CN103215280B - 一种花生spl转录因子基因及其编码蛋白与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种花生SPL转录因子基因及其编码蛋白与应用。花生花青素积累调控转录因子AhSPL2-1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；本发明所提供的花生AhSPL2-1转录因子在植物花青素积累方面发挥重要作用，并在高花青素作物培育中具潜在的应用价值。

Description

一种花生SPL转录因子基因及其编码蛋白与应用

技术领域

本发明涉及一种花生SPL转录因子基因及其编码蛋白与应用，属于生物技术技术领域。

背景技术

花生（Arachis hypogaea L.）是我国重要的油料作物和经济作物，我国是全球最大的花生生产国和出口国，花生产业的发展对我国国民经济的发展和粮油安全具有重要的战略意义。

花青素是一种超强抗氧化的天然物，具有预防心血管疾病、延缓细胞老化、减缓糖尿病症、改善视力及抗癌等功能，因此广泛应用于保健食品及化妆品中。目前，黑米、黑豆等黑色食品因富含花青素、维生素以及多种微量元素而受到广大消费者的青睐。彩色花生，又名五彩花生，按照籽粒种皮颜色可以分为黑、紫黑、白、紫红、红白、彩粒等色系。其中黑色花生更是一种典型的碱性食品，在调节人体生理机能，提高机体免疫力以及疾病预防等方面发挥重要作用。目前，随着人民生活水平的提高以及保健意识的增强，彩色花生的市场需求也逐渐显现出来。

SPL(SQUAMOSA promoter-binding protein-like)是植物特有的一类转录因子，广泛存在于绿色植物中。SPL在植物形态建成、发育阶段转变、孢子发生、花和果实发育、花青素积累、逆境胁迫应答以及激素信号转导等多个生理生化过程中发挥重要调控作用(Gou et al.,2011)。例如，拟南芥AtSPL3、AtSPL4、AtSPL5、AtSPL9、AtSPL10等可以控制植物幼年期到成年期以及成花转变；拟南芥AtSPL8不仅参与调控GA信号转导，而且在维持植物育性方面发挥重要作用；拟南芥AtSPL9和AtSPL10可以通过MYB-bHLH-WD40复合体以及DFR调控花青素合成代谢，过量表达AtSPL9和AtSPL10会抑制花青素积累；水稻OsSPL14是控制水稻株型的关键基因，它可以减少水稻的分蘖数，增加花序分枝、穗粒数以及千粒重，从而提高水稻产量；OsSPL16则可以控制米粒大小、形状和色泽；番茄LeSPL-CNR是控制果实成熟的一个关键基因，该基因发生突变会抑制果实的正常成熟。

鉴于人们对农产品多样性的需求以及保健意识的增强，利用现有的一些花生种质资源，深入研究花生花青素积累的生理生化以及分子生物学机制，从而挖掘出一些花青素合成代谢过程中的关键性基因，并运用基因工程手段培育紫色或黑色农作物，对于提高农产品品质具有重要的现实意义。SPL是植物特有的一类转录因子，涉及多种代谢途径及生理生化过程，但关于SPL能够促进花青素积累的研究还未见报道，该研究具有一定的创新性和前瞻性。

发明内容

本发明在充分利用花生紫色突变体的基础上，提供一种促进花青素积累的转录因子基因—SPL2-1及其编码蛋白与应用。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下：

一种促进花青素积累的花生SPL转录因子基因SPL2-1，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种促进花青素积累的花生SPL转录因子，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种重组载体，是将SEQ ID NO.1所示核苷酸序列连接入载体中获得。

一种重组细胞，该细胞包含有上述重组载体或表达氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的花生SPL转录因子基因SPL2-1。

上述花生SPL转录因子基因SPL2-1、重组载体和/或重组细胞在提高作物中花青素含量的应用。

根据本发明优选的，所述作物为花生、小麦、水稻或玉米。

有益效果

本发明利用一个花生紫色突变体，通过RACE技术克隆到SPL2-1转录因子基因。分别测定了花生紫色突变体以及丰花1号的根、茎和叶片中花青素含量；并且采用Real-time PCR技术定量检测SPL2-1在紫色突变体以及丰花1号的根、茎和叶片中的相对表达水平；结果显示，紫色突变体以及丰花1号的根、茎、叶中青素含量同SPL2-1的表达水平非常吻合；紫色突变体的茎和叶片中花青素含量显著高于丰花1号，SPL2-1的表达水平也显著高于丰花1号；两者根中花青素含量基本一致，SPL2-1的表达水平也没有明显差异。在烟草中过量表达SPL2-1可以提高转基因烟草中花青素含量。从而为提高作物中花青素含量打下了基础。

附图说明

图1、花生紫色突变体以及丰花1号中花青素含量测定结果；

其中：Root为根、Stem为茎、Leaf为叶、Purple表示紫色突变体、Green表示丰花1号；

图2、花生紫色突变体以及丰花1号中SPL2-1的相对表达水平；

其中：Root为根；Stem为茎；Leaf为叶；Purple表示紫色突变体；Green表示丰花1号。

图3、转基因烟草叶片中花青素含量；

其中：T3-2为转基因烟草T3-2株系；T5-7为转基因烟草T5-7株系。

具体实施方案

下面结合说明书附图及实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。

生物材料

花生紫色突变体和烟草品种SR1购自山东鲁生生物科技有限公司；

丰花1号花生购自山东种业集团有限公司。

花生紫色突变体以及丰花1号花生品种的种植

选取种仁饱满、没有病虫害及霉变的花生籽粒作为种子。首先温水浸种2～4h，然后种植于直径15cm，深10cm的花盆中。将花盆置于光照培养箱中，白天光照时间为16h，温度(25±0.3)℃，湿度为80%；夜晚黑暗时间8h，温度(20±0.3)℃，湿度为80%。一周左右子叶即可出土，选取出土两周左右的幼苗进行样品采集。

实施例1：花生花青素含量测定

参照Mancinelli et al(1991)和Serrano et al(2012)的方法，分别测定花生紫色突变体及丰花1号的根、茎、叶中花青素含量。具体步骤如下：

(1)称取50mg花生材料置于1.5mL离心管中，用液氮将其研成粉末。

(2)加入700μl酸性甲醇（CH₃OH:HCl体积比为99:1），4℃过夜提取。（注：设置三组生物学重复，每组重复测量3次。）

(3)4℃，12000rpm离心1min，取600μL上清液置于新的离心管中，然后加入1mL三氯甲烷，再加400μl蒸馏水。

(4)4℃，12000rpm离心10min，上清液用于花青素含量测定。

(5)利用分光光度仪（U-3000,HITACHI）分别在530nm与657nm处测定吸光值。

(6)花青素含量计算公式如下：

花青素含量=(OD₅₃₀-0.25×OD₆₅₇)/m

OD₅₃₀：花青素在530nm波长下的光密度

OD₆₅₇：叶绿素在657nm波长下的光密度

m：样品质量（g）

测定结果如图1所示。花青素测定结果显示，花青素主要在花生的茎和叶片中积累，根中花青素含量较低；此外，花生紫色突变体的茎和叶片中花青素含量均明显高于丰花1号。

实施例2：花生SPL2-1基因克隆

花生总RNA提取方法如下：

（1）称取1g丰花1号茎和叶片的混合材料，液氮中彻底研磨，然后迅速转移到预冷的1.5mL Eppendof管中（每管大约200mg样品）。

（2）65℃预热CTAB提取液（组分：2wt%十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），1.4mol/LNaCl，20mmo/L乙二胺四乙酸（EDTA，pH8.0），100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，2wt%聚乙烯吡咯烷酮（pvp-40））。

（3）加入600μL预热的CTAB提取液，迅速混匀，65℃温浴5min，期间充分混匀3～5次。

（4）冷却至室温后，加入等体积（600μL）的水饱和酚/氯仿/异戊醇（体积比25:24:1）混合液，充分混匀。

（5）4℃，12000rpm，离心15min。

（6）将上清转移到新的1.5mL Eppendof管中，加入等体积氯仿/异戊醇(体积比24:1)混合液，重复抽提一次。

（7）4℃，12000rpm，离心15min。

（8）取上清，加入等体积异丙醇（-20℃预冷），颠倒混匀，室温静置10min。

（9）4℃，12000rpm，离心20min。

（10）弃上清，用体积比为70%的乙醇（-20℃预冷）清洗沉淀2～3次。

（11）室温下静置3～5min，待沉淀干燥后，用30～50μl焦碳酸二乙酯（DEPC）H₂O溶解RNA。

花生总RNA纯化方法如下：

（1）在微量离心管中配制下列反应液；

（2）37℃保温1h。

（3）首先加入50μL H₂O；然后加入等体积水饱和酚/氯仿/异戊醇（体积比25:24:1）混合液，充分混匀。

（4）4℃，12000rpm，离心15min。

（5）将上清转移到新的微量离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇（体积比24:1）混合液重复抽提一次。

（6）4℃，12000rpm，离心15min。

（7）取上清，加入1/10体积的3mol·L^-1NaAc（pH=5.2），轻轻混匀；再加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，混合均匀；-20℃，静置2h。

（8）4℃，12000rpm，离心20min。

（9）弃上清，用70%预冷的乙醇清洗沉淀2～3次。

（10）室温干燥3～5min，用30～50μl DEPC H₂O溶解RNA。

花生总RNA含量与纯度检测：

取1μL上述RNA样品，稀释100倍，利用Eppendorf Biophotometer Plus分光光度计检测A230、A260/A230、A260/A280和测定样品中RNA浓度（μg·ml-1）。

取2～4μg RNA样品，进行1.2wt%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，鉴定RNA是否降解。

cDNA第一链的合成步骤：

利用TaKaRa PrimeScript1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒进行cDNA第一条链的合成。具体步骤如下：

(1)在0.5μL离心管中配制下列混合液：

*11)合成2kb以上的cDNA片段时，Random6mers的使用量为0.4μL。

2)用于Real Time PCR时，Random6mers使用2μL可以得到较好的实验结果。

*21)Total RNA的使用量应小于5μg；Poly(A)⁺RNA的使用量应小于1μg。

2)用于Real Time RT-PCR时，Total RNA的最大使用量为1μg。

(2)在PCR仪上进行下列条件的变性、退火反应：

65℃，5min，然后冰上冷却。

(3)在上述离心管中配制下列反转录反应液。

(4)在PCR仪上按下列条件进行反转录反应：

（30℃，10min）*3；42℃（50℃），60min*4；70℃，15min；4℃。-20℃保存备用。

*3以Random Primers作为反转录引物时，应先进行30℃，10min反应。

*4PrimeScript Reverse Transcriptase延伸能力强，通常情况下，即使模板RNA具有复杂的二级结构，也可以在42℃下进行反转录反应。但当反转录引物使用PCR的下游引物时，由于引物错配的原因等易发生非特异性扩增，这时可以将反转录温度设为50℃。

PCR扩增的反应体系和反应程序：

以上述cDNA为模板，根据目的基因设计正向和反向引物，利用高保真DNA聚合酶TransStart FastPfu DNA Polymerase进行PCR反应，扩增目的基因。反应体系如下：

PCR反应程序：95℃5min；94℃30s，Tm-5℃，30s，72℃1～2min，30循环；72℃10min。

目的片段凝胶检测及回收：

(1)制备1wt%的琼脂糖凝胶。

(2)PCR产物经电泳后，紫外灯下观察结果，切取目的片段（约1000bp），称量胶块重量并计算胶块体积（按1mg=1μL进行计算）。

(3)向胶块中加入3个凝胶体积量的胶块融化液Buffer GM。

(4)均匀混合，15～25℃融化胶块。期间应间断振荡混合，使胶块充分融化（约5～10min）。如果溶胶液颜色由黄色变为橙色或粉色，应向上述凝胶融化液中加入10μL3mol·L^-1NaAC（pH=5.2），均匀混合至溶液恢复黄色。

注：胶块一定要充分融化，否则将会影响DNA回收效率；DNA片段小于400bp时，应加入终浓度为20wt%的异丙醇。

(5)将上述凝胶融化液转移至Spin Column中，12000rpm离心1min，弃滤液。

注：如果将滤液再次加入Spin Column中离心，可以提高DNA的回收率。

(6)将700μL的Buffer WB加入Spin Column中，12000rpm离心30s，弃滤液。

(7)重复操作步骤（6）。

(8)将Spin Column置于新的1.5mL的离心管上，室温放置3～5min，确保残留的乙醇完全挥发。在Spin Column膜中央处加入30μL灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1min。

注：把灭菌蒸馏水或Elution Buffer加热至60℃有利于提高洗脱效率。

(9)12000rpm离心1min，洗脱DNA。

回收PCR产物加A反应：

TransStart FastPfu DNA Polymerase扩增产物为平端，要加A之后才可以连接到T载体上。加A反应试剂盒购于天根生化有限科技公司。反应体系如下：

轻轻混匀，72℃保温30min。加A产物可以经纯化回收后用于连接反应，也可以直接进行连接反应。

pMD18-T克隆载体的连接：

连接载体为Takara公司的pMD18-T载体，插入片段与载体的摩尔数比为（8～10）:1。反应体系通常如下所示：

混合均匀，16℃过夜连接，制得pMD-AhSPL2-1中间载体。

大肠杆菌感受态细胞的制备：

(1)取-80℃低温保藏的的大肠杆菌DH5α菌株（购于天根生化科技有限公司），待其稍微融化后取1μL到3mL不含氨苄青霉素的LB液体培养基中（NaCl10g/L，Tryptone10g/L，Yeast Extract5g/L），37℃，200rpm，过夜培养。

(2)取2mL菌液加入到50mL LB培养基（不含氨苄青霉素）中，37℃振荡培养约2h，至A₆₀₀=0.4～0.6为止。

(3)将菌液转移到50mL离心管中；4℃，4600rpm，离心5min；去掉上清，用10mL（1/5体积）预冷的0.1mol·L^-1的MgCl₂溶液悬浮沉淀。

(4)4℃，4600rpm，离心5min，轻轻倒掉上清，用25mL（1/2体积）预冷的0.1mol·L^-1的CaCl₂溶液悬浮沉淀，冰浴中放置20min。

(5)4℃，4600rpm，离心，5min，轻轻倒掉上清，用5mL预冷的0.1mol·L^-1的CaCl₂（含甘油0.5mL）悬浮沉淀，按照每管100μL进行分装。

(6)液氮速冻，-80℃超低温保存。

大肠杆菌感受态细胞的转化：

(1)制备LB固体培养基（含100mg·L^-1的氨苄青霉素），转化之前每个平板涂40μL50mg·mL^-1的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）和20mg·mL^-1的X-Gal。

(2)取出-80℃保存的大肠杆菌感受态细胞，冰浴中融化，将5～10μL pMD-AhSPL2-1中间载体加入到100μL感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min。

(3)42℃热击90s，然后立即冰浴2min。

(4)加入600μL LB液体培养基（不含氨苄霉素），37℃，200rpm，振荡培养1h。

(5)取适量菌液均匀涂于含有IPTG/X-Gal的LB平板培养基上，

(6)37℃，倒置培养12～20h。

(7)挑取白色单菌落，通过菌液PCR筛选阳性克隆。从中挑选3～5个阳性单克隆进行测序。经检测，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例3：Real-time PCR定量检测SPL2-1的表达水平

cDNA模板的制备：

以出土两周左右的花生紫色突变体和丰花1号为材料，利用上述CTAB法分别从根、茎和叶片中提取总RNA，将检测合格的RNA样品进行反转录，反转录产物即可作为Real-timePCR模板。

Real-time PCR反应体系及反应程序：

荧光染料选用罗氏（Roche）的FastStart Universal SYBR Green master(ROX)，反应体系如下：

将上述反应液混匀，然后进行PCR反应。

反应程序：95℃10min；95℃15s，60℃1min，此时采集荧光信号，40个循环；95℃15s，60℃1min；0.3℃/s升温至95℃，95℃15s，在此期间连续采集荧光信号。

测定相对表达水平如图2所示，由实施例3的测定结果可以看出，SPL2-1在花生根、茎、叶中均有表达，不过在根中的表达水平较低；在茎和叶片中，花生紫色突变体中SPL2-1的相对表达水平均明显高于丰花1号。

实施例4：SPL2-1基因遗传转化

AhSPL2-1过量表达载体的构建：

用限制性内切酶Kpn I和Pst I分别对pMD-AhSPL2-1中间载体和pCAMBIA3301质粒（购自Biovector公司）进行双酶切，回收AhSPL2-1和pCAMBIA3301载体片段，并进行DNA含量测定。用T4DNA连接酶将AhSPL2-1和pCAMBIA3301进行连接，反应体系如下：

16℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5α。筛选阳性克隆并进行测序，选择正确的重组表达载体进行后续试验。

农杆菌EHA105的感受态细胞的制备：

(1)挑取EHA105（购自北京天恩泽生物技术有限公司）单菌落，接种于5mL YEP液体培养基（含50mg·L^-1利福平）中，28℃，200rpm，振荡培养过夜。

(2)取1mL菌液至100mL液体YEP（含50mg·L^-1利福平）中，28℃，振荡培养至OD₆₀₀为0.8～1.0。

(3)将菌液在冰浴中迅速冷却10min，然后分装于50mL离心管中。4℃4500rpm，离心10min。

(4)弃上清，用10ml预冷的0.1mol·L^-1的CaCl₂重悬菌体。

(5)4℃4500rpm，离心10min。

(6)弃上清，将沉淀重悬于1ml预冷的含10%（体积百分比）甘油的0.02mol·L^-1的CaCl₂溶液中，制得EHA105感受态细胞。每管100μl进行分装，液氮速冻后-80℃低温保存。

农杆菌转化：

(1)将上述测序正确的重组表达载体2μL加入到100μl EHA105感受态细胞中，轻轻混匀，冰上静置45min。

(2)液氮中迅速冷冻1min，紧接着37℃水浴3min，再迅速冰浴2min.

(3)加入1ml LB液体培养基，28℃，200rpm，振荡培养3h。

(4)取适量菌液均匀涂于LB固体培养基上（利福平50mg·L^-1，卡那霉素50mg·L^-1）,28℃培养2～3d。

(5)通过菌落PCR筛选阳性克隆，制得转化后的农杆菌EHA105，用于烟草遗传转化。

烟草遗传转化：

(1)用0.5mm的打孔器从烟草叶片上切取叶盘，置于预配养基（含1mg·L^-16-苄氨基腺嘌呤（6-BA）和0.1mg·L^-1α-萘乙酸（NAA）的MS基本固体培养基）上暗培养2d。

(2)将上述转化后的农杆菌EHA105接种于50mL YEP液体培养基中（含利福平50mg·L^-1，卡那霉素50mg·L^-1）。28℃，250rpm，振荡培养约48h，至对数生长后期；再按照1:100（体积比）扩大培养6h，至OD₆₀₀为0.5时收集菌体，用MS培养基稀释10倍，用于侵染烟草叶片。

(3)将预培养的烟草叶盘浸入菌液5～10min，然后用滤纸吸干多余的菌液，转移到分化培养基上进行培养（含1mg·L^-16-BA、0.1mg·L^-1NAA、100mg·L^-1卡那霉素和300mg·L^-1头孢霉素的MS基本固体培养基）。

(4)20～30d更换一次分化培养基。

(5)待抗性芽长至1cm左右时，从基部将芽切下，移入MS培养基中进行生根培养。

(6)将生根后的植株移入温室内栽培。

通过上述转化方法，转化烟草SR1，获得烟草转基因株系20个，其中3号和5号两个株系表现出茎部颜色较烟草SR1深，分别取3号和5号株系的两个各单株，命名为烟草T3-2转基因株系和烟草T5-7转基因株系进行后续实验。

实施例5：烟草花青素含量测定

参照Mancinelli et al(1991)和Serrano et al(2012)的方法，分别测定烟草野生型、烟草T3-2转基因株系和烟草T5-7转基因株系的花青素含量。具体步骤如下：

(1)称取50mg烟草材料置于1.5mL离心管中，用液氮将其研成粉末。

(2)加入700μl酸性甲醇（CH₃OH:HCl体积比为99:1），4℃过夜提取。（注：设置三组生物学重复，每组重复测量3次。）

(3)4℃，12000rpm离心1min，取600μL上清液置于新的离心管中，然后加入1mL三氯甲烷，再加400μl蒸馏水。

(4)4℃，12000rpm离心10min，上清液用于花青素含量测定。

(5)利用分光光度仪（U-3000，HITACHI）分别在530nm与657nm处测定吸光值。

(6)花青素含量计算公式如下：

花青素含量=(OD₅₃₀-0.25×OD₆₅₇)/m

OD530：花青素在530nm波长下的光密度

OD657：叶绿素在657nm波长下的光密度

m：样品质量（g）

转基因烟草花青素测定结果如图3所示。由测定结果可以看出，烟草T3-2转基因株系和烟草T5-7转基因株系中花青素含量明显高于野生型。

实施例6：花生SPL2-1在作物种质创新中的应用

SPL转录因子是植物特有的一类转录因子，在多个代谢途径中均发挥重要调控作用。由实施例1可以看出，花青素主要在花生的茎和叶片中积累，并且花生紫色突变体中花青素含量明显高于丰花1号。而实施例3的测定结果显示，SPL2-1在花生茎和叶片中有较高的表达水平，而且花生紫色突变体要明显高于丰花1号。由实施例1和实施例3可以看出，在花生紫色突变体和丰花1号中SPL2-1的相对表达水平同花青素含量非常吻合。此外，由实施例5的测定结果可以看出，在烟草中过量表达SPL2-1可以有效提高转基因植株中花青素含量。上述实验均表明SPL2-1可以有效促进植物体内花青素积累。在玉米、小麦、水稻、大豆或者花生等作物中过量表达SPL2-1将会提高这些作物中花青素含量，改善作物品质。因而，SPL2-1对于培育高品质作物新品种具有重大的意义。

上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一限制条件。

Claims (2)

1.一种促进花青素积累的花生SPL转录因子基因SPL2-1，核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示。

2.一种促进花青素积累的花生SPL转录因子，氨基酸序列如SEQ ID NO.2 所示。

3. 一种重组载体，是将SEQ ID NO.1所示核苷酸序列连接入载体中获得。

4. 权利要求1所述花生SPL转录因子基因SPL2-1和/或权利要求3所述重组载体在提高作物中花青素含量的应用。

5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述作物为花生、小麦、水稻或玉米。