列是序列表中序列1，共1894bp的核苷酸。

实施例2、培育抗水稻白叶枯病的转基因水稻

一、Xa39(t)基因互补重组表达载体pCAMBIA1300-Xa39(t)的构建

将由Xa39(t)基因自身启动子驱动基因组全长序列的Xa39(t)互补序列构建到载体pCAMBIA1300。Xa39(t)互补序列为序列表中的序列2，其第1-2158位共2158bp的核苷酸为启动子序列、第2159-4052位共1894bp的核苷酸为Xa39(t)的基因组全长序列，第4053-4994位共942bp的核苷酸为终止区序列，具体操作如下：

1、提取水稻FF329叶片的基因组DNA作为模板，用正向引物Xa39(t)-CP-F和反向引物Xa39(t)-CP-R组成的引物对，在高保真聚合酶PrimeSTAR G×L DNA Polymerase(产品目录号:R050A，Takara公司)的作用下进行PCR扩增，得到扩增的产物即序列表中的序列2，Xa39(t)互补序列。

Xa39(t)-CP-F:5’-CCGACGTCCCACTGTAGCTC-3’；

Xa39(t)-CP-R:5’-AGGAGAAGGCAGTGACTCAGT-3’。

PCR反应程序：先95℃预变性5分钟；然后98℃变性10秒，60℃复性15秒，68℃延伸300秒，共30个循环；68℃延伸5分钟；PCR反应结束后，经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的PCR条带，纯化得到PCR扩增产物。

2、在步骤1得到的PCR扩增产物中添加载体pCAMBIA1300的同源序列，具体步骤为：以步骤1的产物为模板，用正向引物Xa39(t)-CP-BamHIF和反向引物Xa39(t)-CP-HindIIIR组成的引物对，在高保真聚合酶PrimeSTAR G×L DNA Polymerase(产品目录号:R050A，Takara公司)的作用下进行PCR扩增，得到的扩增产物即带pCAMBIA1300载体接头的Xa39(t)互补序列。

Xa39(t)-CP-BamHIF:5’-CGGTACCCGGGGATCCCCGACGTCCCACTGTAGCTC-3’(下划线指示的序列为BamHI识别位点序列)；

Xa39(t)-CP-HindIIIR:5’-GGCCAGTGCC

AGGAGAAGGCAGTGACTCAGT-3’(双下划线指示的序列为HindIII识别位点序列)。

扩增程序为：先95℃预变性5分钟；然后98℃变性10秒，60℃复性15秒，68℃延伸300秒，共30个循环；68℃延伸5分钟；PCR反应结束后，经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的PCR条带，纯化得到PCR扩增产物。

3、用限制性内切酶BamHI和HindIII酶切植物双元表达载体pCAMBIA1300，回收载体骨架。

4、将步骤2得到的PCR扩增产物与步骤3回收的载体骨架进行同源重组连接。

同源重组反应体系：步骤3回收的载体骨架50-100ng，步骤2的PCR扩增产物50-100ng，5×In-Fusion HD Enzyme Premix 2μL(融合酶预混料，产品目录号:638910，Clontech公司)，加ddH₂O补充至10μl。

同源重组反应条件：50℃孵育15min。

将反应产物转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，得到正确的含有Xa39(t)互补序列的表达载体，该Xa39(t)基因互补重组表达载体命名为pCAMBIA1300-Xa39(t)。pCAMBIA1300-Xa39(t)含有序列表中序列2所示的Xa39(t)互补序列。

测序结果表明pCAMBIA1300-Xa39(t)是将pCAMBIA1300的BamHI和HindII识别位点间的片段替换为序列表中序列2的第1-4994位核苷酸并保持pCAMBIA1300的其它序列不变得到的重组表达载体。

二、培育Xa39(t)互补转基因植株及其对照

利用pCAMBIA1300-Xa39(t)制备转基因水稻，以空白载体pCAMBIA1300作为对照。水稻日本晴作为制备转基因水稻的受体植物，其对白叶枯病菌株PXO99A表现为中感。

A1、培育Xa39(t)互补转基因植株

用重组表达载体pCAMBIA1300-Xa39(t)制备受体水稻为日本晴的转基因水稻，具体步骤如下：

1、取出水稻日本晴的成熟种子，去壳，挑取饱满光洁无菌斑的种子进行消毒。将消毒后的种子接种到诱导培养基上，28℃、暗培养14天左右，选取外观良好，生长力好的愈伤组织。

2、将实施例2中构建的重组表达载体pCAMBIA1300-Xa39(t)导入根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌，命名为EHA105/pCAMBIA1300-Xa39(t)。

3、取步骤2得到的重组农杆菌，用侵染培养基重悬菌体，得到EHA105/pCAMBIA1300-Xa39(t)菌悬液。

4、将步骤1的日本晴愈伤组织浸泡于步骤3制备的EHA105/pCAMBIA1300-Xa39(t)菌悬液中，侵染20min。侵染后将菌悬液倒掉，取愈伤组织，用无菌滤纸吸干水分，然后置于共培养培养基上，培养28℃暗培养50-55h。

5、完成步骤4后，挑选表面没有明显农杆菌的愈伤组织移至抑菌培养基中，28℃暗培养3-4天。

6、完成步骤5后，将愈伤组织移至筛选培养基上28℃暗培养培养30天，每10天继代一次。

7、完成步骤6后，取新鲜潮霉素抗性的愈伤组织，接于预再生培养基中，28℃暗培养7天，然后置于光照培养间(12h光照/12h黑暗)继续培养7天后转入再生培养基上，继续光照培养，直至生长出再生植株。将利用重组表达载体pCAMBIA1300-Xa39(t)得到的转基因植株记为Xa39(t)互补转基因植株(T₀代)。

遗传转化所用培养基及配方：

诱导培养基：CaCl₂·2H₂O 440mg，KH₂PO₄ 170mg，MgSO₄·7H₂O 370mg，NH₄NO₃1650mg，KNO₃ 1900mg，KI 0.83mg，CoCl₂·6H₂O 0.025mg，H₃BO₃ 6.2mg，Na₂MoO₄·2H₂O0.25mg，MnSO₄·4H₂O 22.3mg，CuSO₄·5H₂O 0.025mg，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg，Na₂-EDTA·2H₂O37.3mg，FeSO₄·7H₂O 27.8mg，VB1 0.1mg，VB6 0.5mg，烟酸0.5mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，2，4-D 2mg，水解酪蛋白2g，麦芽糖30g，琼脂3g，去离子水加至1L。

侵染培养基：配制方法参见参考文献：Hiei Y,Ohta S,Komari T,etal.Efficient transformation of rice(Oryza sativa,L.)mediated byAgrobacterium,and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA[J].PlantJournal,1994,6(2):271–282.。将参考文献中乙酰丁香酮的浓度替换为200μM。

共培养培养基：在诱导培养基中加入乙酰丁香酮和葡萄糖，使乙酰丁香酮在培养基中的含量为200μM，葡萄糖在培养基中的终浓度为10g/L。

抑菌培养基：在诱导培养基中加入头孢霉素，使头孢霉素在培养基中的终浓度为500mg/L。

筛选培养基：在诱导培养基中加入潮霉素和头孢霉素，使潮霉素在培养基中的终浓度为65mg/L，头孢霉素在培养基中的浓度为500mg/L。

预再生培养基：CaCl₂·2H₂O 440mg，KH₂PO₄ 170mg，MgSO₄·7H₂O 370mg，NH₄NO₃1650mg，KNO₃ 1900mg，KI 0.83mg，CoCl₂·6H₂O 0.025mg，H₃BO₃ 6.2mg，Na₂MoO₄·2H₂O0.25mg，MnSO₄·4H₂O 22.3mg，CuSO₄·5H₂O 0.025mg，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg，Na₂-EDTA·2H₂O37.3mg，FeSO₄·7H₂O 27.8mg，VB1 0.1mg，VB6 0.5mg，烟酸0.5mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，水解酪蛋白2g，麦芽糖30g，琼脂3g，激动素2mg，萘乙酸1mg，去离子水加至1L；倒平板之前加入潮霉素并使其浓度为50mg/L。

再生培养基：CaCl₂·2H₂O 440mg，KH₂PO₄ 170mg，MgSO₄·7H₂O 370mg，NH₄NO₃1650mg，KNO₃ 1900mg，KI 0.83mg，CoCl₂·6H₂O 0.025mg，H₃BO₃ 6.2mg，Na₂MoO₄·2H₂O0.25mg，MnSO₄·4H₂O 22.3mg，CuSO₄·5H₂O 0.025mg，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg，Na₂-EDTA·2H₂O37.3mg，FeSO₄·7H₂O 27.8mg，VB1 0.1mg，VB6 0.5mg，烟酸0.5mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，水解酪蛋白2g，麦芽糖30g，琼脂6g，激动素2mg，萘乙酸1mg，去离子水加至1L；倒平板之前加入潮霉素并使其浓度为50mg/L。

A2、制备转基因空载对照植株

按照A1的方法，用载体pCAMBIA1300代替重组表达载体pCAMBIA1300-Xa39(t)得到转空载体水稻植株，作为Xa39(t)互补转基因植株的转基因空载对照植株(T₀代)。

实施例3、Xa39(t)互补转基因植株的筛选与水稻白叶枯病抗性鉴定

一、阳性Xa39(t)互补转基因植株的筛选

待测植株：日本晴以及实施例2得到的T₀代Xa39(t)互补转基因植株、T₀代转基因空载对照植株。

提取待测植株基因组DNA，以基因组DNA为模板，利用Xa39(t)-CPF和p1300-VR组成的引物对进行PCR扩增，用pCAMBIA1300-Xa39(t)质粒作为阳性对照，用受体品种日本晴作为阴性对照。

Xa39(t)-CPF：5’-TGGTGTTTGCTAATGGATTGC-3’；

p1300-VR：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’。

扩增程序为：先95℃预变性3分钟；然后94℃变性25秒，55℃复性25秒，72℃延伸30秒，共35个循环；72℃延伸5分钟。

将PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，阳性对照pCAMBIA1300-Xa39(t)和阳性Xa39(t)互补转基因植株均显示439bp的条带，转基因空载对照植株与阴性对照日本晴不能扩增出任何条带。在28株T₀代单株中，PCR阳性植株(即PCR产物有约439bp片段的Xa39(t)互补转基因植株)15株。选取三个阳性T₀代Xa39(t)互补转基因植株分别记为CP-1、CP-2、CP-3。部分样品的电泳图见图1。图1中，M代表DNA分子量标准(DL2000 DNA marker)，1代表阴性对照日本晴，2代表阳性对照pCAMBIA1300-Xa39(t)质粒，3-5分别代表3个T₀代Xa39(t)互补转基因阳性株系CP-1、CP-2、CP-3。

二、Xa39(t)互补转基因植株的水稻白叶枯病抗性鉴定

待测植株为：日本晴(NIP)，上述步骤一中获得的三个阳性T₀代Xa39(t)互补转基因植株CP-1、CP-2、CP-3的T₁代株系(均为纯合基因型)，以及相应的转基因空载对照植株的T₁代株系。

1、将各待测植株在温室中培养约25天后移栽至网室中进行种植，单株种植，每种植株种植20株。

2、在步骤1水稻植株的分蘖盛期，用水稻白叶枯病菌菌株PXO99A进行接种，采用剪叶法对水稻植株进行人工接种，每株接种5张叶片(菌液浓度为1×10⁹cfu/mL)，每个叶片的接种量均相等，均为40μL。

3、接菌约14天后测量各植株叶片的病斑长度，每个叶片沿叶脉有一个病斑，每个植株测量3张接种叶片的病斑长度，计算平均值。

由图2可以看出，日本晴(NIP)的病斑长度为9.0cm，阳性Xa39(t)互补转基因植株CP-1、CP-2和CP-3株系的病斑长度分别为5.6cm、5.9cm和5.4cm，均与日本晴(NIP)达到显著差异(P<0.05)，病斑长度减短34％-40％。说明互补Xa39(t)基因极显著增强了转基因水稻对水稻白叶枯病的抗性，Xa39(t)也是水稻抗白叶枯病的重要正向调控基因。

实施例4、培育Xa39(t)基因敲除的转基因水稻

一、Xa39(t)基因敲除重组表达载体CRISPR/Cas9-Xa39(t)的构建

1、基于pYLCRISPR/Cas9技术设计Xa39(t)基因的靶序列

利用CRISPR/Cas9方法构建编辑Xa39(t)基因的重组载体，所用靶序列为靶序列1和靶序列2。

靶序列1：TGGGGCCTCGTGGTCGGTT(即序列表中序列1的第699-717位)；将CRISPR/Cas9方法中靶向靶序列1的sgRNA记为sgRNA1，；

靶序列2：AGGCGAGCTCGACGGCGATG(即序列表中序列1的第731-750位CATCGCCGTCGAGCTCGCCT的反向互补序列)；将CRISPR/Cas9方法中靶向靶序列2的sgRNA记为sgRNA2。

2、sgRNA表达盒的构建

2.1 sgRNA1表达盒U6a-sgRNA-Xa39(t)的构建

重组表达载体U6a-sgRNA-Xa39(t)即为sgRNA1表达盒，能编码sgRNA1。U6a-sgRNA-Xa39(t)的序列为序列表中序列3，含有U6a启动子和由103个核苷酸组成的sgRNA1的编码序列：第44-490位为U6a启动子序列，第491-592位为sgRNA1的编码序列。该重组表达载体的具体构建方法如下：

以pYLsgRNA-OsU6a载体为模板，使用引物U-F和U6a-Xa39(t)-R进行PCR扩增，将序列正确的DNA片段命名为U6a-Xa39(t)；

U-F：5’-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3’；

U6a-Xa39(t)-R：5’-AACCGACCACGAGGCCCCACGGCAGCCAAGCCAGCA-3’。

以pYLsgRNA-OsU6a载体为模板，使用引物gR-Xa39(t)-1F和gR-R进行PCR扩增，将序列正确的DNA片段命名为sgRNA-Xa39(t)-1；

gR-Xa39(t)-1F：5’-TGGGGCCTCGTGGTCGGTTGTTTTAGAGCTAGAAAT-3’，gR-R：5’-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3’。

采用重叠PCR(overlapping PCR)方法将U6a-Xa39(t)和sgRNA-Xa39(t)-1连在一起，随后用Pps-GGL和Pgs-GG2为引物进行PCR扩增加上BsaI酶切接头，将得到的序列正确的DNA片段命名为U6a-sgRNA-Xa39(t)；

Pps-GGL：5’-TTCAGAGGTCTCTCTCGACTAGTATGGAATCGGCAGCAAAGG-3’(字体加粗指示的序列为BsaI识别位点序列)；

Pgs-GG2：5’-AGCGTGGGTCTCGTCAGGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3’(字体加粗指示的序列为BsaI识别位点序列)。

2.2sgRNA2表达盒U6b-sgRNA-Xa39(t)的构建

重组表达载体U6b-sgRNA-Xa39(t)即为即为sgRNA2表达盒，能编码sgRNA2。U6b-sgRNA-Xa39(t)的序列为序列表中序列4，含有U6b启动子和由103个核苷酸组成的sgRNA2的编码序列：U6b启动子序列为第40-372位，sgRNA2的编码序列在第373-475位。该重组表达载体的具体构建方法如下：

以pYLsgRNA-OsU6b载体为模板，使用引物U-F和U6b-Xa39(t)-R进行PCR扩增，将序列正确的DNA片段命名为U6b-Xa39(t)；

U-F：5’-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3’；

U6b-Xa39(t)-R：5’-CATCGCCGTCGAGCTCGCCTCAACACAAGCGGCAGC-3’。

以pYLsgRNA-OsU6b载体为模板，使用引物gR-Xa39(t)-2F和gR-R进行PCR扩增，将序列正确的DNA片段命名为sgRNA-Xa39(t)-2；

gR-Xa39(t)-2F：5’-AGGCGAGCTCGACGGCGATGGTTTTAGAGCTAGAAAT-3’；

gR-R：5’-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3’。

采用重叠PCR(overlapping PCR)将U6b-Xa39(t)和sgRNA-Xa39(t)-2连在一起，随后用Pps-GG2和Pgs-GGR为引物扩增加上BsaI酶切接头，将得到的序列正确的DNA片段命名为U6b-sgRNA-Xa39(t)；

Pps-GG2：5’-TTCAGAGGTCTCTCTGACACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3’(字体加粗指示的序列为BsaI识别位点序列)；

Pgs-GGR：5’-AGCGTGGGTCTCGACCGACGCGTATCCATCCACTCCAAGCTC-3’(字体加粗指示的序列为BsaI识别位点序列)。

3、重组表达载体CRISPR/Cas9-Xa39(t)的构建：

CRISPR/Cas9-Xa39(t)含有sgRNA1表达盒U6a-sgRNA-Xa39(t)、sgRNA2表达盒U6b-sgRNA-Xa39(t)和cas9编码基因，能表达sgRNA1和sgRNA2以及Cas9。该重组表达载体的具体构建方法如下：

用BsaI酶同时对所得U6a-sgRNA-Xa39(t)、U6b-sgRNA-Xa39(t)，以及pYLCRISPR/Cas9P_ubi-H载体进行酶切-连接反应，得到Xa39(t)基因敲除载体CRISPR/Cas9-Xa39(t)。

酶切-连接反应体系：U6a-sgRNA-Xa39(t)(10-15ng)，U6b-sgRNA-Xa39(t)(10-15ng)，pYLCRISPR/Cas9P_ubi-H(60-80ng)，10×CutSmart Buffer 1.5μL，10mM ATP 1.5μL，BsaI-HF 10U，T4 DNA ligase 35U，加ddH₂O补充至15μL。

酶切-连接反应体程序：37℃10min，10℃5min，20℃5min，进行3个循环；37℃3min，10℃5min，20℃5min，进行10个循环。

取反应产物10-15μL转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，将得到的序列正确的重组载体命名为CRISPR/Cas9-Xa39(t)。

二、培育Xa39(t)基因敲除的转基因水稻及其对照

以CRISPR/Cas9-Xa39(t)制备转基因水稻，并利用空白载体pYLCRISPR/Cas9P_ubi-H作为对照。以FF329作为制备转基因水稻的受体植物，其对白叶枯病菌株PXO99A表现高抗。

B1、培育Xa39(t)基因敲除植株

按照实施例2中步骤二A1的方法，将日本晴替换为FF329，将pCAMBIA1300-Xa39(t)替换为CRISPR/Cas9-Xa39(t)，其他步骤均不变，得到转基因植株。将利用重组载体CRISPR/Cas9-Xa39(t)得到的转基因植株记为Xa39(t)基因敲除植株(T₀代)。

B2、制备基因敲除空载对照植株

按照B1的方法，将CRISPR/Cas9-Xa39(t)替换为pYLCRISPR/Cas9P_ubi-H，其他步骤均不变，得到转基因植株。将利用载体pYLCRISPR/Cas9P_ubi-H的转基因植株记为基因敲除空载对照植株(T₀代)。

实施例5、Xa39(t)基因敲除植株的筛选与水稻白叶枯病抗性鉴定

一、Xa39(t)基因敲除植株的筛选

待测植株：受体品种FF329以及实施例4得到的T₀代Xa39(t)基因敲除植株、T₀代基因敲除空载对照植株。

提取待测植株的基因组DNA，以基因组DNA为模板，以Xa39(t)-TF和Xa39(t)-TR为引物进行PCR扩增，以受体品种FF329为阴性对照。

Xa39(t)-TF：5’-ATACACATGATCCTCATCTAC-3’；

Xa39(t)-TR：5’-ATATGATGAGCATACACGTAC-3’。

扩增程序为：先95℃预变性5分钟；然后98℃变性10秒，50℃复性15秒，68℃延伸40秒，共30个循环；68℃延伸5分钟。

将得到的PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，所有待测植株均显示约546bp的条带。将PCR扩增产物进行测序，将Xa39(t)基因敲除植株和基因敲除空载对照植株的PCR扩增产物序列与阴性对照FF329进行比对发现，基因敲除空载对照植株中Xa39(t)基因的靶序列未发生改变，20株T₀代单株中，阳性植株(Xa39(t)基因的靶序列处发生改变)有14株。选取3个独立的阳性纯合的Xa39(t)基因敲除植株，记为KO-1、KO-2和KO-3)，它们在Xa39(t)基因的靶序列1处发生了单碱基的插入或小片段的缺失突变。其中敲除株系KO-1缺失了7个碱基，即序列表中序列1的第709-715位，其他序列不变；敲除株系KO-2缺失了4个碱基，即序列表中序列1的第713-716位，其他序列不变；敲除株系KO-3在序列表中序列1的第714位和第715位之间插入一个碱基A，其他序列不变。3个阳性Xa39(t)基因敲除植株的测序峰图如图3所示，序列变化情况如图4所示。

二、Xa39(t)基因敲除植株的水稻白叶枯病抗性鉴定

待测植株为：FF329，上述步骤一中获得的三个阳性T₀代Xa39(t)基因敲除植株KO-1、KO-2和KO-3的T₁代株系(均为纯合基因型)，以及相应的基因敲除空载对照植株的T₁代株系。

1、将各待测植株在温室中培养约25天后移栽至网室中进行种植，单株种植，每种植株种植20株。

2、在步骤1水稻植株的分蘖盛期，用水稻白叶枯病菌菌株PXO99A进行接种，采用剪叶法对水稻植株进行人工接种，每株接种5张叶片(菌液浓度为1×10⁹cfu/mL)，每个叶片的接种量均相等，均为40μL。

3、接菌约14天后测量各植株叶片的病斑长度，每个叶片沿叶脉有一个病斑，每个植株测量3张接种叶片的病斑长度，计算平均值。

由图5可以看出，CRISPR/Cas9敲除载体的受体植物FF329的病斑长度为0.5cm，阳性Xa39(t)基因敲除植株KO-1、KO-2和KO-3的病斑长度分别为12.3cm、13.6cm和11.8cm，均与受体FF329达到极显著差异(P<0.01)，病斑长度显著变长，表明敲除Xa39(t)基因能够极显著提高水稻对白叶枯病的感病性。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 白叶枯病抗性相关基因Xa39(t)及其相关生物材料与培育抗白叶枯病水稻的方法

<130> GNCSY200477

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1894

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 1

agcggttggc gctgaggttg ggcacctccg cgccgaagcg gttggcgctg aggtagctgc 60

cacgtcagct aggggatcgg cccggccgcc acggtggcac aatgtcagcg ccagtcccgt 120

tggcgctgac acggccaacg tcagcgccaa tgtgtttggc gctgaggcga cggcctattt 180

ttggttgaag tttttggcag gggttagttt cgaaataagt tttccaaaag ggtcaatttg 240

tcaaaaaaac ggctcgtccc tgagtcaaag tcttccctat taaattatgc ggcatcacta 300

acatcagcta ctataaaagt cccttccgcg tcactaacat cagctactat aaaagtccct 360

tccgaaacat cttcctcccg catcactaac atcagcttct ataaaagccc ttccttgttg 420

catcatctca aggagctgca agcacttcct ctctggcagc acttcctcat ctcaaggagt 480

tgcaaatgtt gcatcatctc aaggagctgg cagccgtagc cggtatacac atgatcctca 540

tctacctctg ccgctttctc ctccgccgca gccgcaacgt attattcacc gtttccaaca 600

gcctccgttt tcgcctcaag gtattaactg tattgttgta catatgtctc tcggtcatgc 660

tgttctacct gtttggctcc atcatgccgc tgccgccgtg gggcctcgtg gtcggttggg 720

tcatggccct catcgccgtc gagctcgcct acgccttcat ctttccatat agctttcgct 780

acatcgctga caacgacgac gacaagatgg ttattctccc tgtttaagcc ttcagggcct 840

atatatatag tatatatata aagccttcca tactgtctct tcaataaagg ctagcttgtg 900

ttgtgagttg tatctgtgta cgtattttgt ttggttggtt atatattgtc acgtaggtat 960

gccatatata tatgtattgc tgtatttata tttgttacta tcttttgttt ttcagataat 1020

aaaattcagc cagctttgct tgcttcgtcg tacgtgtatg ctcatcatat cctcatccat 1080

cagctgctca tagctagctg ggccgtgtta tatgtgtgta gtgatcagtc acatccatgt 1140

atttcatccc atgtatgtta gtttgttttt catttttgaa agaaaacatg catatatgtt 1200

ataactcaaa gttttgagat gaatttgatc atctaattta tttccgtttt gaattattct 1260

gctctgttgt tgcaaacttt tttttttatg ttgggacact ttctcctcgg tttgattgtt 1320

atattgaatt cgtcgattcc agctagtata tatttgctag tttcactcag acaatcatgc 1380

ctatttgctg atcaggaaca attgaaaaca accattacag agccagacga aattaattaa 1440

tttacactca ccaattattc atcatcacat ctctaaacat cgaattctgg gattccatcg 1500

ttcgtcccct tcccgcagcc gtcggatcgc ggatcgacgg tggcagatcg cttcgttgaa 1560

cgtttttgta atataccatt tcttgagggg ggtttatgca aaatatctct atcccttacc 1620

tcctcctacc tcgccggcgt gacgctctcc tccctcactc ccatccgccg ccggcgaggc 1680

cctcttcgcc gccgtgtcct cctcgtcgtc gctgtatggg gcgaggccgc ggcccgcgag 1740

gggctcggtg gcggcgcggg gggatggggg agcagctcgg cgtacgtcgg cgacgagatt 1800

cgagtcaacg acgccgcgcc gcctctcccc tcaaatctcg gtagacgagt atatatgagg 1860

attgagaggt tccgatcacg gcgacggaac gaac 1894

<210> 2

<211> 4994

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 2

ccgacgtccc actgtagctc acctgtggga atcggtccca tctccagtag taggccgcag 60

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ctattcgggg ttctatgaca catgacgatg gtttcttact atatagtact aactgtgctt 180

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ggatgtatag acgaggatcg atgggatgtt tttatttctt atatgtatgg acttcatata 1560

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ccatccagaa ggcttgctgg gctgggccac ggccgaaacg gccaagtccc acctcagcgc 1860

caggttggct ggcgctgagt ttcccacagt cagcgccatt ttggctggcg ctgaggtcct 1920

agcccgcaag ccatccagaa ggcttgctgg gctggaccac ggccgaaacg gccaagtccc 1980

acctcagcgc cagccaacct ggcgccgagt ttcccacagt cagcgccatt atggctggcg 2040

ctgaggtccc agcccgcaag ccatccagaa ggcttgctgg tctgggcctg ggggttgcgg 2100

ccaagtccca cctcagcgcc agtccggttg gcgctgaggt tgggcacctc cgcgccgaag 2160

cggttggcgc tgaggttggg cacctccgcg ccgaagcggt tggcgctgag gtagctgcca 2220

cgtcagctag gggatcggcc cggccgccac ggtggcacaa tgtcagcgcc agtcccgttg 2280

gcgctgacac ggccaacgtc agcgccaatg tgtttggcgc tgaggcgacg gcctattttt 2340

ggttgaagtt tttggcaggg gttagtttcg aaataagttt tccaaaaggg tcaatttgtc 2400

aaaaaaacgg ctcgtccctg agtcaaagtc ttccctatta aattatgcgg catcactaac 2460

atcagctact ataaaagtcc cttccgcgtc actaacatca gctactataa aagtcccttc 2520

cgaaacatct tcctcccgca tcactaacat cagcttctat aaaagccctt ccttgttgca 2580

tcatctcaag gagctgcaag cacttcctct ctggcagcac ttcctcatct caaggagttg 2640

caaatgttgc atcatctcaa ggagctggca gccgtagccg gtatacacat gatcctcatc 2700

tacctctgcc gctttctcct ccgccgcagc cgcaacgtat tattcaccgt ttccaacagc 2760

ctccgttttc gcctcaaggt attaactgta ttgttgtaca tatgtctctc ggtcatgctg 2820

ttctacctgt ttggctccat catgccgctg ccgccgtggg gcctcgtggt cggttgggtc 2880

atggccctca tcgccgtcga gctcgcctac gccttcatct ttccatatag ctttcgctac 2940

atcgctgaca acgacgacga caagatggtt attctccctg tttaagcctt cagggcctat 3000

atatatagta tatatataaa gccttccata ctgtctcttc aataaaggct agcttgtgtt 3060

gtgagttgta tctgtgtacg tattttgttt ggttggttat atattgtcac gtaggtatgc 3120

catatatata tgtattgctg tatttatatt tgttactatc ttttgttttt cagataataa 3180

aattcagcca gctttgcttg cttcgtcgta cgtgtatgct catcatatcc tcatccatca 3240

gctgctcata gctagctggg ccgtgttata tgtgtgtagt gatcagtcac atccatgtat 3300

ttcatcccat gtatgttagt ttgtttttca tttttgaaag aaaacatgca tatatgttat 3360

aactcaaagt tttgagatga atttgatcat ctaatttatt tccgttttga attattctgc 3420

tctgttgttg caaacttttt tttttatgtt gggacacttt ctcctcggtt tgattgttat 3480

attgaattcg tcgattccag ctagtatata tttgctagtt tcactcagac aatcatgcct 3540

atttgctgat caggaacaat tgaaaacaac cattacagag ccagacgaaa ttaattaatt 3600

tacactcacc aattattcat catcacatct ctaaacatcg aattctggga ttccatcgtt 3660

cgtccccttc ccgcagccgt cggatcgcgg atcgacggtg gcagatcgct tcgttgaacg 3720

tttttgtaat ataccatttc ttgagggggg tttatgcaaa atatctctat cccttacctc 3780

ctcctacctc gccggcgtga cgctctcctc cctcactccc atccgccgcc ggcgaggccc 3840

tcttcgccgc cgtgtcctcc tcgtcgtcgc tgtatggggc gaggccgcgg cccgcgaggg 3900

gctcggtggc ggcgcggggg gatgggggag cagctcggcg tacgtcggcg acgagattcg 3960

agtcaacgac gccgcgccgc ctctcccctc aaatctcggt agacgagtat atatgaggat 4020

tgagaggttc cgatcacggc gacggaacga acccctccct tgttcgccat cgatggcttc 4080

ctcgacgaca gacagggcct ccggcctccc actctcccag gtttgcatta ttcccatccc 4140

tctgccgtcc gtacagaccg tgtgagttcg ggttgaagct aagcttcctc caattctgcg 4200

tgctcttgca cgaatcctac gaattccaga acctctttgc tcaaatccaa ggcttaaggc 4260

ctttttttgt tagaattaaa cctgtatttc cttataatat tagttctgtt tattcctgta 4320

cagaggcaag aaagctcacc agagaagcaa gcagacaagc taccaattct gaggtgagta 4380

cttactcatc tgcgtgttct taattgaact gaaaagtgca tctagatgtg ggtttttttt 4440

ttctgaattc agttaattta acaaggtttc catacctgac atgatgcaaa ttttgctcaa 4500

tgctttccag gtataatttg tagattaatg acctgttgga tccatttcag cataaccttt 4560

aggtatattc taatcctgta tttggtgttt gctaatggat tgcagtaaac ttttccaact 4620

ccattattat agataagaga gaatgcttgc aatggtgtac atgttgagaa cttgatcgat 4680

gagtatgtgt caacggttga ggacgtcaat gaaatcttga tgaagctata attttgatct 4740

acaagagcag cagaaagaaa ttgtcctttc tattttgctt ttaaaactag ggtttctttg 4800

cttttcattt tcacctctgc atggatgagg atcacaacca ggacctctgc ttgagctacc 4860

ctgtagtcac aaagaccttt gtcttgataa caagctgtat ttttgttaag atcacatata 4920

ttagttcttg tatcatgctc tctcaatact agttgtttca tgttgtccta ataactgagt 4980

cactgccttc tcct 4994

<210> 3

<211> 632

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttcagaggtc tctctcgact agtatggaat cggcagcaaa ggattttttc ctgtagtttt 60

cccacaacca ttttttacca tccgaatgat aggataggaa aaatatccaa gtgaacagta 120

ttcctataaa attcccgtaa aaagcctgca atccgaatga gccctgaagt ctgaactagc 180

cggtcacctg tacaggctat cgagatgcca tacaagagac ggtagtagga actaggaaga 240

cgatggttga ttcgtcaggc gaaatcgtcg tcctgcagtc gcatctatgg gcctggacgg 300

aataggggaa aaagttggcc ggataggagg gaaaggccca ggtgcttacg tgcgaggtag 360

gcctgggctc tcagcacttc gattcgttgg caccggggta ggatgcaata gagagcaacg 420

tttagtacca cctcgcttag ctagagcaaa ctggactgcc ttatatgcgc gggtgctggc 480

ttggctgccg tggggcctcg tggtcggttg ttttagagct agaaatagca agttaaaata 540

aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcttttt ttcaagagct 600

tggagtggat ggaccctgac gagacccacg ct 632

<210> 4

<211> 520

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttcagaggtc tctctgacac tggaatcggc agcaaaggat gcaagaacga actaagccgg 60

acaaaaaaaa aaggagcaca tatacaaacc ggttttattc atgaatggtc acgatggatg 120

atggggctca gacttgagct acgaggccgc aggcgagaga agcctagtgt gctctctgct 180

tgtttgggcc gtaacggagg atacggccca cgagcgtgta ctaccgcgcg ggatgccgct 240

gggcgctgcg ggggccgttg gatggggatc ggtgggtcgc gggagcgttg aggggagaca 300

ggtttagtac cacctcgcct accgaacaat gaagaaccca ccttataacc ccgcgcgctg 360

ccgcttgtgt tgaggcgagc tcgacggcga tggttttaga gctagaaata gcaagttaaa 420

ataaggctag tccgttatca acttgaaaaa gtggcaccga gtcggtgctt tttttcaaga 480

gcttggagtg gatggatacg cgtcggtcga gacccacgct 520

Claims (8)

1.一种DNA分子，其特征在于，所述DNA分子具体可为如下1)或2)所示的DNA分子：

1)序列表中序列2所示的DNA分子；

2)序列表中序列1所示的DNA分子。

2.与权利要求1所述的DNA分子相关的生物材料，为下述B1)至B8)中的任一种：

B1)含有所述的DNA分子的表达盒；

B2)含有所述的DNA分子的重组载体、或含有B1)所述表达盒的重组载体；

B3)含有所述的DNA分子的重组微生物、或含有B1)所述表达盒的重组微生物、或含有B2)所述重组载体的重组微生物；

B4)含有所述的DNA分子的转基因植物细胞系、或含有B1)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B5)含有所述的DNA分子的转基因植物组织、或含有B1)所述表达盒的转基因植物组织；

B6)含有所述的DNA分子的转基因植物器官、或含有B1)所述表达盒的转基因植物器官；

B7)降低所述的DNA分子表达的核酸分子；

B8)含有B7)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物、转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官。

3.植物抗病剂，其特征在于：所述植物抗病剂含有权利要求1所述的DNA分子、或/和权利要求2所述生物材料。

4.权利要求1所述的DNA分子、或权利要求2所述生物材料的下述P1-P5中的任一种应用：

P1、权利要求1所述的DNA分子、或权利要求2或3所述生物材料在调控植物抗病性中的应用；

P2、权利要求1所述的DNA分子、或权利要求2或3所述生物材料在制备提高水稻对白叶枯病抗性的产品中的应用；

P3、权利要求1所述的DNA分子、或权利要求2或3所述生物材料在培育抗白叶枯病水稻中的应用；

P4、权利要求1所述的DNA分子、或权利要求2或3所述生物材料在制备抗白叶枯病水稻产品中的应用；

P5、权利要求1所述的DNA分子、或权利要求2或3所述生物材料在水稻育种中的应用。

5.一种培育抗白叶枯病水稻的方法，其特征在于，包括将权利要求1所述的DNA分子导入目的水稻中，得到抗白叶枯病水稻；所述抗白叶枯病水稻对白叶枯病的抗病性高于所述目的水稻对白叶枯病的抗病性。

6.权利要求5所述的方法，其特征在于，所述目的水稻为不含权利要求1所述的DNA分子的水稻。

7.一种培育抗病性降低的转基因水稻的方法，其特征在于，包括敲除目的水稻中权利要求1所述的DNA分子，得到抗病性低于所述目的水稻的转基因水稻；所述抗病性为对水稻白叶枯病的抗性。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述敲除目的水稻中权利要求1所述的DNA分子通过CRISPR/Cas9方法实现。

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