CN104046643B - 水稻转录因子Os01g60810基因CDS序列的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及水稻转录因子Os01g60810基因CDS序列的应用。在本发明中，首次将CaMV35S启动子与水稻转录因子Os01g60810基因的CDS序列进行融合，并将该融合基因转化到水稻中，从而改良水稻株高和茎粗的性状，例如水稻株高明显变矮、茎秆明显增粗。对于详细阐明水稻生长发育机理具有重要的理论价值，并且可以通过转基因手段，改良水稻的性状，因此在生产实践中具有重要意义。

Description

水稻转录因子Os01g60810基因CDS序列的应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及水稻转录因子Os01g60810基因CDS序列的应用。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是我国和全世界最重要的粮食作物之一，是世界一半以上人口的主食，也是单子叶植物功能基因研究的一个重要模式植物。与其相关的分子生物学和遗传学的研究一直倍受大量研究者们的重视，转录水平的调控是基因表达调控的重要方式。

株高是水稻的一个重要农艺性状之一，其主要由水稻节间的伸长调节，它与植株的丰产潜力、抗病虫害、抗倒伏、光合强度和肥料的耐久性密切相关。直到上世纪60年代,水稻半矮秆基因sd1(semi-dwarf)的应用，带来了农业生产的第一次“绿色革命”，这成为了矮化育种的重要标志，这在水稻育种史也是前所未有的重大突破，此后，大量的矮秆基因的发掘、遗传、定位方面的研究受到广大研究者的重视。近年来在水稻中也相继出现与株高相关的研究报道。Ashikari等(1999)利用图位克隆方法分离出水稻D1基因，该基因的隐性突变等位基因d1导致水稻呈现为矮杆表型。研究表明，D1是通过编码一种GTP结合蛋白的α亚基来参与赤霉素信号传导，而d1由于缺失了这种编码功能而导致赤霉素信号传导受阻，使水稻发生矮化。Yamamuro等(2000)通过克隆水稻矮秆基因d61，证明了该基因的作用是使油菜素内酯及其受体的合成受阻而造成植株的矮化表型。Zhi等(2003)克隆了水稻D2基因，通过对该基因的研究发现表明，D2基因是编码一个BR合成霉的中间体P450，而水稻矮秆基因d2则缺失了这种编码功能，使得BR合成受阻从而引起水稻植株的矮化。因此，开展控制水稻株高相关的研究将是水稻主要农业性状的遗传学研究和育种实践的重要内容。

茎秆性状是影响水稻产量的一个重要因素，目前用于评价水稻茎秆的性状的一些农艺性状如茎秆高度、茎秆粗细、茎秆节间长度、茎壁厚度，解剖性状如厚壁组织大、小和数量，维管束数量以及理化性状如木质素、细胞壁纤维素含量、硅与钾的含量和细胞中碳水化合物积累的数量等。近年来关于水稻茎秆各个性状的研究很多，其中茎秆粗度或直径是影响水稻倒伏的一个重要因素。邹德堂等(1997)研究认为，植株茎秆基部越粗，越不容易发生倒伏。肖应辉等(2005)研究表明，倒伏指数与茎杆粗细的相关系数达显著水平，这表明了水稻倒伏指数受茎粗细性状的显著影响。王秀凤等(2006)对水稻茎秆抗倒伏性构成因素做了深入分析，结果表明：遗传因子和栽培管理是影响水稻倒伏最主要的因素，并指出从遗传因子角度改良水稻抗倒伏能力比改善栽培管理条件更经济有效；此后，沈洪昌(2009)对水稻茎秆形态结构与倒伏性的相关性的研究也阐述了这一问题。

因此，鉴定和研究控制水稻株高和茎粗的基因，开展株高和茎粗克隆、基因定位及作用机理等方面的研究，实现对水稻株高和茎粗的改良，具有重要的理论意义与应用价值。

OVATE蛋白首先在番茄中被研究报道，该基因的一个点突变将导致其功能缺失，使番茄形状由圆形变为梨形，过量表达该基因还影响叶片、花和果实的生长和发育。Liu等(2002)研究表明，OVATE蛋白本身并不控制果实的形状，它是一种植物生长和发育抑制调节蛋白。Hackbusch等(2005)在拟南芥中过量表达该基因，过表达株系显示出发育迟缓、叶片、花和角果的生长发育受到抑制，花瓣萼片呈现卵圆形以及短角果等表型变化。Wang等(2007)对该家族基因进行了深入的研究，例如，AtOFPl是一个转录因子抑制子，调控一种控制细胞延伸的赤霉素合成酶基因表达，它的过表达会减小细胞长度，从而使其下胚轴、子叶、叶片、花器官、角果表现均变短的表型变化，同时AtOFP2与AtOFP7也有相似的表型。Li等(2011)研究表明，AtOFP4与生长发育相关基因KNAT7能发生相互作用共同调控次生细胞壁的形成，从而调控植物的生长和发育。该结论为解释过表达拟南芥的表型变化提供了新的理论依据。水稻中尚未见OVATE蛋白的相关研究报道，水稻转录因子Os01g60810是水稻OVATE蛋白家族成员之一，因此，研究它在水稻中的调控机制以及功能具有非常重要的理论意义与应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供水稻转录因子Os01g60810基因CDS序列的应用。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种融合基因，其为CaMV35S启动子-Linker-Os01g60810。

其中，CaMV35S启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；Os01g60810为水稻转录因子Os01g60810基因的CDS序列，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；Linker序列为5'-CTAGAGTTATCAACAAGTTTGTA-3'。

本发明还提供在严格条件下，可与该融合基因的核苷酸序列发生杂交的核苷酸序列。所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜。

本发明还提供含有所述融合基因的载体(例如，植物双元表达载体pCambia1390)、工程菌及细胞系。

所述载体的构建方法如下：

(1)在植物转录因子数据库(http://rice.plantbiology.msu.edu/analyse_search_locus.shtml)中找到Os01g60810基因，根据其CDS序列设计PCR扩增引物对，其为正向引物F5'-CAAAAAAGCAGGCTTCATGGGGAGGCACAAGTTCAGG-3'和反向引物R5'-CAAGAAAGCTGGGTCCATCTTGATGTCCGCGAGGTTG-3'。

(2)以野生型‘日本晴’水稻总cDNA为模板，利用上述引物F和R进行PCR，获得Os01g60810基因完整的CDS序列。

(3)将上述PCR产物克隆到pDONR克隆载体上，经测序鉴定得到与目的基因完全相同的序列。

(4)通过LR反应将Os01g60810基因的CDS序列构建到其由花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子驱动的植物双元表达载体上，获得组成型过表达载体35S:Os01g60810，其全序列如SEQ ID No.3所示。

上述组成型过表达载体35S:Os01g60810可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中(Weissbach，1998，Methodfor Plant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，第411-463页；Geiserson和Corey，1998，Plant Molecular Biology，第二版)。

本发明还提供一种转基因水稻植株的构建方法，具体为：采用农杆菌介导的方法，将上述携带有编码所述组成型水稻转录因子35S-Linker-Os01g60810基因的表达载体转入水稻愈伤组织中，用含诱导剂和农杆菌的AAM培养液进行转化，转化后的材料经过共培养-筛选-分化-生根-炼苗和移栽，筛选转基因水稻植株。

本发明还提供用于扩增水稻转录因子Os01g60810基因CDS序列的引物对，包括正向引物F5'-CAAAAAAGCAGGCTTCATGGGGAGGCACAAGTTCAGG-3'和反向引物R5'-CAAGAAAGCTGGGTCCATCTTGATGTCCGCGAGGTTG-3'。

本发明进一步提供水稻转录因子Os01g60810基因CDS序列在调控水稻株高、茎粗(例如，抑制水稻株高，增加水稻茎粗)中的应用。将水稻转录因子Os01g60810基因的CDS序列去掉终止密码子之后，构建到CaMV35S启动子的下游，转化水稻，从而改良转基因水稻植株性状。

前述的应用，其是将水稻转录因子Os01g60810基因的CDS序列去掉终止密码子之后，通过Gateway系统构建到CaMV35S启动子的下游，转化水稻，从而调控水稻株高、茎粗等性状。

本发明首次将玉米CaMV35S启动子与水稻转录因子Os01g60810基因的CDS序列进行融合，并将该融合基因转化到水稻中，从而改良水稻株高和茎粗的性状，例如抑制水稻株高，增加水稻茎粗。对于详细阐明水稻生长发育机理具有重要的理论价值，并且可以通过转基因手段，改良水稻的性状，因此在生产实践中具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例1中构建的组成型过表达载体35S:Os01g60810的质粒图谱。

图2为本发明实施例3中过表达Os01g60810转基因水稻株系的基因组PCR鉴定结果。

图3为本发明实施例4中过表达Os01g60810转基因水稻的株高性状表型改变(A)和考种数据分析(B)；其中,WT表示野生型水稻‘kitaake’，35S:Os01g60810表示35S:Os01g60810转基因水稻株系。

图4为本发明实施例4中过表达Os01g60810转基因水稻植株的茎粗的改变(A)和考种数据分析(B)；其中，WT表示野生型水稻‘kitaake’，35S:Os01g60810表示35S:Os01g60810转基因水稻株系。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1Os01g60810基因CDS序列的获得及植物表达载体的构建

1.Os01g60810基因CDS序列的获得

在植物转录因子数据库(http://rice.plantbiology.msu.edu/analyses_search_locus.shtml)中找到Os01g60810基因，根据其CDS序列设计PCR扩增引物，正向引物F5'-CAAAAAAGCAGGCTTCATGGGGAGGCACAAGTTCAGG-3'和反向引物R5'-CAAGAAAGCTGGGTCCATCTTGATGTCCGCGAGGTTG-3'。以野生型‘日本晴’水稻总cDNA为模板，利用引物F和R进行PCR，获得Os01g60810基因完整的CDS序列(Seq I D No.1)。

2.植物表达载体的构建

将水稻转录因子Os01g60810基因的CDS序列通过Gateway系统构建到CaMV35S启动子(SEQ ID No.2)的下游。

2.1将上述PCR产物克隆到pDONR克隆载体上

按照PrimeSTAR聚合酶扩增体系和反应程序进行PCR。此过程中包含两轮PCR，第一轮PCR的引物用加部分adaptor attB接头的基因引物(F和R)，而第二轮的模板用第一轮的PCR产物，并且引物用完整的adaptor attB引物(attB-adaptor-F：5'-GTGGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC-3'，attB-adaptor-R：5'-GTGGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC-3')。将PCR产物克隆到pDONR克隆载体(购自Invitrogen)上，经测序鉴定得到与目的基因完全相同的序列。

2.2植物表达载体的构建

通过LR反应将Os01g60810基因的CDS序列构建到其由CaMV35S驱动的植物双元表达载体pCambia1390上，获得组成型过表达载体35S:Os01g60810，其全序列如SEQ ID No.3所示，载体图谱见图1。

LR反应体系如下：

于25℃反应过夜。用反应体系转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆。实施例2转基因水稻植株的获得

取水稻‘kitaake’成熟种子，人工或机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子经消毒之后接种到诱导培养基上进行诱导培养。选择外观良好，生长力好的水稻愈伤组织为受体材料，采用农杆菌介导法将35S:Os01g60810转入水稻愈伤组织中，用含有100μM的乙酰丁香酮和OD值为0.7的农杆菌的AAM培养液进行转化，将转化液浸泡过的愈伤组织置于共培养基上进行共培养，25℃暗培养3d后置于加有35mg/L潮霉素筛选培养基上培养约30d，每10d继代一次。然后将筛出的抗性愈伤转移到分化培养基上分化约20d，每10d继代一次。将分化出绿色小苗的抗性愈伤转移到生根培养基上生根，待约7d长出发达根系后炼苗，并计算转化所获转基因苗数。共获得20个转基因植株。炼苗7d后转移至大田生长。

本实施例中涉及的培养基配方如下：

诱导培养基：N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+铜钴母液+2.5mg/L2,4D+0.6g/L酸水解酪蛋白+2.878g/L脯氨酸+0.5g/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖，以水配制，调pH至5.8～5.9后加入植物凝胶4g/L。

共培养基：N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+2.5mg/L2,4D+0.5g/L谷氨酰胺+0.6g/L酸水解酪蛋白+10g/L葡萄糖+30g/L蔗糖，以水配制，调pH至5.2后加入植物凝胶4g/L。灭菌后，50℃左右加入AS(乙酰丁香酮)100～200μg/mL。

筛选培养基：N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+铜钴母液+2.5mg/L2,4D+0.6g/L酸水解酪蛋白+2.878g/L脯氨酸+0.5g/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖，以水配制，调pH至5.8～5.9后加入植物凝胶4g/L。灭菌后加入35mg/L潮霉素(购自上海纽津生物技术有限公司)。

分化培养基：MS无机+MS-B5微量+MS有机+铁盐+MS-铜钴母液+0.05mg/L NAA+2.0mg/L Kinetin(激动素)+30g/L山梨醇+2g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖，以水配制，调pH至5.8～5.9后加入植物凝胶4g/L。

实施例3转基因阳性株系的鉴定

为检测实施例2中获得的35S:Os01g60810转基因水稻株系的T2代水稻株系中基因的过表达情况,用adaptor attB接头引物检测转基因株系，检测引物如下：

正向引物F5'-GTGGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC-3'

反向引物R5'-GTGGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC-3'

进行PCR检测，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示，出现明显的特异性条带。其中，WT表示野生型水稻‘kitaake’，35S:Os01g60810-1，35S:Os01g60810-2和35S:Os01g60810-3表示35S:Os01g60810转基因水稻株系。

实施例4转基因水稻表型分析和考种分析

将实施例2中获得的转基因水稻株系(35S:Os01g60810)与野生型‘kitaake’水稻进行比较，从表型上可以明显的看出，转基因水稻株高明显变矮(图3)，转基因水稻茎粗明显增加(图4)。数据分析表明，转基因水稻株高、茎粗与野生型水稻相比变化显著。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献

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Claims (2)

1.水稻转录因子Os01g60810 基因CDS序列在调控水稻株高和茎粗中的应用，所述水稻转录因子Os01g60810 基因的CDS序列如Seq ID No.1所示；

所述调控水稻株高和茎粗是指抑制水稻株高和增加水稻茎粗；

其是将水稻转录因子Os01g60810 基因的CDS序列去掉终止密码子之后，构建到CaMV35S启动子的下游，转化水稻，从而改良转基因水稻植株性状。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，其是将水稻转录因子Os01g60810 基因的CDS序列去掉终止密码子之后，通过Gateway系统构建到CaMV 35S启动子的下游。