CN101514343A

CN101514343A - 水稻抗病相关基因OsEDR1和它在改良水稻抗病性中的应用

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Publication number: CN101514343A
Application number: CNA2009100612613A
Authority: CN
Inventors: 王石平; 沈祥陵; 袁斌
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2009-03-25
Filing date: 2009-03-25
Publication date: 2009-08-26
Anticipated expiration: 2029-03-25
Also published as: CN101514343B

Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及包含水稻抗病相关基因OsEDR1的DNA片段的分离克隆和功能验证。利用基于RNA干扰(RNA interference，RNAi)原理的转基因技术，将OsEDR1基因的部分DNA片段与能够表达双链RNA的载体连接并转入水稻品种，抑制水稻品种中OsEDR1基因的表达。OsEDR1基因表达量显著降低的遗传转化水稻对白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的抗性明显增强，证明OsEDR1基因在水稻抗白叶枯病和抗细菌性条斑病反应中是负调控因子，可以通过抑制OsEDR1基因的表达改良水稻的抗病性。

Description

水稻抗病相关基因OsEDR1和它在改良水稻抗病性中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及一个水稻抗病相关基因OsEDR1的分离克隆、功能验证和应用。OsEDR1基因是水稻抗病反应中的负调控因子。抑制OsEDR1基因表达的转基因植株的抗病能力显著提高。

背景技术

植物在生长的过程中，受到多种病原物的侵害。植物病原物的种类繁多，包括病毒、细菌、真菌和线虫等。病原物侵入植物导致两种结果：(1)病原体成功的在寄主植物内繁殖，引起相关的病症；(2)寄主植物产生抗病反应，杀死病原物或阻止其生长。利用抗性基因资源改良植物的抗病性，是预防病害同时又保护环境的根本出路。

植物的抗病反应是多基因参于调控的复杂过程。参于植物抗病反应的基因分为两类：(1)抗病基因，又称R(resistance)基因和(2)抗病相关基因。

根据目前人们对抗病基因功能的认识，这类基因的产物主要是作为受体，直接或间接与病原蛋白相互作用，启动植物体内的抗病信号传导路径(Tang等，1996；Baker等，1997；Jia等，2000；Dangl和Jones，2001；Nimchuk等，2001)。抗病基因介导的抗病反应抗性强，是很好的基因资源。但由于下述原因，使利用抗病基因改良植物抗性受到限制：(1)抗病基因的资源有限，如目前知道的抵抗水稻重要病害白叶枯病的抗病基因大约只有30个；(2)抗病基因具有病原种类和病原生理小种特异性，抗病范围有限；(3)因为病原的快速突变，一个抗病基因的作用往往几年或者十几年后就丧失了。

抗病相关基因是指除抗病基因外所有参于抗病反应的基因，它们的编码产物参于合成植物体内抗病信号分子、参于信号传导、阻止信号传导或参于防卫反应等。这类基因的共同特点是病原诱导后它们的表达量升高或减少，因此人们可以根据病原诱导前后基因的表达量的差异大规模地鉴定植物抗病相关基因(Maleck等，2000；Schenk等，2000；Zhou等，2002)。目前，人们对抗病相关基因的认识有限。根据已有报道，绝大多数抗病相关基因单独作用时的抗性能力可能比抗病基因小。但根据下述原因，它们是值得大力开发的基因资源：(1)由于绝大多数抗病相关基因的产物不需要直接与病原物相互作用，这类基因是具有持久抗性的基因资源；(2)大多数抗病相关基因参于的抗病反应没有病原特异性，因此它们是具有广谱抗性的基因资源；(3)这类基因的资源丰富。但是，水稻中虽然鉴定了很多抗病相关基因(Zhou等，2002；Chu等，2004)，这些基因在水稻抗病反应中的作用机理、以及单个抗病相关基因是否会引起水稻抗病表型的改变都不清楚。

水稻是世界上重要的粮食作物，但病害的影响常常造成其产量和品质的下降。水稻白叶枯病由白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)引起，是世界上对水稻危害最大的细菌性病害(过崇俭，1995)。另外，水稻细菌性条斑病(细条病)由细条病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)引起，也是水稻的重要病害。因此，了解病害的发病机制，有助于利用高效途径改良水稻品种的抗性，控制病害的发生，减少或避免植物病害所带来的损失。

分离克隆抗病相关基因是对水稻抗病机理研究的前提。同时，与抗病基因的应用相比，抗病相关基因的应用能提供植物更为广谱及长效的抗性。通过抑制作为抗病反应负调控因子的抗病相关基因的功能进行水稻品种的改良，将进一步增强植物的抗病性，拓宽植物的抗谱。这些方面是采用常规植物育种和改良技术所不能达到的。

发明内容

本发明的目的是分离克隆水稻中携带的一个抗病相关基因完整DNA片段，并利用RNA干扰技术(RNAinterference，RNAi)和水稻T-DNA插入沉默技术通过使目标基因沉默鉴定该基因在抗病反应过程中所起作用，为利用这个基因改良水稻品种或其它植物抵御病害的能力奠定基础。该基因被命名为OsEDR1(Enhanced Disease Resistance 1)。

本发明涉及分离一种包含OsEDR1基因的DNA片段并鉴定其功能，该片段赋予植物对由白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)和细条病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)所引起的病害产生抗病反应。其中，所述片段如序列表SEQ ID NO：1所示，或者基本上相当于SEQ ID NO：1所示的DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID NO：1所示序列的亚片段。对其序列进行分析表明它编码一种丝裂原激活蛋白激酶激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase kinase，MAPKKK)。抑制序列表SEQ IDNO：1所示序列的表达可以增强水稻对白叶枯病和细条病的抗性。

可以采用已经克隆的OsEDR1基因作探针，从cDNA和基因组文库中筛选到本发明的基因或同源基因。同样，采用PCR技术，也可以从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的OsEDR1基因以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。采用以上技术，可以分离得到包含OsEDR1基因的序列或者包含一段OsEDR1基因的序列，将这一序列与合适的载体连接，可以转入植物细胞抑制其自身的OsEDR1基因的表达，产生抗病转基因植物。采用这种转基因技术创造抗病植物是传统育种技术所不能达到的。

本发明为增强水稻对白叶枯病菌的抗性提供了一种新的方法。这种方法包括将OsEDR1基因的部分片段和与能够表达双链RNA(double strand RNA，dsRNA)的载体连接、转入水稻，通过抑制其自身OsEDR1基因的表达改良水稻对白叶枯病的抗性。

在本发明的实施例部分，申请人阐述了OsEDR1基因的分离、功能验证和应用过程以及该基因的特点。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是OsEDR1基因的核苷酸序列和它编码的蛋白质的氨基酸序列。

图1.本发明鉴定和分离克隆水稻抗病相关基因OsEDR1以及验证OsEDR1基因功能的流程图。

图2.用定量反转录-PCR(quantitative reverse transcription-PCR，qRT-PCR)技术检测感病水稻品种中花11和抗病水稻家系MKbFZH1接白叶枯病菌菌株PXO61后OsEDR1基因的表达模式。水稻样品来源于没有任何处理的对照材料和接种PXO614、12、24、48、72小时后的材料。

图3.是OsEDR1基因的结构。无黑框的数字表示基因各个结构的核苷酸数目；有黑框的数字表示与粳稻日本晴中的OsEDR1基因比较，本发明中粳稻中花11中的OsEDR1基因的核苷酸替换位点和替换类型(如3310位的“A”在中花11中突变为“G”；5325位的“C”在中花11中突变为“A”；6308位的“C”在中花11中突变为“G”。核苷酸的替换位点编号是序列表SEQ ID NO：1中的序列位点编号，其中翻译起始密码的“A”记为1)。“ATG”和“TGA”分别是翻译起始密码和终止密码。短箭头示用PCR扩增OsEDR1基因编码区的引物位置。

图4.pDS1301载体携带表达OsEDR1双链RNA片段(545bp)，即克隆D120R。RB和LB代表pDS1301载体(Cao等，2007；Yuan等，2007)上的T-DNA右和左边界；GUS代表pDS1301载体上的β-葡萄糖苷酸酶基因(标记基因)；Hpt代表pDS1301载体上的潮霉素磷酸转移酶基因(筛选基因)。35S代表pDS1301载体上的花椰菜花叶病毒启动子；AdhI代表pDS1301载体上的玉米乙醇脱氢酶基因内含子I；OCS代表pDS1301载体上的章鱼碱合成酸基因终止子；Waxy-a代表pDS1301载体上的水稻Waxy基因内含子。

图5.T₀代遗传转化植株(D120RZ1)中的OsEDR1基因表达量降低与植株对白叶枯病菌株PXO61的抗性增强相关。对照为水稻品种中花11(遗传转化的受体)。遗传转化植株中OsEDR1基因的表达量是相对于对照中花11中OsEDR1基因的表达量。星号(*)表示与对照相比，转基因植株的病斑面积显著(P＜0.01)减小。

图6.OsEDR1基因T-DNA插入突变体04Z11MP37中T-DNA插入位点(A)和突变体验证分析(B)。图中横线条代表OsEDR1基因的内含子、黑色横柱条表示外显子的编码序列。数字表示T-DNA插入位点前核苷酸位点(按序列表SEQ ID NO：1.所示序列编号)。“ATG”和“TAG”分别是翻译起始密码和终止密码。箭头1F、1R、LBT2分别表示用来验证突变体是否正确的PCR引物；其中1F和1R引物是根据OsEDR1基因序列设计，分别位于T-DNA插入位点两侧；LBT2是根据T-DNA内部序列设计的引物。图6B中的水(对照)表示样品中的模板DNA用水替代。

图7.T₁代T-DNA插入突变体植株(04Z11MP37)中的OsEDR1基因表达减少或消失与植株对白叶枯病菌株PXO61的抗性增强相关。对照为水稻品种中花11(遗传转化的受体)。突变体植株中OsEDR1基因的表达量是相对于对照中花11中OsEDR1基因的表达量。星号(*)表示与对照相比，转基因植株的病斑面积显著(P＜0.01)减小。

图8.OsEDR1基因的T-DNA插入突变体04Z11MP37对水稻细条病菌RH3、JSB2-24、HBN8-47的侵染产生快速的超敏反应。图中箭头所指为渗透接种细条病菌的位点，剩余斑点为叶片自发产生的类病斑(lesionmimic)。

具体实施方式

以下实施例中进一步定义本发明，图1描叙了鉴定和分离克隆OsEDR1基因以及验证OsEDR1基因功能的流程。根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明作出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例一：OsEDR1基因在不同水稻品种中的表达模式分析

拟南芥的AtEDR1基因参与调控拟南芥的抗病反应，该基因编码一个丝裂原激活蛋白激酶激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase kinase，MAPKKK)(Frye等，2001)。为了分析水稻中的AtEDR1同源基因是否也参与抗病反应的调控，申请人采用BLAST分析方法(Altschul等，1997)，利用AtEDR1基因的序列检索水稻全基因组序列数据库[TIGR(The Institute for Genomic Research，http://rice.tigr.org)，发现在水稻基因组中编号位点为LOC_Os03g06410的基因是AtEDR1的同源基因；该基因编码蛋白的氨基酸序列与AtEDR1蛋白序列有46.5％一致性(identity)，其预测的激酶区与AtEDR1的激酶区有80％的氨基酸一致性。LOC_Os03g06410所代表的基因在水稻基因组中是单拷贝。因此，申请人将位点为LOC_Os03g06410的基因命名为OsEDR1。

为了证实OsEDR1基因是否参于抗病反应的调控，申请人采用定量反转录-PCR(quantitative reversetranscription-PCR，qRT-PCR)技术(Qiu等，2007)分析了OsEDR1基因在不同水稻品种中接种白叶枯病菌株PXO61(菲律宾生理小种1，见Sun等文献，2004)后的表达模式。白叶枯病菌接种采用常规报道的或教科书介绍的剪叶法对成株期的水稻植株进行接种(见Sun等，2004)。白叶枯病菌菌株PXO61由菲律宾国际水稻研究所惠赠(Sun等，2004)。白叶枯病菌的培养遵循已经公开发表的方法(Sun等，2004)。接种后分不同时间点取接种叶片抽提总RNA(Zhou等，2002)。取1-5μg总RNA用DNaseI(美国Invitrogen公司)处理15分钟以去除基因组DNA污染，然后参照Zhou等(Zhou等，2002)的方法，使用oligo(dT)₁₅寡聚引物和M-MLV反转录酶(美国Promega公司)进行反转录。采用实时定量PCR分析试剂盒

PCR Master Mix(宝生物工程(大连)有限公司)，并根据试剂盒使用说明书，在ABI 7500 Real-Time PCRsystem(美国Applied Biosystems公司)仪器上进行实时定量PCR反应。用水稻内源肌动蛋白(actin)基因的表达量衡量、并均一化样品RNA含量(Qiu等，2007)。qRT-PCR分析中的OsEDR1基因特异PCR引物是EDR1F2(5′-AAGCGGCTCGATATTCCCAAG-3′)和EDR1R2(5′-GGAATGCCCCTCAACATCAAG-3′)，肌动蛋白基因PCR引物是水稻内源肌动蛋白(actin)F(5′-TGCTATGTACGTCGCCATCCAG-3′)和actinR(5′-AATGAGTAACCACGCTCCGTCA-3′)。

实验结果显示接种白叶枯病菌PXO61后诱导OsEDR1基因在中等感病粳稻品种中花11(Oryza sativassp.Japonica，一个公开使用的水稻品种)和抗病转基因株系MKbFZH1(见Cao等，2007，该转基因株系有中花11背景)中表达(图2)。MKbFZH1携带抗白叶枯病主效基因Xa3/Xa26(Cao等，2007)。在没有白叶枯病菌侵染时，OsEDR1基因在抗病水稻MKbFZH1中的表达量显著低于在感病水稻中花11中的表达量(图2)。接种PXO61后虽然都诱导OsEDR1基因在MKbFZH1和中花11中表达，但在MKbFZH1中该基因的总体表达水平仍显著低于感病水稻中花11(图2)。这些结果提示OsEDR1基因可能作为抗病反应的负调控基因参于抗白叶枯病反应的调控。

实施例二：确定水稻品种中花11中的OsEDR1基因的序列和结构

1.水稻品种中花11中的OsEDR1基因的序列

水稻全基因组序列数据库的LOC_Os03g06410位点信息中包含有OsEDR1基因的cDNA序列[GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)注册号：AK111595]，该cDNA序列长3645bp。水稻全基因组序列数据库中的水稻序列来自于粳稻品种日本晴(Oryza sativa ssp.Japonica)，cDNA序列AK111595也来自于日本晴。

申请人根据水稻品种日本晴中的OsEDR1基因编码区两侧的序列设计了一对PCR引物：EDR1F3(5′-ATGGTACCGTTGACGAGATGAAGAATCT-3′)(下划线代表用于载体连接的接头中的KpnI限制性内切酶消化位点)和EDR1R3(5′-TAAGGTACCACAAACTTAACAGCAACAATCATCA-3′)(下划线代表用于载体连接的接头中的KpnI限制性内切酶消化位点)(图3)。利用这对PCR引物从粳稻品种中花11中扩增包含OsEDR1基因的DNA片段(图3)。利用PCR引物EDR1F3、EDR1R3和位于基因内部的PCR引物EDR1F1(5′-TAACTAGTGGTACCGAAGATGACTTCTAC-3′)、EDR1R1(5′-TAGAGCTCGGATCCAGCACCCATGAAGAG-3′)、EDR1F13(5′-ATTGGATCCCTTGTGATTGGTGAAA-3′)，EDR1F15(5′-GAGTAATTATACTGGTGATGA-3′)和EDR1R15(5′-TCATCACCAGTATAATTACTC-3′)，以及美国Applied Biosystems公司的测序试剂盒，以双脱氧核苷酸末端终止法(美国Applied Biosystems公司)分别从PCR扩增片段两端测序。序列拼接后得到一长6401bp的DNA序列，它包含完整的OsEDR1基因的编码序列(图3)。

2.水稻品种中花11中的OsEDR1基因结构分析

与水稻品种日本晴中的OsEDR1基因序列比较，水稻品种中花11中的OsEDR1序列有3个核苷酸的替换，它们分别位于第4、7、13外显子的内部(图3)；位于第7外显子的核苷酸替换造成一个编码氨基酸的差异(由日本晴OsEDR1蛋白中的脯氨酸变为中花11 OsEDR1蛋白中的丙氨酸)，位于第13外显子的核苷酸替换也造成一个编码氨基酸的差异(由日本晴OsEDR1蛋白中的脯氨酸变为中花11 OsEDR1蛋白中的组氨酸)。因此，两个水稻品种中同一个基因序列的高度相似性，申请人可以利用日本晴中OsEDR1基因的cDNA序列确定中花11中的OsEDR1基因的结构。比较分析中花11中的OsEDR1基因的基因组序列和日本晴中的OsEDR1基因的cDNA序列，确定中花11中的OsEDR1基因包含十三个外显子和十二个内含子。第一个外显子由445个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的1-445bp处)，第一个内含子由811个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的446-1256bp处)，第二个外显子由422个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的1257-1678bp处)，第二个内含子由465个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的1679-2143bp处)，第三个外显子由101个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的2144-2244bp处)，第三个内含子由642个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的2245-2886bp处)，第四个外显子由1264个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的2887-4150bp处)，第四个内含子由185个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的4151-4335bp处)，第五个外显子由40个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的4336-4375bp处)，第五个内含子由111个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的4376-4486bp处)，第六个外显子由70个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的4487-4556bp处)，第六个内含子由129个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的4557-4685bp处)，第七个外显子由100个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的4686-4785bp处)，第七个内含子由337个核苷酸组成(位于序列表SEQID NO：1的4786-5122bp处)，第八个外显子由79个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的5123-5201bp处)，第八个内含子由78个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的5202-5279bp处)，第九个外显子由100个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的5280-5379bp处)，第九个内含子由88个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的5380-5467bp处)，第十个外显子由67个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的5468-5534bp处)，第十个内含子由92个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的5535-5626bp处)，第十一个外显子由52个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的5627-5678bp处)，第十一个内含子由243个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的5679-5921bp处)，第十二个外显子由176个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的5922-6097bp处)，第十二个内含子由108个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的6098-6205bp处)，第十三个外显子由138个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的6206-6343bp处)。

下文中涉及的OsEDR1基因均来自水稻品种中花11。

3.OsEDR1基因编码产物的分析

OsEDR1基因的编码区由3051个核苷酸组成，编码一个长度为1017个氨基酸的蛋白质。根据Ichimura等(2002)的丝裂原激活蛋白激酶蛋白质家族的分类，OsEDR1蛋白属于典型的该家族中的MAPKKK蛋白。利用已有的生物信息学工具InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/Tools/InterProScan/)和ExPASy(http://www.expasy.ch/prosite/)进行分析，发现它属于MAPKKK蛋白中的第二亚类，具有一个保守的激酶结构域(IVHRDLKSPNLLVDN)和一个热激蛋白70结构域。

实施例三：OsEDR1基因的功能验证

1.遗传转化载体的构建

本发明采用RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术、通过抑制水稻品种中花11中OsEDR1基因的表达，验证该基因的功能。这个技术途径的主要机理：将目标基因的部分片段以反向重复的形式与能够表达双链RNA(double strand RNA，dsRNA)的载体连接，通过遗传转化将该载体导入植物中。获得的转化植株大量表达与目标基因部分片段同源的dsRNA。这些dsRNA迅速形成短干扰RNA(short interfering RNA，siRNA)。这些siRNA与目标基因的转录子(mRNA)互补配对，在细胞内特殊酶的作用下使目标基因的转录子降解，从而在mRNA水平上抑制目标基因的功能。研究者可以通过转基因植株表型的改变，验证目标基因的功能。RNA干扰技术已被广泛用于基因功能的验证(Smith等，2000；McGinnis等，2005)。

本发明中用于农杆菌介导的遗传转化的载体是pDS1301，它是常用的水稻遗传转化RNAi载体(Cao等，2007；Yuan等，2007)。该载体携带具有组成型表达的花椰菜花叶病毒启动子，能够组成性抑制目标基因的表达(图4)。

申请人首先采用上述方法从水稻品种中花11中抽取总RNA和通过反转录获得cDNA。用PCR引物EDR1F1(5′-TA ACTAGT GGTACC GATTGGGAAGGTTC-3′)(下划线代表用于载体连接的接头中的SpeI KpnI限制性内切酶消化位点)和EDR1R1(5′-TA GAGCTC GGATCC AGCACCCATGAAGAG-3′)(下划线代表用于载体连接的接头中的SacI BamHI限制性内切酶消化位点)以中花11的cDNA为模板，扩增得到一个545bp(位于序列表SEQ ID NO：1的3769-4150、4336-4375、4487-4556、4686-4738bp处)的cDNA片段。用限制性内切酶KpnI和BamHI分别消化酶切该cDNA片段、加入了BamHI和KpnI酶切位点的中间载体pGEM-G(美国Promega公司)和遗传转化载体pDS1301，酶切完全后在65℃水浴10min灭活限制性内切酶。将酶切片段在0.8％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收目的条带。用T₄-DNA连接酶将OsEDR1的cDNA片段分别与中间载体pGEM-G和遗传转化载体pDS1301进行连接。将连接好的载体利用电转化的方法(Wilson和Gough，1988)转入大肠杆菌菌株DH10B(Sun等，2004)。所用电转化仪为Electroporator 2510(德国eppendorf公司)，操作参照Electroporator 2510工作手册进行，转化的电压为1800V，电容为10μF，2500V脉冲放电，时间参数为5毫秒/样品。通过BamHI和KpnI酶切筛选外源片段正向插入的阳性克隆。

用SacI和SpeI酶切携带OsEDR1的cDNA片段的pGEM-G载体质粒和已经连入第一链OsEDR1的cDNA片段的pDS1301载体质粒。酶切完全后在65℃水浴10min灭活限制性内切酶。用T₄-DNA连接酶将OsEDR1的cDNA片段连接到携带OsEDR1的cDNA片段的pDS1301质粒的SacI/SpeI酶切位点。用上述电转化方法将连接好的载体转入大肠杆菌菌株DH10B，通过SacI和SpeI双酶切反应筛选阳性克隆，阳性克隆命名为D120R(图4)。

2.遗传转化和T₀代遗传转化植株分析

采用农杆菌介导的遗传转化方法(Lin和Zhang，2005)将D120R阳性克隆导入水稻感病品种中花11。获得的遗传转化植株被命名为D120RZ1(其中前面部分为遗传转化载体名称，Z1代表水稻品种中花11)。本发明共获得独立转化植株15株。采用上述接种方法对全部转化植株在成株期阶段接种白叶枯病菌株PXO61(Sun等，2004)，与对照中花11及遗传转化阴性植株相比，所有的阳性遗传转化植株的抗性显著增强(P＜0.01)，其病斑面积减小了大约96％至98％(表1)。

表1.T₀代遗传转化植株(D120RZ1-)对白叶枯病菌株PXO61的反应

⁽¹⁾每株转化基因植株接种3-5片叶，14天后调查病斑和病叶长度，每个数据来自于多个叶片的平均值。

⁽²⁾阴性转化植株，其它植株为阳性转化植株。

为进一步验证转化植株的抗病能力增强是否与OsEDR1基因表达量相关，申请人采用上述定量RT-PCR方法检测了这15株T₀代转化植株中OsEDR1基因的相对表达量。实验结果显示转化植株中OsEDR1基因的表达量变化与植株的表型变化密切相关(图5)。抗病性增强的转化植株中OsEDR1基因的表达量与对照材料中花11相比显著减少。而抗病表型无明显变化的阴性转化植株中OsEDR1基因表达量与中花11相比无明显降低。该结果说明遗传转化植株对白叶枯病菌的抗性增强是因为OsEDR1基因的表达量降低；OsEDR1基因的编码产物在水稻抗白叶枯病反应中发挥负调控因子的作用；抑制水稻中OsEDR1基因的表达，可增强水稻对白叶枯病的抗性。

3.筛选水稻突变体库和突变体植株抗性分析

为进一步验证OsEDR1基因在水稻抗病反应中的作用，申请人利用OsEDR1基因的序列检索水稻T-DNA插入突变体数据库RMD(Zhang等，2006)，发现该数据库中的突变体04Z11MP37具有354bp的侧翼序列(序列表SEQ ID NO：1中的3464-3817bp)与OsEDR1基因同源。提示T-DNA插入在OsEDR1基因内部。序列比较分析提示T-DNA插入在序列表SEQ ID NO：1所示序列的3817bp后，即T-DNA插入在OsEDR1基因的第4个外显子内(图6A)。

为了验证所获得突变体的正确性，申请人根据OsEDR1基因的序列设计了一对位于T-DNA插入位点两侧的PCR引物(图6A)：1F(5′-CCATCAACTTATTTGCCGACC-3′)和1R(5′-GTCGACGCATAATCCGCAC-3′)。另外，根据T-DNA序列设计了PCR引物LBT2(5′-ATAGGGTTTCGCTCATGTGTTGAGCAT-3′)(Wu等，2003)。利用这3条PCR引物分析所获得突变体的T-DNA是否插入在OsEDR1基因的内部。这一分析的基本原理是：在04Z11MP37的纯合突变体(一对同源染色体中都有T-DNA的插入)植株中，由于插入的T-DNA片段大约14kb(Wu等，2003)，利用引物1F和1R、采用常规PCR方法无法扩增如此大的DNA片段，而用引物1F和LBT2一段大小已知的水稻基因组和T-DNA的杂合DNA片段；在04Z11MP37的杂合突变体(一对同源染色体中只有一条染色体中有T-DNA插入)植株中，用引物1F和引物1R可以扩增一段大小已知的水稻基因组的DNA片段，用引物1F和LBT2也可以扩增一段大小已知的水稻基因组和T-DNA的杂合DNA片段；在04Z11MP37的阴性(家系中分离出的没有T-DNA插入的)植株中，用引物1F和1R可以扩增一段大小已知的水稻基因组DNA片段，但是用引物1F和LBT2不能够扩增DNA片段。申请人对15株04Z11MP37家系的T₁植株进行了上述PCR分析。结果显示其中4株是纯合突变体，4株是阴性植株，7株是杂合突变体(图6B)。这些结果说明申请人获得的水稻材料04Z11MP37是OsDER1基因突变体。

04Z11MP37突变体具有粳稻品种中花11的遗传背景(Wu等，2003)。对上述15株04Z11MP37家系的T₁植株接种白叶枯病菌株PXO61，与遗传转化受体中花11以及遗传转化阴性植株相比，所有的阳性遗传转化植株的抗性显著增强(P＜0.01)，其病斑面积减小了大约93％至97％((表2)。

表2.04Z11MP37株系接种白叶枯病菌PXO61后的病斑面积

⁽²⁾阴性转化植株，其它植株为阳性转化植株。

为进一步验证突变体植株的抗病能力增强是否与OsEDR1基因表达量相关，申请人采用上述定量RT-PCR方法检测了这15株植株中OsEDR1基因的相对表达量。实验结果显示转化植株中OsEDR1基因的表达量变化与植株的表型变化密切相关(图7)。抗病性增强的植株中OsEDR1基因的表达与对照中花11相比显著减少或消失。而抗病表型无明显变化的阴性转化植株中OsEDR1基因表达量与中花11相比无明显变化(图7)。该结果进一步说明OsEDR1基因的编码产物在水稻抗白叶枯病反应发挥负调控因子的作用。抑制水稻中OsEDR1基因的表达，可增强水稻对白叶枯病的抗性。

实施例四：抑制OsEDR1基因的植株对细条病的抗性显著增强

申请人对纯合的OsEDR1基因T-DNA插入突变体的T2家系(04Z11MP37-3)和具有同样遗传背景的对照水稻品种中花11在孕穗期接种细条病菌JSB2-24、RH3、HNB8-47(Lai等，2004；Chen等，2006)。申请人采用渗透法和针刺法两种方法接种细条病菌(Chen等，2006)。采用渗透法接种10天后发现水稻品种中花11对这三个菌株均不产生超敏反应(hypersensitive response)，而04Z11MP37-3植株产生明显超敏反应(图8)，提示抑制OsEDR1基因也使水稻增强对细条病的抗性。

申请人进一步采用针刺法接种细条病菌，定量检测突变体植株的抗性程度。接种14天后检测发病情况(Chen等，2006)，发现与感病对照中花11相比，具有同样遗传背景的04Z11MP37-3植株对细条病菌JSB2-24、RH3、HNB8-47的抗性显著增强(P＜0.01)，其病斑长度减短了大约48％至67％(表3)。

表3.04Z11MP37株系接种不同细条病菌后的病斑长度

细条病菌	水稻材料	病斑长度(cm)	P值
细条病菌	水稻材料	病斑长度(cm)	P值	JSB2-24	中花11(对照)	0.61±0.06
	04Z11MP37-3	0.32±0.07	0.0001	JSB2-24	中花11(对照)	0.61±0.06

RH3	中花11(对照)	0.70±0.06
RH3	中花11(对照)	0.70±0.06	04Z11MP37-3	0.35±0.05	0.0001
HNB8-47	中花11(对照)	1.00±0.09	04Z11MP37-3	0.35±0.05	0.0001
HNB8-47	中花11(对照)	1.00±0.09	04Z11MP37-3	0.33±0.05	0.0000

这些结果说明OsEDR1基因的编码蛋白既是水稻抗白叶枯病反应的负调控因子，也是抗细条病反应的负调控因子。抑制OsEDR1基因表达可培育具有广谱抗性的水稻。

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序列表

<110>华中农业大学

<120>水稻抗病相关基因OsEDR1和它在改良水稻抗病性中的应用

<130>

<141>2009-03-22

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>6343

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(6343)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(445)

<220>

<221>Intron

<222>(446)..(1256)

<220>

<221>CDS

<222>(1257)..(1678)

<220>

<221>Intron

<222>(1679)..(2143)

<220>

<221>CDS

<222>(2144)..(2244)

<220>

<221>Intron

<222>(2245)..(2886)

<220>

<221>CDS

<222>(2887)..(4150)

<220>

<221>Intron

<222>(4151)..(4335)

<220>

<221>CDS

<222>(4336)..(4375)

<220>

<221>Intron

<222>(4376)..(4486)

<220>

<221>CDS

<222>(4487)..(4556)

<220>

<221>Intron

<222>(4557)..(4685)

<220>

<221>CDS

<222>(4686)..(4785)

<220>

<221>Intron

<222>(4786)..(5122)

<220>

<221>CDS

<222>(5123)..(5201)

<220>

<221>Intron

<222>(5202)..(5279)

<220>

<221>CDS

<222>(5280)..(5379)

<220>

<221>Intron

<222>(5380)..(5467)

<220>

<221>CDS

<222>(5468)..(5534)

<220>

<221>Intron

<222>(5535)..(5626)

<220>

<221>CDS

<222>(5627)..(5678)

<220>

<221>Intron

<222>(5679)..(5921)

<220>

<221>CDS

<222>(5922)..(6097)

<220>

<221>Intron

<222>(6098)..(6205)

<220>

<221>CDS

<222>(6206)..(6340)

<400>1

atg aag aat ctg ttc aag agt aag atc aag tgg cag cac cgg tcg aac 48

Met Lys Asn Leu Phe Lys Ser Lys Ile Lys Trp Gln His Arg Ser Asn

1 5 10 15

gac ccc gcg tcg tcg cag ggg cag ggg cag ggg ctg ccg cag cag acg 96

Asp Pro Ala Ser Ser Gln Gly Gln Gly Gln Gly Leu Pro Gln Gln Thr

20 25 30

ccg ccg tcg cca tcg ccg gcg agc tcc ccg tcg ggg ggg ccg cct gcg 144

Pro Pro Ser Pro Ser Pro Ala Ser Ser Pro Ser Gly Gly Pro Pro Ala

35 40 45

cta tcc gtg tcg acg gta tcg tcg tcg tcc cct tcc gcc gcc gcg acg 192

Leu Ser Val Ser Thr Val Ser Ser Ser Ser Pro Ser Ala Ala Ala Thr

50 55 60

ccg acg ggg gct gct gcg gcg ggg gcg gga ggt ggg ggt ggg gga acg 240

Pro Thr Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Thr

65 70 75 80

ggt ggg gag gat tac atg ttg tcg gag gag gag ttc cag atg cag ctg 288

Gly Gly Glu Asp Tyr Met Leu Ser Glu Glu Glu Phe Gln Met Gln Leu

85 90 95

gcg atg gcg ctg tcg gcg tcc aac agc gag tgc gtg ggc gac ctg gac 336

Ala Met Ala Leu Ser Ala Ser Asn Ser Glu Cys Val Gly Asp Leu Asp

100 105 110

ggg gag cag atc agg aag gcc aag ctg ata agc ctc ggc agg ggc gac 384

Gly Glu Gln Ile Arg Lys Ala Lys Leu Ile Ser Leu Gly Arg Gly Asp

115 120 125

cgc ttc gcc gcc gtc cgg gac gac gag caa acc gcg gat gcg ctc tcc 432

Arg Phe Ala Ala Val Arg Asp Asp Glu Gln Thr Ala Asp Ala Leu Ser

130 135 140

cgc cgc tac cgg g tgagtcgcca tgaccaagga ttcgattcga gatggattat 485

Arg Arg Tyr Arg

145

atatgctaaa ctatgcaacc gtgtgactag tgagatttta gtttgcattg ccatacaaca 545

gtagacttat tgcgggggaa ggattgtttt acatgttatg attaccagtt actactataa 605

tccatgctac cattgttctc gtcgaattca aattcaacca atggattgga tagtagcttc 665

cgtggctatg tctagaccat gtaaatgtga atcttcacct tggaatggaa aatcacacat 725

agaataggga agggctccta tctagcatct acatgtattc attcctgtgg actggaatta 785

cctcctttgg tctcttccag gttcccggtg atcaacccat taaaacaatt gtattaataa 845

aatacttcta caatatacgt tgccatgttt ttgctggtgc attgcgatag aatcctacag 905

atcagagtct tgcattggat attgcccagg aataaaggac tattgtttct gtggacggcg 965

gggaagtaga tgatattaca aggcagcgag attttctaga ctggaggttc ttttgcgggc 1025

aattgtagct ttgtagcttg ttggttacat caatctatgt cttttacatg ttgggttgat 1085

tccattctgt tacttagtga gtgatatttc atatttgtag atattttgct tggtagatca 1145

cttttttcct tccatgatgt gtcaattaag ctcaaacatg gggatgataa gtatatttgc 1205

ttgctggatt gtctgacatt ctatcactgt gcttctattc tgactttcag gac tac 1261

Asp Tyr

150

aac ttt ctt gat tac cat gag aaa gtt att gat ggc ttc tat gac att 1309

Asn Phe Leu Asp Tyr His Glu Lys Val Ile Asp Gly Phe Tyr Asp Ile

155 160 165

ttt ggc ccc tct atg gaa tca tca aag caa ggg aag atg cca tca cta 1357

Phe Gly Pro Ser Met Glu Ser Ser Lys Gln Gly Lys Met Pro Ser Leu

170 175 180

gca gat ctt caa acg ggc ata ggc gac ctg ggt ttt gaa gtc atc gta 1405

Ala Asp Leu Gln Thr Gly Ile Gly Asp Leu Gly Phe Glu Val Ile Val

185 190 195

atc aat cgt gcc att gat acc acc tta cag gag atg gaa caa gtt gca 1453

Ile Asn Arg Ala Ile Asp Thr Thr Leu Gln Glu Met Glu Gln Val Ala

200 205 210

caa tgt atc ctg ctt gac ttt cct gtt gca aat att gca gcc tta gtt 1501

Gln Cys Ile Leu Leu Asp Phe Pro Val Ala Asn Ile Ala Ala Leu Val

215 220 225 230

caa aga ata gcc gag ctt gtt aca gat cac atg ggt gga cct gtg aaa 1549

Gln Arg Ile Ala Glu Leu Val Thr Asp His Met Gly Gly Pro Val Lys

235 240 245

gat gca aat gac atg ctc act aga tgg cta gag aaa agc act gag cta 1597

Asp Ala Asn Asp Met Leu Thr Arg Trp Leu Glu Lys Ser Thr Glu Leu

250 255 260

aga acc tca cta cac aca agt ttg ttg cct att ggc tgc atc aag ata 1645

Arg Thr Ser Leu His Thr Ser Leu Leu Pro Ile Gly Cys Ile Lys Ile

265 270 275

ggt ctg tct cgt cac cgt gcc cta ctt ttc aag gtcagttctc tctcagaaaa 1698

Gly Leu Ser Arg His Arg Ala Leu Leu Phe Lys

280 285

tcctcaatat attgaatgtt atgaattgtc tagggtaagg gttcaaagac taggggatat 1758

ggcactcgcc ttctaataac ggtggcaggg cttctccctg ctgagctaaa agaggatttg 1818

aggcttaggg ctaactttag agattcattg attgattgat aatagagtac gtgggggtcc 1878

ctttataggg aggacatact agacacataa ggaactaaat ctctagtatt atataaacca 1938

atccaatctc tatctctaac tttctaataa acttcatctc tttcctaact agataatctc 1998

ctatatttat atgatttatt cctaatttat catgcccaaa ctgctgcatg ggcctatgct 2058

catacattga atgtaagcac tagatttctt catttgtcca acatatatag atgtccgctt 2118

atggctactg tatatcttcg tgcag att ctc gct gat agt gtt ggc att cct 2170

Ile Leu Ala Asp Ser Val Gly Ile Pro

290 295

tgc aag ctt gtc aaa ggg agt aat tat act ggt gat gat gat gat gct 2218

Cys Lys Leu Val Lys Gly Ser Asn Tyr Thr Gly Asp Asp Asp Asp Ala

300 305 310

atc aac ata ata aag atg aat gaa agg tattgatgt atttgatcat 2264

Ile Asn Ile Ile Lys Met Asn Glu Arg

315 320

tgctgtttct ctgggggaaa actatagtaa aaaaacccgg accggtgggt gacctggccg 2324

accttctggt tcaccggtct gaccggtggc tcggatggtt gaaccacggt tcacatgtgt 2384

acatgtatat tgttattccc tcctactcac atatggtgca atagcataag ggttaggcca 2444

tccttccgtg agcacactgc ccagggttcg attcccacca aatgcgccac tccttgccaa 2504

ttttgcggaa aaaaagggga cagccacagc aagcattgat gaaatgggcc tcaggcagcc 2564

catttatggc ccatttgcag gttgacctgt ccaaccagta tcggtttaat gtccggttcg 2624

cctaagaacc ggccggttca gccggttcaa agcggtttga atgcatgtcc ggtctttgaa 2684

gcaaaccgaa ccgtgctaag gtctggttcc catttttttc cggtcgaacc gccggtccgg 2744

tctggttttt tctactatgg ggaaaacaat ccaaatacat tatttattta ttcgtctgct 2804

acctttgttt caaatatatt tttaaataat ttggtattgc tgccttacat tttctaagtg 2864

ggtttatgtg ctgtttttgc ag g gag ttt ttg gtt gat ctc atg gct gct 2914

Glu Phe Leu Val Asp Leu Met Ala Ala

325 330

ccc ggt act ctt att cca tca gat gtc tta agt tgg aag ggc aac tca 2962

Pro Gly Thr Leu Ile Pro Ser Asp Val Leu Ser Trp Lys Gly Asn Ser

335 340 345

tta aat tct aat gca aga ctc acc cag aat cca ttg gct ggg tca tca 3010

Leu Asn Ser Asn Ala Arg Leu Thr Gln Asn Pro Leu Ala Gly Ser Ser

350 355 360

agt aca act gat tct aat ctc agt gcc aat gca tta cca ccc gga cat 3058

Ser Thr Thr Asp Ser Asn Leu Ser Ala Asn Ala Leu Pro Pro Gly His

365 370 375 380

aaa ggt ggc caa ctg cct tta ttt agc agt ggc gat tgg ata tcg gcc 3106

Lys Gly Gly Gln Leu Pro Leu Phe Ser Ser Gly Asp Trp Ile Ser Ala

385 390 395

agt caa tct gga tat gaa aaa gat gga gcc acc aca tct tca cag gcc 3154

Ser Gln Ser Gly Tyr Glu Lys Asp Gly Ala Thr Thr Ser Ser Gln Ala

400 405 410

tct tca agt ggc aca aca tct gtt gct gct gga agc gct ttt gat agt 3202

Ser Ser Ser Gly Thr Thr Ser Val Ala Ala Gly Ser Ala Phe Asp Ser

415 420 425

tct tgg aca tta gtt tct cat gga caa tca gat gat cca tca acc tct 3250

Ser Trp Thr Leu Val Ser His Gly Gln Ser Asp Asp Pro Ser Thr Ser

430 435 440

gct ggt atg tca gca cag cag aaa gtt ata ctt cca ggt gga gaa cat 3298

Ala Gly Met Ser Ala Gln Gln Lys Val Ile Leu Pro Gly Gly Glu His

445 450 455 460

cca tgg aat gag gat ata aat gcg cga aat gag aat ata aaa ctt gtt 3346

Pro Trp Asn Glu Asp Ile Asn Ala Arg Asn Glu Asn Ile Lys Leu Val

465 470 475

tca gat tta caa ggg aat tca gag tcc atc aac tta ttt gcc gac ctt 3394

Ser Asp Leu Gln Gly Asn Ser Glu Ser Ile Asn Leu Phe Ala Asp Leu

480 485 490

aat cct ttt ggg ggt agg gag ccc aaa agg act tca gtg cca tta aat 3442

Asn Pro Phe Gly Gly Arg Glu Pro Lys Arg Thr Ser Val Pro Leu Asn

495 500 505

ggg cca gat aat aga aat aat gag ttg caa aga cgc aga gag aat gta 3490

Gly Pro Asp Asn Arg Asn Asn Glu Leu Gln Arg Arg Arg Glu Asn Val

510 515 520

gtc cct agc aca cga aga ccc cag cag cga tta gtt atg aaa aac tgg 3538

Val Pro Ser Thr Arg Arg Pro Gln Gln Arg Leu Val Met Lys Asn Trp

525 530 535 540

tct cct tac aat gat gtt tcc aac aac aag cag tac aat tat gtt gag 3586

Ser Pro Tyr Asn Asp Val Ser Asn Asn Lys Gln Tyr Asn Tyr Val Glu

545 550 555

gat tca ttt gca cgt aga aat att ggt gat aat gct gca tca tca tct 3634

Asp Ser Phe Ala Arg Arg Asn Ile Gly Asp Asn Ala Ala Ser Ser Ser

560 565 570

cag gtg cca cgg cca tct gca aaa aat act aat ctt aat gtt gta gtg 3682

Gln Val Pro Arg Pro Ser Ala Lys Asn Thr Asn Leu Asn Val Val Val

575 580 585

cgc act gat aca cca tac atg gca gct cat aat tat gat aat agt atg 3730

Arg Thr Asp Thr Pro Tyr Met Ala Ala His Asn Tyr Asp Asn Ser Met

590 595 600

gct ggt tcc tct gca atg aag atg act tct aca gct ggg att ggg aag 3778

Ala Gly Ser Ser Ala Met Lys Met Thr Ser Thr Ala Gly Ile Gly Lys

605 610 615 620

gtt cct gat aag gtt ctg tac ggt gat ttg gac aag ggc ctt act aat 3826

Val Pro Asp Lys Val Leu Tyr Gly Asp Leu Asp Lys Gly Leu Thr Asn

625 630 635

tct aga ctg ggg gat caa cca ccg ata gaa aga cat aaa tgg ggc aat 3874

Ser Arg Leu Gly Asp Gln Pro Pro Ile Glu Arg His Lys Trp Gly Asn

640 645 650

tct gta gaa gga agg att cca aca ggc aca gtt cac aat caa gca aaa 3922

Ser Val Glu Gly Arg Ile Pro Thr Gly Thr Val His Asn Gln Ala Lys

655 660 665

gaa cac aag gag aac ttc gat gga aag caa gac aat aag aag tta cat 3970

Glu His Lys Glu Asn Phe Asp Gly Lys Gln Asp Asn Lys Lys Leu His

670 675 680

cct gat cca aag aaa tcc cca ctt gac aga ttc atg gac aca tca atg 4018

Pro Asp Pro Lys Lys Ser Pro Leu Asp Arg Phe Met Asp Thr Ser Met

685 690 695 700

cca tca agg aac cct gaa tcc gtt tca cca tcc ttt gct agg tca cac 4066

Pro Ser Arg Asn Pro Glu Ser Val Ser Pro Ser Phe Ala Arg Ser His

705 710 715

aag cta gac acc atg ttc gac gat gtg tct gaa tgt gaa att cat tgg 4114

Lys Leu Asp Thr Met Phe Asp Asp Val Ser Glu Cys Glu Ile His Trp

720 725 730

gaa gat ctt gtg att ggt gaa agg att ggc tta ggt atttttcctc 4160

Glu Asp Leu Val Ile Gly Glu Arg Ile Gly Leu Gly

735 740

aactaagatt ttgacatgat ccttgcttct ctatacatta acaagttgaa ccgacaaatc 4220

tttaacaatt tgtcaaacta tattattata gctcagccat gtgtaaactc attgcactat 4280

ctgatgccaa tttgttgcac aaacttgaac caacttcttc ctcctcccaa caggt tca 4338

Ser

745

tat gga gag gtg tac cgt gct gat tgg aat gga aca g taagaaactg 4385

Tyr Gly Glu Val Tyr Arg Ala Asp Trp Asn Gly Thr

750 755

tttgctttta tttccatatt gtgccataga aacattcttc ccagaggtta aattctttat 4445

tgttttgctt ctgtcaaaaa acatttttgt ttatttgcag g aa gta gct gtc aag 4500

Glu Val Ala Val Lys

760

aaa ttc ttg gat caa gat ttc tat ggt gat gct ttg gat gaa ttc cgg 4548

Lys Phe Leu Asp Gln Asp Phe Tyr Gly Asp Ala Leu Asp Glu Phe Arg

765 770 775

agt gaa gta ggtgaaact atatatattt tatatatctt agagctttac 4596

Ser Glu Val

780

tggctatagc gtggattcat ttatttgtca tttttaattg atttttgctg caatgttttg 4656

atttgccata tactttcttt ttacaaggt g cgg att atg cgt cga ctg cgt cat 4710

Arg Ile Met Arg Arg Leu Arg His

785

cca aat att gtt ctc ttc atg ggt gct gtt act cgt cct cca aac tta 4758

Pro Asn Ile Val Leu Phe Met Gly Ala Val Thr Arg Pro Pro Asn Leu

790 795 800 805

tct att gta tct gag tat ctt cca agg tataacaatt ttctactgtt 4805

Ser Ile Val Ser Glu Tyr Leu Pro Arg

810

gtttgcttgt gaagatcttt tggtgtttat gataaagtat catggtgtag ataaacatag 4865

aaaacattct atctggaagg accacaaaga aaagctctct caacaactta gctttagaat 4925

ggaacataac actggaggtt caacatgctg tagttgaaat acctgtcttt aatgatttac 4985

ttgtgcatgg gaggtggcat actggcatct atctatagta gttatattat agtgcaactc 5045

atgctctata gttattgtac tggtcatgtt cgacgaattg atggctcacc cttgactact 5105

ctcctgtcct tggcagg gga agc tta tat aag atc ctt cac cgt cct aat 5155

Gly Ser Leu Tyr Lys Ile Leu His Arg Pro Asn

815 820 825

tgc caa att gac gag aag cgt aga att aaa atg gcc ctt gat gtg g 5201

Cys Gln Ile Asp Glu Lys Arg Arg Ile Lys Met Ala Leu Asp Val

830 835 840

taagtatttt ctatattttc ttggcatgtt tgtttatttt tgtatctgct tgagaaaatg 5261

gttgctttct cttaaagg cc aaa gga atg aat tgc ctc cat att agt gta 5311

Ala Lys Gly Met Asn Cys Leu His Ile Ser Val

845 850

cca aca att gtt cat cgg gat ctt aaa tca cca aac ttg ctg gtt gac 5359

Pro Thr Ile Val His Arg Asp Leu Lys Ser Pro Asn Leu Leu Val Asp

855 860 865

aac aac tgg aat gtg aag gta ctgtgctct ttttaccttt acattcattc 5409

Asn Asn Trp Asn Val Lys Val

870

agtcataagt atttatgagc gtgctgatcg attggctcac caatgatgtg aaataggt t 5468

tgt gat ttt gga ctt tca cgc ttg aag cac agt aca ttc tta tca tcc 5516

Cys Asp Phe Gly Leu Ser Arg Leu Lys His Ser Thr Phe Leu Ser Ser

875 880 885 890

aaa tcc act gct gga act gtaagtacta aaccggacca tagtaggatg 5564

Lys Ser Thr Ala Gly Thr

895

agttctctcc ttctttgatc atcactaaac atttactatt tctgttttcg atatctcacc 5624

ag ccg gag tgg atg gca cct gag gtc ttg cgg aat gaa caa tca aat 5671

Pro Glu Trp Met Ala Pro Glu Val Leu Arg Asn Glu Gln Ser Asn

900 905 910

gaa aag t aagttattcc tcgatggctt ttgtttcaat aactattagc ttttgcccta 5728

Glu Lys

gcttgttcaa tttatttttt cattctgggc ataccattca aagttgttca gcattacaga 5788

agaaattatg tttatcttcc agtctctact cgtagaaatg gaacacccat ctccctcaca 5848

aacctttcag ctttccttgt ttgattggtg tggcagtaat ctcactcaga catcacctga 5908

aatttctgca ggt gt gat gtt tac agc ttt ggt gtc atc ttg tgg gaa 5956

Cys Asp Val Tyr Ser Phe Gly Val Ile Leu Trp Glu

915 920 925

tta gca aca ctt agg atg cca tgg agt gga atg aat cca atg caa gtt 6004

Leu Ala Thr Leu Arg Met Pro Trp Ser Gly Met Asn Pro Met Gln Val

930 935 940

gtt ggg gca gtc ggc ttc cag gac aag cgg ctc gat att ccc aag gaa 6052

Val Gly Ala Val Gly Phe Gln Asp Lys Arg Leu Asp Ile Pro Lys Glu

945 950 955

att gat cct cta gtt gca agg atc ata tgg gaa tgc tgg cag aag 6097

Ile Asp Pro Leu Val Ala Arg Ile Ile Trp Glu Cys Trp Gln Lys

960 965 970

tgagtgttta gaaacaaacc tattttatgt tgcatcaata aagtactctc ttccaactat 6157

caattgtgtt gctagatccg agctaatatt tggtttttaa acctcagg gat cca aat 6214

Asp Pro Asn

975

ttg cgg ccc tcg ttt gca cag tta acc agt gct ttg aag act gtc caa 6262

Leu Arg Pro Ser Phe Ala Gln Leu Thr Ser Ala Leu Lys Thr Val Gln

980 985 990

agg cta gta acc cct tct cac cag gag tcc cag agc cct cct gtg gct 6310

Arg Leu Val Thr Pro Ser His Gln Glu Ser Gln Ser Pro Pro Val Ala

995 1000 1005

caa gaa ata tgg gtg aat tct tcc acc cct tga 6343

Gln Glu Ile Trp Val Asn Ser Ser Thr Pro

1010 1015

<210>2

<211>1017

<212>PRT

<213>Oryza sativa

<400>2

Met Lys Asn Leu Phe Lys Ser Lys Ile Lys Trp Gln His Arg Ser Asn

1 5 10 15

Asp Pro Ala Ser Ser Gln Gly Gln Gly Gln Gly Leu Pro Gln Gln Thr

20 25 30

Pro Pro Ser Pro Ser Pro Ala Ser Ser Pro Ser Gly Gly Pro Pro Ala

35 40 45

Leu Ser Val Ser Thr Val Ser Ser Ser Ser Pro Ser Ala Ala Ala Thr

50 55 60

Pro Thr Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Thr

65 70 75 80

Gly Gly Glu Asp Tyr Met Leu Ser Glu Glu Glu Phe Gln Met Gln Leu

85 90 95

Ala Met Ala Leu Ser Ala Ser Asn Ser Glu Cys Val Gly Asp Leu Asp

100 105 110

Gly Glu Gln Ile Arg Lys Ala Lys Leu Ile Ser Leu Gly Arg Gly Asp

115 120 125

Arg Phe Ala Ala Val Arg Asp Asp Glu Gln Thr Ala Asp Ala Leu Ser

130 135 140

Arg Arg Tyr Arg Asp Tyr Asn Phe Leu Asp Tyr His Glu Lys Val Ile

145 150 155 160

Asp Gly Phe Tyr Asp Ile Phe Gly Pro Ser Met Glu Ser Ser Lys Gln

165 170 175

Gly Lys Met Pro Ser Leu Ala Asp Leu Gln Thr Gly Ile Gly Asp Leu

180 185 190

Gly Phe Glu Val Ile Val Ile Asn Arg Ala Ile Asp Thr Thr Leu Gln

195 200 205

Glu Met Glu Gln Val Ala Gln Cys Ile Leu Leu Asp Phe Pro Val Ala

210 215 220

Asn Ile Ala Ala Leu Val Gln Arg Ile Ala Glu Leu Val Thr Asp His

225 230 235 240

Met Gly Gly Pro Val Lys Asp Ala Asn Asp Met Leu Thr Arg Trp Leu

245 250 255

Glu Lys Ser Thr Glu Leu Arg Thr Ser Leu His Thr Ser Leu Leu Pro

260 265 270

Ile Gly Cys Ile Lys Ile Gly Leu Ser Arg His Arg Ala Leu Leu Phe

275 280 285

Lys Ile Leu Ala Asp Ser Val Gly Ile Pro Cys Lys Leu Val Lys Gly

290 295 300

Ser Asn Tyr Thr Gly Asp Asp Asp Asp Ala Ile Asn Ile Ile Lys Met

305 310 315 320

Asn Glu Arg Glu Phe Leu Val Asp Leu Met Ala Ala Pro Gly Thr Leu

325 330 335

Ile Pro Ser Asp Val Leu Ser Trp Lys Gly Asn Ser Leu Asn Ser Asn

340 345 350

Ala Arg Leu Thr Gln Asn Pro Leu Ala Gly Ser Ser Ser Thr Thr Asp

355 360 365

Ser Asn Leu Ser Ala Asn Ala Leu Pro Pro Gly His Lys Gly Gly Gln

370 375 380

Leu Pro Leu Phe Ser Ser Gly Asp Trp Ile Ser Ala Ser Gln Ser Gly

385 390 395 400

Tyr Glu Lys Asp Gly Ala Thr Thr Ser Ser Gln Ala Ser Ser Ser Gly

405 410 415

Thr Thr Ser Val Ala Ala Gly Ser Ala Phe Asp Ser Ser Trp Thr Leu

420 425 430

Val Ser His Gly Gln Ser Asp Asp Pro Ser Thr Ser Ala Gly Met Ser

435 440 445

Ala Gln Gln Lys Val Ile Leu Pro Gly Gly Glu His Pro Trp Asn Glu

450 455 460

Asp Ile Asn Ala Arg Asn Glu Asn Ile Lys Leu Val Ser Asp Leu Gln

465 470 475 480

Gly Asn Ser Glu Ser Ile Asn Leu Phe Ala Asp Leu Asn Pro Phe Gly

485 490 495

Gly Arg Glu Pro Lys Arg Thr Ser Val Pro Leu Asn Gly Pro Asp Asn

500 505 510

Arg Asn Asn Glu Leu Gln Arg Arg Arg Glu Asn Val Val Pro Ser Thr

515 520 525

Arg Arg Pro Gln Gln Arg Leu Val Met Lys Asn Trp Ser Pro Tyr Asn

530 535 540

Asp Val Ser Asn Asn Lys Gln Tyr Asn Tyr Val Glu Asp Ser Phe Ala

545 550 555 560

Arg Arg Asn Ile Gly Asp Asn Ala Ala Ser Ser Ser Gln Val Pro Arg

565 570 575

Pro Ser Ala Lys Asn Thr Asn Leu Asn Val Val Val Arg Thr Asp Thr

580 585 590

Pro Tyr Met Ala Ala His Asn Tyr Asp Asn Ser Met Ala Gly Ser Ser

595 600 605

Ala Met Lys Met Thr Ser Thr Ala Gly Ile Gly Lys Val Pro Asp Lys

610 615 620

Val Leu Tyr Gly Asp Leu Asp Lys Gly Leu Thr Asn Ser Arg Leu Gly

625 630 635 640

Asp Gln Pro Pro Ile Glu Arg His Lys Trp Gly Asn Ser Val Glu Gly

645 650 655

Arg Ile Pro Thr Gly Thr Val His Asn Gln Ala Lys Glu His Lys Glu

660 665 670

Asn Phe Asp Gly Lys Gln Asp Asn Lys Lys Leu His Pro Asp Pro Lys

675 680 685

Lys Ser Pro Leu Asp Arg Phe Met Asp Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn

690 695 700

Pro Glu Ser Val Ser Pro Ser Phe Ala Arg Ser His Lys Leu Asp Thr

705 710 715 720

Met Phe Asp Asp Val Ser Glu Cys Glu Ile His Trp Glu Asp Leu Val

725 730 735

Ile Gly Glu Arg Ile Gly Leu Gly Ser Tyr Gly Glu Val Tyr Arg Ala

740 745 750

Asp Trp Asn Gly Thr Glu Val Ala Val Lys Lys Phe Leu Asp Gln Asp

755 760 765

Phe Tyr Gly Asp Ala Leu Asp Glu Phe Arg Ser Glu Val Arg Ile Met

770 775 780

Arg Arg Leu Arg His Pro Asn Ile Val Leu Phe Met Gly Ala Val Thr

785 790 795 800

Arg Pro Pro Asn Leu Ser Ile Val Ser Glu Tyr Leu Pro Arg Gly Ser

805 810 815

Leu Tyr Lys Ile Leu His Arg Pro Asn Cys Gln Ile Asp Glu Lys Arg

820 825 830

Arg Ile Lys Met Ala Leu Asp Val Ala Lys Gly Met Asn Cys Leu His

835 840 845

Ile Ser Val Pro Thr Ile Val His Arg Asp Leu Lys Ser Pro Asn Leu

850 855 860

Leu Val Asp Asn Asn Trp Asn Val Lys Val Cys Asp Phe Gly Leu Ser

865 870 875 880

Arg Leu Lys His Ser Thr Phe Leu Ser Ser Lys Ser Thr Ala Gly Thr

885 890 895

Pro Glu Trp Met Ala Pro Glu Val Leu Arg Asn Glu Gln Ser Asn Glu

900 905 910

Lys Cys Asp Val Tyr Ser Phe Gly Val Ile Leu Trp Glu Leu Ala Thr

915 920 925

Leu Arg Met Pro Trp Ser Gly Met Asn Pro Met Gln Val Val Gly Ala

930 935 940

Val Gly Phe Gln Asp Lys Arg Leu Asp Ile Pro Lys Glu Ile Asp Pro

945 950 955 960

Leu Val Ala Arg Ile Ile Trp Glu Cys Trp Gln Lys Asp Pro Asn Leu

965 970 975

Arg Pro Ser Phe Ala Gln Leu Thr Ser Ala Leu Lys Thr Val Gln Arg

980 985 990

Leu Val Thr Pro Ser His Gln Glu Ser Gln Ser Pro Pro Val Ala Gln

995 1000 1005

Glu Ile Trp Val Asn Ser Ser Thr Pro

1010 1015

Claims

1、一种影响水稻对白叶枯病和细菌性条斑病产生抗性的OsEDR1基因，它是序列表SEQ ID NO：1中所示的DNA序列。

2、OsEDR1基因编码区的DNA，它是编码序列表SEQ ID NO：1所示蛋白质的DNA序列。

3、权利要求1所述的OsEDR1基因和权利要求2所述的OsEDR1基因编码区的DNA序列在增加水稻对白叶枯病和细菌性条斑病抗性中的应用。