CN111233991A

CN111233991A - 水稻OsNBARC1蛋白及其编码基因在调控水稻对白叶枯病抗性中的应用

Info

Publication number: CN111233991A
Application number: CN202010209789.7A
Authority: CN
Inventors: 周永力; 卢家玲; 张帆; 黎志康
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-03-23
Filing date: 2020-03-23
Publication date: 2020-06-05
Anticipated expiration: 2040-03-23
Also published as: CN111233991B

Abstract

本发明涉及水稻OsNBARC1蛋白及其编码基因在调控水稻对白叶枯病抗性中的应用。本发明公开了水稻OsNBARC1蛋白的氨基酸序列，以及其编码基因的序列和编码区序列，并利用基因互补和基因编辑技术进行了功能验证。实验结果证明，OsNBARC1互补转基因植株对白叶枯病的抗性显著提高，相较于野生型植株，病斑长度下降61.9％左右，OsNBARC1基因敲除植株对白叶枯病的抗性显著降低，相较于野生型植株，病斑长度增加2.8倍左右。这些实验结果表明水稻OsNBARC1蛋白具有正向调控水稻的抗病性的功能，可以用于改良水稻对白叶枯病的抗性，对于培育抗白叶枯病水稻新品种具有重要意义。

Description

水稻OsNBARC1蛋白及其编码基因在调控水稻对白叶枯病抗性中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一个水稻抗病相关基因的功能与应用，具体涉及水稻OsNBARC1蛋白及其编码基因在调控水稻对白叶枯病抗性中的应用。

背景技术

水稻白叶枯病是由黄单胞杆菌水稻致病变种(Xanthomonas oryz ae pv.oryzae，Xoo)引起的一种重要的细菌性病害，发病范围较广。一般年份可导致水稻减产10％左右，严重时减产50％-60％。利用抗性基因培育抗病品种是目前防治水稻白叶枯病最经济有效的措施。

迄今，现有技术已报道45个水稻白叶枯病抗性基因(http://www.shigen.nig.ac.jp/rice/oryzabase/gene/list)。然而，来源于野生稻的抗病基因难以利用，部分抗性基因仅具有成株期抗性，并且大多抗性基因的抗谱较窄。在已鉴定的水稻白叶枯病抗性基因中，仅Xa3、Xa4、Xa21和Xa23等基因在生产中得以广泛应用。由于水稻白叶枯病菌具有高度的变异性，携带单个主效基因的抗病品种大面积推广种植后，潜在的毒性小种变为优势小种或病菌变异出现新的毒性小种，极易导致品种抗性丧失。

因此，鉴定水稻抗病相关基因有助于进一步培育抗病品种，增强植物的抗病性，有利于控制和降低水稻白叶枯病的危害。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供水稻OsNBARC1蛋白及其编码基因在调控水稻对白叶枯病抗性中的应用。

第一方面，本发明提供水稻OsNBARC1蛋白或其编码基因或水稻OsNBARC1蛋白编码基因的启动子驱动基因组全长序列在调控水稻对白叶枯病抗性中的应用。

本发明进一步提供水稻OsNBARC1蛋白或其编码基因或水稻OsNBARC1蛋白编码基因的启动子驱动基因组全长序列在水稻遗传育种或转基因水稻制备中的应用。

进一步地，通过提高所述水稻OsNBARC1蛋白编码基因的表达量，提高水稻的抗白叶枯病能力。

进一步地，所述提高所述水稻OsNBARC1蛋白编码基因的表达量为通过基因互补技术将所述水稻OsNBARC1蛋白编码基因的启动子驱动基因组全长序列转化至所述水稻中构建OsNBARC1互补转基因植株。

进一步地，所述水稻OsNBARC1蛋白具有如下任一种氨基酸序列：

i)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

ii)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸的替换、插入或缺失得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；

iii)与如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列；优选地，所述同源性至少90％；更优选为95％。

本发明的前期研究发现，对白叶枯病具有广谱抗性的水稻导入系FF329及其对PXO99A等菌株感病的轮回亲本黄华占(HHZ)接种后，OsNBARC1在FF329和HHZ之间差异表达，接种后24小时，OsNBARC1在FF329植株中显著上调表达，在HHZ植株中仅微量表达，推测该基因可能调控FF329对白叶枯病的抗病反应。本发明克隆了OsNBARC1基因，并通过基因互补和基因编辑技术进行了功能验证，发现水稻OsNBARC1基因在改良水稻对白叶枯病抗性方面具有重要意义。

第二方面，本发明提供水稻OsNBARC1蛋白编码基因的启动子驱动基因组全长序列，所述水稻OsNBARC1蛋白编码基因的启动子驱动基因组全长序列包括如SEQ ID NO.4所示核苷酸序列；

所述水稻OsNBARC1蛋白具有如下任一种氨基酸序列：

i)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

本发明进一步提供包含所述水稻OsNBARC1蛋白编码基因的启动子驱动基因组全长序列的生物材料，所述生物材料包括表达盒、载体或转基因植物细胞。

第三方面，本发明提供一种调控水稻对白叶枯病抗性的方法，包括：

调控水稻中水稻OsNBARC1蛋白编码基因的表达量；

所述水稻OsNBARC1蛋白编码基因具有如下任一种核苷酸序列：

i)如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

ii)如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸的替换、插入或缺失得到的编码相同功能蛋白的核苷酸序列；

优选地，所述水稻OsNBARC1蛋白编码基因的编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步地，使用如下引物可以扩增得到所述水稻OsNBARC1基因的编码区：

OsNBARC1-CDS-F:5’-ATGGAGTTCGCCACAGGGGC-3’，

OsNBARC1-CDS-R:5’-TTACCTCCTATTGTCAAGGTATTCTC-3’；

进一步地，通过提高所述水稻中所述水稻OsNBARC1蛋白编码基因的表达量，提高水稻的抗白叶枯病能力；或者，通过将OsNBARC1互补转基因植株与其他株系杂交，培育抗白叶枯病株系。

进一步地，所述提高所述水稻中所述水稻OsNBARC1蛋白编码基因的表达量为通过基因互补技术将所述水稻OsNBARC1蛋白编码基因的启动子驱动基因组全长序列转化至所述水稻中构建OsNBARC1互补转基因植株。

本发明具有如下有益效果：

本发明公开了水稻OsNBARC1蛋白的氨基酸序列，以及其编码基因的序列和编码区序列，并利用基因互补和基因编辑技术进行了功能验证。实验结果证明，OsNBARC1互补转基因植株对白叶枯病的抗性显著提高，相较于野生型植株，病斑长度下降61.9％左右，OsNBARC1基因敲除植株对白叶枯病的抗性显著降低，相较于野生型植株，病斑长度增加2.8倍左右。本发明提供的水稻OsNBARC1基因有正向调控水稻的抗病性的功能，可以用于改良水稻对白叶枯病的抗性，对于培育抗白叶枯病水稻新品种具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例4提供的水稻白叶枯病抗性基因OsNBARC1互补转基因植株的PCR鉴定结果；其中，M为DNA分子量标准(DL2000 DNA marker)，1为阳性对照，2为阴性对照，3为OsNBARC1互补转基因株系CP-1，4为OsNBARC1互补转基因株系CP-2，5为OsNBARC1互补转基因株系CP-3；

图2为本发明实施例4提供的经过CRISPR/Cas9敲除的OsNBARC1基因敲除株系KO-1、KO-2和KO-3的测序峰图；

图3为本发明实施例4提供的经过CRISPR/Cas9敲除的OsNBARC1基因敲除株系KO-1、KO-2和KO-3与FF329的氨基酸序列比较；

图4为本发明实施例5提供的黄华占(HHZ)和OsNBARC1基因互补转基因株系CP-1、CP-2和CP-3的病斑长度对比；

图5为本发明实施例5提供的FF329和OsNBARC1基因敲除株系KO-1、KO-2和KO-3的病斑长度对比。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1、水稻OsNBARC1基因的克隆

1.水稻OsNBARC1基因的基因组序列的获得

提取水稻品种FF329的叶片DNA，以此DNA为模板，利用：

正向引物OsNBARC1-F:5’-ACTCACTCCAAATCCTGAGTAGT-3’，

反向引物OsNBARC1-R:5’-AGCGGCCAATATGCTCGGAAT-3’；

用PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(Code:R050A，Takara)进行PCR扩增，得到扩增产物，即序列表中的SEQ ID NO.2，OsNBARC1基因序列。

2.水稻OsNBARC1基因的编码区序列的获得

取水稻品种FF329的叶片总RNA，采用FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix(Code:KR118，TIANGEN)合成cDNA，以此cDNA为模板，利用引物：

OsNBARC1-CDS-F:5’-ATGGAGTTCGCCACAGGGGC-3’，

OsNBARC1-CDS-R:5’-TTACCTCCTATTGTCAAGGTATTCTC-3’；

用PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(Code:R050A，Takara)进行PCR扩增，得到扩增产物，即序列表中的SEQ ID NO.3，OsNBARC1基因的编码区序列。序列分析发现，OsNBARC1基因含有1个RX-CC_like结构域和1个NB-ARC结构域，与水稻抗病蛋白RGA5、RGA4、Pik-6和Pik-2高度同源，可能在水稻中行使抗病防御功能。

实施例2、水稻OsNBARC1互补载体和基因编辑载体的构建

1.水稻OsNBARC1互补载体的构建

构建由OsNBARC1基因自身启动子驱动基因组全长序列的OsNBARC1基因互补载体pCAMBIA1300-OsNBARC1。操作步骤如下：

(1)提取水稻品种FF329的叶片DNA，以该DNA为模板，利用：

正向引物OsNBARC1-CP-F:5’-TTGGAAGAGCGAGAGACTTCG-3’，

反向引物OsNBARC1-CP-R:5’-AAAAGCAGCCACTCTTATCTCG-3’；

用PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(Code:R050A，Takara)进行PCR扩增，得到扩增产物(即序列表中的SEQ ID NO.4，OsNBAR C1基因自身启动子驱动基因组全长序列)，并进行切胶回收。

(2)将步骤(1)得到的扩增产物添加载体同源序列，具体步骤为：以步骤1的产物为模板，利用：

正向引物OsNBARC1-CP-BamHIF:5’-GAGCTCGGTACCCGGGGATCCTTGGAAGAGCGAGAGACTTCG-3’，

反向引物OsNBARC1-CP-HindIIIR:5’-ACGACGGCCAGTGCCAAGCTTAAAAGCAGCCACTCTTATCTCG-3’；

用PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(Code:R050A，Takara)进行PCR扩增，得到扩增产物(即带载体接头的OsNBARC1基因自身启动子驱动基因组全长序列)，并进行切胶回收。

(3)将步骤(2)得到的回收产物与经BamHI和HindIII酶切的载体pCAMBIA1300进行同源重组连接，得到含有SEQ ID NO.4所示的DNA片段的序列正确的重组载体，命名为pCAMBIA1300-OsNBARC1。

同源重组反应体系：经BamHI和HindIII酶切的载体pCAMBIA1300 50-100ng，步骤(2)的回收产物50-100ng，5×In-Fusion HD Enzyme Premix 2μL，加ddH₂O补充至10μL。

同源重组反应条件：50℃孵育15min。

将反应产物转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，得到正确的含有OsNBARC1基因自身启动子驱动基因组全长序列的表达载体pCAMBIA1300-OsNBARC1。pCAMBIA1300-OsNBARC1含有序列表中SEQ ID NO.4所示的OsNBARC1基因自身启动子驱动基因组全长序列。

2.水稻OsNBARC1基因编辑载体的构建

利用CRISPR/Cas9技术构建编辑OsNBARC1基因的重组载体，所用靶序列为靶序列1和靶序列2。

靶序列1：CACGCTCCTCCCCAAGCTGG(即序列表中SEQ ID NO.3的第27-46位)；将CRISPR/Cas9方法中靶向靶序列1的sgRNA记为sgRNA1；

靶序列2：GAGCCAAGTCAGGGAGGTGA(即序列表中SEQ ID NO.3的第378-397位)；将CRISPR/Cas9方法中靶向靶序列2的sgRNA记为sgRNA2。

sgRNA表达盒构建：

以pYLsgRNA-OsU6a载体为模板，使用引物：

U-F：5’-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3’，

U6a-OsNBARC1-R：5’-CCAGCTTGGGGAGGAGCGTGCGGCAGCCAAGCCAGCA-3’；

进行PCR扩增，将序列正确的DNA片段命名为U6a-OsNBARC1；以pYLsgRNA-OsU6a载体为模板，使用引物：

gR-OsNBARC1-1F：5’-CACGCTCCTCCCCAAGCTGGGTTTTAGAGCTAGAAAT-3’，

gR-R：5’-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3’；

进行PCR扩增，将序列正确的DNA片段命名为sgRNA-OsNBARC1-1。采用overlappingPCR方法将U6a-OsNBARC1和sgRNA-OsNBARC1-1连在一起，随后用引物：

Pps-GGL：5’-TTCAGAGGTCTCTCTCGACTAGTATGGAATCGGCAGCAAAGG-3’，

Pgs-GG2：5’-AGCGTGGGTCTCGTCAGGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3’；

进行PCR扩增加上酶切接头，将得到的序列正确的DNA片段命名为U6a-sgRNA-OsNBARC1，U6a-sgRNA-OsNBARC1即为sgRNA1表达盒。U6a-sgRNA-OsNBARC1的序列为序列表中SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.5的第44-490位为U6a启动子，第491-593位为sgRNA1的编码序列。U6a-sgRNA-OsNBARC1能编码sgRNA1，sgRNA1序列为序列表中SEQ ID NO.6。

以pYLsgRNA-OsU6b载体为模板，使用引物：

U-F：5’-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3’，

U6b-OsNBARC1-R：5’-TCACCTCCCTGACTTGGCTCAACACAAGCGGCAGC-3’；

进行PCR扩增，将序列正确的DNA片段命名为U6b-OsNBARC1；以pYLsgRNA-OsU6b载体为模板，使用引物：

gR-OsNBARC1-2F：5’-AGCCAAGTCAGGGAGGTGAGTTTTAGAGCTAGAAAT-3’，

gR-R：5’-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3’；

进行PCR扩增，将序列正确的DNA片段命名为sgRNA-OsNBARC1-2。采用overlappingPCR方法将U6b-OsNBARC1和sgRNA-OsNBARC1-2连在一起，随后用：

Pps-GG2：5’-TTCAGAGGTCTCTCTGACACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3’，

Pgs-GGR：5’-AGCGTGGGTCTCGACCGACGCGTATCCATCCACTCCAAGCTC-3’；

扩增加上酶切接头，将得到的序列正确的DNA片段命名为U6b-sgRNA-OsNBARC1，U6b-sgRNA-OsNBARC1即为sgRNA2表达盒。U6b-sgRNA-OsNBARC1的序列为序列表中SEQ IDNO.7，SEQ ID NO.7的第40-372位为U6b启动子，第373-474位为sgRNA2的编码序列。U6b-sgRNA-OsNBARC1能编码sgRNA2，sgRNA2序列为序列表中SEQ ID NO.8。

重组载体的构建：

将上述U6a-sgRNA-OsNBARC1和U6b-sgRNA-OsNBARC1分别与pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体进行酶切-连接反应，得到OsNBARC1基因敲除载体CRISPR/Cas9-OsNBARC1。

酶切-连接反应体系：U6a-sgRNA-OsNBARC1(10-15ng)，U6b-sgRNA-OsNBARC1(10-15ng)，pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体(60-80ng)，10×CutSmart Buffer 1.5μL，10mM ATP1.5μL，BsaI-HF10U，T4 DNA ligase 35U，加ddH₂O补充至15μL。

酶切-连接反应体程序：37℃10min，10℃5min，20℃5min，进行3个循环；37℃3min，10℃5min，20℃5min，进行10个循环。

取反应产物10-15μL转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，将得到的序列正确的重组载体命名为CRISPR/Cas9-OsNBARC1，CRISPR/Cas9-OsNBARC1含有sgRNA1表达盒和sgRNA2表达盒，能表达sgRNA1和sgRNA2以及Cas9。

实施例3、转基因植株的获得

分别利用实施例2中的pCAMBIA1300-OsNBARC1与CRISPR/Cas9-OsNBARC1制备转基因水稻，并分别利用空白载体pCAMBIA1300和pYLCRISPR/Cas9Pubi-H作为对照。分别利用黄华占(HHZ)、FF329作为制备转基因水稻的受体植物，其中水稻品种黄华占(HHZ)对白叶枯病菌株PXO99A表现高感，水稻品种FF329对白叶枯病菌株PXO99A表现高抗。具体步骤如下：

(1)取出植物的成熟种子，去壳，挑取饱满光洁无菌斑的种子进行消毒。

(2)将消毒后的种子接种到诱导培养基上，28℃、暗培养14天左右，选取外观良好，生长力好的愈伤组织。

(3)取实施例2中构建的重组载体pCAMBIA1300-OsNBARC1电击转入根癌农杆菌EHA105，得到重组菌。

(4)取步骤(3)得到的重组菌，用侵染培养基重悬菌体，得到菌悬液。

(5)将步骤(2)的黄华占愈伤组织浸泡于步骤(4)制备的EHA105/pCAMBIA1300-OsNBARC1菌悬液中，侵染20min。侵染后将菌悬液倒掉，取愈伤组织，用无菌滤纸吸干水分，然后置于共培养培养基上，培养28℃暗培养50-55h。

(6)完成步骤(5)后，挑选表面没有明显农杆菌的愈伤组织移至抑菌培养基中，28℃暗培养3-4天。

(7)完成步骤(6)后，将愈伤组织移至筛选培养基上，28℃暗培养30天，每10天继代一次。

(8)完成步骤(7)后，取新鲜潮霉素抗性的愈伤组织，接于预再生培养基中，28℃暗培养7天，然后置于光照培养间(12h光照/12h黑暗)继续培养7天后转入再生培养基上，继续光照培养，直至生长出再生植株，得到转基因植株。

将利用重组载体pCAMBIA1300-OsNBARC1得到的转基因植株记为OsNBARC1基因互补转基因植株，将利用载体pCAMBIA1300得到的转基因植株记为转基因空载对照植株。

按照上述方法，将黄华占替换为FF329，将pCAMBIA1300-OsNBARC1替换为CRISPR/Cas9-OsNBARC1，其他步骤均不变，得到转基因植株。将利用重组载体CRISPR/Cas9-OsNBARC1得到的转基因植株记为OsNBARC1基因敲除植株，将利用pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体得到的转基因植株记为基因敲除空载对照植株。

遗传转化所用培养基及配方：

诱导培养基：CaCl₂·2H₂O 440mg，KH₂PO₄ 170mg，MgSO₄·7H₂O 370mg，NH₄NO₃1650mg，KNO₃ 1900mg，KI 0.83mg，CoCl2·6H₂O 0.025mg，H₃BO₃ 6.2mg，Na₂MoO₄·2H₂O0.25mg，MnSO₄·4H₂O 22.3mg，CuSO₄·5H₂O 0.025mg，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg，Na₂-EDTA·2H₂O37.3mg，FeSO₄·7H₂O 27.8mg，VB1 0.1mg，VB6 0.5mg，烟酸0.5mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，2，4-D 2mg，水解酪蛋白2g，麦芽糖30g，琼脂3g，去离子水加至1L。

侵染培养基：配制方法参见参考文献：Hiei Y，Ohta S，Komari T，etal.Efficient transformation of rice(Oryza sativa，L.)mediated byAgrobacterium，and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA[J].PlantJournal，1994，6(2):271–282.。将参考文献中乙酰丁香酮的浓度替换为200μM。

共培养培养基：在诱导培养基中加入乙酰丁香酮和葡萄糖，使乙酰丁香酮在培养基中的终浓度为200μM，葡萄糖在培养基中的终浓度为10g/L。

抑菌培养基：在诱导培养基中头孢霉素，使头孢霉素在培养基中的终浓度为500mg/L。

筛选培养基：在诱导培养基中加入潮霉素和头孢霉素，使潮霉素在培养基中的终浓度为65mg/L，头孢霉素在培养基中的终浓度为500mg/L。

预再生培养基：CaCl₂·2H₂O 440mg，KH₂PO₄ 170mg，MgSO₄·7H₂O 370mg，NH₄NO₃1650mg，

KNO₃ 1900mg，KI 0.83mg，CoCl₂·6H2O 0.025mg，H₃BO₃ 6.2mg，Na₂MoO₄·2H₂O0.25mg，

MnSO₄·4H₂O 22.3mg，CuSO₄·5H₂O 0.025mg，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg，Na₂-EDTA·2H₂O37.3mg，FeSO₄·7H₂O 27.8mg，VB1 0.1mg，VB6 0.5mg，烟酸0.5mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，水解酪蛋白2g，麦芽糖30g，琼脂3g，激动素2mg，萘乙酸1mg，去离子水加至1L；倒平板之前加入潮霉素并使其浓度为50mg/L。

再生培养基：CaCl₂·2H₂O 440mg，KH₂PO₄ 170mg，MgSO₄·7H₂O 370mg，NH₄NO₃1650mg，KNO₃ 1900mg，KI 0.83mg，CoCl₂·6H₂O 0.025mg，H₃BO₃ 6.2mg，Na₂MoO₄·2H₂O0.25mg，MnSO₄·4H₂O 22.3mg，CuSO₄·5H₂O 0.025mg，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg，Na₂-EDTA·2H₂O37.3mg，FeSO₄·7H₂O 27.8mg，VB1 0.1mg，VB6 0.5mg，烟酸0.5mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，水解酪蛋白2g，麦芽糖30g，琼脂6g，激动素2mg，萘乙酸1mg，去离子水加至1L；倒平板之前加入潮霉素并使其浓度为50mg/L。

实施例4、转基因植株的鉴定

1.OsNBARC1基因互补植株的鉴定

待测植株：受体品种黄华占(HHZ)以及实施例3得到的OsNBARC1基因互补植株、转基因空载对照植株。

提取待测植株基因组DNA，以基因组DNA为模板，利用引物：

p1300-VF：5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’，

OsNBARC1-CPR：5’-TGAATCGCGTCAAGATCTCA-3’；

进行PCR扩增，用pCAMBIA1300-OsNBARC1质粒作为阳性对照，用受体品种黄华占作为阴性对照。

将PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，阳性对照和阳性OsNBARC1互补转基因植株均显示741bp的条带，转基因空载对照植株与阴性对照不能扩增出任何条带。部分样品的电泳图见图1。选取三个阳性OsNBARC1基因互补转基因株系分别记为CP-1、CP-2、CP-3。

2.OsNBARC1基因敲除植株的鉴定

待测植株：受体品种FF329以及实施例3得到的OsNBARC1基因敲除植株、基因敲除空载对照植株。

提取待测植株的基因组DNA，以基因组DNA为模板，使用引物：

OsNBARC1-TF：5’-CCCATCCTTCAATCCTTGACT-3’，

OsNBARC1-TR：5’-CCATCTTGAGCTTCTTGGGC-3’；

进行PCR扩增，以受体品种FF329为阴性对照。

将得到的PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，阴性对照显示约751bp的条带。

将PCR扩增产物进行测序，将OsNBARC1基因敲除植株的PCR扩增产物序列与阴性对照进行比对，基因敲除空载对照植株中OsNBARC1基因未发生改变，3个独立的OsNBARC1基因敲除植株(分别为KO-1、KO-2和KO-3)均在OsNBARC1基因的靶点1处发生了5bp的缺失，在靶点2处发生了3bp的缺失。3个敲除株系的测序峰图如图1所示。将序列翻译成氨基酸序列，比较FF329和3个独立的敲除株系发现，OsNBARC1基因敲除后，原有的编码蛋白截短，其生物学功能可能被破坏。3个敲除株系的测序峰图如图2所示，氨基酸序列比较如图3所示。

实施例5、转基因株系的抗白叶枯病鉴定

待测植株为：黄华占(HHZ)，阳性OsNBARC1基因互补转基因植株CP-1、CP-2、CP-3(T1代植株，均为纯合基因型)，转基因空载对照植株；FF329，OsNBARC1基因基因敲除植株KO-1、KO-2和KO-3(T1代植株，均为纯合基因型)，基因敲除空载对照植株。

1、将各待测植株在温室中培养约25天后移栽至网室中进行种植，单株种植，每种植株种植20株。

2、在步骤1水稻植株的分蘖盛期，用白叶枯病菌菌株PXO99A进行接种，采用剪叶法对水稻植株进行人工接种，每株接种5张叶片(菌液浓度为1×10⁹cfu/mL)，每个叶片的接种量均相等，均为40μL。

3、接菌约14天后测量各植株叶片的病斑长度，每个叶片沿叶脉有一个病斑，每个植株测量3张接种叶片的病斑长度，计算平均值。

由图4可以看出，黄华占(HHZ)的病斑长度为17.6cm，阳性OsNBARC1基因互补转基因植株CP-1、CP-2和CP-3株系的病斑长度分别为6.9cm、6.5cm和6.7cm，平均降低了约61.9％，均显著短于黄华占的病斑长度，表明OsNBARC1基因能显著提高水稻对白叶枯病的抗病性。由图5可以看出，CRISPR/Cas9敲除载体的受体植物FF329的病斑长度为0.5cm，阳性OsNBARC1基因敲除植株KO-1、KO-2和KO-3的病斑长度分别为2.3cm、1.8cm和1.6cm，平均超出了2.8倍，显著长于FF329的病斑长度，表明敲除OsNBARC1基因能够提高水稻对白叶枯病的感病性。

以上结果表明，OsNBARC1基因正向调控水稻对白叶枯病的抗性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 水稻OsNBARC1蛋白及其编码基因在调控水稻对白叶枯病抗性中的应用

<130> KHP201110680.9

<160> 29

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 273

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 1

Met Glu Phe Ala Thr Gly Ala Met Gly Thr Leu Leu Pro Lys Leu Val

1 5 10 15

Glu Leu Leu Lys Glu Gln Tyr Asp Leu Gln Lys Ser Val Lys Glu Gly

20 25 30

Ile Thr Phe Leu Ile Ala Glu Leu Lys Ser Ile Gln Ala Ala Leu Glu

35 40 45

Lys Val Ser Lys Val Pro Leu Asp Gln Leu Asp Glu Gln Thr Lys Ile

50 55 60

Trp Ala Trp Asp Ile Arg Glu Leu Ser Tyr Asp Ile Glu Asp Asn Ile

65 70 75 80

Asp Thr Phe Met Ile Cys Val Asp Gly Leu Glu Pro Ala Lys Lys Gln

85 90 95

Asn Leu Thr Trp Leu Ile Asp Lys Cys His Lys Ser Leu Ser Lys Ile

100 105 110

Lys Ile Arg His Lys Ile Ala Asn Glu Ile Lys Asp Ile Lys Ser Gln

115 120 125

Val Arg Glu Val Met Glu Arg Arg Asp Arg Tyr Lys Ile Asp Asp Val

130 135 140

Ala Thr Ile Pro Pro Thr Phe Val Asp Pro Arg Ile Leu Thr Leu Tyr

145 150 155 160

Glu Asn Val Thr Lys Leu Val Gly Val Asp Lys Ala Ser Asp Asp Leu

165 170 175

Met Lys Arg Leu Ser Val Gly Asp Glu Ala Pro Lys Lys Leu Lys Met

180 185 190

Val Ser Val Val Gly Ile Gly Gly Leu Gly Lys Thr Thr Leu Ser Lys

195 200 205

Val Val Phe Asp Lys Leu Lys Leu Gln Phe Asp Cys Ala Ala Phe Val

210 215 220

Pro Val Gly Gln Asn Pro Glu Ile Lys Lys Val Leu Lys Asp Ile Leu

225 230 235 240

Val Glu Leu Asn Lys Asp Lys Tyr Met Ser Phe Asp Val Thr Thr Val

245 250 255

Asn Glu Arg His Met Ile Asn Glu Leu Arg Glu Tyr Leu Asp Asn Arg

260 265 270

Arg

<210> 2

<211> 5015

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

actcactcca aatcctgagt agtccatggc gactccaccc acctgagcag aaagatctcc 60

tccaccacca ccagcagcag cagcatcagc caagagcagc aagaagccaa gaacaagagc 120

ttggctctcc aattcttttg caaggtcagc tgcattcgat tcaagtgtac tcccccctct 180

actttgcggt tgcagtttgt aggtgaacac ttttctgtcc tgagttgtta ggcatctgca 240

aggacgtctg aaacatttgg agagaacaca acaattaatc tgggtagact gtgtttttat 300

tgtgtaaaac tgggaaggaa acaaatacta ccagatctga acaaactatg taggaactgg 360

tcatctgata gttgtgtctg tcagaagatt tggggattaa cggttactat tgacttagct 420

caaagagcat ataaatgtgt acaagataag agagaaatcc ataataccct caatactctt 480

atcagtgtct ggtgagagtt aaagttacag aggatgccac aatcatcttc tctttctgca 540

tttgaatgaa catctgaaac agctatatac aattgaagaa atttgtgctt tgttgtgact 600

ctatgagatc ttgacgcgat tcattcggat cctgaattat tgttgttagt ccttaacaaa 660

tactattgtt gttacttaca gatattgagt gagtttggct agcaaggata tagacctgac 720

tacctaataa ctgtattctg tcctctattt aatagcttca gcagtttcaa tgattattga 780

gtttcgcttt ctttcaaaac tctgccttta tgtgtaaaca tgcttcgcca gctcttttgc 840

caaaatttcc catccttcaa tccttgactg ctaacagatt tcttatatgc tttttcattc 900

cagcagtgct tctcaaaatg gtttcatgtg tgaaccgagg cagctgtctg gtggtgaaca 960

gcaccatata atcatcacaa taaacagaga ggaggggggt ggggcgtagt aaaccatcag 1020

gaatggagtt cgccacaggg gcaatgggca cgctcctccc caagctggtg gagctgctca 1080

aggaacaata tgatctgcag aagagtgtga aggaggggat aacattcctc atagctgagc 1140

tcaagagcat acaagcagca cttgagaagg tctcaaaggt gccgctagac caacttgacg 1200

agcaaaccaa gatctgggct tgggacatta gggagttgtc ttatgacatt gaggacaaca 1260

ttgatacctt catgatatgt gtggatggtc ttgagccagc caagaaacag aatttaacat 1320

ggttaattga caagtgccac aaatcgttgt ccaagataaa gatccgacac aaaatagcca 1380

atgaaatcaa agatatcaag agccaagtca gggaggtgat ggaacgacgt gataggtaca 1440

agattgatga tgtcgctact attcctccaa catttgtgga tcctcgcatc ttgacattat 1500

atgagaatgt caccaagctt gttggggttg ataaggcaag tgatgatcta atgaagaggt 1560

tgtctgtggg ggatgaggcg cccaagaagc tcaagatggt ctctgttgtt ggaattggag 1620

gattgggcaa gacaactctt tccaaagtag tgtttgacaa gcttaaactg caatttgatt 1680

gtgctgcttt tgttcctgtc ggtcaaaacc ctgaaatcaa gaaagtcctg aaggacatcc 1740

tagttgaact taacaaggac aagtacatgt catttgatgt aacaacagta aatgaaaggc 1800

atatgattaa tgagcttcga gaataccttg acaataggag gtaagtgtgt agtaccctcc 1860

aatatttttg cttttcatga tgaacttatt ctcatggttg caatagttgt agacctttat 1920

ctgtattact ggtatatata actttttcta tatttcttta ataaaaaaag aatgaaaatg 1980

ttgcatagat caggaaaaca gaaaatgcaa cgaattctaa tgttaattgc agaacaggaa 2040

aaatatattt aactatctaa ctacattaat ccactcgttg ctagtgccag agaccaattt 2100

gatctaaaac cctttgattc aatagactta aataataaga tgagaattat gtttgcacac 2160

aaatgtcttg ggcactcata ttgcttcagt tttagaaaat agtaattaaa taatctctta 2220

tttatatatc agtacagttt atcatttcac taatccatga cccttctatt ctcatgggga 2280

taggtacttg attgttattg atgacgtatg ggagacatca aaatggaaca ttattaaatg 2340

tgctttgatt gatagtaatc gtggaagtag agtaatcata acaactcgta tttatcaagt 2400

tgctaatgaa gctgctgaag aatttggtgg tgtttacatg atggaaccac tttctgatga 2460

taactcaaaa aagttattct acaatagaat atttggtgtt gcctgcagta gttcaactgg 2520

taatcaatcg gttgaggcaa ccaaaaagat cttacataaa tgtggtggca taccactatc 2580

tataattgca atagctagtt tgttggttga taaaccaaca ggagactggt ctataattta 2640

tgactctata ggttttggga ctggagatcg aaatgaggcg gttcagaaca caaggaagat 2700

attgtctttt agctactatc acttaccctc atacctaaag acttgtatgt tgtacctaag 2760

catatatcca gaagatcatt tgattaaaaa ggatactttg atatggaagt gggtagctga 2820

aggctttgtc caagaggaac aagataaggc attatttgag gtcggcgaga ggtactttat 2880

tgagcttata aatagaagca tgatccagcc aatggagaat gatggtaaga tttctggctg 2940

ccacatacat gacatggtgt tagatcttat ccgaaacata atagccgaag aaaactttgt 3000

aaaagtattc gacaaactac atgaggtgca caggttgtct tcacagagga gtactgtccg 3060

taggatagca ctgcatgaga gttggaacca aggcaaaaac aatgaccttg ctgttggcat 3120

gacacaattg aggtcattca atgccatcaa gtgtactatt agcatgatgc cctcgcttct 3180

gagcttccag gttctacgcg tgctagagct acaaggctgt aatgtcacag gaggtttata 3240

cctcaagcat atcggaaagc tacgtcagtt gaggtaccta ggaatgagag gcacacgtgt 3300

tgctgagctt ccagtggaaa tagggaatct gatgcacctg cagacactag atgtccgata 3360

cacaggtctg aaggaactgc cgtcgaccat ttgtaagcta agcaagctga tgcggctgtg 3420

cgtcgctgga ggaacgggcg tgctgatggg tggttggaat ctgagttcac tgcaatacct 3480

aaagatgggc tatggttgca tcaaaagtaa caaagacttc gccatagaag tgggcaagct 3540

gatggagctg agaatcctca agatttatgt agagaacaag tttgacaagg gcacgaagaa 3600

cgctttgcta cagtctctgt gctgcttgcg tagactccag aacctgatga tagatttccc 3660

cttgccattt cagaatacga tgagcatctg ggatggctgg gacctctggg agccctcacc 3720

tcagctccgt gtgttccgta tatgcggcat tgagctgcct cggcttccag agtgggtgaa 3780

ctccatgtgc gtcccgtacc tatccgagct gcgacttgac gtggtagcca tggaagcacg 3840

ggacctggac atgcttgcaa ggatgccagc actccgcaca ctctgcctga gaacccaggc 3900

gagattttcg tggacagttg gtggtgccgg actgtttccg aacctgagat tctgtaggat 3960

ggacatagca ctcacatttc ttcaaggagc catgccgatg ctcatgaagc ttcaattatg 4020

gctgtgggcg tctgaatatt gtgccgccac tgacgttgga ttggggcacc tccctctgct 4080

caatcgcgtc gaagttatcc tccactgctg cgatgcgact accaggcagg tggaggaagc 4140

agaggcggcg tggaggcaca tggtgaattc tcacccgaac cgtcccgcca ttcgtgtgtc 4200

ccgacttgaa gaggtatggt tggtttggtt aatcatgatt aatcaattgg ttagttcaca 4260

ttcccctacc tacacgcacg cctccccact tctgactgcc ctccaaattc tgtaaccaat 4320

cagctttact tgttctcaat tgacgtattt cgttcctcag ttcatatcgc tctcgcactt 4380

tgtttttcag taccggatga aaggagatga agataatgat gatgaggaga tttcagctaa 4440

ggatcacgtt gacggaaatt gtgacgatgg gaattcagca tatacggacc aagaggtgct 4500

gcgcttgcgc ctgccatgca taactattcg atcctggttg catgattaat tacatgctct 4560

tggttactga ccggaggtta attagtcgcc tgttctagcc ggacaatgat ttagccaaag 4620

aggaggaaga ggaggaggct acgaaccaat cttgaaccgg atctcttcac tcattcggtc 4680

atgctttcag gtacacatgt accaaagttg cacatcaaaa tcttcatgac attcttcaac 4740

tttaatcata cgcttatctc taacttttat tcccggctgt aattaaacag cggcagctgc 4800

agggcaagag aagaataaaa gggagaagag tagagcggaa ttgaagagaa actcatctcc 4860

ttcgctgggc cttttttttt atttttttgt tgctgttggt tttctttccc tgttttttct 4920

caagaattta tatagtgtgg tttgtaataa tggttgtctc ggttacaata aggcccaagt 4980

aggctcagac agaaattccg agcatattgg ccgct 5015

<210> 3

<211> 822

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 3

atggagttcg ccacaggggc aatgggcacg ctcctcccca agctggtgga gctgctcaag 60

gaacaatatg atctgcagaa gagtgtgaag gaggggataa cattcctcat agctgagctc 120

aagagcatac aagcagcact tgagaaggtc tcaaaggtgc cgctagacca acttgacgag 180

caaaccaaga tctgggcttg ggacattagg gagttgtctt atgacattga ggacaacatt 240

gataccttca tgatatgtgt ggatggtctt gagccagcca agaaacagaa tttaacatgg 300

ttaattgaca agtgccacaa atcgttgtcc aagataaaga tccgacacaa aatagccaat 360

gaaatcaaag atatcaagag ccaagtcagg gaggtgatgg aacgacgtga taggtacaag 420

attgatgatg tcgctactat tcctccaaca tttgtggatc ctcgcatctt gacattatat 480

gagaatgtca ccaagcttgt tggggttgat aaggcaagtg atgatctaat gaagaggttg 540

tctgtggggg atgaggcgcc caagaagctc aagatggtct ctgttgttgg aattggagga 600

ttgggcaaga caactctttc caaagtagtg tttgacaagc ttaaactgca atttgattgt 660

gctgcttttg ttcctgtcgg tcaaaaccct gaaatcaaga aagtcctgaa ggacatccta 720

gttgaactta acaaggacaa gtacatgtca tttgatgtaa caacagtaaa tgaaaggcat 780

atgattaatg agcttcgaga ataccttgac aataggaggt aa 822

<210> 4

<211> 6309

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 4

ttggaagagc gagagacttc gcatctggct ggataagtat cttcttcctc ctcctcagat 60

gtctcactca ctccaaatcc tgagtagtcc atggcgactc cacccacctg agcagaaaga 120

tctcctccac caccaccagc agcagcagca tcagccaaga gcagcaagaa gccaagaaca 180

agagcttggc tctccaattc ttttgcaagg tcagctgcat tcgattcaag tgtactcccc 240

cctctacttt gcggttgcag tttgtaggtg aacacttttc tgtcctgagt tgttaggcat 300

ctgcaaggac gtctgaaaca tttggagaga acacaacaat taatctgggt agactgtgtt 360

tttattgtgt aaaactggga aggaaacaaa tactaccaga tctgaacaaa ctatgtagga 420

actggtcatc tgatagttgt gtctgtcaga agatttgggg attaacggtt actattgact 480

tagctcaaag agcatataaa tgtgtacaag ataagagaga aatccataat accctcaata 540

ctcttatcag tgtctggtga gagttaaagt tacagaggat gccacaatca tcttctcttt 600

ctgcatttga atgaacatct gaaacagcta tatacaattg aagaaatttg tgctttgttg 660

tgactctatg agatcttgac gcgattcatt cggatcctga attattgttg ttagtcctta 720

acaaatacta ttgttgttac ttacagatat tgagtgagtt tggctagcaa ggatatagac 780

ctgactacct aataactgta ttctgtcctc tatttaatag cttcagcagt ttcaatgatt 840

attgagtttc gctttctttc aaaactctgc ctttatgtgt aaacatgctt cgccagctct 900

tttgccaaaa tttcccatcc ttcaatcctt gactgctaac agatttctta tatgcttttt 960

cattccagca gtgcttctca aaatggtttc atgtgtgaac cgaggcagct gtctggtggt 1020

gaacagcacc atataatcat cacaataaac agagaggagg ggggtggggc gtagtaaacc 1080

atcaggaatg gagttcgcca caggggcaat gggcacgctc ctccccaagc tggtggagct 1140

gctcaaggaa caatatgatc tgcagaagag tgtgaaggag gggataacat tcctcatagc 1200

tgagctcaag agcatacaag cagcacttga gaaggtctca aaggtgccgc tagaccaact 1260

tgacgagcaa accaagatct gggcttggga cattagggag ttgtcttatg acattgagga 1320

caacattgat accttcatga tatgtgtgga tggtcttgag ccagccaaga aacagaattt 1380

aacatggtta attgacaagt gccacaaatc gttgtccaag ataaagatcc gacacaaaat 1440

agccaatgaa atcaaagata tcaagagcca agtcagggag gtgatggaac gacgtgatag 1500

gtacaagatt gatgatgtcg ctactattcc tccaacattt gtggatcctc gcatcttgac 1560

attatatgag aatgtcacca agcttgttgg ggttgataag gcaagtgatg atctaatgaa 1620

gaggttgtct gtgggggatg aggcgcccaa gaagctcaag atggtctctg ttgttggaat 1680

tggaggattg ggcaagacaa ctctttccaa agtagtgttt gacaagctta aactgcaatt 1740

tgattgtgct gcttttgttc ctgtcggtca aaaccctgaa atcaagaaag tcctgaagga 1800

catcctagtt gaacttaaca aggacaagta catgtcattt gatgtaacaa cagtaaatga 1860

aaggcatatg attaatgagc ttcgagaata ccttgacaat aggaggtaag tgtgtagtac 1920

cctccaatat ttttgctttt catgatgaac ttattctcat ggttgcaata gttgtagacc 1980

tttatctgta ttactggtat atataacttt ttctatattt ctttaataaa aaaagaatga 2040

aaatgttgca tagatcagga aaacagaaaa tgcaacgaat tctaatgtta attgcagaac 2100

aggaaaaata tatttaacta tctaactaca ttaatccact cgttgctagt gccagagacc 2160

aatttgatct aaaacccttt gattcaatag acttaaataa taagatgaga attatgtttg 2220

cacacaaatg tcttgggcac tcatattgct tcagttttag aaaatagtaa ttaaataatc 2280

tcttatttat atatcagtac agtttatcat ttcactaatc catgaccctt ctattctcat 2340

ggggataggt acttgattgt tattgatgac gtatgggaga catcaaaatg gaacattatt 2400

aaatgtgctt tgattgatag taatcgtgga agtagagtaa tcataacaac tcgtatttat 2460

caagttgcta atgaagctgc tgaagaattt ggtggtgttt acatgatgga accactttct 2520

gatgataact caaaaaagtt attctacaat agaatatttg gtgttgcctg cagtagttca 2580

actggtaatc aatcggttga ggcaaccaaa aagatcttac ataaatgtgg tggcatacca 2640

ctatctataa ttgcaatagc tagtttgttg gttgataaac caacaggaga ctggtctata 2700

atttatgact ctataggttt tgggactgga gatcgaaatg aggcggttca gaacacaagg 2760

aagatattgt cttttagcta ctatcactta ccctcatacc taaagacttg tatgttgtac 2820

ctaagcatat atccagaaga tcatttgatt aaaaaggata ctttgatatg gaagtgggta 2880

gctgaaggct ttgtccaaga ggaacaagat aaggcattat ttgaggtcgg cgagaggtac 2940

tttattgagc ttataaatag aagcatgatc cagccaatgg agaatgatgg taagatttct 3000

ggctgccaca tacatgacat ggtgttagat cttatccgaa acataatagc cgaagaaaac 3060

tttgtaaaag tattcgacaa actacatgag gtgcacaggt tgtcttcaca gaggagtact 3120

gtccgtagga tagcactgca tgagagttgg aaccaaggca aaaacaatga ccttgctgtt 3180

ggcatgacac aattgaggtc attcaatgcc atcaagtgta ctattagcat gatgccctcg 3240

cttctgagct tccaggttct acgcgtgcta gagctacaag gctgtaatgt cacaggaggt 3300

ttatacctca agcatatcgg aaagctacgt cagttgaggt acctaggaat gagaggcaca 3360

cgtgttgctg agcttccagt ggaaataggg aatctgatgc acctgcagac actagatgtc 3420

cgatacacag gtctgaagga actgccgtcg accatttgta agctaagcaa gctgatgcgg 3480

ctgtgcgtcg ctggaggaac gggcgtgctg atgggtggtt ggaatctgag ttcactgcaa 3540

tacctaaaga tgggctatgg ttgcatcaaa agtaacaaag acttcgccat agaagtgggc 3600

aagctgatgg agctgagaat cctcaagatt tatgtagaga acaagtttga caagggcacg 3660

aagaacgctt tgctacagtc tctgtgctgc ttgcgtagac tccagaacct gatgatagat 3720

ttccccttgc catttcagaa tacgatgagc atctgggatg gctgggacct ctgggagccc 3780

tcacctcagc tccgtgtgtt ccgtatatgc ggcattgagc tgcctcggct tccagagtgg 3840

gtgaactcca tgtgcgtccc gtacctatcc gagctgcgac ttgacgtggt agccatggaa 3900

gcacgggacc tggacatgct tgcaaggatg ccagcactcc gcacactctg cctgagaacc 3960

caggcgagat tttcgtggac agttggtggt gccggactgt ttccgaacct gagattctgt 4020

aggatggaca tagcactcac atttcttcaa ggagccatgc cgatgctcat gaagcttcaa 4080

ttatggctgt gggcgtctga atattgtgcc gccactgacg ttggattggg gcacctccct 4140

ctgctcaatc gcgtcgaagt tatcctccac tgctgcgatg cgactaccag gcaggtggag 4200

gaagcagagg cggcgtggag gcacatggtg aattctcacc cgaaccgtcc cgccattcgt 4260

gtgtcccgac ttgaagaggt atggttggtt tggttaatca tgattaatca attggttagt 4320

tcacattccc ctacctacac gcacgcctcc ccacttctga ctgccctcca aattctgtaa 4380

ccaatcagct ttacttgttc tcaattgacg tatttcgttc ctcagttcat atcgctctcg 4440

cactttgttt ttcagtaccg gatgaaagga gatgaagata atgatgatga ggagatttca 4500

gctaaggatc acgttgacgg aaattgtgac gatgggaatt cagcatatac ggaccaagag 4560

gtgctgcgct tgcgcctgcc atgcataact attcgatcct ggttgcatga ttaattacat 4620

gctcttggtt actgaccgga ggttaattag tcgcctgttc tagccggaca atgatttagc 4680

caaagaggag gaagaggagg aggctacgaa ccaatcttga accggatctc ttcactcatt 4740

cggtcatgct ttcaggtaca catgtaccaa agttgcacat caaaatcttc atgacattct 4800

tcaactttaa tcatacgctt atctctaact tttattcccg gctgtaatta aacagcggca 4860

gctgcagggc aagagaagaa taaaagggag aagagtagag cggaattgaa gagaaactca 4920

tctccttcgc tgggcctttt tttttatttt tttgttgctg ttggttttct ttccctgttt 4980

tttctcaaga atttatatag tgtggtttgt aataatggtt gtctcggtta caataaggcc 5040

caagtaggct cagacagaaa ttccgagcat attggccgct aaactgtcat gtgtgatttt 5100

tacactatgc ttgtttctca tgatcacctg ttttacttga ttcaaaggtt gttggttgga 5160

acatggaagc atttgtttca gatatgacga tcgtggtagt agcacctgaa ttctgaaagc 5220

agccggcaga aacagcacac catactgatg ccttgaccca ggactacatg atatatgatg 5280

cacaggaatg tcggtacttt gttttccttt gcttttcaca cacatgtagc aaagcagaag 5340

atctgcagca agttcgcagc ggaaaatgta caccgtattc ctgtgtgtct gtgttcttgt 5400

ctgtgcgtgc ctgtgatcca ggagctgtgc ttgctctcct ggagtccggt gagcgaggaa 5460

caggaaatgg cgagcttcct tccattgacc tgctacaccg atagaattga gcatattgca 5520

aataaaaagt aagttcagac tcaaggcgga agacaaacca tgaaccatgt ggtgctcata 5580

attaagttca gcacgaaaaa aaccatagga ggaatccata ccaacgtgtt tggcacagag 5640

tctcggtttg gaaacatgct aaatgttata attcgaaatc ttaactgtcg cagaaaaaaa 5700

aattctccag tttggtagaa tacactaaaa attacatgtt ttcaaataga accctcatta 5760

acaaacaaat tcctgagttt aaagcagagc taagtgaact tcaagtttga tgagtaataa 5820

ttaatgtgat tccggtggga atcatgttag attaattcat gagttccaaa gtatcgaggg 5880

atatgtttga ctttgattcc ctccaaaatg cacgcgaact taaaatgaaa ggcctcttaa 5940

taaagtttac atttatacaa aagttgaaaa aaaaatgatc ttcattagca tataacaatg 6000

catactgtct tcattagcat aaaaatgcat actgcaggct aatgcagaat acaatatgaa 6060

acaaaataat ctaaatctca tggtgtattt atagcaaaaa gaaatgtcga tttaagtaca 6120

attaatctac cataatctaa aaaacatcat aagctgccat ccatacaaac gaaattaagc 6180

cgaggactaa tcacatgtgc ataatataca taagagctta cataagatta cactagctaa 6240

ttaatcaact agctagctta gtgaaggtga gagagtatta gtgtcgtcga gataagagtg 6300

gctgctttt 6309

<210> 5

<211> 633

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttcagaggtc tctctcgact agtatggaat cggcagcaaa ggattttttc ctgtagtttt 60

cccacaacca ttttttacca tccgaatgat aggataggaa aaatatccaa gtgaacagta 120

ttcctataaa attcccgtaa aaagcctgca atccgaatga gccctgaagt ctgaactagc 180

cggtcacctg tacaggctat cgagatgcca tacaagagac ggtagtagga actaggaaga 240

cgatggttga ttcgtcaggc gaaatcgtcg tcctgcagtc gcatctatgg gcctggacgg 300

aataggggaa aaagttggcc ggataggagg gaaaggccca ggtgcttacg tgcgaggtag 360

gcctgggctc tcagcacttc gattcgttgg caccggggta ggatgcaata gagagcaacg 420

tttagtacca cctcgcttag ctagagcaaa ctggactgcc ttatatgcgc gggtgctggc 480

ttggctgccg cacgctcctc cccaagctgg gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat 540

aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt tttcaagagc 600

ttggagtgga tggaccctga cgagacccac gct 633

<210> 6

<211> 103

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cacgctcctc cccaagctgg gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt ttt 103

<210> 7

<211> 519

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttcagaggtc tctctgacac tggaatcggc agcaaaggat gcaagaacga actaagccgg 60

acaaaaaaaa aaggagcaca tatacaaacc ggttttattc atgaatggtc acgatggatg 120

atggggctca gacttgagct acgaggccgc aggcgagaga agcctagtgt gctctctgct 180

tgtttgggcc gtaacggagg atacggccca cgagcgtgta ctaccgcgcg ggatgccgct 240

gggcgctgcg ggggccgttg gatggggatc ggtgggtcgc gggagcgttg aggggagaca 300

ggtttagtac cacctcgcct accgaacaat gaagaaccca ccttataacc ccgcgcgctg 360

ccgcttgtgt tgagccaagt cagggaggtg agttttagag ctagaaatag caagttaaaa 420

taaggctagt ccgttatcaa cttgaaaaag tggcaccgag tcggtgcttt ttttcaagag 480

cttggagtgg atggatacgc gtcggtcgag acccacgct 519

<210> 8

<211> 102

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agccaagtca gggaggtgag ttttagagct agaaatagca agttaaaata aggctagtcc 60

gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcttttt tt 102

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

actcactcca aatcctgagt agt 23

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agcggccaat atgctcggaa t 21

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atggagttcg ccacaggggc 20

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ttacctccta ttgtcaaggt attctc 26

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ttggaagagc gagagacttc g 21

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aaaagcagcc actcttatct cg 22

<210> 15

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gagctcggta cccggggatc cttggaagag cgagagactt cg 42

<210> 16

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

acgacggcca gtgccaagct taaaagcagc cactcttatc tcg 43

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ctccgtttta cctgtggaat cg 22

<210> 18

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ccagcttggg gaggagcgtg cggcagccaa gccagca 37

<210> 19

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cacgctcctc cccaagctgg gttttagagc tagaaat 37

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cggaggaaaa ttccatccac 20

<210> 21

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ttcagaggtc tctctcgact agtatggaat cggcagcaaa gg 42

<210> 22

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

agcgtgggtc tcgtcagggt ccatccactc caagctc 37

<210> 23

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

tcacctccct gacttggctc aacacaagcg gcagc 35

<210> 24

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

agccaagtca gggaggtgag ttttagagct agaaat 36

<210> 25

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

agcgtgggtc tcgaccgacg cgtatccatc cactccaagc tc 42

<210> 26

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

caggaaacag ctatgacc 18

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

tgaatcgcgt caagatctca 20

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

cccatccttc aatccttgac t 21

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

ccatcttgag cttcttgggc 20

Claims

1.水稻OsNBARC1蛋白或其编码基因或水稻OsNBARC1蛋白编码基因的启动子驱动基因组全长序列在调控水稻对白叶枯病抗性中的应用。

2.水稻OsNBARC1蛋白或其编码基因或水稻OsNBARC1蛋白编码基因的启动子驱动基因组全长序列在水稻遗传育种或转基因水稻制备中的应用。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，通过提高所述水稻OsNBARC1蛋白编码基因的表达量，提高水稻的抗白叶枯病能力。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述提高所述水稻OsNBARC1蛋白编码基因的表达量为通过基因互补技术将所述水稻OsNBARC1蛋白编码基因的启动子驱动基因组全长序列转化至所述水稻中构建OsNBARC1互补转基因植株。

5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述水稻OsNBARC1蛋白具有如下任一种氨基酸序列：

i)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

6.水稻OsNBARC1蛋白编码基因的启动子驱动基因组全长序列，其特征在于，所述水稻OsNBARC1蛋白编码基因的启动子驱动基因组全长序列包括如SEQ ID NO.4所示核苷酸序列；

所述水稻OsNBARC1蛋白具有如下任一种氨基酸序列：

i)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

7.一种生物材料，其特征在于，所述生物材料包括权利要求6所述水稻OsNBARC1蛋白编码基因的启动子驱动基因组全长序列，所述生物材料包括表达盒、载体或转基因植物细胞。

8.一种调控水稻对白叶枯病抗性的方法，其特征在于，包括：

调控水稻中水稻OsNBARC1蛋白编码基因的表达量；

所述水稻OsNBARC1蛋白编码基因具有如下任一种核苷酸序列：

i)如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，通过提高所述水稻中所述水稻OsNBARC1蛋白编码基因的表达量，提高水稻的抗白叶枯病能力；或者，通过将OsNBARC1互补转基因植株与其他株系杂交，培育抗白叶枯病株系。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述提高所述水稻中所述水稻OsNBARC1蛋白编码基因的表达量为通过基因互补技术将权利要求6所述水稻OsNBARC1蛋白编码基因的启动子驱动基因组全长序列转化至所述水稻中构建OsNBARC1互补转基因植株。