CN114350687B - 一种水稻抗白叶枯病基因、蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种水稻抗白叶枯病基因、蛋白及其应用，属于分子生物学技术领域。本发明首次获得了水稻抗白叶枯病基因Xa47(t)的核苷酸序列和编码区序列，通过功能互补和基因敲除技术进行功能验证和功能评估可知，相对于感白叶枯病材料，转入本发明所述抗白叶枯病基因Xa47(t)的水稻病斑长度明显较短，表现出较强的抗病特性，对11个菌株达到抗到高抗的水平，具有广谱高抗白叶枯病的特性，对于培育水稻抗病新品种具有重要意义。

Description

一种水稻抗白叶枯病基因、蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种水稻抗白叶枯病基因、蛋白及其应用。

背景技术

水稻白叶枯病、稻瘟病和纹枯病是我国水稻生产中的三大病害，其中水稻白叶枯病由稻黄单胞杆菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，简称Xoo)引起，是世界范围内最严重的细菌性病害，我国除新疆、西藏和东北的北部以外均有不同程度的发生，长江以南和江淮平原籼稻产区为常发区，遭受白叶枯病危害后易造成水稻减产20％～30％，严重时可达50％，甚至绝收。在目前全球气候急剧变化的情况下，水稻白叶枯病发生面积在逐年增加，水稻产量损失严重，已严重威胁到国家粮食安全(陈功友,徐正银,杨阳阳,等.我国水稻白叶枯病菌致病型划分和水稻抗病育种中应注意的问题.上海交通大学学报(农业科学版),2019,37(1):71-77.)。克服该病害的有效途径需不断培育抗病新品种，以抵御白叶枯病菌的不断变异。尤其是发掘出广谱高抗白叶枯病的基因，并服务于育种实践，已成为目前水稻分子育种的重要目标。

在水稻新品种的培育历程中，将来自栽培品种或其近缘野生种中的优良基因不断重组、聚合已成为一种常态，但栽培品种中原有的遗传资源利用日趋饱和，从远缘种群中引入优良基因创作新的水稻品种扩大亲本间遗传差异已成为一种新的研究热点。栽培稻有20多个野生近缘种，含有极其丰富的遗传变异。云南省是亚洲栽培稻的遗传多样性中心和起源中心之一，分布有普通野生稻(Oryza rufipogon Griff.)、药用野生稻(Oryzaofficinalis Wall.)和疣粒野生稻(Oryza granulataBaill.)三种野生种，而且每种野生稻具有许多亚种或生态类型，这些种质资源在表型和分子水平上都具有较高的遗传多样性，拥有显著的抗逆、抗病虫害、耐寒、耐旱和耐贫瘠等许多优良性状(程在全.云南野生稻遗传特性及其优良基因克隆研究.四川:四川大学,2006.)。因此，利用广谱高抗白叶枯病的野生资源培育水稻新品种，这不仅将大大降低生产成本，而且具有重要的生态意义。

前期我们利用广谱高抗白叶枯病的元江普通野生稻渗入系(元江普通野生稻与栽培稻合系35杂交后代BC₂F₁₆)精细定位到了一个位于水稻11号染色体的显性抗白叶枯病基因Xa47(t)(陈玲,钟巧芳,王玲仙,等.与水稻广谱高抗白叶枯病基因Xa45(t)紧密连锁的分子标记Hxjy-14,2020a,中国,ZL201910825566.0.；陈玲,王波,程在全,等.水稻广谱高抗白叶枯病基因Xa45(t)的共分离分子标记Hxjy-1,2020b,中国,ZL201910825603.0.；陈玲,程在全,王波,等.与水稻广谱高抗叶枯病基因Xa45(t)紧密连锁分子标记R13I14,2020c,中国,ZL201910825560.3.)，之前暂命名为Xa45(t)，因与位于4号染色体的水稻抗白叶枯病基因Xa1的等位基因Xa45(t)重名(Ji CH,Ji ZY,Liu B,et al.Xa1 allelic R genesactivate rice blight resistance suppressed by interfering TAL effectors.PlantComm,2020,1(4),100087.)，所以后将其改为Xa47(t)。利用Xa47(t)的共分离标记检测发现该基因带有元江普通野生稻血缘，目前从野生稻中克隆到的基因只有3个，分别为来自长雄野生稻(Oryza longistaminataA.chev et Roehr)的Xa21(Song WY,Wang GL,Chen LL,etal.A receptor kinase-like protein encoded by the rice disease resistancegene,Xa21.Science,1995,270(5243):1804-1806.)、普通野生稻的Xa23(ZhouYL,UzokweVNE,Zhang CH.Improvement ofbacterial blight resistance of hybrid rice inChina using the Xa23 gene derived from wild rice(Oryza rufipogon).Crop Prot,2011,30(6):637-644.)和小粒野生稻(Oryza minutaPresl.)的Xa27基因(Gu K,Tian D,Yang F,et al.High-resolution genetic mapping of Xa27(t),a new bacterialblight resistance gene in rice,Oryza sativa L.Theor Appl Genet,2004,108(5):800-807.)，这3个基因对白叶枯病广谱高抗，其中Xa21和Xa23已被广泛地应用于水稻抗病育种中，说明从野生稻中发掘优异的抗病基因应用价值广泛。Xa47(t)带有野生稻血缘，明确该基因的序列信息及其广谱高抗白叶枯病的特性，并充分阐述其育种利用具有重要的价值意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种水稻抗白叶枯病基因Xa47(t)，首次提供了水稻抗白叶枯病基因Xa47(t)的核苷酸序列和编码区序列，对于培育水稻抗病新品种具有重要意义。

为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种水稻抗白叶枯病基因Xa47(t)，所述基因的核苷酸序列如SEQID NO.13所示。

上述水稻抗白叶枯病基因Xa47(t)编码获得的水稻抗白叶枯病蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。

优选的，所述基因Xa47(t)的CDS序列如SEQ ID NO.14所示。

本发明提供了一种含有上述基因Xa47(t)的重组子。

优选的，所述重组子的基础质粒为pCE2。

优选的，所述基因Xa47(t)由引物214QC-9F和214QC-9R对试供亲本G252进行扩增、测序获得。

更优选的，所述引物214QC-9F的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述引物214QC-9R的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

本发明提供了一种培育抗白叶枯病水稻新品种的方法，所述方法包括如下步骤：

将上述的基因Xa47(t)和Ubiqutin启动子进行重组后转化至水稻中，得到抗白叶枯病水稻新品种。

优选的，所述Ubiqutin启动子由引物Ubi-F和Ubi-R对质粒pJET-Ubi进行扩增得到；

所述Ubi-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述Ubi-R的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。

本发明还提供了上述基因Xa47(t)、重组子、上述方法在抗白叶枯病水稻育种中的应用。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种来自元江普通野生稻渗入系G252的水稻抗白叶枯病基因Xa47(t)，通过PacBio SMRT技术和Dovetail Hi-C技术成功地将元江普通野生稻和栽培稻合系35的基因组对应到水稻染色体上，并与日本晴基因组进行共线性分析，同时根据测序组装序列以及Xa47(t)基因的定位情况，快速预测到了Xa47(t)的候选基因，获得了水稻抗白叶枯病基因Xa47(t)的核苷酸序列和编码区序列。通过功能互补和基因敲除技术进行功能验证和功能评估可知，相对于感白叶枯病材料，转入本发明所述抗白叶枯病基因Xa47(t)的水稻病斑长度明显较短，表现出较强的抗病特性，对11个菌株达到抗或者高抗的水平，具有广谱高抗白叶枯病的特性，对于培育水稻抗病新品种具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例2中合系35与日本晴11号染色体共线性图。Chr11表示11号染色体；29021106Kb表示日本晴11号染色体总长度；29113644Kb表示合系35中11号染色体总长度。

图2为本发明实施例2中元江普通野生稻与日本晴11号染色体共线性图。Chr11表示11号染色体；29021106Kb表示日本晴11号染色体总长度；31935697Kb表示元江普通野生稻11号染色体总长度。

图3为本发明实施例2中分离Xa47(t)核苷酸序列的凝胶电泳图。M表示Marker，从上至下分别为5000bp、300bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp；G252为分离Xa47(t)基因的供体亲本。

图4为本发明实施例2中Xa47(t)基因核苷酸分离的测序峰图。

具体实施方式

本发明提供了一种水稻抗白叶枯病基因Xa47(t)，所述基因的核苷酸序列如SEQID NO.13所示。

本发明提供了上述水稻抗白叶枯病基因Xa47(t)编码获得的水稻抗白叶枯病蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。

本发明中，所述基因Xa47(t)的CDS序列如SEQ ID NO.14所示。

本发明提供了一种含有上述基因Xa47(t)的重组子。本发明中，所述重组子的基础质粒优选为pCE2。

本发明中，所述基因Xa47(t)由引物214QC-9F和214QC-9R对试供亲本G252进行扩增、测序获得。所述214QC-9F的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述214QC-9R的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。本发明中，所述214QC-9F和214QC-9R是根据筛选获得的Xa47(t)候选基因的编码区上下游区域进行设计得到的。本发明中，所述供体亲本G252为元江普通野生稻渗入系。本发明中，所述筛选的方法优选包括：通过对元江普通野生稻渗入系双亲进行建库和高通量测序获得连续基因组，将所述连续基因组与参考基因组进行共线性分析，根据Xa47(t)基因位于分子标记R13I14和Hxjy-14之间情况，明确Xa47(t)基因的此定位区段在元江普通野生稻、合系35和日本晴之间排列顺序的一致性，然后进行基因注释分析即可获得所述Xa47(t)候选基因。本发明中，所述获得连续基因组的方法优选包括PacBioSequel_SMRT技术和Dovetail Hi-C建库技术。

本发明提供了一种培育抗白叶枯病水稻新品种的方法，所述方法包括如下步骤：将上述的基因Xa47(t)和Ubiqutin启动子进行重组后转化至水稻中，得到抗白叶枯病水稻新品种。

本发明中，所述Ubiqutin启动子由引物Ubi-F和Ubi-R对质粒pJET-Ubi进行扩增得到；所述Ubi-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述Ubi-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供了上述基因Xa47(t)、重组子、上述方法在抗白叶枯病水稻育种中的应用。

本发明中，所述的栽培稻合系35为我国选育的高产优质粳稻品种，公布于文献(殷富有,张敦宇,叶玉,等.普通野生稻栽培稻杂交后代白叶枯病抗性评价.江西农业学报,2010,22(8):81-84.)。

所述的HZhj19、PXO99、PB、ScYc-b、T7147、Y8、YM1、YM187、YN24、YJDP-2和YJWS-2白叶枯病菌在非专利文献公开，申请人有保存，自本专利申请日起20年内可提供。

所述的HZhj19、YM1、YM187、YN24、YJDP-2和YJWS-2菌株为本实验室在2013～2017年从自然发病的病叶上分离而来，公布于文献(陈玲,张敦宇,陈越,等.云南药用野生稻种质资源的白叶枯病抗性评价.南方农业学报,2019,50(7):1417-1425.)。

所述的PXO99菌株为菲律宾标准菌株6，采集自菲律宾，公布于文献(Ji CH,Ji ZY,Liu B,et al.Xa1 allelic R genes activate rice blight resistance suppressed byinterfering TAL effectors.Plant Comm,2020,1(4),100087.)。

所述的PB菌株，为PXO99菌株的突变株系，公布于文献(陈玲,张敦宇,陈越,等.云南药用野生稻种质资源的白叶枯病抗性评价.南方农业学报,2019,50(7):1417-1425.)。

所述的Y8菌株为云南强致病型生理小种，采集自中国云南，公布于文献(殷富有,张敦宇,叶玉,等.普通野生稻栽培稻杂交后代白叶枯病抗性评价.江西农业学报,2010,22(8):81-84.)。

所述的ScYc-b(中国标准菌株5号)和YN24(中国标准菌株9号)菌株，采集自中国东北稻区，公布于文献(吴宪,许晶,温嘉伟,等.东北水稻白叶枯病菌株遗传多样性分析及品种对白叶枯病抗性评价.吉林农业大学学报,2015,37(3):290-295.)。

所述的T7147(日本标准菌株2号)，采集自日本，公布于文献(周永力,翟文学,章琦,等.Xa21转基因水稻对白叶枯病的抗性及其遗传.植物病理学报,2001,31(2):123-129.)。

所述的栽培稻JG30，是我国选育的矮秆中晚熟籼稻(栽培稻)，公布于文献(金旭伟,王春连,杨清,等.水稻抗白叶枯病近等基因系CBB30的培育及Xa30(t)的初步定位.中国农业科学,2007,40(6):1094-1100.)。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

下述实施例中，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明专利的技术方案，在实施例中仅出示了与本发明专利方案密切相关的技术方案和/或处理步骤，如无特殊说明，省略的其他细节方法均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1元江普通野生稻和栽培稻合系35基因组高通量测序

1.元江普通野生稻和栽培稻合系35的基因组DNA提取

基于CTAB方法提取基因组DNA：采取样品的幼嫩叶片约200mg，用液氮研磨成粉状，将组织转移到预热65℃的2.0mL管中，加入900μL 2％CTAB裂解缓冲液，涡旋混合。将离心管在65℃下孵育60分钟，然后在室温(RT)下以10,000rpm离心5分钟。用900μL体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)提取上清液，重复2次，然后在新管中以10,000rpm的速度在室温下离心10分钟。加入2/3体积的预冷(-20℃)异丙醇，-20℃放置2小时以上沉淀DNA，室温12000rpm离心15分钟。加入75％无水乙醇洗涤沉淀并离心去除，然后将DNA沉淀风干3-5分钟。用200μL ddH₂O溶解沉淀后进行后续实验。

所述2％CTAB裂解缓冲液的配制方法为：取4g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，16.364gNaCl，1M Tris-HCl 20mL(pH8.0)，0.5M EDTA8mL，先用70mL ddH₂O溶解，再定容至200mL灭菌备用。

2.元江普通野生稻和栽培稻合系35染色体级别的连续基因组获取

将步骤1提取得到的DNA送华大生物科技(武汉)有限公司，通过PacBio Sequel_SMRT平台进行建库和全基因组测序，结合Dovetail Hi-C建库技术以及MECAT组装系统，获得元江普通野生稻和栽培稻合系35染色体级别的连续基因组。

实施例2 Xa47(t)的克隆

1.Xa47(t)候选基因的预测

选用MCScanX软件将实施例1中元江普通野生稻和栽培稻合系35的11号染色体的连续基因组与高质量参考基因组即日本晴基因组进行共线性分析。随后利用Soft Berry(http://linux1.softberry.com/)中的FGENESH程序对R13I14和Hxjy-14两个标记之间的序列进行基因注释分析，在Smart数据库(http://smart.embl-heidelberg.de/)预测注释基因的功能，根据注释的功能筛选出Xa47(t)候选基因。

根据Xa47(t)基因位于分子标记R13I14和Hxjy-14之间的事实，通过共线性分析得到图1和图2。从图1和图2可看出，Xa47(t)基因的此定位区段在元江普通野生稻、合系35和日本晴之间排列顺序比较一致，表明可参照目前研究较为清楚的日本晴基因组从该区段进行Xa47(t)基因的预测。进而根据上述步骤从该区域注释到3个候选基因，其中一个是含有NBS-LRR结构域的LOC_Os11g46200基因，其余两个基因与转座相关，与抗病不相关，因此将LOC_Os11g46200作为Xa47(t)基因的候选基因。

2.Xa47(t)候选基因的克隆

根据步骤1得到的候选基因的编码区上下游区域，设计10对特异引物，采用CTAB法提取Xa47(t)的供体亲本G252的基因组DNA，利用PCR进行扩增，取7μLPCR扩增产物在1％琼脂糖凝胶上5V/cm恒压电泳，凝胶成像系统成像后，根据PCR产物，筛选出一个特异引物214QC-9F/R，其中，214QC-9F的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，214QC-9R的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，该引物的扩增片段大小正确且带型清晰，结果如图3所示。将该PCR产物直接送北京擎科生物技术有限公司昆明分公司进行测序，得到测序结果如图4所示。由图4可见，测序峰图信号强，峰型完整且为单峰，表明测序结果较好。

所述的PCR扩增采用45μLPCR反应体系进行；45μLPCR反应体系为：MaxMasterMix 24μL，10μmol/L上、下游引物各2.4μL，20ng/μL模板DNA 6μL，ddH₂O 10.2μL；PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性15sec，55℃复性15sec，68℃延伸5min，共35个循环；68℃延伸10min。

测序结果显示，Xa47(t)候选基因的核苷酸(DNA长度)为4240bp，编码区(CDS)序列为2409bp，编码802个氨基酸，具体核苷酸序列见序列表SEQ ID NO.13，编码获得的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。

实施例3 Xa47(t)基因的功能验证和育种评价

1.功能互补试验验证候选基因功能和育种评价

提取Xa47(t)的供体亲本G252的总RNA，反转录为cDNA后，参照Xa47(t)候选基因编码区序列，利用软件BioXM2.6从Xa47(t)的DNA序列中预测出其编码区(CDS区)，在预测出的编码区两端设计特异引物G252-CDS-F/R，利用G252的cDNA进行PCR扩增，将预期大小正确的片段与载体pCE2连接，将连接产物进行测序，获得Xa47(t)编码区序列，同时获得pCE2-Xa47CDS质粒。

选择pCamBIA1305质粒作为植物表达载体骨架，用XbaI和BstEII对其进行双酶切，利用引物Ubi-F/R扩增质粒pJET-Ubi中的Ubiqutin启动子，利用Xa47-OE-F/R引物扩增质粒pCE2-Xa47CDS中的Xa47(t)CDS序列，切胶回收目的片段后，通过同源重组的方法构建Ubi-Xa47(t)过表达载体，通过农杆菌介导法转化感白叶枯病的栽培稻JG30材料。本实施例所采用的引物序列如下表1所示。

表1引物序列

对上述转化栽培稻JG30材料后的T₁代阳性转基因苗进行孕穗期接种HZhj19、PXO99、PB、ScYc-b、T7147、Y8、YM1、YM187、YN24、YJDP-2和YJWS-2共11个白叶枯病强致病菌，每个菌株接种3株转化苗，同时以感病材料金刚30作为对照，接种21天后调查病斑长度，结果如表2所示。其中，所述病斑长度单位为cm。

表2T₁代遗传转化苗Ubi-Xa47(t)表型鉴定

由表2可以看出，感病材料金刚30病斑在12cm以上，表现较强的感病特性，转化苗的病斑在5cm以下，对11个菌株达到抗到高抗的水平，说明遗传转化株系的白叶枯病抗性是由Xa47(t)基因提供，该基因具有很强的白叶枯病抗性，对于抗白叶枯病水稻育种具有重要应用价值。

2.基因编辑实验评估候选基因功能

根据CRISPR-P2.0在线软件(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2)在Xa47(t)整个DNA序列(正反链)里找出含有GN20GG或N20GG的PAM序列，选择中靶效率评分大于0.5的特异性较高的作为sgRNA候选序列，通过查找共找到3个sgRNA序列，将3个sgRNA序列进行体外验证。将体外验证较好的sgRNA-2的PAM前面20bp的序列作为Spacer序列，分别设计上、下游sgRNA的Oligo序列sgF/R，并在sgF的5'端加入同源臂GGCA，sgR的5'端加入同源臂AAAC，送北京擎科生物技术有限公司昆明分公司合成。

利用合成的Oligo序列制备两端具有粘性末端的双链DNA片段(Oligo-Xa47(t))。利用CIP酶切10ug pOs-sgRNA载体，制作出线性化pOs-sgRNA载体。将线性化pOs-sgRNA载体与Oligo-Xa47(t)相连，转化大肠杆菌，获得阳性克隆，构建出pOs-sgRNA-Oligo-Xa47(t)载体。利用LR Clonase^TMII enzyme mix将pOs-sgRNA-Oligo-Xa47(t)质粒与pH-Ubi-cas9-7质粒进行LR反应，最终获得CRISPR/Cas9-Xa47(t)载体，并用引物Seq-U3和Seq-Cas对CRISPR/Cas9-Xa47(t)载体进行测序来验证其正确性，测序公司为北京擎科生物技术有限公司昆明分公司。将验证正确的载体通过农杆菌介导法转化Xa47(t)的供体亲本G252。本实施例所用引物序列如表3所示。

表3引物序列

对转化后的T₁代阳性基因敲除苗进行孕穗期接种上述11个白叶枯病菌株，供体亲本G252作为对照，结果显示，G252对11个菌株均抗病，敲除苗对11个菌株都感病，该结果与过表达植株的表型相对应，表明本发明所述基因Xa47(t)抗不同的白叶枯病菌，具有广谱高抗的特性。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

序列表

<110> 云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所

<120> 一种水稻抗白叶枯病基因、蛋白及其应用

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgacggggg aggaagtc 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgtatgatg catgtcacg 19

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggtacccggg gatcctctag actgcagtgc agcgtct 37

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cccccgtcat ctgcagaagt aacaccaaac a 31

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acttctgcag atgacggggg aggaag 26

<210> 6

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gggaaattcg agctggtcac cttaatacca tatacatgta tgatgcatgt 50

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggcacaaggt gccggaaaaa agaa 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aaacttcttt tttccggcac cttg 24

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

taccacctcg gctatccaca 20

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gacaagggca gggatttcg 19

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tttagctgct ctaagttggt 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

agtcattagt ttcgaacggg 20

<210> 13

<211> 4240

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atgacggggg aggaagtcga tgctttgtgc aaggatgagt tgatggcgga ggtgcgtgag 60

ctgtcctacg acatggacga cgccatcgac gaattcttct tagaggagcc catggcgggc 120

ggcgacggtg gccctttcga tgagctcaag acaagagttg aggatgtctc caagcggttc 180

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agaagtgcac ttgcatgagg atggaggcaa agctgaaata cccattcgtt gtgatgaaat 780

tttaaaagcg aactctaccg taaactctaa attaagcccc aaaaattata atgcaagtat 840

tcctgtttta atcaatattt ggcatcattt tttttacaat gtataattca gctacacaat 900

tttctcattt ttttttacaa ttgcttataa ttaagctaca caagctacca attcagctac 960

acaattggta catactacta tactagccaa atacccgtga tttgctacgt attaaaacaa 1020

attaatagtg agatttttgg ggcaattaat ttggttttgt agaagttata tcatagagaa 1080

attattttat aacggtaaag ttggttgaaa atatgatgga taatgtggta aataaaaaaa 1140

gtactatagt tggtggcaga ttcactgcca ttgccctctt ttgaaaggaa tatagaattt 1200

tatcttgtag aagttatatt gtacaagtga aatatgatgg aatcatatat gtagaataaa 1260

acattaaagt atgtgggggt atttggttga aaatatgatg gagtatgtgg taaatagaaa 1320

aaaaatacta tacttgatga tggggcgatg atagattcac tgccaccacc attgcatttt 1380

ttttaaaagg agtatataaa catatatagg aacccatcta ctcattactt ggtaagaggt 1440

cttacttggt aattgtgctg gacggtagca tgccagttta ccattcatca tcattattgg 1500

attccttttt tttcttaaaa aaaggtataa tatgatatgc aacttcttaa ttgctttatt 1560

tcttttctag attaatttta gataaaaatt ttattggata tggatcagct agcgtagtaa 1620

aaagtgaacg atacatgaga aaaaagattg atttgacaaa acaaaaacac aacccattaa 1680

attggagcgt cttattcccg tagactgtaa cagaatggtt cggtgatatg atcaactaat 1740

gttttttgtt gcagcaaagt attgtggtca aggtgccgga aaaaagaagg gacgacatga 1800

acgatgatgc attgcactgg gcggtgagtt cgttgcatgg agtgccctcg ggtggtacgt 1860

ctggagattg tagtaggttg cagttggatg gtgaaggcgc gaacatccgc aagctcttgt 1920

ccaccctccg gaataaggtg ggccacgccc agttggtgca ggtcgaggat aagagaaaaa 1980

gggtagagga ggcgacgaag ccttgtgaat ttcacgaggt caaaacaata tgcatccttg 2040

gattgcctgg cgcaggcaaa acaactcttg caaaactgtt gtactcccat cactcaacga 2100

cagagcagca attccaacac cgggctttcg tgtcactctc tccgggtgcc aatctcaccg 2160

acactcttac tgatatttta ttgcaagtag gagcatataa tgatgatgca acaccatatt 2220

gtgggaccgg aacaccgcac caacagtatc tcattgacaa catatcagct tatctcattg 2280

gcaaaaagta agcagagttc tttagaatga tgttatttta aataatatta ttttttttta 2340

aaaaaaatta acaatgtgta tttgatggaa ttaataaaaa tatgttttaa gagaaattaa 2400

taaaaaatat ttgatatcaa attctgcagg atggtcttaa ttagaatttc tataaaaaga 2460

gagtagatga gaaacaccca ggggctcttc tggctagctc cacaagccaa cctattatgt 2520

ttgaagcctc acccctacct atttaatatt aggtctttct ctaatattcg ctatttattt 2580

gatattaaat ccttccctaa tattcgtgtt tttaaaagag agtagatgac aaacagacat 2640

caaattaagc tgattgtttt tcgatcatct caaaggggaa gcttctcatg tgggtggact 2700

catatcttcg aaattattat atagttgcat gtattagtgc taatatattg aggcttattt 2760

actttttttc aacttctaaa gatatcttat tataattgat gacgtttggc gctgggaaga 2820

gtgggaagtc atcagaaagt ccattccaaa gaatgatctg ggtagcagaa taatcatgac 2880

tactcgtctt aattcaatag ctgagaagtg tcgcaatgat gacatggatg cgtttgttta 2940

tgaaactgag gctctggatt atgtggatgc ttggctgttg tgtgacaagg tagcaagaaa 3000

gtctgtcaca tgtatgaaca ttaatccatg ctatgatatc gtggacgtgt gctatggtat 3060

gccgttagca ctaattcgtg tgtcgtcagc attggcagaa gagatacaag ctttagacag 3120

tgatgaatgg caaatatgga gggctctgag acgggtagag gatggtattt tggacatccc 3180

atccttgaag ccattggcag agagtttatg ccttggttac gaccatcttc ctctctatct 3240

gaggactttg ttgttatgtt gtagtgtgta ccattggctt gatggtggga ttgttcaaag 3300

gggccgtttg gtcacaaggt ggattgctga aggatttgtt tcagaagaga aagcagcaga 3360

aggttacttt gatgagcttg tcgacagagg atggattaag catagagggt ggaacgagta 3420

tgagatctac cctatgatgc tggccatcct tagatacaag tcgaaggagt acaattttgt 3480

aacttgtttg ggtacgggat ttgatacttg tactagtgca tctctatcct actcctctcc 3540

aacaatggcg attcgccggc tttgtcttca aagggggtac ccaatgaaat gcttctcaag 3600

tatggatgtg tcacacactc gcagccttgt tatccttggc gacgtgatag gagtcccctt 3660

ggatatgttt aaaagattgc gagtgttgga ccttgaagat aatatcggta tagaggactc 3720

ccacctgaag aagatatgtg agcagctaga gagcctcagg ctgctcaagt acctaggtct 3780

caagggtacg cgaatcacta agctcccaca ggagatacag aagctgaagc atctggagat 3840

tttgtacgtg aggagcacag gcatcaaaga gctcccacgg gagatcgggg aagtgaaaca 3900

actgcggact ctggacgtga ggaacacgcg gatcagcgag ctcccgtcgc agatcgggga 3960

gctcaaacat ctgcggactc tggacgtgag gaacacgcgg atcagcgagc tcctgtcgca 4020

gatcggggag ctcaaacatc tgcggactct ggacgtgagg aacacgcgga tcagcgagct 4080

cccgtcgcag atcggggagc tcaaacatct gcggactctg gacgtgagga acacgcggac 4140

ttctatattt ttttattcta gaagaagaat aaaaaaatat agaagtactg atatctggct 4200

ctctgcacgt gacatgcatc atacatgtat atggtattaa 4240

<210> 14

<211> 2409

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atgacggggg aggaagtcga tgctttgtgc aaggatgagt tgatggcgga ggtgcgtgag 60

ctgtcctacg acatggacga cgccatcgac gaattcttct tagaggagcc catggcgggc 120

ggcgacggtg gccctttcga tgagctcaag acaagagttg aggatgtctc caagcggttc 180

tccgacagcc ggcggtggag gccacaggtg gagcaacatc aaccatccct aaccgccgca 240

accgtagact gtccacctcc tcacgctcgc ttcgtccaca acatgatgga tgtgtcagag 300

ctcgtggaga tggacaaact acatgagaca gagctcatca aattgctgga acaaggtgcg 360

gacacaagca tatatgcttc ccggtggcgc atcgcaacac catggcatga taaggagcaa 420

agtattgtgg tcaaggtgcc ggaaaaaaga agggacgaca tgaacgatga tgcattgcac 480

tgggcggtga gttcgttgca tggagtgccc tcgggtggta cgtctggaga ttgtagtagg 540

ttgcagttgg atggtgaagg cgcgaacatc cgcaagctct tgtccaccct ccggaataag 600

gtgggccacg cccagttggt gcaggtcgag gataagagaa aaagggtaga ggaggcgacg 660

aagccttgtg aatttcacga ggtcaaaaca atatgcatcc ttggattgcc tggcgcaggc 720

aaaacaactc ttgcaaaact gttgtactcc catcactcaa cgacagagca gcaattccaa 780

caccgggctt tcgtgtcact ctctccgggt gccaatctca ccgacactct tactgatatt 840

ttattgcaag taggagcata taatgatgat gcaacaccat attgtgggac cggaacaccg 900

caccaacagt atctcattga caacatatca gcttatctca ttggcaaaaa gtatcttatt 960

ataattgatg acgtttggcg ctgggaagag tgggaagtca tcagaaagtc cattccaaag 1020

aatgatctgg gtagcagaat aatcatgact actcgtctta attcaatagc tgagaagtgt 1080

cgcaatgatg acatggatgc gtttgtttat gaaactgagg ctctggatta tgtggatgct 1140

tggctgttgt gtgacaaggt agcaagaaag tctgtcacat gtatgaacat taatccatgc 1200

tatgatatcg tggacgtgtg ctatggtatg ccgttagcac taattcgtgt gtcgtcagca 1260

ttggcagaag agatacaagc tttagacagt gatgaatggc aaatatggag ggctctgaga 1320

cgggtagagg atggtatttt ggacatccca tccttgaagc cattggcaga gagtttatgc 1380

cttggttacg accatcttcc tctctatctg aggactttgt tgttatgttg tagtgtgtac 1440

cattggcttg atggtgggat tgttcaaagg ggccgtttgg tcacaaggtg gattgctgaa 1500

ggatttgttt cagaagagaa agcagcagaa ggttactttg atgagcttgt cgacagagga 1560

tggattaagc atagagggtg gaacgagtat gagatctacc ctatgatgct ggccatcctt 1620

agatacaagt cgaaggagta caattttgta acttgtttgg gtacgggatt tgatacttgt 1680

actagtgcat ctctatccta ctcctctcca acaatggcga ttcgccggct ttgtcttcaa 1740

agggggtacc caatgaaatg cttctcaagt atggatgtgt cacacactcg cagccttgtt 1800

atccttggcg acgtgatagg agtccccttg gatatgttta aaagattgcg agtgttggac 1860

cttgaagata atatcggtat agaggactcc cacctgaaga agatatgtga gcagctagag 1920

agcctcaggc tgctcaagta cctaggtctc aagggtacgc gaatcactaa gctcccacag 1980

gagatacaga agctgaagca tctggagatt ttgtacgtga ggagcacagg catcaaagag 2040

ctcccacggg agatcgggga agtgaaacaa ctgcggactc tggacgtgag gaacacgcgg 2100

atcagcgagc tcccgtcgca gatcggggag ctcaaacatc tgcggactct ggacgtgagg 2160

aacacgcgga tcagcgagct cctgtcgcag atcggggagc tcaaacatct gcggactctg 2220

gacgtgagga acacgcggat cagcgagctc ccgtcgcaga tcggggagct caaacatctg 2280

cggactctgg acgtgaggaa cacgcggact tctatatttt tttattctag aagaagaata 2340

aaaaaatata gaagtactga tatctggctc tctgcacgtg acatgcatca tacatgtata 2400

tggtattaa 2409

<210> 15

<211> 802

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Met Thr Gly Glu Glu Val Asp Ala Leu Cys Lys Asp Glu Leu Met Ala

1 5 10 15

Glu Val Arg Glu Leu Ser Tyr Asp Met Asp Asp Ala Ile Asp Glu Phe

20 25 30

Phe Leu Glu Glu Pro Met Ala Gly Gly Asp Gly Gly Pro Phe Asp Glu

35 40 45

Leu Lys Thr Arg Val Glu Asp Val Ser Lys Arg Phe Ser Asp Ser Arg

50 55 60

Arg Trp Arg Pro Gln Val Glu Gln His Gln Pro Ser Leu Thr Ala Ala

65 70 75 80

Thr Val Asp Cys Pro Pro Pro His Ala Arg Phe Val His Asn Met Met

85 90 95

Asp Val Ser Glu Leu Val Glu Met Asp Lys Leu His Glu Thr Glu Leu

100 105 110

Ile Lys Leu Leu Glu Gln Gly Ala Asp Thr Ser Ile Tyr Ala Ser Arg

115 120 125

Trp Arg Ile Ala Thr Pro Trp His Asp Lys Glu Gln Ser Ile Val Val

130 135 140

Lys Val Pro Glu Lys Arg Arg Asp Asp Met Asn Asp Asp Ala Leu His

145 150 155 160

Trp Ala Val Ser Ser Leu His Gly Val Pro Ser Gly Gly Thr Ser Gly

165 170 175

Asp Cys Ser Arg Leu Gln Leu Asp Gly Glu Gly Ala Asn Ile Arg Lys

180 185 190

Leu Leu Ser Thr Leu Arg Asn Lys Val Gly His Ala Gln Leu Val Gln

195 200 205

Val Glu Asp Lys Arg Lys Arg Val Glu Glu Ala Thr Lys Pro Cys Glu

210 215 220

Phe His Glu Val Lys Thr Ile Cys Ile Leu Gly Leu Pro Gly Ala Gly

225 230 235 240

Lys Thr Thr Leu Ala Lys Leu Leu Tyr Ser His His Ser Thr Thr Glu

245 250 255

Gln Gln Phe Gln His Arg Ala Phe Val Ser Leu Ser Pro Gly Ala Asn

260 265 270

Leu Thr Asp Thr Leu Thr Asp Ile Leu Leu Gln Val Gly Ala Tyr Asn

275 280 285

Asp Asp Ala Thr Pro Tyr Cys Gly Thr Gly Thr Pro His Gln Gln Tyr

290 295 300

Leu Ile Asp Asn Ile Ser Ala Tyr Leu Ile Gly Lys Lys Tyr Leu Ile

305 310 315 320

Ile Ile Asp Asp Val Trp Arg Trp Glu Glu Trp Glu Val Ile Arg Lys

325 330 335

Ser Ile Pro Lys Asn Asp Leu Gly Ser Arg Ile Ile Met Thr Thr Arg

340 345 350

Leu Asn Ser Ile Ala Glu Lys Cys Arg Asn Asp Asp Met Asp Ala Phe

355 360 365

Val Tyr Glu Thr Glu Ala Leu Asp Tyr Val Asp Ala Trp Leu Leu Cys

370 375 380

Asp Lys Val Ala Arg Lys Ser Val Thr Cys Met Asn Ile Asn Pro Cys

385 390 395 400

Tyr Asp Ile Val Asp Val Cys Tyr Gly Met Pro Leu Ala Leu Ile Arg

405 410 415

Val Ser Ser Ala Leu Ala Glu Glu Ile Gln Ala Leu Asp Ser Asp Glu

420 425 430

Trp Gln Ile Trp Arg Ala Leu Arg Arg Val Glu Asp Gly Ile Leu Asp

435 440 445

Ile Pro Ser Leu Lys Pro Leu Ala Glu Ser Leu Cys Leu Gly Tyr Asp

450 455 460

His Leu Pro Leu Tyr Leu Arg Thr Leu Leu Leu Cys Cys Ser Val Tyr

465 470 475 480

His Trp Leu Asp Gly Gly Ile Val Gln Arg Gly Arg Leu Val Thr Arg

485 490 495

Trp Ile Ala Glu Gly Phe Val Ser Glu Glu Lys Ala Ala Glu Gly Tyr

500 505 510

Phe Asp Glu Leu Val Asp Arg Gly Trp Ile Lys His Arg Gly Trp Asn

515 520 525

Glu Tyr Glu Ile Tyr Pro Met Met Leu Ala Ile Leu Arg Tyr Lys Ser

530 535 540

Lys Glu Tyr Asn Phe Val Thr Cys Leu Gly Thr Gly Phe Asp Thr Cys

545 550 555 560

Thr Ser Ala Ser Leu Ser Tyr Ser Ser Pro Thr Met Ala Ile Arg Arg

565 570 575

Leu Cys Leu Gln Arg Gly Tyr Pro Met Lys Cys Phe Ser Ser Met Asp

580 585 590

Val Ser His Thr Arg Ser Leu Val Ile Leu Gly Asp Val Ile Gly Val

595 600 605

Pro Leu Asp Met Phe Lys Arg Leu Arg Val Leu Asp Leu Glu Asp Asn

610 615 620

Ile Gly Ile Glu Asp Ser His Leu Lys Lys Ile Cys Glu Gln Leu Glu

625 630 635 640

Ser Leu Arg Leu Leu Lys Tyr Leu Gly Leu Lys Gly Thr Arg Ile Thr

645 650 655

Lys Leu Pro Gln Glu Ile Gln Lys Leu Lys His Leu Glu Ile Leu Tyr

660 665 670

Val Arg Ser Thr Gly Ile Lys Glu Leu Pro Arg Glu Ile Gly Glu Val

675 680 685

Lys Gln Leu Arg Thr Leu Asp Val Arg Asn Thr Arg Ile Ser Glu Leu

690 695 700

Pro Ser Gln Ile Gly Glu Leu Lys His Leu Arg Thr Leu Asp Val Arg

705 710 715 720

Asn Thr Arg Ile Ser Glu Leu Leu Ser Gln Ile Gly Glu Leu Lys His

725 730 735

Leu Arg Thr Leu Asp Val Arg Asn Thr Arg Ile Ser Glu Leu Pro Ser

740 745 750

Gln Ile Gly Glu Leu Lys His Leu Arg Thr Leu Asp Val Arg Asn Thr

755 760 765

Arg Thr Ser Ile Phe Phe Tyr Ser Arg Arg Arg Ile Lys Lys Tyr Arg

770 775 780

Ser Thr Asp Ile Trp Leu Ser Ala Arg Asp Met His His Thr Cys Ile

785 790 795 800

Trp Tyr

Claims (8)

1.一种水稻抗白叶枯病基因Xa47(t)，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNO .13所示。

2.权利要求1所述水稻抗白叶枯病基因Xa47(t)编码获得的水稻抗白叶枯病蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO .15所示。

3.根据权利要求1所述的基因Xa47(t)，其特征在于，所述基因Xa47(t)的CDS序列如SEQID NO .14所示。

4.一种含有权利要求1或3所述基因Xa47(t)的重组子。

5.根据权利要求4所述的重组子，其特征在于，所述重组子的基础质粒为pCE2。

6.根据权利要求1所述基因Xa47(t)，其特征在于，所述基因Xa47(t)由引物214QC-9F和214QC-9R对试供亲本G252进行扩增、测序获得；

所述引物214QC-9F的核苷酸序列如SEQ ID NO .11所示，所述214QC-9R的核苷酸序列如SEQ ID NO .12所示。

7.一种培育抗白叶枯病水稻新品种的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

将权利要求1或3所述的基因Xa47(t)和Ubiqutin启动子进行重组后转化至水稻中，得到抗白叶枯病水稻新品种；

所述Ubiqutin启动子由引物Ubi-F和Ubi-R对质粒pJET-Ubi进行扩增得到；

所述Ubi-F的核苷酸序列如SEQ ID NO .3所示，所述Ubi-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

8.权利要求1或3所述基因Xa47(t)、权利要求4或5所述重组子、权利要求7所述方法在抗白叶枯病水稻育种中的应用。