CN102399274A

CN102399274A - 负调控水稻抗病与细胞死亡的基因及其用途

Info

Publication number: CN102399274A
Application number: CN2011103427749A
Authority: CN
Inventors: 马伯军; 陈析丰; 顾志敏; 郝亮
Original assignee: Zhejiang Normal University CJNU
Current assignee: Zhejiang Normal University CJNU
Priority date: 2011-11-03
Filing date: 2011-11-03
Publication date: 2012-04-04
Anticipated expiration: 2031-11-03
Also published as: CN102399274B

Abstract

本发明公开了一种负责调控水稻抗病与细胞死亡的基因SPL5编码的蛋白质，该蛋白质为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。本发明还同时公开了编码上述蛋白质的基因，该基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。该基因具有负责调控水稻抗病与细胞死亡的功能，能用于构建转基因水稻。

Description

负调控水稻抗病与细胞死亡的基因及其用途

技术领域

本发明涉及一种水稻抗病、细胞死亡基因的负调控因子及其编码基因与应用，属于植物分子遗传学领域。

背景技术

超敏反应(hypersensitive response，HR)是一种由基因介导的植物特异性防御机制，能引发感染部位细胞的迅速死亡，从而限制病原菌向四周扩散以达到抗病的目的。植物类病变(lesion mimic)是一类具有类似HR表型的突变体，在没有逆境、损伤或病害情况下能自发引起细胞死亡、产生坏死斑。类病变突变体常常在组织、生理及分子水平上表现出基本的抗病特征，启动系统获得抗性(systematic acquired resistance，SAR)反应，提高对病原菌的抗性(Lorrain et al.，2003；Kamlofski et al.，2007)。

目前认为植物类病变的原因可能是一些抗病、调控死亡或基本代谢酶等基因发生突变，从而造成植株防御系统被激活、正常生理代谢紊乱、细胞提前衰老死亡等(Johal，2007)。一些控制类病变性状的基因已被克隆，它们编码的蛋白具有不同功能，如膜相关的蛋白(Noutoshi et al.，2006)、离子通道蛋白(Mosher et al.，2010)、锌指蛋白(Dietrich et al.，1997)、热激蛋白转录因子(Yamanouchi et al.，2002)、U-Box/Armadillo重复蛋白(Zeng etal.，2004)以及参与脂肪酸(Kachroo et al.，2001)、卟啉(Ishikawa et al.，2001)、芳香类化合物(Gray et al.，1997)等的生物合成或代谢途径的蛋白。调控植物类病变发生的基因非常多，涉及各种复杂的生命活动过程，目前还不清楚这些基因导致类病变的具体分子机理及其在信号转导网络中的关系。

水稻既是单子叶模式植物，又是世界上最重要的粮食作物之一。水稻病害是影响其产量的重要限制因子，而水稻类病变突变体能提高植株对多种病害的抗性，因此，近年来水稻类病变突变体研究引起了国内外许多学者的广泛关注。迄今，据统计已鉴定的水稻类病变突变体有50多种(陈析丰等，2011)，其中38种增强了对稻瘟病、白叶枯病和纹枯病的抗性，尤其是spl4、spl5、spl7、spl11、Spl12等突变体具有广谱的抗病性(Yin et al.，2000；Mizobuchi et al.，2002；Kojo et al.，2006；Wu et al.，2008)。在一些水稻类病变突变体中，胼胝质或酚类物质、植保素、活性氧等化学物质往往过量积累，这些物质具有抵抗或抑制病原菌的作用，尤其是活性氧能直接杀死病原菌并启动HR；一些抗病相关的基因如稻瘟病诱导的PR1和PBZ1、大麦白粉病菌诱导的HvOxOa和HvOxOLP、参与H₂O₂代谢并受白叶枯病诱导的POX22.3和POX8.1等基因在某些突变体中表达上调。在对突变体blm(Jung etal.，2006)、crd1(Takahashi et al.，2003)、crd2(Tsunezuka et al.，2005)、spl1(Wang etal.，2008)和spl6(Kang et al.，2007)的蛋白组学研究中，也发现了一些防御相关的蛋白(PBZ1、PR5、PR10、COMT等)或活性氧代谢相关的酶(CAT、APX、SOD、GST等)的表达水平发生变化。这些研究结果表明类病变很可能自发启动了水稻的HR或SAR抗病反应机制。

目前发现已鉴定的水稻类病变突变体的表型由单个的隐性或显性基因控制，其中spl7(Yamanouchi et al.，2002)、spl11(Zeng et al.，2004)、Spl18(Mori et al.，2007)、spl28(Qiao et al.，2010)、oslsd1(Wang et al.，2005)、OsNH1(Chern et al.，2005)、attm1(Takahashi et al.，2007)和OsACDR1(Kim et al.，2009)八个突变基因已经被克隆。spl7基因编码一个热激蛋白转录因子，此类蛋白在热胁迫下促进热激蛋白(heat shock protein)基因的转录，诱导植株的热激应答反应。spl11编码一个具E3泛素连接酶活性的蛋白，含有一个U-box和一个armadillo重复序列保守结构域，前者在酵母中与泛素化有关，而后者在动物中参与蛋白间的互作，推测SPL11可能通过泛素化对植物的细胞死亡与防卫反应起负调控作用。Spl18基因编码一个酰基转移酶(acyltransferase)，是“T-DNA激活标签”诱导的突变，该基因在野生型水稻中低水平表达，而Spl18突变体中表达量非常高。spl28编码一个网格蛋白相关的接头蛋白AP1M1(clathrin-associated adaptor protein complex 1 mediumsubunit l1)，此类蛋白在高尔基体转运途径中具有重要作用，亚细胞定位也证明SPL28在高尔基体上，而且SPL28能互补一个与高尔基体膜运输相关的酵母突变体amp1-1Δ的表型。oslsd1编码一个锌指蛋白，过表达OsLSD1能促进水稻愈伤的分化及增加植株叶绿素B的含量，在烟草中过表达OsLSD1能增强植株对真菌毒素Fumonisins B1的抗性，推测OsLSD1可能是调控植物细胞死亡与愈伤分化的多功能蛋白因子。OsNH1(NPR1 homolog 1)是拟南芥SAR中一个关键调控基因NPR1的同源基因，其编码的蛋白具有双向核定位序列与锚定蛋白(ankyrin)重复结构域，能与水稻抗病相关转录因子rTGA2.2互作，过表达该基因能增强水稻对白叶枯病的抗性，而且使植株的生长对光更敏感。attm1(OsPti1a)是逆转座子Tos17插入突变体，野生型基因编码一个质膜蛋白激酶(cytoplasmic protein kinase)，与西红柿的抗病蛋白Pti1高度同源，过表达OsPti1a会降低植株的抗病性，推测OsPti1a可能在水稻的防御系统中起负调控作用。OsACDR1基因编码一个丝裂原活化蛋白激酶激酶的激酶(raf-like mitogen-activated protein kinase kinase kinase，MAPKKK)，亚细胞定位于植物细胞核中，过表达该基因能诱导水稻发生类病变，并增强对稻瘟病的抗性；而抑制或沉默该基因的表达也会使水稻产生类病变，但与野生型相比对稻瘟病更敏感，表明OsACDR1可能是水稻抗病途径中的正调控因子。这些研究表明已克隆的水稻类病变基因在功能上似乎没有直接的相关性，目前对这些基因如何调控类病变的发生及其分子作用机理等问题知之甚少。

水稻类病变突变体spl5是由粳稻(Oryza sativa L.ssp.Japonica)Norin8经γ射线辐射诱导而成，从分蘖期开始叶片上就自发出现红褐色坏死斑点，随着植株的生长不断增多，直到抽穗期几乎布满整个叶片。spl5突变体对稻瘟病、白叶枯病等具有广谱的抗性，是研究水稻类病变、细胞死亡及抗病机理的一个理想材料。Iwata等(1978)曾报道spl5突变表型受单个隐性基因控制，并将spl5基因定位在水稻7号染色体短臂上30cM处，位于g-1和Rc两个形态学标记之间，但至今国内外一直没有成功克隆该基因的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种负责调控水稻抗病与细胞死亡的基因SPL5及其编码的蛋白质以及该基因的用途。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种负责调控水稻抗病与细胞死亡的基因SPL5编码的蛋白质，该蛋白质为SEQ ID NO：2(即序列表NO：2)所示的氨基酸序列。

作为本发明的负责调控水稻抗病与细胞死亡的基因SPL5编码的蛋白质的改进：蛋白质还包括在SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个氨基酸生成的衍生物。

本发明还提供了一种编码上述蛋白质的基因，该基因具有SEQ ID NO：1(即序列表NO：1)所示的核苷酸序列。

作为本发明的基因的改进：该基因还包括在SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸生成的突变体、等位基因和衍生物。

本发明还同时提供了上述基因的用途：用于构建转基因水稻。

本发明还同时提供了一种转基因植物细胞，为包含上述核酸的转基因植物细胞。

本发明的发明人利用spl5(浙辐802)突变体，即通过多次回交将spl5基因导入野生型籼稻浙辐802而获得的浙辐802遗传背景的spl5近等基因系材料，通过图位克隆(map-based cloning)技术对spl5基因进行了精细定位(Chen et al.，2009)，将目标基因定位在7号染色上34kb的物理距离内，并对该区段的spl5基因组序列进行全部测序，确定了spl5候选基因，经水稻转基因功能互补试验，验证了候选基因的功能，最终克隆spl5基因。

该spl5基因具有负责调控水稻抗病与细胞死亡的功能。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是水稻spl5基因初步定位的遗传连锁图；

左侧表示Iwata等(1978)报道的三个形态学标记d-6、g-1与spl5基因的连锁关系及其遗传距离；右侧表示spl5基因初步定位中6个连锁SSR分子标记与spl5基因的遗传距离；图中标记的遗传位置与遗传距离参照Gramene数据库(http://www.gramene.org)。

图2是水稻spl5基因精细定位的遗传连锁图与候选基因分析；

a.水稻spl5基因精细定位逐渐放大的遗传连锁图，标记下方的数字表示该标记在浙辐802与spl5杂交F₂群体的3536个突变体单株中检测到的交换事件个数；

b.水稻spl5基因定位区间15.1kb基因组序列的基因预测，含有3个预测基因，分别表示为Gene1、Gene2和Gene3，其中Gene3的一个外显子上有一个突变位点，通过分子标记CAPS24可以检测突变位点，箭头表示CAPS24标记的引物序列的位置；

c.SPL5候选基因中缺失了一个碱基G(guanine)，导致移码突变和提前终止翻译，DNA序列下方的字母表示翻译的氨基酸序列，WT表示野生型水稻，spl5表示spl5突变体。

图3是pCAMBIA1300-2×35S::SPL5过表达载体模式图；

Hygromycin(R)表示潮霉素抗性基因；2×P_35S表示2个串联重复的CaMV35S promoter；T_35S表示35S polyA Terminator；BamH I是构建载体的限制内切酶及其位置。

图4是水稻spl5突变体的组织培养和转基因再生苗；

a.野生型水稻(WT)、浙辐802背景的spl5突变体(spl5_ZF802)与TP309背景的spl5突变体(spl5_TP309)的表型；b.spl5_TP309突变体的愈伤组织诱导；c.d.农杆菌侵染后spl5_TP309突变体在含潮霉素MS培养基上的抗性愈伤；e.spl5_TP309突变体的转基因再生植株。

图5是水稻SPL5基因的转基因功能互补实验分析；

a-c.野生型水稻TP309(WT)、spl5(TP309)突变体与SPL5转基因水稻SPL5-OX(spl5/spl5)4个独立株系的分子鉴定；a.对转基因水稻基因组中外源插入的SPL5基因的PCR分析；b.对转基因水稻中SPL5基因的表达分析；c.对转基因水稻基因组中内源spl5基因突变位点的CAPS标记分析；d.成熟期SPL5转基因水稻SPL5-OX(spl5/spl5)的整个植株表型；e.野生型水稻TP309(WT)、spl5(TP309)突变体、SPL5转基因水稻SPL5-OX(spl5/spl5)及转空载体的转基因水稻叶片的表型。

具体实施方式

实施例1、水稻spl5突变体的获得与表型

水稻spl5突变体是由粳稻(Oryza sativa L.ssp.Japonica)Norin8的种子经γ射线辐射(Iwata et al.，1978)后，在诱变的突变体库中筛选得到的。在水稻正常生长所需的环境下，该突变体从分蘖期开始叶片上就自发出现红褐色坏死斑，随着植株的生长不断增多，直到抽穗期几乎布满整个叶片，同时，spl5突变体显著提高了对稻瘟病、白叶枯病等水稻病害的抗性，表明正常的SPL5基因具有负调控水稻的细胞死亡与抗病的功能，该基因突变后能激活植株的细胞坏死和抗病防御反应。

实施例2、水稻spl5基因的精细定位

利用水稻spl5突变体与野生型籼稻(Oryza sativa L.ssp.Indica)浙辐802多次回交，将spl5突变基因转育到浙辐802中，获得了带有浙辐802遗传背景的spl5突变体。再用获得的籼稻spl5(浙辐802)突变体与野生型籼稻93-11进行杂交，其F₁代植株均表现为野生型，在F₁代自交得到的F₂群体中，野生型与突变型的分离比例约为3∶1，符合孟德尔遗传学规律，表明水稻类病变spl5突变体是由单个隐性基因控制。

spl5突变体最早是由日本的Iwata等鉴定的，并利用形态学标记将spl5基因初步定位于第7染色体靠近着丝点的短臂上(Iwata，1978)。发明人从spl5突变体(浙辐802)与水稻9311杂交F₂群体中选取100个突变单株，对spl5基因进行了初步定位。具体方法如下：

分别提取每个单株水稻叶片组织的基因组DNA，已报道的DNA提取方法很多，可任意选择一种。本发现采用的是陈文岳等(中国水稻科学，2005，19：561-563)报道的一种水稻DNA简易提取法。

用已公布的水稻SSR标记引物(McCouch，2002)进行PCR扩增分析，PCR反应体系为：在0.2ml的PCR扩增专用薄壁管中，加入20ng水稻DNA、正反向引物各0.25μM、4种dNTP(dCTP、dGTP、dATP、dTTP，)各100μM、2μl 10×Buffer、1个酶活力单位的Taq DNA聚合酶，用去离子水定容到20μl，充分混匀。本发明使用的PCR试剂为TaKaRa公司产品，引物可委托Invitrogen公司合成。PCR扩增在热循环仪上进行，扩增条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，55～60℃退火30秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃延伸5分钟。本发明采用的热循环仪为Biometra公司的T3000型。

对PCR产物的电泳分析。用1×TAE电泳液制备浓度为3％的琼脂糖凝胶，将所得的20μl酶切产物与2μl 10×Loading Buffer混合，加到凝胶的点样孔中，以DNA Marker100bp DNA Ladder(TaKaRa公司)作为分子量对照，在100V恒压下电泳30分钟。用溴化乙锭(Ethidium bromide，EB)对凝胶进行染色，显示DNA条带，染色方法按照《分子克隆》(冷泉港实验室出版社，第三版)。在紫外透射仪上，用305nm波段观察凝胶上的电泳条带。

通过以上分析，对水稻第7染色体上6个SSR(simple sequence repeat)标记RM1243、RM7479、RM6574、RM7121R、M8247、RM214与spl5基因的连锁分析，在这100个突变单株中RM1243、RM7479、RM6574分别检测到18、7和5个独立的交换事件，在另一侧RM214和RM8247分别检测到9和1个交换事件，而RM7121没有检测到交换，表明RM7121与spl5基因紧密连锁或共分离。因此，初步将spl5基因定位在RM6574和RM8247两个标记之间，遗传距离为3.3CM(图1)。

按照以上方法，又利用水稻spl5突变体(浙辐802)与野生型籼稻浙辐802构建了F₂群体，获得了3536个突变单株，并根据粳稻日本晴(http://rgp.dna.affrc.go.jp)与籼稻9311(http://rice.genomics.org.cn)的基因组序列差异，包括序列长度差异和单个核甘酸多态(SNP，single nucleotide polymorphism)差异，设计开发了一系列新的SSR、InDel(insertionand deletion)和CAPS(cleaved amplified polymorphic sequences)标记，其中SSR与InDel标记的引物经PCR扩增后在琼脂糖凝胶(1％～3％)电泳中即可表现出多态性，CAPS标记的PCR扩增产物还需特定的限制性内切酶酶解后，在琼脂糖凝胶(1％～3％)电泳中才可表现出多态性。表1中列出了以上新开发的引物序列、PCR反应条件及CAPS标记所需的限制性内切酶。通过初步定位的6个SSR标记和新开发的SSR7、SSR12、SSR41、SSR46分子标记对所有突变体单株的染色体交换事件分析，首先将spl5基因精细定位在标记SSR7与RM7121之间，两个分子标记的物理距离为80kb(图2a)；然后，利用新开发的一系列InDel和CAPS分子标记进行定位分析，标记InDel66和CAPS7分别只检测到一个独立的交换事件，标记CAPS1没有检测到交换事件，因此，将spl5基因进一步精细定位在标记InDel66和CAPS7之间，两个标记间的物理距离为15.1kb(图2-a)。

表1水稻spl5基因精细定位中新开发分子标记的引物序列、PCR条件及酶切要求

1.PCR反应：先94℃预变性5min，再按照以上条件进行35个循环，最后72℃延伸5min

2.CAPS markers showed polymorphisms after their PCR products were cleaved with indicated restrictionenzymes

实施例3、基因组测序与SPL5侯选基因的确定

根据日本晴的基因组序列设计引物，进行常规的PCR扩增，PCR产物的大小为1000～1500bp，邻近的PCR片段末端相互重叠，构成的PCR跨叠克隆群(contig)覆盖整个15.1kb序列，通过对每个PCR产物进行测序(委托Invitrogen公司)，将水稻spl5突变体的15.1kb序列全部测通，发现在此区间spl5突变体除了一个碱基G(guanine)缺失外，其余序列与野生型粳稻日本晴完全一致。同时，对水稻spl5突变体的原始亲本——粳稻Norin8基因组的相应位点进行PCR扩增和测序分析，结果该位点与野生型日本晴的序列一致，没有发生碱基的缺失。因此，将spl5突变位点锁定水稻7号染色体的在一个碱基上。根据RiceGAAS数据库(http://ricegaas.dna.affrc.go.jp/rgadb/)对日本晴基因组的注释信息，spl5基因定位区间的15.1kb序列中含有3个预测基因(图2-b)，而碱基缺失的位点位于其中一个预测基因(RiceGAAS accession：P0431A02.16)。虽然，RiceGAAS数据库提供了软件预测的P0431A02.16基因序列及ORF(open reading frame)，但是目前未有克隆该基因及全长cDNA的相关报道。用预测的P0431A02.16基因ORF序列在GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中进行BLAST分析，截止2011年9月17日，搜索到4条一致性为98～100％的cDNA序列(GenBank accession：NM_001065675、NM_001065676、AK100154、AK064566)，但是在P0431A02.16基因ORF中这4条cDNA的覆盖率只有20～49％，约1050bp序列没有相匹配的cDNA序列。

发明人采用5’RACE和3’RACE技术从野生型粳稻日本晴中克隆了P0431A02.16基因的全长cDNA，该cDNA包含了5’UTR(untranslated region)、3’UTR及3’polyA，总长4494bp(不含polyA)，ORF长4068bp(含终止子，为SEQ ID NO：1中带下划线的部分)，编码1356个氨基酸(如SEQ ID NO：2所示)。通过比对P0431A02.16基因序列与其全长cDNA，发现spl5突变位点在基因第7个外显子上，单个碱基的缺失引起基因的移码突变，并导致翻译提前终止(图c)。此外，该碱基的缺失导致了一个限制性内切酶BstN I识别位点(CCWGG)的突变，所以开发了一个新的分子标记CAPS24(图b)，该标记的两条引物分别位于内含子和外显子上，可以用于水稻基因组中内源spl5突变位点的检测。由此，将P0431A02.16确定为SPL5的侯选基因，即spl5基因的野生型等位基因。

实施例4、SPL5侯选基因的水稻转基因功能互补试验

为验证SPL5侯选基因(P0431A02.16)的功能，即证明水稻spl5突变表型是由P0431A02.16基因突变导致的，通过限制性内切酶BamH I和T4DNA连接酶将该基因的野生型全长cDNA克隆到双元表达载体pCAMBIA1300S上，构建了转基因过表达载体pCAMBIA1300-2×35S::SPL5(图3)。本发明所用的限制性内切酶及T4DNA连接酶为Promega公司的产品，实验方法按照产品的说明书操作。由于spl5(浙辐802)突变体的组织培养和植株再生都很困难，为了提高该突变体的遗传转化效率，先将spl5(浙辐802)突变体与一个常用的粳稻转基因品种TP309多次回交，将spl5突变基因导入TP309中，获得的TP309遗传背景的spl5突变体(图4-a)。以spl5(TP309)突变体作为转基因受体，采用农杆菌介导法(Nishimura et al.，2006)，将SPL5候选基因转化到了spl5突变体(TP309)愈伤组织中，经潮霉素筛选、分化和再生得到了转基因水稻(图4-b-e)。用SPL5基因特异性引物对转基因水稻的PCR分析，表明SPL5基因的全长cDNA已经插入了转基因水稻基因组(图5-a)，在植株中过量表达(图5-b)，同时，分子标记CAPS24的检测结果显示，在转基因水稻基因组中内源的spl5基因是纯合突变(图5-c)；这些转化了SPL5基因的spl5突变体水稻都表现出野生型(图5-d，图5-e)，即突变植株上没有出现类病变的细胞坏死现象，而转化了pCAMBIA1300S空载体(不含SPL5基因)的转基因spl5突变体则表现出类病变表型(图5-e)。这些结果表明候选基因P0431A02.16具有互补spl5突变表型的功能，因此该基因就是SPL5基因。

即，将野生型的SPL5基因转到spl5突变体中，细胞死亡的现象消失了，就表明该基因对细胞死亡有负调控作用。

实施例5、SPL5蛋白的序列分析

用SPL5基因的氨基酸序列在GenBank数据库中进行BLAST分析，SPL5蛋白含有两个保守的结构域，N端含有一个Mono-functional DNA-alkylating methyl methanesulfonate(MMS1)结构域，C端含有一个cleavage and polyadenylation specificity factor A(CPSF_A)结构域；SPL5与目前已知的SF3b3蛋白具有较高的同源性，与人、鼠的SF3b3序列的一致性分别为23％、24％，与其它植物SF3b3的一致性比较高，如Hordeum vulgare var.distichum(大麦，75％)、Vitis vinifera(葡萄，53％)、Arabidopsis thaliana(拟南芥，50％)，Physcomitrella patens subsp.Patens(苔藓，41％)，表明SPL5基因编码一个splicing factor 3bsubunit 3(SF3b3)蛋白。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.一种负责调控水稻抗病与细胞死亡的基因SPL5编码的蛋白质，其特征是：所述蛋白质为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的负责调控水稻抗病与细胞死亡的基因SPL5编码的蛋白质，其特征是：所述蛋白质还包括在SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个氨基酸生成的衍生物。

3.一种编码如权利要求1或2所述蛋白质的基因，其特征是：所述基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的基因，其特征是：所述基因还包括在SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸生成的突变体、等位基因和衍生物。

5.如权利要求3或4所述的基因的用途，其特征是：用于构建转基因水稻。

6.一种转基因植物细胞，其特征是：为包含权利要求3或4所述核酸的转基因植物细胞。