CN102268081B - 水稻侧根控制基因OsIAA11及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水稻侧根控制基因OsIAA11编码的蛋白质，其具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。本发明还同时公开了编码上述蛋白质的基因，该基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。本发明的基因能用于构建具有水稻侧根控制功能的转基因水稻。由于侧根的正常发生发育对维持水稻生长发育以及高产稳产是必不可少的，而且该基因仅影响侧根发生发育，因此在分子育种中存在较大的应用潜力。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程领域。具体的说，本发明涉及一种图位克隆技术克隆的水稻OsIAA11基因的基因组序列，功能获得性转基因实验和自身抑制突变体的筛出证明该基因控制侧根的发育。
背景技术
从土壤中吸收水分和营养以及锚定是植物根系的两大基本功能。正确的根形态建成对于执行其两大基本功能是必不可少的，而水稻作为研究根系的第二大模式植物，有着更加重要的农业生产意义。全世界有25亿人以水稻作为主要的粮食，全球约有9％的可用耕地用于种植水稻。水稻占人均能量消耗的21％和人均蛋白摄入的15％。水稻属于单子叶禾本科作物，其根系构型为须根系。种子萌发后产生种子根，但种子根一般会退化甚至消亡，同时可在根茎结合部产生很多不定根，种子根和不定根上都可以进一步分化出侧根(严小龙等2007)。
由于侧根庞大的数量，极大的增加了水稻从外界吸收水分和矿物质的能力。
水稻的侧根发生源自临近原生韧皮部的中柱鞘细胞的分裂。发育的过程相比拟南芥侧根的发育过程，也比较相似。首先两个临近的中柱鞘细胞进行垂周分裂，继而进行多次的垂周、平周分裂，原基逐渐膨大，并逐步穿过皮层，到最终突破表皮。水稻的侧根还有大小侧根之分。小侧根呈现出一定的生长模式，数量很多。而直径大一些的侧根也能被观察到，称为大侧根。大侧根生长上没有固定的模式，直径比主根小，数量少。且大侧根的上面还可以再长侧根，而小侧根是不会再长侧根(Kawata Shin-ichiro，1976；Rebouillat etal.，2009)。
到目前为止，在拟南芥中有关IAA调控侧根发育已有很多分子水平的研究，如IAA3(Tian and Reed，1999)，IAA14(Fukaki et al.，2002)，IAA18(Uehara et al.，2008)，IAA19(Tatematsu et al.，2004)and IAA28(Rogg et al.，2001)。但在单子叶作物中的研究却是鲜有报道。仅有最近玉米中报道了一个Zmrum突变体，这个基因的突变造成玉米缺少胚根，主根生长受到抑制且侧根也大量减少，但是茎生根上的侧根发育却是正常(Von Behrens et al.，2011)。
参考文献具体如下：
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10、Von Behrens I，Komatsu M，Zhang Y，Berendzen KW，Niu X，Sakai H，Taramino G，Hochholdinger F(2011)Rootless with undetectable meristem 1 encodes a monocot-specificAUX/IAA protein that controls embryonic seminal and post-embryonic lateral root initiationin maize.Plant J 66：no.doi：10.1111/j.1365-313X.2011.04495.x(Von Behrens I，Komatsu M，Zhang Y，Berendzen KW，Niu X，Sakai H，Taramino G，Hochholdinger F(2011)玉米中Rootless with undetectable meristem 1编码了一个单子叶植物特异的AUX/IAA蛋白，这个蛋白控制胚根以及胚后侧根的起始.植物杂志66：no.doi：10.1111/j.1365-313X.2011.04495.x)。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种水稻侧根控制基因OsIAA11及其应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种水稻侧根控制基因OsIAA11编码的蛋白质，其具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
作为本发明的蛋白质的改进：氨基酸序列还包括在SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个氨基酸生成的衍生物。
本发明还同时提供了一种水稻侧根控制基因OsIAA11(即编码上述蛋白或其功能类似物的基因)，该基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
作为本发明的基因的改进：核苷酸序列还包括在SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸生成的突变体、等位基因和衍生物。
本发明还同时提供了上述基因的用途，用于构建具有水稻侧根控制功能的转基因水稻。
本发明还同时提供了一种转基因植物细胞，为包含上述核酸的转基因植物细胞。
本发明的提供一种从水稻侧根突变体Osiaa11中克隆的新基因OsIAA11，如SEQ IDNO：1所示的基因组DNA序列，也包括与SEQ ID NO：1所示的基因组DNA序列至少有80％同源性的基因序列。本发明中的SEQ ID NO：2所示的蛋白质序列，其中进行一个或几个替换，插入或缺失所获得的功能类似物。另外，也包括在Seq ID No.1中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物，具有相同功能的序列也能达到本发明的目的。
本发明的另一个目的是提供一种用OsIAA11基因进行高效的植物转化的方法，具体地说，本发明提供了具有Seq ID No.1所示的序列的基因片段的载体。
本发明的发明人通过EMS处理的Kasalath突变体库筛选到水稻侧根缺陷突变体Osiaa11，并且克隆了控制不定根发育的OsIAA11基因。IAA11与动物和拟南芥中的IAA14同源性最高(Jain et al.，2006)。在拟南芥研究中，该基因突变侧根几乎缺失、根毛大量减少，地上与地下部分重力反应迟缓(Fukaki et al.，2002)。而水稻中Osiaa11的除了侧根外，其他性状基本正常。
本发明是首次发现OsIAA11具有控制水稻侧根发育的功能，由于侧根的正常发生发育对维持水稻生长发育以及高产稳产是必不可少的，而且该基因仅影响侧根发生发育，因此在分子育种中存在较大的应用潜力。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1是水稻侧根缺陷突变体Osiaa11的表型图。
A，7天苗龄的野生型(左)，纯合突变体(中)和杂合突变体(右)的全株照，bars＝2cm。B-C，7天苗龄的根毛表型。B，野生型；C，纯合突变体，bar＝1mm；D，21天苗龄的野生型(左)以及纯合突变体(右)，bars＝4cm。E-F，2个月苗龄的根局部。E，野生型；F，纯合突变体；G，纯合突变体的重力反应。H-I，根横切观察结构。H，野生型；I，纯合突变体，bar＝50μm；J，根纵切观察侧根发生，野生型(左)和纯合突变体(右)bar＝50μm。野生型(n＝10)，突变体(n＝20)。
图2是OsIAA11基因的图位克隆及转基因验证图。
A，OsIAA11基因的图位克隆，RM5864，RM6266及RM5626为定位所用到的SSR标记，D10，G02，P0，N03以及H15为BAC克隆B1434D10，OSJNBb0070G02，OSJNBb0069P02，OSJNBa0010N03以及OSJNBa0066H15的缩写。OsIAA11基因的内含子用空白表示，外显子用实心方框表示。I，II，III和IV分别代表OsIAA11的四个结构域。B，根据突变位点设计的d-CAPS标记检测结果，左边为野生型，右边为纯合突变体。(C-E)，转基因回复验证结果。C，转基因载体构建结构图。D，转基因苗根表型，右边为空载体对照，右边为转基因苗。E，转基因植株侧根数目统计结果，**代表极显著差异。
图3是Iaa11自身抑制株系(Iaa11-R)的表型图。
A，iaa11-R基因结构及突变位点；B，iaa11-R自身抑制株系14天表型，箭头表示侧根；C，iaa11-R突变位点序列测定结果。
图4回复载体pCAMBIA1300NH-GFP的结构示意图。
具体实施方式
从本实验室发展的EMS(ethyl methylsulfonate)诱变的籼稻(Oryza Sativa L.ssp indica)地方品种Kasalath突变体库中筛选到一个水稻侧根发育缺陷突变体Osiaa11，该突变体是一个符合单基因控制遗传规律的半显性突变体(图1A)。组织切片分析发现其侧根发育停止在中柱鞘细胞第一次垂周分裂阶段(图1H，I，J)。
本发明采用基因图位克隆方法分离OsIAA11基因。首先创建了一个F2定位群体，由Osiaa11的纯合体为母本，野生型粳稻Nipponbare为父本杂交获得的F2中的隐性个体组成。并利用SSR(Simple Sequence Repeats)分子标记对OsIAA11位点进行初步定位。粗定位(30个F2突变个体)将突变基因定位于第3条染色体上的SSR标记RM6266附近(重组子为0/30)。我们将群体扩大到103个，将定位区间锁定在SSR标记RM5864(重组子为9/103)，RM6266(重组子为1/103)，RM5626(重组子为10/103)。定位结果表明，OsIAA11初步定位在第3染色体短臂介于RM6266和RM5626两个标记之间。我们对该区间的候选基因进行测序分析，发现突变体和野生型的IAA11基因的ORF存在差异，在突变体中，该基因的ORF第317个碱基的C突变成了T(图2A)，从而导致氨基酸由脯氨酸变为亮氨酸，并得到dCAPs验证(图2B)。
为了进一步证明突变体突变表型是由OsIAA11的突变引起的。我们对突变体进行了功能获得性转基因(图2D-E)，包括IAA11基因启动子约3K及IAA11基因组ORF约3.1K的序列被克隆到双元植物转基因载体pCAMBIA1300NH-GFP中。将构建好的载体通过农杆菌介导转化野生型愈伤，经T1代以及T2代转基因苗的遗传分离规律可知转化了Osiaa11的野生型转基因材料模拟了突变体的表型(图2D、E)。另外，我们还从iaa11再突变的突变体库中，筛到一个侧根部分回复的突变株系。在14天时，这个回复突变株系(命名为iaa11-R)，能够产生少量的侧根(突变体则是完全的无侧根)。测序结果显示，这个回复突变是IAA11的自身突变造成的。在IAA11的第三结构域，ORF上的第461bp(以ATG的A处为1)处由A突变为T，氨基酸则由Q(天冬酰胺)变为L(亮氨酸)(图3)。上述结果证明了该突变体的确是由于OsIAA11的突变引起的，表明本发明获得了使野生型侧根减少的转基因水稻。
上述结果表明，我们克隆的水稻OsIAA11基因具有一定的应用价值，可以通过利用该基因对作物品种进行转基因改造。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。
实施例1，突变体的筛选和表型
以EMS诱变的Kasalath突变体库为突变体筛选对象，M2代种子用蒸馏水冲洗干净，0.6％(v/v)稀HNO3破休眠处理16hr，37℃暗处催芽至露白。将露白的种子播于水稻培养液(培养液配方为国际水稻所标准配方)上浮着的尼龙网纱上面，在温度为30/22℃(昼/夜)左右、光照12小时条件下，培养7天，以侧根(包括长度、数量等)的改变为筛选标准进行突变体的筛选，从中筛选到一个无侧根的突变体(图1A-F)，即，水稻侧根发育缺陷突变体Osiaa11。
实施例2，基因定位
F2定位群体是由纯合体(Osiaa11)为母本和野生型粳稻品种Nipponbare为父本杂交获得的，总共鉴定出186侧根缺陷表型的F2个体，采用水稻微量DNA的快速提取方法从水稻叶片中提取用于基因定位的基因组DNA。取大约2cm水稻幼嫩叶片，经液氮冷冻，在1.5ml的离心管中将叶片磨成粉末，提取总DNA，获得的DNA溶解于200μl无菌水中。每个SSR和STS反应用2μl DNA样品。
1)、在OsIAA11基因的初步定位试验中，对30个F2个体进行SSR分析。根据公布的粳稻和籼稻创建的分子遗传图谱，选取近似均匀分布于各条染色体上的SSR引物，根据已知的反应条件进行PCR扩增，然后在7％的丙烯酰胺凝胶电泳分离，检测PCR产物的多态性。
1、SSR引物
RM6266 CCGTCACCTTCTTGAGAAGC
GACATCGAGAGCGAGGACAG
RM5864 ATTAGTACCGTGTGGTCCGC
GACCGAATTGGTGATCGATC
RM5626ATCAGTCGGTCATAAACGCC
ACCTTCCTCTTCTGCTGCTG
2 PCR反应体系：
反应条件为：95℃先变3min；然后进入循环反应即94℃，30s；58℃，30s；72℃，30s，循环数为35，最后再延伸5min结束。
3、粗定位结果表明(30个F2突变个体)，突变基因定位于第3条染色体上的SSR标记RM6266附近(重组子为0/30)。
2)、在精细定位OsIAA11基因时，对由103个F2个体组成的群体进行SSR分析。具体内容如下：
我们将群体扩大到103个，将定位区间锁定在SSR标记RM5864(重组子为9/103)，RM6266(重组子为1/103)，RM5626(重组子为10/103)。将基因定位在第3染色体短臂介于RM6266和RM5626两个标记之间。我们对该区间的候选基因进行测序分析，发现突变体和野生型的IAA11基因的ORF存在差异，在突变体中，该基因的ORF第317个碱基的C突变成了T(图2A)，从而导致氨基酸由脯氨酸变为亮氨酸，该结果得到dCAPs验证(图2B)。
实施例3，基因预测和序列分析
根据精细定位的结果，OsIAA11基因位于BAC克隆OSJNBb0069P02上RM6266和RM5626范围之内(图2A)。根据TIGR(http://www.tigr.org/tdb/e2k1/osa1/)的水稻基因注释信息，对定位的染色体区段内基因预测分析，该区间有2个AUX/IAA基因。用Kasalath野生型和Osiaa11突变体cDNA为模板对候选的2个基因进行扩增，扩增产物分别测序，测序结果进行比对分析，发现IAA11基因起始密码子ATG后第317bp处的碱基C突变成了T，从而导致氨基酸由脯氨酸变为亮氨酸，该点突变已得到dCAPs验证(图2B)。
实施例4，突变体中OsIAA11基因的获得性功能验证以及自身抑制突变体筛选。以Osiaa11基因组DNA为模板，用引物分段扩出iaa11基因全长，长度约为6.2kb的DNA片段，包括ATG前promoter区约3kb，基因编码区约3.1kb，到最后的终止密码子(不包括终止密码子)。扩增的引物序列为：
Promoter区扩增引物
上游引物：ATTGTCGACTTAGGGACCGGTGATGGACTTTA
下游引物：GCCTCTAGAATTCGATCTTCTCCAATGCAGC
Genomic区扩增引物
上游引物：ATATCTAGAATGGCTGGCCTCGGGTTC
下游引物：ATTGGTACCGACATAGGATCAACAAAAGA
利用PrimerSTAR DNA Polymerase把DNA全长分段扩增出来，PCR条件为95℃变性4min，然后进入循环反应，95℃30s，58℃30s，72℃4min，循环30次，最后再延伸7min结束。PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳并割胶回收目的条带，连接PEASY-Bluntsimple(全式金)载体，连接产物热击转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂板挑阳性单克隆，经测序正确后的克隆质粒Genomic-T质粒用XbaI和KpnI做双酶切，和经过XbaI和KpnI双酶切的pCAMBIA1300GFP-NH载体连接，然后以此为中间载体进行SalI和XbaI双酶切，和经过XbaI和SalI双酶切的promoter-T质粒片段进行连接反应。即把突变的Osiaa11基因片段连入双元载体pCAMBIA1300GFP-NH(可购自浙江大学)中。
以Osiaa11的基因组DNA为模板，用引物分段扩出iaa11基因全长，长度约为6.2kb的DNA片段，其中ATG前约3kb，基因长度约3.1kb，到最后的终止密码子(不包括终止密码子)。
最终确定：该基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。其中：带下划线的为外显子，其余为内含子。SEQ ID NO：3所示的为启动子序列。水稻侧根控制基因OsIAA11编码的蛋白质具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
最后与pCAMBIA1300NH-GFP的载体片段连接，电击转化电击感受态大肠杆菌DH5a。蓝白斑筛选挑选白斑进行菌液PCR检测，检测为阳性的克隆用M13正反向引物进行测序以确定其是否包含全部的基因组序列。将得到的正确克隆的质粒通过农杆菌菌株EHA105介导的水稻遗传转化体系导入到野生型中，经过侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗移栽，得到转基因植株。农杆菌(EHA105)介导的水稻遗传转化体系主要应用Hiei等人(1994)报道的方法基础上进行优化。所得到的转基因植株水稻侧根显著减少(图2D-E)，表明OsIAA11基因具有控制水稻侧根发育的功能。
另外，我们以Osiaa11为背景材料进行EMS突变，并从Osiaa11再突变的突变体库中，筛到一个侧根部分回复的突变株系(命名为iaa11-R)。在14天时，这个回复突变株系能够产生少量的侧根(突变体则是完全的无侧根)。测序结果显示，这个回复突变是IAA11的自身突变造成的。经测序分析发现在IAA11的第三结构域，ORF上的第461bp(以ATG的A处为1)处由A突变为T，氨基酸则由Q(天冬酰胺)变为L(亮氨酸)(图3)。
上述结果证明了该突变体(Osiaa11)的确是由于OsIAA11的突变引起的，也表明本发明获得了使野生型侧根减少的转基因水稻。
上述结果可以得到该突变体(Osiaa11)的确是由于OsIAA11的突变引起的。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (3)
1.水稻侧根控制基因OsIAA11编码的蛋白质，其特征是：为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
2.一种水稻侧根控制基因OsIAA11，其特征是：该基因为SEQ ID NO：1 所示的核苷酸序列。
3.权利要求2所述的基因的用途，其特征是：用于构建转基因水稻，所述转基因水稻侧根的发生发育受到控制。
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