CN101450965A

CN101450965A - 水稻花器官分化与发育控制基因ps及其应用

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Publication number: CN101450965A
Application number: CNA2007100099445A
Authority: CN
Inventors: 段远霖; 吴为人; 王�锋; 刘华清; 刁志娟; 蔡美双; 兰涛
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2007-12-07
Filing date: 2007-12-07
Publication date: 2009-06-10

Abstract

本发明从水稻雄蕊雌蕊化突变体中克隆并鉴定了控制水稻花器官分化与发育的基因PS。转基因功能互补实验证明PS是控制水稻花器官分化与发育的基因。氨基酸序列分析比较表明PS属于zinc－finger类转录因子。该基因在阐述转录水平调控花器官分生组织发育，特别是雄蕊和雌蕊发育具有十分重要作用。PS对水稻的营养生长没有影响，利用基因工程技术有目的地调控该基因在水稻花器官分生组织中的表达，可培育出无雄蕊或少雄蕊、多雌蕊等水稻新种质，从而可提高水稻的产量、提高杂交制种质量和降低生产成本等。因此，该基因具有十分重要的应用价值和广阔的应用前景。

Description

水稻花器官分化与发育控制基因PS及其应用

技术领域本发明涉及植物基因工程领域。具体的说，涉及一种利用图位克隆技术克隆水稻PS(pistilloid-stamen)基因，以及利用转基因互补实验验证该基因的功能；同时还涉及利用该基因或其功能的同源序列基因的载体和涉及利用该基因或其功能类似物调控植株的花器官分化与发育，创造水稻新种质，提高水稻等作物的产量，降低生产成本。

背景技术植物的果实和种子是人类食物的主要来源，它们都是植物生殖发育的产物，而植物生殖发育的关键是花的形成。因此，对花发育分子遗传的研究显得尤为重要。目前，植物花发育调控的分子遗传机制已成为植物发育生物学的一个研究热点。而对植物花器官发育分子遗传机制的知识主要来自双子叶模式植物拟南芥和金鱼草，这主要归功于在拟南芥和金鱼草中发现了大量的花发育突变体。近十多年来，双子叶植物花发育分子遗传机制的研究取得了巨大的成就，先后克隆了上百个功能明确的花器官发育基因，提出了具有里程碑意义的花器官发育“ABC”模型(Coen etal.，1991)。此后，又先后提出了“ABCD”模型(Angenent et al.，1995；Colombo，1995；Theissen，2001)、“ABCDE”模型(Pelaz et al.，2000；Theissen，2001)和“四因子”模型(Theissen and Saedler，2001；Theissen，2001)，分别对“ABC”模型进行补充和完善。现已明确，这五类功能基因的绝大多数成员属于MADS-box基因家族。

水稻是我国乃至世界的主要粮食作物。水稻作为模式单子叶植物，是单子叶植物花发育研究的主要对象。尽管目前水稻等单子叶植物中均已经分离了多个决定花器官分化与发育的MADS-box基因和非MADS-box基因。但与双子叶植物相比，目前水稻等单子叶植物花发育分子遗传基础研究相对落后。同时，由于水稻等单子叶植物花分生组织和花器官组成与双子叶植物存在很大差异(双子叶植物的花从外到内依次是花萼、花瓣、雄蕊和心皮四轮花器官组成；水稻的颖花由1个外稃、1个内稃，2个浆片，6枚雄蕊和1个雌蕊组成)，提示两者的花发育分子遗传机制存在特异性。这些来自双子叶植物的知识是否完全适用于单子叶植物，目前尚缺少大量分子证据的有力支持。因此，开展水稻等单子叶植物花发育的分子遗传研究十分必要。而要真正揭示单子叶植物花器官发育的分子遗传调控机制还得依靠发掘出一系列相关突变体并开展深入研究。

水稻雄蕊雌蕊化突变体pistilloid-stamen(ps)是单基因隐性突变，符合孟得尔遗传规律。ps突变体的营养生长、枝梗原基发育和颖花的数目均正常，但花器官的1、3轮同时发生突变，第1轮的内外颖变窄、细、硬，完全不能闭合，内颖弯曲呈月牙形；第3轮的六枚雄蕊完全转化为雌蕊或肉质状的雌蕊-雄蕊嵌合体，表现为无雄蕊、多雌蕊。Luo等(2006)报道了ps突变体(其表型与我们获得的ps突变体存在较大差异，六枚雄蕊中只有部分雄蕊转化为雌蕊)并定位了PS基因，但至今未见进一步的研究报道。目前双子叶植物和其它单子叶植物中还没有类似ps突变体的报道，利用现有双子叶植物花器官发育模型不能对ps的突变特性作出合理的解释。

发明内容本发明的目的是提供一种从水稻突变体ps中克隆的新基因PS及其蛋白质，以及由此获得的转基因植物细胞，和利用所述基因对水稻穗部小花进行改造的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：提供一种水稻花器官分生组织控制基因PS编码的蛋白质，其具有Seq ID No.2所示的氨基酸序列。

作为本发明的一种改进：上述氨基酸序列还包括Seq ID No.2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸生成的衍生物。

本发明还提供一种编码上述两种蛋白质的基因，其具有Seq ID No.1所示的核苷酸序列。

作为本发明的一种改进，上述核苷酸序列还包括在Seq ID No.1所示的序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物。

本发明还提供一种包含上述基因的植物表达载体。

本发明还提供一种包含上述两种核苷酸序列的转基因植物细胞。

本发明还提供一种对水稻花器官分生组织进行改造的方法，包括用具有Seq ID No.1所示的核苷酸序列的基因转化水稻细胞，再将转化后的水稻细胞培育成植株，可用于培育多子房水稻、少雄蕊或无雄蕊的雄性不育系新种质。

进一步具体的说，本发明提供了一种从水稻突变体pistilloid-stamen中克隆的新基因PS，如Seq ID No.1所示的DNA序列，也包括与Seq IDNo.1所示的DNA序列至少有70％同源性的基因序列。本发明中的Seq IDNo.2所示的蛋白质属于single C₂H₂ zinc-finger类型的转录因子，其中包括进行一个或几个氨基酸替换、插入或缺失所获得的功能类似物。另外，也包括在Seq ID No.1中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物，具有相同功能的序列也能达到本发明的目的。

本发明的另一个目的是提供一种用PS基因进行高效的植物转化的方法，具体地说，本发明提供了Seq ID No.1所示的序列基因的载体，其中，如图4所示的pCAMBIA1301-PS，该载体可以表达由上述核苷酸序列编码的多肽或其同源类似物。

本发明还提供了一种利用植物表达载体转化植物细胞影响水稻花器官分生组织发育的方法。

实现本发明的具体技术步骤如下：

一.水稻雄蕊雌蕊化突变体ps的分离和遗传分析：

利用明恢86的幼胚进行组织培养，本发明获得了一个水稻雄蕊完全雌蕊化突变体ps，该突变体的营养生长、枝梗分化和颖花的数目均正常，但花器官的内外颖变窄、细、硬而不能闭合，内颖弯曲呈月牙形；六枚雄蕊完全转化为雌蕊或肉质状的雌蕊-雄蕊嵌合体。通过突变杂合体植株自交及野生型植株正反交实验，证明ps是一个符合单基因控制的遗传规律的隐性突变体，如图1所示。

二、图位克隆控制水稻花器官发育的基因PS：

1.PS的初步定位：

为了分离PS基因，本发明采用图位克隆的方法，首先创建了一个F₂定位群体，由PS杂合体(明恢86，PSps)为母本，选用ACC8558为父本(PSPS)杂交获得的F₂中的隐性个体组成。利用水稻SSR标记对PS基因进行初步定位见图2。定位结果表明，PS基因初步定位在第1染色体短臂末端介于RM462和RM84两个标记之间。

2.PS基因的精细定位：

通过对RM462和RM84两个标记之间的BAC/PAC序列分析，开发出新的水稻SSR标记，将PS基因精细定位于如图3所示的PAC P0408F06上的SSR标记c和d之间约57Kb范围内，通过分析此区段开放阅读框(ORF)推测侯选基因。

3.PS基因的鉴定和功能分析：

如图5所示，本发明通过转基因技术获得了使突变体恢复正常表型的转基因水稻，证明了本发明正确克隆了PS基因；氨基酸序列分析表明，PS编码single C₂H₂ zinc-finger domain蛋白，属于zinc-finger类转录因子基因。

水稻是我国乃至世界的主要粮食作物。水稻生产在我国国民经济中占有举足轻重的地位，是我国第一大栽培作物，播种面积约为3100万公顷，总收获量在2.0亿吨左右，约占我国粮食总产量的40％。但目前存在耕地面积减少的趋势，迫切需要培育高产水稻品种。基因工程技术的发展使得应用PS基因调整水稻花发育方式和穗部结构成为可能。本发明获得的水稻雄蕊完全雌蕊化突变体ps，是单基因隐性突变，符合孟得尔遗传规律。本发明通过图位克隆技术获得了PS基因，并通过功能互补实验鉴定了该基因的功能。氨基酸序列分析表明，该基因属于zinc-finger类转录因子，其在阐述基因转录水平调控花器官发育方面具有重要作用。该基因对水稻的营养生长没有影响，可以利用基因工程技术有目的地调节它在水稻雄蕊和雌蕊分化与发育过程中的表达量，进而可培育出无雄蕊或少雄蕊、多雌蕊的水稻新种质，从而可提高水稻的产量、提高杂交制种质量、降低生产成本。因此，该基因具有非常重要的应用价值和广阔的应用前景。

附图说明下面结合附图对理解本发明作进一步的详细描述，但并非对本发明作限定。

图1是水稻突变体ps与野生型明恢86的小花表型及其花器官结构图。其中1a是野生型明恢86与突变体ps的小花表型；1b显示野生型明恢86的花器官结构；1c与1d显示ps突变体的花器官结构。

图2是PS基因在水稻第1染色体上的初步定位图；

图3是PS基因精细定位图；

图4是pCAMBIA1301-PS载体图谱；

图5是功能互补实验T₀代转基因水稻小花图。其中ps是水稻雄蕊雌蕊化突变体小花，PS/ps为T₀代转基因水稻小花。

具体实施方式

实施例1：水稻花器官分化与发育控制基因PS的图位克隆

1.水稻材料：

水稻(Oryza sativa ssp minghui86)突变体ps(pistilloid-satmen)，原始野生型材料为明恢86。该突变体为本发明者从明恢86的幼胚组织培养再生植株的后代中获得。

2.分析和定位群体：

突变杂合体PSps与野生型品种ACC8558进行杂交，F₁代自交，得到F2群体，在抽穗期选出1208个ps突变表型的植株作为定位群体。于抽穗期每株取1克左右的叶片，用来提取总DNA。

3.利用水稻SSR标记定位PS基因：

采用水稻微量法快速抽提水稻的总DNA。取大约0.3克水稻叶片，放入1.5ml离心管中经液氮快速冷冻，用小塑料研棒研成粉末后提取DNA，获得的DNA溶于100ul超纯水中。每一个20ul的反应体系中加入1ul DNA样品。

在PS基因的初步定位实验中，利用DNA池的定位方法，选100个F2群体中的突变体个体进行SSR分析。根据公布的水稻SSR遗传图谱，按照一定的遗传距离，均匀选取分布于各条染色体上的SSR引物，根据已知的反应条件进行扩增，然后在6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上分离和硝酸银染色，检测PCR产物的多态性，将PS基因初步定位在水稻第1染色体短臂的RM462和RM84两个标记之间。

在精细定位PS基因时，对F2群体中的1208个突变体个体进行SSR分析。

根据分子标记RM462和RM84之间的BAC/PAC序列分析，利用已公布的水稻基因组序列，设计了9对新的水稻SSR标记，其中4对在两个亲本间有多态。用这4对有多态的SSR标记对F2群体中的1208个突变体个体进行了连锁分析。这4对SSR的引物序列为：

a-1 TGAGCGAGAGAACGCTTTG

a-2 TAACAGAGCGAGAAGGGCA

b-1 TGGGATAAACCGTAAGGGCT

b-2 GTGCTCTGTCGCTATGACTG

c-1 GTGACGTTTCAGGCTTTGGT

c-2 TCTTTCAGGCAGCGTGTTCT

d-1 CAGGAAGTGTGTGTGTGTGTG

d-2 AGGAGTAGTTGGGGTGGTAGA

4.基因预测与比较分析

根据精细定位的结果，PS基因位于PAC克隆P0408F06上的两个SSR标记c和d之间约57Kb范围内。根据Rice Automated Annotation System(http://RiceGAAS.dna.affrc.go.jp)的预测，发现此区间有6个ORF，其中5个是“hypothetical protein”或“unknown protein”，1个是zinc-finger基因。对5个功能未知基因进行基因组序列分析表明，野生型与突变体之间的基因组序列完全一致，说明这5个功能未知基因都不可能是PS基因。然后在zinc-finger基因不同区域设计引物，采用PCR的方法分别扩增ps突变体和对应的野生型明恢86的基因组序列，结果发现ps突变体中该zinc-finger基因发生缺失。进一步设计一对引物(上游引物：TTGGATCATGGTGAGGGAGA；下游引物：ATGGTGCAGAGTGACGACA)进行PCR扩增和测序，对ps突变体基因组缺失进行确认。结果野生型扩出9220bp，ps突变体只扩出1166bp。测序结果表明，ps突变体在此zinc-finger基因区域共缺失了8054bp，其中5’^-端起始密码子ATG前缺失4492bp，基因区1416bp完全缺失，3’^-末端终止密码子TGA后缺失2146bp。

根据PAC克隆P0408F06序列的基因注释信息，此基因编码singleC₂H₂ zinc-finger domain蛋白，属于zinc-finger类转录因子基因。拟南芥的JAGGED基因也属于single C₂H₂ zinc-finger基因，该基因影响拟南芥的叶片、萼片、花瓣和雄蕊的发育(Dinneny et al，2003)。

实施例2 遗传转化

根据籼稻明恢86基因的序列，在候选的single C₂H₂ zinc-finger基因区和启动子区分别设计带有酶切位点的引物，分两个区段进行高保真PCR扩增并测序，挑选序列完全正确的克隆，利用共有的Kpn1位点将它们连接成3.49Kb的片段，该片段包含起始密码子ATG上游的2074bp和基因全长1416bp。将上述3.49Kb的片段经酶切和连接，构建成如图4所示的表达载体，再将其转入农杆菌中。

启动子PCR扩增所用引物是：

上游引物：5’CGG AATTCTGTGAGAGAGAAAGAGTGGGA

下游引物：5’GGGGTACCGCGAAGAAGAAGAAGAAGAGG

PCR扩增基因所用引物是：

上游引物：5’GGTACCCGCTATGAACTCATCAAGGA

下游引物：5’GGATCCTCAGGAGGCGGCGTTCACGT

利用愈伤侵染法技术转化突变杂合体(明恢86)自交后代的幼胚(水稻开花10-15天左右)诱导的愈伤组织。这些愈伤组织的基因型有三种：PSPS、PSps和psps。根据ps突变体中该基因缺失序列的长度，设计两对引物，将PSPS和PSps基因型和psps基因型的愈伤组织完全区分开，将鉴定出的psps基因型的愈伤组织用于互补实验。这两对引物序列为：

引物1 上游：TTGGATCATGGTGAGGGAGA

下游：ATGGTGCAGAGTGACGACA

引物2 上游：TGACTCTCGGGGAAGCTACT

下游：ATGGATTTCGCTGTTGGG

幼胚诱导的愈伤组织经过2～3次的继代，挑选生长迅速、颜色鲜黄、表面光滑、质地致密、直径大小为2-3mm的胚性愈伤组织颗粒作转化的受体。用含有双元质粒载体的EHA105菌株浸染水稻愈伤，置25℃条件下暗培养3天后，在含有30mg/L Hygromycin的筛选培养基上培养15天，后再重复筛选培养一次；30天后，将筛选出的愈伤组织转至含有50mg/L Hygromycin的筛选培养基上继续筛选一周。将继续增生分裂的抗性愈伤转入分化培养基上于光照条件下培养，一周后愈伤开始转绿，三周后开始长出幼芽和根，当芽长至2-3cm时，移至1/2MS培养基上，待幼苗在生根培养基上生长10天后，在水中炼苗三天，移至大田。对突变体幼胚转基因后的再生植株进行鉴定和连续的观察，转基因水稻营养生长正常，与野生型比较没有明显区别。如图5所示，抽穗期穗部小花的花器官形态正常，与同一生长阶段的突变体比较，雄蕊雌蕊化的突变表型完全消失，小花恢复正常。

以上所述仅为本发明的若干个具体实施方式，应当指出，对与本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Untitled.ST25

SEQUENCE LISTING

序列表

<110>福建农林大学

<120>水稻花器官分化与发育控制基因PS及其应用

<130>

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>792

<212>DNA

<213>水稻

<400>1

<210>2

<211>263

<212>PRT

<213>水稻

<400>2

Claims

1、一种水稻花器官分生组织控制基因PS编码的蛋白质，具有Seq ID No.2所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的蛋白质，其氨基酸序列还包括在SeqID No.2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸生成的衍生物。

3.一种编码权利要求1或2所述蛋白质的基因，具有Seq ID No.1所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的基因，其核苷酸序列还包括在Seq IDNo.1所示的序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物。

5.一种含有权利要求3或4所述基因的植物表达载体。

6.一种含有权利要求3或4所述基因的转基因植物细胞。

7.一种改良水稻花器官分生组织的方法，包括用具有Seq ID No.1所示的核苷酸序列的基因转化水稻细胞，再将转化后的水稻细胞培育成植株。