CN103952403A - 水稻抗白叶枯病新基因Xa39紧密连锁的分子标记 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一个水稻抗白叶枯病新基因Xa39的分子标记方法，属于水稻抗病育种和分子遗传学领域。本发明实质是根据连锁分离规律，利用携带Xa39的抗白叶枯病水稻回交导入系FF329与亲本黄华占的F2群体，结合接种白叶枯病菌后各个体的表现型对目标基因进行连锁分析，将Xa39精细定位到水稻第11染色体上97Kb的区间内，并获得了与之紧密连锁的基于PCR的分子标记RM26985。将本发明应用于水稻抗病育种，可以快速准确地鉴定出抗白叶枯病基因型的个体，加快水稻抗病分子育种的进程。

Description

水稻抗白叶枯病新基因Xa39紧密连锁的分子标记
技术领域
本发明涉及一个水稻白叶枯病抗性新基因Xa39紧密连锁的分子标记，属于水稻抗病育种和分子遗传学领域，适用于在水稻抗病育种中引入白叶枯病抗性基因Xa39，利用紧密连锁的分子标记对该基因进行水稻抗白叶枯病性状的辅助选择育种。
背景技术
由黄单胞杆菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo)引起的水稻白叶枯病是是一种重要的水稻细菌病害，该病在我国南方稻区以及亚洲东南亚稻区经常暴发成灾，是水稻高产、稳产的重要限制因子之一。水稻与白叶枯病菌之间存在特异性的互作，培育和种植抗病品种是防治水稻白叶枯病最经济有效的方法。迄今，国内外已鉴定38个白叶枯病抗性基因，但是由于来源于野生稻的抗病基因难以转育、部分抗性基因仅具有成株期抗性以及大多抗性基因的抗谱较窄等原因，育种中利用的抗性基因十分有限。20世纪80年代以来，国内外水稻抗病育种中主要利用的白叶枯病抗性基因包括Xa3、Xa4、Xa7和Xa21。由于携带单一抗病基因水稻品种的大面积种植，我国广东以及东南亚其它稻区已相继出现对基因Xa4和Xa21有毒力的菌株。因此，鉴定白叶枯病抗性新基因，通过分子标记辅助选择利用新基因或与已知优良抗病基因进行聚合对于培育具有广谱持久抗性的水稻品种具有重要意义。
目前已鉴定的38个水稻抗白叶枯病基因主要来自水稻(Oryzae sativa L)栽培品种，O.longistaminata，O.rufipogon，O.minuta，O.officinalis以及O.nivara等野生稻种，此外，还有一些基因来自水稻诱变突变体(http：//www.ricedata.cn/gene/)。研究表明，植物抗病基因在进化过程中形成了几种共有的进化形式。植物祖先抗病基因的复制创造了新基因座，基因序列内的点突变以及基因间和基因内重组产生的变异也可以导致产生新的特异性抗病基因。我们的研究结果表明通过回交，将水稻种质资源中的遗传变异导入到主栽品种的优良遗传背景中，结合后代目标性状的定向选择，不仅可以培育不同轮回亲本的目标性状导入系系群，而且可以发掘有利基因。
本课题组2006年以来，培育了以黄华占为轮回亲本，以PSBRC66为供体亲本的BC1F4回交导入系群体。采用PXO61(Race1)、PXO86(Race2)、PXO79(Race3B)、PXO340(Race3C)、PXO71(Race4)、PXO112(Race5)、PXO99(Race6)、PXO145(Race7)、PXO280(Race8)、PXO339(Race9A)、PXO349(Race9B)、PXO347(Race9C)、PXO363(Race9D)、PXO341(Race10)14个菲律宾白叶枯病菌生理小种，以及CV(GD1358)、CII(KS6-6)、CIV(Z173)、CVI(OS198)、CVII(JS49-6)、GIV(GD-IV)、GV(GD-V)7个中国代表菌株在植株苗期对回交群体进行人工接种，鉴定各导入系的白叶枯病抗性。申请者发现株系FF329对上述21个菌株均表现典型的过敏性坏死抗病反应，病斑长度小于1cm；亲本黄华占和PSBRC66对各菌株的抗感反应一致，对PXO86(Race2)、PXO79(Race3B)、PXO340(Race3C)、PXO99(Race6)、PXO339(Race9A)、PXO349(Race9B)、PXO347(Race9C)、PXO363(Race9D)、CV(GD1358)、GV(GD-V)表现感病反应，病斑长度达13cm以上，表明FF329对白叶枯病具有与双亲不同的抗性反应。遗传分析表明，黄华占/FF329F1植株对白叶枯病菌强毒力代表菌株PXO99表现高度抗病反应，F2群体中抗病植株数目与感病植株数目符合3∶1分离规律；FF329/PSBRC66杂交F1植株对PXO99也表现高度抗病反应。上述结果表明FF239对白叶枯病的抗性由显性单基因控制。申请人首先采用集团分离分析法(bulkedsegregation analysis，BSA)将该基因定位在水稻第11染色体RM21(位于19.173Mb)和RM206(位于19.17322.481Mb)两个标记之间，经比较作图发现这一区间内已报道5个白叶枯病抗性基因：Xa10、Xa21、Xa23、Xa30和Xa36。Xa10、Xa21、Xa30、Xa36与FF329的抗谱不同(http：//www.ricedata.cn/gene)；Xa23与Xa39均对10菲律宾小种(P1、P2、P3c、P4、P5、P6、P7、P8、P9A、P10)和5个中国菌株(CV、CII、CIV，CVI和CVII)表现抗性，但抗性基因来源不同，Xa23来自O.rufipogon，FF329来自两个对白叶枯病菌均不产生免疫反应的栽培稻品种杂交后代，因此FF329携带一个新的抗白叶枯病显性基因，暂命名为Xa39。
由于Xa39是一个对白叶枯病菌具有广谱抗性的显性基因，特别是对抗病基因Xa4毒力菌株CV和抗病基因Xa21毒力菌株GV均表现免疫反应，该基因在改良常规稻和杂交稻育种中都具有重要的应用价值。因此，精细定位Xa39基因，寻找与其紧密连锁的分子标记，通过标记辅助选择技术培育水稻抗病新品种具有重要的意义。
发明内容
(一)技术问题
本发明针对上述研究背景，利用FF329与轮回亲本黄华占构建的F2分离群体为试材，筛选目标染色体区段的交换单株，结合表现型对目标基因进行高精确度的连锁分析，将Xa39基因精细定位到一个97kb的区间内；获得与之紧密连锁的基于PCR的分子标记RM26985，借助该标记可以有效筛选带有Xa39基因的抗白叶枯病的个体，主要用于水稻抗白叶枯病品种的培育。
(二)技术方案
水稻抗白叶枯病新基因紧密连锁的分子标记方法，其特征在于：
用一对位于水稻第11染色体的特异性PCR引物RM26985，其中正向引物序列为CACAAGACAACCTTCAATGG，反向引物序列为：GGCTTAGGAGCGTTTATAGG，扩增带有白叶枯病抗性新基因(Xa39)血缘的育种材料基因组DNA。如果能扩增出一条与FF329类似的170bp左右大小的片段，那么推测该育种材料可能含有Xa39的等位基因。水稻抗白叶枯病新基因Xa39及其分子标记方法可以应用于水稻育种。
(二)有益效果
本发明鉴定到的水稻第11染色体上的特异性引物是可以对抗白叶枯病新基因(Xa39)进行基因型鉴定的共显性分子标记。
本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：
(1)通过新基因标记的筛选，可以获得抗白叶枯病的育种材料。
(2)本发明的分子标记可以用于苗期中群体的基因型选择，有效地鉴别带有Xa39基因的个体，加快育种进程。
具体实施方式
下面结合具体实施实例，进一步阐述本发明。其中所用方法如无特别说明均为常规方法。
(一)水稻抗白叶枯病新基因精细定位及其紧密连锁标记获得
通过Gramene网站上公布的SSR引物，以及根据生物信息学比对测序的粳稻品种和籼稻品种9311在Xa39两侧连锁标记RM21和RM206之间的序列差异进一步设计的Indel引物扩增FF329及其亲本黄华占，筛选获得多态性分子标记。
以白叶枯病免疫株系FF329为父本，以轮回亲本黄华占为母本，配置杂交获得F1种子，在F1植株苗期人工接种白叶枯病菌代表菌株PXO99，选取抗病单株收获以获得F2群体。对获得的F2个体进行基因型分析，在接种菲律宾小种PXO99的1454个HHZ/FF329的F2个体中筛选出8个代表性重组体的标记基因型(表1)，结合表现性对目标基因进行高精度的连锁分析，将Xa39精细定位在标记RM26985和DM13之间97Kb的区间内。
表18个代表性重组体的标记基因型及其白叶枯抗病表现
1)A表示来自HHZ的纯合基因型、B表示来自FF329的纯合基因型、H表示杂合基因型。
(二)利用F2分离群体进行RM26985标记的验证
利用RM26985引物鉴定1454个HHZ/FF329的F2群体Xa39基因的分离及各个体对白叶枯病小种PXO99的抗性表现。经PCR扩增，反应产物在4％琼脂糖凝胶上电泳，经genefinder染料染色，群体中各个体分离出两条带型，3种基因型，其中一条分子量为170bp的带型来自抗病亲本FF329，另一条分子量为150bp的带型来自感病亲本黄华占和PSBRC66。RM26985的引物扩增后获得与FF329大小相同的片段(纯合基因型或杂合基因型)的单株表现为抗病，病斑长度均小于1em；与HHZ大小相同的片段(纯合型)的单株表现为感病，病斑长度大于10cm。在整个F2群体中利用RM26985的基因型预测抗病表型的正确率为99.72％(1450/1454)，表明RM26985标记与Xa39紧密连锁，通过RM26985标记基因型鉴定可以很好的鉴别Xa39基因型，预测植株对白叶枯菌的抗病性(图1)。
说明书附图说明
图1利用RM26985引物鉴定1454个HHZ/FF329的F2群体Xa39基因的分离及各个体对白叶枯病小种PXO99的抗性表现。电泳图上方M代表标准分子量标记(DL500DNAMarker)，HHZ代表感病亲本黄华占，P66代表PSBRC66，FF329为抗病亲本，编号1-35的数字代表从HHZ/FF329群体中随机抽取的35个F2单株。各单株基因型及其对应的病级标注在各单株编号上方，S表示感病(病斑长度大于10cm)，R表示抗病(病斑长度小于1cm)。

Claims (2)

1.水稻抗白叶枯病新基因Xa39紧密连锁的分子标记引物对RM26985，其正向引物序列为：CACAAGACAACCTTCAATGG，反向引物序列为：GGCTTAGGAGCGTTTATAGG。
2.权利要求1所述的水稻抗白叶枯病新基因Xa39的分子标记在水稻育种中的应用。
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