CN102816243B - 水稻转录因子Os06g08400基因的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及水稻转录因子Os06g08400基因的应用，其是利用转录因子激活基序VP64（即4个转录因子激活基序VP16）与水稻转录因子Os06g08400基因融合构建得到组成型转录因子，并转化到农作物如水稻中，从而改良水稻籽粒性状，如水稻籽粒明显变宽变厚。对于详细阐明调控种子发育机理具有重要的理论价值，并且可以通过转基因手段，改良水稻的粒型，因此在生产实践中也具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于遗传工程领域，具体地说，涉及水稻转录因子Os06g08400基因的应用。
背景技术
水稻(Oryza sativa L.)是最重要的三大粮食作物之一，是世界一半以上人口的主食。当前水稻增产的研究较依赖于有限的水稻种质资源，传统的杂交育种优势正在逐渐减弱，而水稻转基因技术有可能发掘水稻进一步增产的潜力。
禾谷类作物的产量很大程度上取决于其籽粒的大小，因此水稻籽粒性状的基因调控是重要的研究领域。近年来，已经通过基因克隆、QTL等技术手段揭示了至少8个基因在控制粒型方面具有重要作用。SG1基因编码一个功能未知的蛋白，主要在水稻根和发育的穗中表达，该蛋白的过量表达出现短粒和矮化表型。SG1降低了对油菜素内酯BR的应答，通过减少细胞增殖从而降低诸如种子、穗轴节间等器官的伸长。SGL1是一个类SG1蛋白，具有与SG1类似的功能，通过RNAi下调SG1及其同源基因SGL1的表达，水稻粒长和穗轴的节间较野生型变长（Nakagawa等，2012）。GS3位点是控制水稻粒重和粒长的主效QTL，同时也是控制水稻粒宽和籽粒充实度的微效QTL(Fan,Xing等，2006;Mao,Sun等，2010)。PGL1是一个非典型的不结合DNA的碱性螺旋-环-螺旋蛋白(bHLH)，过量表达PGL1增加了籽粒长度和重量。APG是PGL1的拮抗性互作因子，两者都定位在核内。PGL1/APG介导的籽粒长度增加是由于内颖细胞长度增加引起的。APG和PGL1不影响已知籽粒长度调控基因GS3和SRS3的表达。PGL1-APG代表了一个新的籽粒长度和重量调控途径，APG是一个负向调节子，其功能受到PGL1的抑制（Heang等，2012）。Mi3(t)基因，来源于籼型水稻Y34，该基因能使粒长缩短35.7%～47.4%，千粒重降低45.9%～62.4%，它主要控制籽粒长度，产生小粒(刘明伟等，2005)。此外，控制水稻籽粒性状的基因还有gGL7和gGL7-2。总之，控制水稻籽粒发育是一个复杂过程，涉及到多基因多条途径的协调控制，目前发现调控该性状的基因不多，调控籽粒发育的分子机理尚未阐明，因此，寻找控制籽粒性状发育的基因和新的发掘手段对作物改良并提高作物产量具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供水稻转录因子Os06g08400基因的应用。
为了实现本发明目的，本发明首先提供一种融合蛋白，该融合蛋白为（VP16）n-Linker-Os06g08400；其中，n为≥1的整数；Linker由1~20个柔性氨基酸串联而成（例如，GGGGG，GPPPG，或Gatway载体重组位点编码的氨基酸序列DPAFLYKVVPR）；VP16为来自单纯疱疹病毒（Herpes simplex virus）的VP16蛋白；Os06g08400为水稻转录因子Os06g08400，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
本发明还提供一种用于扩增水稻转录因子Os06g08400基因的引物对，其为正向引物F：5′-CAAAAAAGCAGGCTTCATGGGTTGGTTGACCAAATTTTTTAGA-3′和反向引物R：5′-CAAGAAAGCTGGGTCAAATGGGAAAGTCCCTGTTAACCG-3′。
优选地，前述融合蛋白中n为4，即前述融合蛋白为(VP16)4-Linker-Os06g08400。其中，(VP16)4即VP64，是由4个VP16功能域基序融合在一起组成的增强子，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
本发明还提供编码所述融合蛋白的基因，以及在严格条件下，可与该基因的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；其中，所述严格条件为65℃，在0.1×SSPE或0.1×SSC、0.1%SDS的溶液中杂交并洗膜。
本发明还提供含有编码所述融合蛋白的基因的载体。所述载体为任一种可引导外源基因在宿主中表达的载体。优选地，所述载体为植物双元表达载体（例如，pCAMBIA1301）。在将本发明编码所述融合蛋白的基因构建到植物表达载体中时，可在其转录起始核苷酸前添加任一种强启动子（例如，玉米强启动子Ubiquitin）或诱导型启动子。此外，在将本发明编码所述融合蛋白的基因构建到植物表达载体中时，还可以使用增强子，且这些增强子区域必须与编码序列的阅读框相同，以确保整条序列的翻译。
本发明还提供含有编码所述融合蛋白的基因的转基因细胞系。
本发明还提供含有编码所述融合蛋白的基因的工程菌。
本发明还提供编码所述融合蛋白的基因在改良水稻籽粒性状（如增加水稻籽粒的宽度和厚度）中的应用。
本发明进一步提供水稻转录因子Os06g08400基因的应用，其是将水稻转录因子Os06g08400基因的CDS序列（完整翻译区）构建到4个转录因子激活基序VP16的下游，转化植物，筛选并最终获得转基因植物。
前述的应用，其是将水稻转录因子Os06g08400基因的CDS序列通过Gateway系统构建到4个转录因子激活基序VP16的下游，转化水稻（例如，水稻品种‘kitaake’），从而改良转基因水稻籽粒的性状（如增加水稻籽粒的宽度和厚度）。其中，水稻转录因子Os06g08400基因是水稻转录因子Orphan家族成员之一，命名为OsOrphan40。水稻转录因子Os06g08400基因的CDS序列如SEQ ID No.3所示，4个转录因子激活基序VP16的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
携带有编码所述融合蛋白的基因的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中（Weissbach，1998，Method for Plant Molecular BiologyVIII，Academy Press，New York，第411-463页；Geiserson和Corey，1998，Plant Molecular Biology，2nd Edition）。
本发明不同于QTL技术，而是利用VP64增强水稻转录因子的功能。其特点在于：VP64是由4个VP16功能域基序融合在一起组成的一类增强子，可增强融合转录因子的功能。OsOrphan40是水稻转录因子Orphan家族成员之一，当在其N-端融合VP64基序后，其表达的融合蛋白可增强OsOrphan40转录因子的功能。本发明通过基因工程手段将VP64融合到OsOrphan40的N-端，转化水稻品种‘kitaake’后，能够增加籽粒宽度发育。
本发明首次利用转录因子激活基序VP64（即4个转录因子激活基序VP16）与水稻转录因子Os06g08400基因融合构建得到组成型转录因子，并转化到农作物，如水稻中，从而改良水稻籽粒性状，如水稻籽粒宽度和厚度增加。对于详细阐明调控种子发育机理具有重要的理论价值，并且可以通过转基因手段，改良水稻的粒型，因此在生产实践中也具有重要意义。
附图说明
图1为本发明实施例1中nVP64-bar-asRED载体图谱。
图2为本发明实施例1中ubi:VP64-OsOrphan40载体图谱。
图3为本发明实施例3中PCR检测转基因阳性水稻株系的结果；其中，WT为野生型水稻‘kitaake’，Orphan40为VP64-Orphan40转基因水稻株系。
图4为本发明实施例3中Western Blot检测转基因阳性水稻株系的结果；其中，WT为野生型水稻‘kitaake’，Orphan40-1、Orphan40-2、Orphan40-3、Orphan40-4和Orphan40-5为VP64-Orphan40转基因水稻株系。
图5为本发明实施例4中VP64-Orphan40转基因水稻籽粒粒型（左）及米粒粒型的分析结果；其中，WT为野生型水稻‘kitaake’，Orphan40为VP64-Orphan40转基因水稻。
图6为本发明实施例4中VP64-Orphan40转基因水稻籽粒性状的考种统计数据分析结果；其中，WT为野生型水稻‘kitaake’，Orphan40-1、Orphan40-2、Orphan40-3、Orphan40-4和Orphan40-5为VP64-Orphan40转基因水稻株系。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1 水稻转录因子Os06g08400基因的获得及植物表达载体的构建
在植物转录因子数据库（http://plntfdb.bio.uni-potsdam.de/v3.0/fam_mem.php?family_id=Orphans&sp_id=OSAJ）中找到水稻转录因子OsOrphan40基因，或者在MSU Rice Genome Annotation ProjectDatabase中查找编号Os06g08400，根据其CDS序列设计PCR扩增引物：正向引物F1：5′-CAAAAAAGCAGGCTTCATGGGTTGGTTGACCAAATTTTTTAGA-3′和反向引物R1：5′-CAAGAAAGCTGGGTCAAATGGGAAAGTCCCTGTTAACCG-3′。
以水稻‘日本晴’（Oryza sativa subsp.japonica）叶片为材料，TRIzol法提取总RNA，反转录得cDNA，反应步骤如下：（1）在冰上向不含核酸酶的PCR反应管中依次加入下列物质：总RNA 6μl(0.1ng-5μg)，Oligo(dT)18引物1μl，不含核酸酶的ddH2O5μl，置于PCR仪中65℃反应5min；(2)然后再加入下列物质：5×反应缓冲液4μl，RNase抑制剂1μl，10mM dNTP 2μl，M-MμlV反转录酶1μl，轻轻混匀，在PCR仪中45℃反应60min；（3）PCR仪中，70℃5min，终止反应。以总cDNA为模板，进行PCR扩增，获得OsOrphan40基因全序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
第一轮PCR反应总体系为25μL,包括水稻cDNA（50ng）1μL，dNTP（2.5mM）2.5μL，引物F1(10μM)1μL，引物R1(10μM)1μL，PrimeSTAR Taq酶（5U/μL）0.3μL，10×反应缓冲液2.5μL，ddH2O16.7μL，共25μL。PCR反应程序为:98℃预变性3min；98℃ 10s，56℃15s，72℃ 1.5min，共35个循环；最后72℃ 5min。
第二轮PCR反应总体系为50μL,包括第一轮PCR产物（50ng）1μL，dNTP（2.5mM）5μL，引物F1(10μM)1.5μL，引物R1(10μM)1.5μL，PrimeSTAR Taq酶（5U/μL）1μL，10×反应缓冲液5μL，加ddH2O补足至50μL。PCR反应程序为:98℃预变性3min；98℃ 10s，56℃ 15s，72℃ 1.5min，共35个循环；最后72℃ 5min。
将第二轮PCR产物通过BP反应连接到pDONRzeo载体(Invitrogen)上，经测序鉴定阳性克隆。然后通过LR反应将OsOrphan40构建到其目的基因的N端融合了VP64标签的植物表达载体nVP64-hyg-asRED上（图1），获得载体ubi：VP64-OsOrphan40（图2，载体全序列如SEQID NO.6所示）。
其中，植物表达载体nVP64-bar-asRED的构建过程为：以双元表达载体pCAMBIA1300左右边界包含的序列为骨架序列，通过体外重组，将ubi promoter-VP64-Gateway表达单元、35S promoter-asRED表达单元和35S promoter-bar表达单元与之融合构建得到，载体nVP64-bar-asRED的全序列如SEQ ID No.5所示。
实施例2 转基因水稻植株的获得
取水稻‘kitaake’成熟种子，人工或机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子经消毒之后接种到诱导培养基上进行诱导培养。选择外观良好，生长力好的水稻愈伤组织为受体材料，采用农杆菌介导法将载体ubi：VP64-OsOrphan40转入水稻愈伤组织中，用含有100μM的乙酰丁香酮和O.D.值为0.7的农杆菌的AAM转化液进行转化，将转化液浸泡过的愈伤组织置于共培养基上进行共培养，25℃暗培养3d后置于筛选培养基上培养约30d，每10d继代一次。然后将筛出的抗性愈伤转移到分化培养基上分化约20d，每10d继代一次。将分化出绿色小苗的抗性愈伤转移到生根培养基上生根，待约7d长出发达根系后炼苗，并计算转化所获转基因苗数。炼苗7d后转移至大田生长。用Basta筛选转基因水稻，长出4片幼叶后开始喷洒Basta(1:1000，v:v)，隔1天喷1次，共喷洒3次。共获得转基因水稻20株。
其中，诱导培养基配方为：N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+铜钴母液+2.5mg/L 2,4D+0.6g/L酸水解酪蛋白+2.878g/L脯氨酸+0.5g/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖，以水配制，调pH至5.8~5.9后加入植物凝胶4g/L。
共培养基配方为：N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+2.5mg/L 2,4D+0.5g/L谷氨酰胺+0.6g/L酸水解酪蛋白+10g/L葡萄糖+30g/L蔗糖，以水配制，调pH至5.2后加入植物凝胶4g/L。灭菌后，50℃左右加入AS（乙酰丁香酮）100~200μg/mL。
筛选培养基配方为：N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+铜钴母液+2.5mg/L 2,4D+0.6g/L酸水解酪蛋白+2.878g/L脯氨酸+0.5g/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖，以水配制，调pH至5.8~5.9后加入植物凝胶4g/L。灭菌后加入35mg/L潮霉素（购自上海纽津生物技术有限公司）或5mg/L Bialaphos（购自北京拜尔迪生物技术公司）。
分化培养基配方为：MS无机+MS-B5微量+MS有机+铁盐+MS-铜钴母液+0.05mg/L NAA+2.0mg/L Kinetin（激动素）+30g/L山梨醇+2g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖，以水配制，调pH至5.8~5.9后加入植物凝胶4g/L。
实施例3 Os06g08400-VP64转基因水稻的鉴定
为检测Os06g08400基因的CDS序列是否整合至水稻基因组DNA中，首先采用CTAB法分别提取野生型和转基因水稻叶片总DNA，设计检测引物序列，上游引物：5′-ATTTTTTTAGCCCTGCCTTCATACG-3′，下游引物：5′-CCAAATGTTTGAACGATCGATCCA-3′，进行PCR，扩增体系为：反应缓冲液5μl，dNTP 1μl，ddH2O 2.2μl，Taq DNA聚合酶0.2μl，上下游引物各0.3μl，DNA模板1μl，反应条件为热启动96℃ 5min；95℃30s，55℃ 30s，72℃ 2min，共32个循环；72℃延伸10min，最后25℃反应结束。鉴定转基因植株，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果表明，转基因水稻均扩增出目的条带，而野生型水稻中未扩增出目的条带（图3），初步确定Os06g08400基因的CDS序列已通过农杆菌介导的方法插入到水稻基因组中，PCR产物经测序后，测序结果如SEQ ID No.3所示。
由于过表达载体带有FLAG标签，在转基因水稻中将与目的蛋白融合，因此利用该FLAG抗体可以鉴定转基因水稻中目的基因的蛋白表达情况，经过SDS-PAGE蛋白电泳→免疫印记→免疫荧光反应，Western Blot鉴定结果表明转基因植株存在目的蛋白，而野生型未杂出条带（图4）。
具体的Western Blot实验流程如下：
将适量样品放入液氮冰冻后研磨成粉末，加入适量上样缓冲液混匀，12000rpm离心10分钟；取5μl上清加样，以90V电压SDS-PAGE电泳30分钟后，120V电泳60-90分钟，当溴酚蓝到达凝胶的底端即可停止电泳；电泳后采用半干转移法转膜，并用丽春红染色液对膜进行染色，观察转膜效果；转膜完毕后，将膜放入含5%的脱脂奶粉的PBST溶液中封闭室温封闭60分钟或4℃过夜；室温下加入一抗(FLAG抗体，购自Abmart，货号M20008L)孵育1小时或4℃孵育过夜，然后用PBST洗涤3次，每次5分钟；室温下加入二抗（羊抗鼠，购自Abmart，货号M21001S）孵育1小时，然后用PBST洗涤3次，每次5分钟；在膜上加入底物，进行曝光。
实施例4 转基因水稻表型分析和考种分析
与野生型水稻‘kitaake’相比，VP64-Os06g08400（即VP64-Orphan40）转基因水稻的籽粒（带颖壳的稻粒）及米粒（脱去颖壳的稻粒）明显变宽（图5）。根据考种数据分析结果，可以明显看出VP64-Os06g08400转基因水稻的籽粒性状较野生型差异显著（图6），从图6可以看出，转基因的水稻籽粒和米粒表现出显著的粒宽和粒厚增加。
以上提供的实施例是将水稻转录因子Os06g08400基因的CDS序列通过Gateway系统构建到4个转录因子激活基序VP16的下游，转化水稻品种‘kitaake’，从而改良水稻籽粒性状，如水稻籽粒宽度和厚度增加、粒重增加。同样地，将水稻转录因子Os06g08400基因的CDS序列通过Gateway系统构建到1~3个或4个以上转录因子激活基序VP16的下游，转化水稻品种，也能够达到改良水稻籽粒性状的效果。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (6)
1.一种融合蛋白，其特征在于，该融合蛋白为（VP16）4-Linker-Os06g08400；
其中，Linker由1～20个柔性氨基酸串联而成；VP16为来自单纯疱疹病毒（Herpes simplex virus）的VP16蛋白，（VP16）4的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；Os06g08400为水稻转录因子Os06g08400，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.编码权利要求1所述融合蛋白的基因。
3.含有权利要求2所述基因的载体。
4.含有权利要求2所述基因的工程菌。
5.权利要求2所述的基因在改良水稻籽粒性状中的应用。
6.水稻转录因子Os06g08400基因在调控水稻籽粒性状中的应用，其特征在于，其是将水稻转录因子Os06g08400基因的CDS序列通过Gateway系统构建到4个转录因子激活基序VP16的下游，转化水稻，从而改良转基因水稻籽粒的性状；
其中，水稻转录因子Os06g08400的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，4个转录因子激活基序VP16所编码蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。
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