CN103725692B - 水稻育性控制锌指蛋白基因 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水稻育性控制锌指蛋白基因在水稻育性遗传育种中的应用，该水稻育性控制锌指蛋白基因的核苷酸序列如序列表中SEQ？ID？NO：1所示。实验表明：本发明所述SEQ？ID？NO：1基因能够控制水稻花粉育性；与野生型植株相比，OsZRL下调转基因植株花粉育性降低。因此，本发明所述基因对水稻雄配子发育具有负调控作用，并可在水稻遗传育种中应用。

Description

水稻育性控制锌指蛋白基因

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，尤其涉及一种水稻育性控制锌指蛋白基因。

背景技术

水稻是我国最主要粮食作物，水稻产量对保障国家粮食安全具有举足轻重的作用。我国水稻育种以杂种优势为标志的第二代“绿色革命”，使水稻产量有了前所未有的突破，杂交水稻育种三系法、两系法配套策略分别利用核质互作不育系和光、温敏不育系得以实现。另一方面，杂种不育又是远源杂种优势利用的主要障碍，因而育性在水稻遗传育种研究中备受关注。育性控制基因的分离克隆不仅可以促进对水稻育性形成分子机制的深入了解，还可以推动利用分子标记辅助育种、利用基因工程创造不育性和广亲和材料的研究，且对其它禾本科粮食作物遗传育种也具借鉴作用。

与其他植物一样，水稻的生殖发育也是在外部温度、光照和内部营养、激素等信号诱导下多个基因以复杂方式相互作用的综合结果。与拟南芥菜相比，水稻生殖发育基因调控研究结果相对较少，但在近年也取得了重要进展：(1)在水稻细胞质雄性不育(cytoplasmicmalesterility,CMS)及其育性恢复基因定位分离方面，水稻第10染色体长臂被认为是不同类型CMS恢复基因的密集区。Wang等(PlantCell，2006)对BoroII型细胞质雄性不育机制的研究表明，CMS由线粒体异常基因orf79编码的细胞毒素肽引起，在第10染色体Rf-1基因座位鉴定的两个恢复基因Rf1a和Rf1b均可破坏或降解细胞毒素肽而使水稻育性恢复，从而在分子水平解释了BoroII型水稻细胞质雄性不育及育性恢复的机理。(2)对于水稻光、温敏性不育基因的精细定位已有较多的报道(Qiu等,HubeiAgriculturalSciences,2007)。Chen等(PlantCell,2007)在水稻育性转换机制的研究中发现，水稻尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因Ugp1是花粉发育所必需的，并认为Ugp1基因的温度敏感型可变剪接是其温敏不育表型的分子基础。(3)在水稻杂种不育分子机制研究方面，Chen等(ProcNatlAcadSciUSA,2008)报道了编码天冬氨酰蛋白酶的S5基因在籼粳稻中的差异造成其杂种雌配子不育，广亲和品种的S5基因则因大片段缺失导致功能丧失而不影响杂种育性。Long等(ProcNatlAcadSciUSA,2008)的研究则针对水稻籼粳杂种雄性不育进行，认为水稻第1染色体Sa基因座位两个邻近基因SaM和SaF的等位基因之间的互作影响了籼粳稻杂种一代的花粉育性，并由此提出“两基因/三组分互作”(two-gene/three-componentinteraction)水稻杂种不育分子机制。这些研究工作必然推动对水稻生殖发育基因调控的进一步系统阐述和对水稻丰富品种资源的优势利用。

植物生殖发育涉及众多基因，其中一些基因起到更重要的枢纽作用。在已经分离的植物开花调控和花器官发育基因中，锌指蛋白(zinc-fingerprotein)基因占有重要地位。锌指蛋白因其具有可以结合锌离子的指状结构域-锌指结构域(zinc-fingerdomain)而命名。根据锌指结构域中半胱氮酸(C)和组氨酸(H)残基的数目和位置可将锌指蛋白分为C2H2、C2HC、C2C2等亚类。锌指蛋白中有单个或成簇出现的锌指结构域，依赖在长期进化过程中形成的锌指结构域的多变组合，使其不仅可以结合DNA，还可以结合RNA、蛋白质和脂类底物，甚至同一类锌指蛋白也显示不同的结合特性。因此，锌指蛋白具有调控基因转录、染色质重构等多种生理功能(Gamsjaeger等，TrendsBiochemSci,2007)。在植物中普遍存在锌指蛋白，模式植物基因组中发现几十甚至上百个锌指蛋白基因，其中有些锌指蛋白是植物所特有的，它们参与调控植物各个时期的生长发育。在拟南芥菜开花诱导中处于核心地位的CONSTANS(CO)基因编码锌指蛋白转录因子，它在长日照条件下激活下游基因的表达促进开花；水稻中CO的同源基因Hd1也编码锌指蛋白转录因子，但与CO不同的是Hd1在短日照条件下激活下游基因表达而促进水稻开花(Yano等,PlantCell,2000)。Wu等(ProcNatlAcadSciUSA,2008)在水稻中分离鉴定的锌指蛋白转录因子RID1，通过调控Hd1,RFT1等下游开花调控基因而影响水稻从营养生长向生殖生长的转化。在花粉发育方面，在矮牵牛中已发现有多个锌指蛋白在花药中特异表达并呈现明显的先后顺序(Kapoor等,PlantCell,2002)。拟南芥菜的PHD型锌指蛋白基因MALESTERILITY1(MS1)是雄性不育基因，其功能是调控花粉和绒毡层的发育(Ito等,PlantCell,2007)。

目前对水稻育性控制锌指蛋白基因(OryzasativaSterile-relatedZinc-fingerProtein，缩写为OsSZP)及其同源锌指蛋白亚家族基因的功能还未有报道，对OsSZP在水稻育性形成中的作用的研究，可以开拓新的水稻不育基因资源，为作物杂种优势利用和新品种分子设计提供理论基础。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种水稻育性控制锌指蛋白基因。

为了解决上述技术问题，本发明是通过以下的技术方案实现的：

第一方面，本发明涉及一种水稻育性控制锌指蛋白基因(OryzasativaSterile-relatedZinc-fingerProtein，缩写为OsSZP)，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：1所示。

第二方面，本发明涉及上述水稻育性控制锌指蛋白基因编码的蛋白，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO：2所示。

第三方面，本发明涉及上述水稻育性控制锌指蛋白基因的RNA干涉真核重组质粒，由以下步骤制备得到：

(1)在序列表中SEQIDNO：1所示核苷酸序列中选择一段基因片段，所选择的基因片段是SEQIDNO：1所述第1317bp至1743bp的核苷酸序列，将所述基因片段正向插入到pSK载体上，再将该基因片段反向插入已含正向插入基因片段的pSK载体，获得pSK中间载体，正向插入的基因片段与反向插入的基因片段之间存在有150bp的内含子序列；

(2)利用限制性内切酶切下pSK中间载体上含有正向插入与反向插入的基因片段的部分，然后连接到真核表达载体上，即获真核重组质粒。

第四方面，本发明涉及上述水稻育性控制锌指蛋白基因在水稻育性遗传育种中的应用。

第五方面，本发明涉及上述水稻育性控制锌指蛋白基因的RNA干涉真核重组质粒在培育水稻不育系方面的应用。

本发明的有益效果是：

为水稻等单子叶禾本科作物的生殖发育调控和遗传育种提供了一种新的基因资源。所用基因为水稻本身自有基因，所以转基因水稻的安全性能高。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是水稻育性控制锌指蛋白基因OryzasativaSterile-relatedZinc-fingerProtein(下称OsSZP)在野生型水稻品种日本晴幼苗、田间生长成熟植株各组织以及不同光、温生长条件下的表达情况。A：从左至右依次为：OsSZP在野生型水稻幼苗根、茎、叶中表达水平；B：从左至右依次为：OsSZP在野生型田间生长成熟水稻植株根、茎、叶、颖花中表达水平；C：野生型水稻植株在正常生长条件(28℃,12h光/12h暗)、低温(4℃,12h光/12h暗)、高温(42℃,12h光/12h暗)，以及高温暗培养条件下(42℃,24h暗)处理48h后的OsSZP基因表达水平。ACTIN为内参基因。

图2是水稻OsSZP基因RNA干涉转基因植株表型。A：OsSZP基因RNA干涉真核重组质粒(pHB-SZPRI)的示意图。B：转基因水稻植株中筛选标记潮霉素抗性基因(Hpt)PCR扩增结果。图中，M：DNA分子标记,DL2000；1：阴性对照，PCR模板为野生型植株基因组DNA；2：阳性对照，PCR模板为重组质粒pHB-SZPRI；3-5：PCR模板为3个独立RNA干涉转基因植株Ri-1、Ri-2、Ri-3的基因组DNA。C：RNA干涉转基因水稻株系实时定量PCR检测结果。从左至右依次为：野生型(WT)、3个RNA干涉转基因株系(Ri-1～Ri-3)中OsSZP基因的表达水平；D：野生型(WT)、RNA干涉转基因水稻株系(Ri-1～Ri-3)秕谷率。

图3是水稻OsSZP过表达转基因植株表型。A：野生型(WT)、过表达水稻株系(OX-1～OX-3)中OsSZP基因表达水平定量检测结果；B：野生型(WT)、过表达抑制水稻株系(CS-1～CS-3)中OsSZP基因表达水平。

具体实施方式

下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如SambrookRussell的分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：水稻OsSZP基因的克隆

1、试剂

RNA提取试剂Trizol购于Invitrogen公司；反转录酶ReverTraAce购于Toyobo公司；高保真DNA聚合酶PrimeStar购于TaKaRa公司；克隆载体pEASY^TM-BluntSimpleCloningVector购于北京全式金生物技术有限公司；引物由上海英骏生物技术有限公司合成，其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。

2、大肠杆菌菌株和植物材料

大肠杆菌(Escherichiacoli)菌株DH5α购于北京全式金生物技术有限公司；水稻粳稻品种日本晴(OryzasativeL.ssp.japonicacv.Nipponbare)种子由四川省农业科学院繁育提供。

3、培养基和溶液

LB培养基:胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L。用NaOH调pH至7.0，高压灭菌。

SOB培养基:胰蛋白胨20g/L，酵母粉5g/L，NaCl0.58g/L，KCl0.19g/L，100×Mg²⁺10mL。用NaOH调pH至7.0，高压灭菌。

SOC培养基:SOB培养基经高压灭菌后冷至60℃或60℃以下，加20mL除菌的1mol/L葡萄糖溶液。

100×Mg²⁺溶液:20.33gMgCl₂.6H₂O和24.65gMgSO₄.7H₂O定容于100mLH₂O，高压灭菌。

20％葡萄糖溶液:20g葡萄糖定容于100mLH₂O，过滤除菌。

4、方法

4.1水稻叶片RNA提取

1)取新鲜水稻叶片，加入液氮研磨成粉状，迅速转移100-200mg粉末于不含RNase的1.5mLEp管中，即刻加入1mLTrizol提取液混匀，振荡10s，室温下放置5min；

2)加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15s，室温下放置2-3min；

3)4℃，12000g离心15min，吸取上清约600μL至新EP管中，加入0.6mL异丙醇，室温下放置10min；

4)4℃，12000g离心10min，弃上清，沉淀用70％乙醇冲洗两次，4℃，7500g离心5min；

5)倒掉乙醇，常温干燥RNA沉淀10min，溶于50μLRNase-freeddH₂O中，保存于-80℃中备用。

4.2RT-PCR

4.2.1RT

1)取1μg总RNA与1μLpolyT₁₈(10μM)引物混合，用RNase-freeddH₂O补足到12.75μL，轻轻混匀；

2)65℃保温5min，立即转移至冰浴中，放置2min；

3)加入5×反应缓冲液4μL，10mMdNTP2μL，RNA抑制剂0.25μL(40U/μL)，ReverTraAce反转录酶1μL(100U/μL)，42℃1h，合成第一链cDNA；

4)95℃加热5min，失活反转录酶，终止反应。

4.2.2PCR

水稻OsSZP基因的克隆。将200μLEP管放置于冰上，加入试剂：

按以下程序进行扩增：98℃2min(预变性)；98℃10s(变性)，56℃10s(复性)，72℃90s(延伸)，所述变性-复性-延伸30个循环；72℃5min(总延伸)。

以上述PCR产物为模板，以引物SZPF2和SZPR2进行第二轮PCR，复性温度58℃，其它条件同上。

引物序列如下：

SZPF1:5’-TCTCTCTCTAGTGAACTTGC-3’

SZPR1:5’-AGGGTTCTGTATCTCCATCCAAC-3’

SZPF2:5’-AAGCTTCTCCACAACCTCATTTACACCT-3’

SZPR2:5’-GAGCTCGCACATACAATGAAGCCGCTAT-3’

通过上述操作，获得了OsSZP基因PCR扩增产物。

4.3高保真PCR产物与克隆载体pEASY-Blunt连接

将由上述4.2所述获得的OsSZP基因PCR扩增产物与克隆载体pEASY^TM-BluntSimpleCloningVector按摩尔分子数比2：1连接(25℃，10min)，连接体系如下：

pEASY^TM-BluntSimpleCloningVector(50μg/μL)1μL

PCR产物(～150μg/μL)2μL

4.4大肠杆菌转化

1)从液氮中取出大肠杆菌(Escherichiacoli)菌株DH5α感受态细胞冰浴解冻；

2)将4.3所述连接产物与大肠杆菌感受态细胞轻轻混匀，冰浴30min；

3)42℃热冲击90s，立即冰浴1-2min；

4)加入0.8mLSOC，混匀，37℃温和振荡培养1h；

5)室温13000rpm离心1min，倒掉一部分上清液，留约200μL的上清液，用吸头将上清液与细胞混匀，涂布于含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB平板，37℃培养过夜。

4.5快速裂解法鉴定重组克隆

1)挑取单克隆接种于500μL含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养液中，37℃振荡培养至A₆₀₀为0.6～0.8；

2)取200μL菌液至0.5mLEP管中，13000rpm离心1min，去上清，留约20μL上清；

3)加入20μL2×快速裂解液(0.2MNaOH50mL，SDS0.5g,蔗糖27.2g，加双蒸水至200mL)，剧烈振荡；

4)13000rpm离心15min；

5)取5μL上清直接电泳。与对照相比，电泳带滞后的即可能是重组载体。

4.6菌落PCR鉴定重组质粒

将4.5所述经快速裂解法鉴定的重组载体再进行菌落PCR鉴定，以确定插入片段是目标片段，反应体系如下：

反应条件：94℃3min(预变性)；94℃30s(变性)，58℃30s(复性)，72℃90s(延伸)，所述变性-复性-延伸26个循环；72℃5min(总延伸)。

对菌落PCR鉴定的重组载体，命名为pEASY-OsSZP，进行测序。测序结果表明，获得了连接于pEASY-BluntSimple克隆载体的OsSZP基因全长编码序列。

实施例2：水稻OsSZP基因表达模式分析

1、试剂

RNA提取试剂Trizol购于Invitrogen公司；反转录酶ReverTraAce购于Toyobo公司；TaqDNA聚合酶购于TaKaRa公司；引物由上海英骏生物技术有限公司合成，其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。

2、方法

取野生型水稻品种日本晴幼苗和田间生长成熟植株不同组织、以及在不同光、温条件下植株叶片样品，液氮研磨后提取RNA，进行反转录，操作步骤如实施例1中4.1、4.2所述。

以水稻内参基因(ACTIN，Genbank登录号X16280)为对照，进行OsSZP基因表达水平的半定量PCR分析。OsSZP基因引物为：SZPIF1和SZPIR1；ACTIN基因引物为：ACTF和ACTR。引物序列如下：

SZPIF：5’-CTCGACTCCTTCGACGACCT-3’

SZPIR：5’-AGGGTTCTGTATCTCCATCC-3’

ACTF：5’-AAGATCCTGACGGAGCGTGGTTAC-3'

ACTR：5'-CTTCCTAATATCCACGTCGCACTTC-3'

按以下程序进行扩增：94℃5min(预变性)；94℃30s(变性)，56℃30s(复性)，72℃20s(延伸)，所述变性-复性-延伸27个循环；72℃10min(总延伸)。反应体系为：

3、结果

3.1OsSZP基因在水稻植株各组织中的表达

半定量RT-PCR实验结果表明，如图1A，B所示，水稻OsSZP在野生型日本晴幼苗、田间生长成熟植株的根中均不表达；在幼苗、成熟植株的茎、叶中均有表达；而在颖花中表达量最高。

3.2OsSZP基因在不同光、温生长条件水稻植株中的表达

RT-PCR实验结果显示，与正常生长条件(28℃,12h光/12h暗)相比，低温(4℃,12h光/12h暗)、高温(42℃,12h光/12h暗)条件下处理48h后，野生型水稻植株中OsSZP表达均稍有降低；与光照培养相比，高温暗培养(42℃,24h暗)条件下表达量明显降低，见图1C。

实施例3：水稻OsSZP基因RNA干涉重组质粒的构建

1、试剂

质粒提取试剂盒EasyPurePlasmidMiniPrepKit购于北京全式金生物技术有限公司；琼脂糖胶回收试剂盒EasyPureQuickGelExtractionKit购于北京全式金生物技术有限公司；TaqDNA聚合酶、限制性内切酶XhoI、BamHI、HindIII、PstI、EcoRI、T4连接酶购于TaKaRa公司；引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

其它进口分装、常规试剂与实施例1相同。

2、农杆菌菌株和植物表达载体

用于转基因的根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株EHA105购于Clontech公司；真核表达载体pHB由上海交通大学杨洪全教授实验室构建(Mao等，ProcNatlAcadSciUSA,2005)提供。

3、培养基

YEB培养基:酵母提取物1g/L，牛肉膏5g/L，蛋白陈5g/L，蔗糖5g/L

MgSO₄.7H₂O0.5g/L。用NaOH调pH至7.0，高压灭菌。

4、方法

4.1OsSZP基因片段的获得

4.1.1PCR

选取SEQIDNO：1所述序列第1317bp至1743bp的基因片段设计引物构建OsSZP基因RNA干涉真核重组质粒，引物序列如下：

SZPIF1:5’-CTCGAGGATCCTCGACTCCTTCGACGACCT-3’

SZPIR1:5’-AAGCTTAGGGTTCTGTATCTCCATCC-3’

SZPIF2:5’-CTGCAGTCGACTCCTTCGACGACCT-3’

SZPIR2:5’-GAATTCAGGGTTCTGTATCTCCATCC-3’

分别以SZPIF1和SZPIR1为正向片段扩增引物、以SZPIF2和SZPIR2为反向片段扩增引物，进行OsSZP正向插入、反向插入基因片段PCR扩增，反应体系和扩增程序如实施例2所述。

4.1.2目的基因片段与克隆载体pMD18-T的连接和转化

将上述4.1.1所述获得的PCR产物与pMD18-T载体16℃连接4h，连接反应体系如下：

将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，操作步骤如实施例1中4.4所述。

4.1.3重组质粒鉴定与测序

对4.1.2所获转化克隆进行菌落PCR，操作步骤如实施例1中4.6所述。然后对菌落PCR确定的重组质粒进行测序。通过将测序结果与基因序列进行比对，确定获得水稻OsSZP正向插入、反向插入基因片段，分别命名为pMD18-SZPRIF1R1、pMD18-SZPRIF2R2。

4.2pSK中间载体的构建

4.2.1质粒提取、DNA片段酶切回收

将上述4.1所获测序正确的水稻OsSZP正向基因片段质粒pMD18-SZPRIF1R1、pSK载体分别进行质粒提取，提取过程按照生产商建议程序进行。

1)将分别带有质粒pMD18-SZPRIF1R1、pSK的大肠杆菌接种于裝有5mLLB培养液(含有100μg/mL氨苄青霉素)的试管中，37℃培养12h；

2)取3mL菌液，室温下10000g离心1min，吸尽上清。加入250μL含有RNaseA的无色重悬液RB(ResuspensionBuffer)，漩涡振荡重新悬浮大肠杆菌；

3)加入250μL蓝色裂解液LB(LysisBuffer)，温和翻转混合4～6次，使菌体充分裂解，形成蓝色透亮溶液；

4)加入350μL黄色中和液NB(NeutralizationBuffer)，轻轻混合5～6次，直至形成紧实的黄色凝集块，室温静置2min；

5)15000g离心5min，小心吸取上清加入吸附柱中；

6)15000g离心1min，弃去收集液；

7)加入650μL洗涤液WB(WashBuffer)，15000g离心1min，弃去收集液；

8)15000g离心2min，彻底去除残留的WB；

9)将吸附柱置于干净离心管中，在吸附柱中央加入50μL洗脱液EB(ElutionBuffer)，室温静置1min；

10)10000g离心1min，洗脱DNA。DNA溶液于-20℃保存。

将所获得pMD18-SZPRIF1R1、pSK质粒分别以限制酶XhoI、HindIII进行双酶切，然后进行胶回收。DNA回收过程按照生产商建议程序进行。

1)切取琼脂糖凝胶中的DNA片段，放入离心管中；

2)加入3倍体积琼脂糖凝胶溶解液GSB(GelSolubilizationBuffer)，于55℃水浴6～10min使胶块完全融化。当胶块完全融化后，观察溶液颜色，如颜色为紫色，加入适量3M醋酸钠(pH5.2)，使溶液呈黄色；

3)待凝胶溶液降至室温(高温时吸附柱结合DNA能力弱)，加入吸附柱中静置1min，10000g离心1min，弃去收集液；

4)加入650μL洗涤液WB(WashBuffer)，10000g离心1min，弃去收集液；

5)10000g离心2min，去除残留的WB；

6)将吸附柱开盖静置1min，使残留乙醇挥发干净，在吸附柱中央加入60℃预热50μL洗脱液EB(ElutionBuffer)，室温静置1min；

7)10000g离心1min，洗脱DNA。将洗脱出的DNA于-20℃保存。

4.2.2水稻OsSZP正向基因片段与pSK载体的连接

将4.2.1所获得的水稻OsSZP正向插入基因片段、pSK载体的酶切回收产物进行连接，连接反应体系如下：

连接反应在16℃进行4h后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，操作步骤分别如实施例1中4.4所述。挑取转化平板上所生长单克隆，如实施例1中4.6所述进行菌落PCR鉴定。获得带有OsSZP正向插入基因片段的pSK重组质粒，命名为pSK-SZPRIF1R1。

4.2.3水稻OsSZP反向插入基因片段与已连有正向插入基因片段的pSK载体的连接

将4.1.3所获得pMD18-SZPRIF2R2质粒与上述4.2.2所获pSK-SZPRIF1R1载体，分别以EcoRI、PstI进行双酶切后连接、转化、鉴定。获得带有水稻OsSZP正向和反向插入基因片段的pSK中间载体，命名为pSK-SZPRI。

4.3RNA干涉真核重组质粒的获得

将4.2.3所获得pSK-SZPRI中间载体、植物表达载体pHB分别以BamHI、PstI双酶切后回收。将所回收OsSZP基因片段、pHB载体酶切片段于16℃连接4h，然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。

挑取转化平板上所生长单克隆，如实施例1中4.6所述进行菌落PCR鉴定。然后将所鉴定转化阳性克隆进行质粒提取。经BamHI、PstI双酶切鉴定，获得水稻OsSZP基因RNA干涉真核重组质粒，命名为pHB-SZPRI(图2A)。

4.4农杆菌感受态细胞制备

1)挑取农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株EHA105单菌落于2mLYEB液体培养基(含50μg/mL利福平)中，28℃振荡培养过夜；

2)取过夜培养液500μL转接于50mLYEB(含50μg/mL利福平)液体培养基中，28℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.5；

3)4℃5000rpm离心5min收集菌体，加l0mL0.15MNaCl溶液悬浮菌体，冰浴10min；

4)4℃5000rpm离心5min收集菌体，用lmL预冷的20mMCaCl₂溶液悬浮菌体，冰浴10min；

5)所制备感受态细胞分装成200μL/管，液氮中速冻lmin，置-80℃保存备用。

4.5农杆菌转化

1)取200μL农杆菌感受态细胞，冰上解冻；

2)加入lμg上述4.3所述pHB-SZPRI重组载体，轻弹混匀，冰浴30min；

3)液氮中速冻lmin，37℃水浴5min，然后加入1mLYEB培养基，28℃慢速振荡培养4h；

4)将培养物涂布于含50μg/mL卡那霉素和50μg/mL利福平的YEB平板上，28℃培养约48h。

4.6农杆菌阳性克隆的鉴定

挑取如上4.5所述转化平板上生长的农杆菌单菌落，接种于含50μg/mL卡那霉素和50μg/mL利福平的YEB液体培养基中，28℃振荡培养过夜，以菌液为模板进行PCR鉴定。鉴定结果表明，获得了可用于水稻遗传转化的带有pHB-SZPRI质粒的阳性农杆菌克隆。

实施例4：水稻OsSZPRNA干涉转基因植株的获得

1、试剂

RNA提取试剂Trizol购于Invitrogen公司；反转录酶ReverTraAce购于Toyobo公司；实时定量PCR试剂TransStart^TMGreenqPCRSuperMix购于北京全式金生物技术有限公司。其它试剂均为进口分装或国产分析纯产品。

2、培养基

植物组织培养基如表1所示。

表1

(1)诱导培养基：NB+2mg/L2，4-D，pH5.8～5.9；(2)共培养培养基：NB+2mg/L2，4-D+100μmol/L乙酰丁香酮，pH5.2；(3)筛选培养基：NB+2mg/L2，4-D+250mg/L羧苄青霉素+30～50mg/L潮霉素，pH5.8～5.9；(4)分化培养基：NB+10mg/LKT+0.4mg/LNAA+250mg/L羧苄青霉素，pH5.8～5.9；(5)生根培养基：1/2MS，pH5.8～5.9。

3、方法

3.1农杆菌介导法转化水稻

3.1.1胚性愈伤组织的诱导及继代

水稻野生型日本晴成熟种子手工去壳后，75％乙醇消毒1min，25％次氯酸钠溶液中振荡消毒25min，灭菌蒸馏水冲洗3次，接种到诱导培养基上。27℃暗培养条件下诱导约7天愈伤组织形成，切除胚根，继续培养7d，待愈伤长大后进行继代培养。共继代2次。

3.1.2农杆菌的培养及处理

从-80℃低温冻存管中刮取少量实施例3所获带有pHB-SZPRI质粒的阳性农杆菌克隆菌液，在含有50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的YEB固体培养基划线，然后在28℃暗培养48h活化。取活化平板上的单菌落转接于含有50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的YEB液体培养基，28℃培养48h后，悬浮于20mL含有100μM乙酰丁香酮的AAM培养基中，剧烈摇动1min，静置1h。

3.1.3共培养

选取自然分散、颜色鲜黄、直径约为2～3mm的颗粒状愈伤于灭菌的培养瓶中，加入上述3.1.2处理的农杆菌菌液，略微摇动后静置30min，于无菌滤纸上晾干愈伤后接种于共培养基，25℃暗培养3d。

3.1.4洗除农杆菌

挑取共培养后的愈伤于广口培养瓶中，用无菌水冲洗至水中不见丝状菌体，以含250mg/L羧卞青霉素的无菌水静置1h，然后将转化愈伤置于无菌滤纸上晾干，移至含有潮霉素的筛选培养基。

3.1.5愈伤组织的筛选

转化愈伤在筛选培养板上生长，每2周转板1次。共转板2次。

3.1.6抗性愈伤组织的继代与植株的再生

转化愈伤在筛选培养板上生长约3周后即可见瘤状鲜黄色抗性愈伤从褐化干瘪的愈伤中长出。待愈伤长大后挑选抗性愈伤至分化培养基上。约2周后愈伤开始转绿，然后分化出幼苗。将幼苗移至生根培养基上，待幼苗生根长成后，移出培养瓶，洗净根上的培养基移至温室盆栽。

3.2转基因植株的鉴定

3.2.1水稻基因组DNA的提取

分别取野生型、转基因植株叶片提取基因组DNA。

1)取液氮研磨叶片细粉100mg于1.5mLEP管中，每管加入500μL65℃预热的2×CTAB提取缓冲液(100mMTris－HclpH8.0，20mMEDTApH8.0，1.4MNaCl，40mMβ-巯基乙醇，2％CTAB)混匀；

2)65℃水浴保温60min，冷却至室温，加入等体积的氯仿；

3)5000g离心10min，取上清液，加入等体积的异丙醇，室温放置15min，沉淀DNA；

4)12000g离心10min，弃上清，用70％乙醇冲洗后吹干沉淀；

5)将沉淀溶于200μL灭菌ddH2O中，加入RNaseA(10mg/mL)，37℃保温30min。加入等体积的酚/氯仿，混匀；

6)12000g离心10min，取上清，加入1/10体积3MNaAc和2.5倍体积的无水乙醇，室温放置10min；

7)12000g离心10min，弃上清，用70％乙醇冲洗后吹干沉淀，溶于100μL灭菌ddH2O中。DNA溶液于-20℃保存。

3.2.2阳性转基因植株鉴定

分别以野生型、转基因植株基因组DNA为模板，利用载体所携带潮霉素抗性标记基因(Hpt)进行PCR扩增。潮霉素抗性基因特异引物为：

HPTF：5'-TCGTTATGTTTATCGGCACTTTG-3'

HPTR：5'-GCGTCTGCTGCTCCATACAAG-3'

按以下程序进行扩增：94℃3min(预变性)；94℃30s(变性)，58℃30s(复性)，72℃20s(延伸)，所述变性-复性-延伸30个循环；72℃5min(总延伸)。

3.2.3RNA干涉转基因水稻植株中OsSZP表达水平定量PCR检测

分别取野生型、RNA干涉转基因植株叶片液氮研磨后提取RNA，进行反转录，操作步骤如实施例1所述。

取野生型、转基因植株cDNA，以水稻内参基因(ACTIN，Genbank登录号X16280)为对照，进行OsSZP基因表达水平的实时定量PCR分析。OsSZP基因引物为：RTSZPF和RTSZPR；ACTIN基因引物为：RTACTF和RTACTR。引物序列如下：

RTSZPF：5’-GATCCTCATTGGCCCTACCC-3’

RTSZPR：5’-CCCTTCCTGTACTGCGACCC-3’

RTACTF：5’-AGTGATTGCACCACCAGAAAGA-3’

RTACTR：5’-CAGGACCAGATTCATCATACTCG-3’

实时定量PCR反应体系如下：

反应条件：95℃30s；95℃5s，60℃15s，72℃10s，40个循环。扩增后，65℃5s，每个循环增加0.5℃，60个循环，进行溶解曲线分析。每个样品重复三次。PCR反应在Bio-RadCFX96上运行。

3.2.4转基因植株表型分析

将RNA干涉转基因阳性鉴定株系(Ri-1～Ri-3)与同期生长野生型植株生长情况进行分析比较。

分别取野生型、过表达转基因植株花药组织样品制备切片。操作步骤如下：

1)固定：剪取植株颖花以FAA固定液(70％酒精：甲醛：冰乙酸＝16：1：1)，置于4℃固定24h；

2)染色：倒去固定液，加入50％乙醇，室温静置0.5h；放于苏木精染液中染色48h；然后倒掉染色液，以30％乙醇浸洗2h，其间换30％乙醇数次至水中无浮色；

3)脱水：将染色样品采用乙醇浓度梯度脱水，依次经50％、70％、85％、95％、100％乙醇脱水，各梯度脱水2h；

4)透明：脱水后样品以1/2二甲苯+1/2无水乙醇(即二甲苯与无水乙醇等体积混和液)处理2h，然后加入二甲苯处理3h；

5)浸蜡：将材料转入装有二甲苯的小容器，逐渐往二甲苯中加入碎蜡，待其溶化后再加入少许碎蜡至饱和，在37℃恒温箱中过夜。次日加碎蜡至饱和，置60℃恒温箱3～5h后，倒掉含有二甲苯的蜡液换入熔化纯蜡。浸蜡48h，中途更换纯蜡2～3次；

6)包埋：将浸蜡样品倒入叠好的纸槽中，迅速放入冰水中使蜡块凝固；

7)切片：修整蜡块，以切片机切片，厚度5～10μm；

8)贴片：在载玻片上涂少许粘片剂，将切好的蜡带放入温水中，然后放至载玻片上，置于37℃恒温箱过夜烘片；

9)脱蜡及染色：将载玻片在二甲苯中脱蜡2次，每次0.5～1h。脱蜡后以中性树胶封片。

4、结果

4.1RNA干涉转基因水稻植株鉴定

4.1.1转基因阳性水稻植株鉴定

利用潮霉素抗性标记基因(Hpt)序列对转基因、野生型水稻叶片基因组DNA进行PCR扩增检测。阳性转基因植株扩增出Hpt目标条带(560bp)，如图2B所示，而野生型植株未能扩增出目标条带。

4.1.2转基因阳性水稻植株OsSZP基因表达分析

实时定量PCR分析结果显示，3个独立转基因植株(Ri-1～Ri-3)中OsSZP基因较野生型明显降低，见图2C。

4.2RNA干涉转基因水稻植株表型分析

对OsSZP基因RNA干涉转化植株的田间育性性状检测结果显示，各转基因株系秕谷率分别为98.9％、65.4％、89.3％，OsSZP基因下调程度与秕谷率的升高相对应(图2D)。在RNA干涉转基因植株的花药组织切片中，OsSZP基因下调后花粉囊表皮细胞形状不规则；绒粘层退化早；有较大比例同一花药4个花粉囊发育不同步或败育；成熟花粉形状不规则，染色不均匀。

实验结果表明，当将在水稻颖花中表达量较高的锌指蛋白OsSZP基因通过RNA干涉下调后，花粉败育率、谷粒不育率明显升高。

实施例5：水稻OsSZP基因过表达重组质粒的构建

1、试剂

高保真DNA聚合酶PrimeStar、限制性内切酶HindIII、SacI购于TaKaRa公司。

其它进口分装、常规试剂、药品与实施例3相同。

2、农杆菌菌株和植物表达载体

如实施例3所述。

3、培养基

如实施例3所述。

4、方法

4.1质粒提取

将由实施例1所获得已测序、连接于克隆载体pEASY^TM-BluntSimpleCloningVector的水稻OsSZP基因重组质粒pEASY-OsSZP进行质粒提取，提取过程如实施例3所述按照生产商建议程序进行。

4.2DNA片段酶切回收

将重组质粒pEASY-OsSZP、植物表达载体pHB分别以限制酶HindIII、SacI进行双酶切、胶回收。DNA回收过程如实施例3所述按照生产商建议程序进行。

4.3回收片段连接转化

对上述4.2所回收pHB载体酶切片段、水稻OsSZP基因全长编码序列于16℃连接4h，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。

挑取转化平板上所生长单克隆，如实施例1中4.6所述进行菌落PCR鉴定。然后将所鉴定转化阳性克隆如实施例3中4.1所述进行质粒提取。经HindIII、SacI双酶切鉴定，获得OsSZP基因过量表达重组质粒，命名为pHB-OsSZP。

4.4农杆菌感受态细胞制备与转化

操作步骤如实施例3中4.4、4.5所述。

4.5农杆菌阳性克隆的鉴定

挑取如上4.4所述转化平板上生长的农杆菌单菌落，接种于含50μg/mL卡那霉素和50μg/mL利福平的YEB液体培养基中，28℃振荡培养过夜，以菌液为模板进行PCR鉴定。鉴定结果表明，获得了可用于水稻遗传转化的带有pHB-OsSZP质粒的阳性农杆菌克隆。

实施例6：OsSZP过表达转基因水稻植株的获得

1、试剂

如实施例4所述。

2、培养基

如实施例4所述。

3、方法

3.1农杆菌介导法转化水稻

实验步骤如实施例4中3.1所述。

3.2OsSZP过表达转基因水稻植株的鉴定

3.2.1水稻基因组DNA的提取

分别取野生型、转基因水稻植株叶片提取基因组DNA。操作步骤如实施例4中3.2.1所述。

3.2.2阳性转基因植株鉴定

分别以野生型、转基因水稻植株基因组DNA为模板，对水稻潮霉素抗性标记基因(Hpt)进行PCR扩增。操作步骤如实施例4中3.2.2所述。

3.2.3转基因植株中水稻OsSZP基因定量PCR检测

分别取野生型、过表达转基因植株叶片液氮研磨后提取RNA，进行反转录。操作步骤如实施例1所述。

取野生型、转基因植株cDNA，以水稻内参基因(ACTIN，Genbank登录号X16280)为对照，进行OsSZP基因表达水平的实时定量PCR分析。操作步骤如实施例4中3.2.3所述。

3.2.4转基因植株表型分析

将OsSZP过表达转基因水稻株系(OX-1～OX-3)、OsSZP过表达抑制水稻株系(CS-1～CS-3)与同期生长野生型植株生长情况进行分析比较。

4、结果

4.1OsSZP过表达转基因水稻植株鉴定

4.1.1转基因阳性水稻植株鉴定

利用潮霉素抗性标记基因(Hpt)序列对转基因、野生型水稻叶片基因组DNA进行PCR扩增检测。阳性转基因植株扩增出Hpt目标条带(560bp)，而野生型植株未能扩增出目标条带。

4.1.2转基因阳性水稻植株OsSZP基因表达水平定量分析

实时定量PCR分析结果显示，3个独立过表达转基因水稻株系(OX-1～OX-3)中OsSZP表达量较野生型升高；过表达抑制水稻株系(CS-1～CS-3)中OsSZP基因较野生型降低，见图3A，3B。

4.2OsSZP转基因水稻植株表型分析

OsSZP全长编码序列转基因植株的田间育性性状显示，与野生型相比，OsSZP过表达转基因株系(OX-1～OX-3)的性状无明显差异，育性未受影响；而过表达抑制转基因株系(CS-1～CS-3)则育性下降，秕谷率分别为50.0％、66.7％、55.8％。进一步表明OsSZP基因控制水稻育性。

以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。

Claims (1)

1.一种水稻育性控制锌指蛋白基因在水稻育性遗传育种中的应用，其特征在于：所述水稻育性控制锌指蛋白基因的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：1所示。