CN104031928A

CN104031928A - 一种水稻根系伸长控制基因OsKASI及编码的蛋白质

Info

Publication number: CN104031928A
Application number: CN201410211595.5A
Authority: CN
Inventors: 朱世华; 丁沃娜; 林丽
Original assignee: Ningbo University
Current assignee: Shandong Kaiyi Gene Technology Co ltd
Priority date: 2014-05-19
Filing date: 2014-05-19
Publication date: 2014-09-10
Anticipated expiration: 2034-05-19
Also published as: CN104031928B

Abstract

本发明公开了一种水稻根系伸长控制基因OsKASI及编码的蛋白质，该蛋白的编码基因如序列表SEQIDNO：1所示的碱基序列，该蛋白的氨基酸序列如序列表SEQIDNO：2所示，是一个β-酮酰-酰基载体蛋白合酶I，与根系伸长相关；该碱基序列若发生突变，如1511位的胞嘧啶被胸腺嘧啶取代，编码的氨基酸序列的257位丙氨酸突变为缬氨酸，这样该蛋白就抑制根系的伸长，具体在植株表现为主根、不定根和侧根都变短。该蛋白及其编码基因的应用，可以为水稻的根系改良和杂交育种或转基因植物的开发创造条件。

Description

一种水稻根系伸长控制基因OsKASI及编码的蛋白质

技术领域

本发明涉及水稻生长发育，具体涉及一种水稻根系伸长控制基因OsKASI及编码的蛋白质。

背景技术

水稻根系是水稻的重要组成部分，其不但是地上部的物理支撑，同时也是水稻从地下吸收营养成分和水分的重要器官。水稻根系构型为须根系，能不断地从茎节最靠近中柱维管的分生区细胞发生不定根，最后由数量众多的不定根及其侧根构成了它的根系结构。根型由长度、数量和空间范围等几个参数决定，研究发现根长决定了其他根系性状的遗传表现，是所有根系性状中最重要性状，单株产量等7个地上部农艺性状与根长呈极显著正相关。根系伸长的主要细胞学基础之一是根尖分生组织的细胞分裂，根尖分生组织功能或结构的缺陷会导致短根发生。根系的伸长另外一个主要细胞学基础是根尖伸长区细胞的伸长，这与细胞壁形成、纤维素的合成和微管组织形成等相关。尽管根长对植物产量和抗性有重要的作用，但由于根系生长在土壤里加大了研究的难度，使对根系伸长的遗传背景和分子机理所知甚少，使得在水稻育种与栽培上，根长的因素并没有被充分利用。因此，重点挖掘控制水稻根长的基因，分离、克隆一系列控制根长的基因便于定向改良水稻根系性状，如授权公告号为CN102161985的发明专利，就公开了与水稻根系生长有关的基因KSR1,该基因KSRI及编码的蛋白质有些碱基和氨基酸发生突变，水稻根系表现为短根系。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种水稻根系伸长控制基因OsKASI及编码的蛋白质，该蛋白是β-酮酰-酰基载体蛋白合酶I，在氨基酸取代或缺失等情况下，能抑制水稻根系的伸长，使水稻出现短根系现象，可以为水稻的根系改良和杂交育种或转基因植物的开发创造条件。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种水稻根系伸长控制基因OsKASI，该控制基因OsKASI的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所示的DNA序列中一个或几个碱基对错义突变。SEQ ID NO：1序列由3387个碱基组成，自5端第88-90位为起始密码子，编码具有序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸残基序列的蛋白质(命名为OsKASI)，该OsKASI由465个氨基酸残基组成，为β-酮酰-酰基载体蛋白合酶I，氨基酸序列中一个或几个氨基酸错义突变。如所示的DNA序列中1511位的胞嘧啶(C)被胸腺嘧啶(T)取代，编码的氨基酸序列的257位丙氨酸(Ala)突变为缬氨酸(Val)，水稻根系表达为短根系。

该OsKASI可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

与现有技术相比，本发明的优点在于一种水稻根系伸长控制基因OsKASI及编码的蛋白质，该蛋白的编码基因如序列表SEQ ID NO：1所示的碱基序列，该蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示，是一个β-酮酰-酰基载体蛋白合酶I，与根系伸长相关；该碱基序列若发生突变，如1511位的胞嘧啶被胸腺嘧啶取代，编码的氨基酸序列的257位丙氨酸突变为缬氨酸，这样该蛋白就抑制根系的伸长，具体在植株表现为主根、不定根和侧根都变短。该蛋白及其编码基因的应用，可以为水稻的根系改良和杂交育种或转基因植物的开发创造条件。

附图说明

图1是野生型(WT)和OskasI突变体正常水培8天的表型比较，其中a：8天苗龄的WT和OskasI突变体的全株照，bar＝2cm。b和c：WT和OskasI的主根在体视镜下的观测结果，bars＝0.5mm。d：WT根成熟区纵切；e：OskasI突变体根成熟区纵切，bars＝100μm；

图2是OsKASI基因的图位克隆和基因结构；其中a：OsKASI基因的精细定位结果，RM6734和RM253为定位所用到的SSR标记，STS1、STS2和STS3为新发展的多态标记，P0528E04代表BAC克隆，Rec代表重组子；b：OsKASI基因结构和突变位点，非翻译区和内含子用实线表示，外显子用实心方框表示，箭头指示突变位点；

图3是功能互补实验图：野生型(WT)、OskasI突变体和两株T2代转基因回复株系(OV1和OV2)的表型图；

图4是超表达转化载体pCAMBIA1300改的结构示意图。

具体实施方式

以下结合附图、实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1突变体的表型及遗传分析

从甲基磺酸乙酯诱变的籼稻(Oryza Sativa L.ssp indica)品种Kasalath突变体库中筛选到一个水稻短根系突变体OskasI。8天苗龄的OskasI突变体的根系伸长受到严重抑制，主根、不定根和侧根都变短(图1a，b，c)，主根的组织切片分析发现突变体的细胞伸长受到抑制(图1d，e)。以突变体突变体OskasI为父本，与野生型Kasalath(WT)杂交，获得子一代F₁植株与野生型Kasalath完全一致，说明OsKASI为隐性突变。F₁代自花授粉所得的F₂中，正常植株与短根植株的分离比为168/60＝2.8，卡方检测结果为0.21<χ² _0.05,1＝3.84，正常植株与短根植株的比例符合一对基因控制的3：1分离比，表明该突变体是隐性单基因突变体。

实施例2OsKASI基因的定位

从突变体OskasI和Nipponbare的杂交后代F2中分离出短根突变个体，利用基因图位克隆法(Map-based Cloning)对突变基因进行定位。初定位(30个F2突变个体)将突变基因定位在第6染色体SSR标记为RM6734和RM253之间。之后，扩大定位群体，并在该区间内发展了3对有多态的新的STS分子标记，分别命名为STS1，STS2和STS3，序列如下：

STS1U-5’ACCAGGCTGAATGTATAGAT3’

STS1L-5’TTAGGCACATAAACCAAG3’

STS2U-5’AAAATTGTAGTGGGTTGGT3’

STS2L-5’TACAGAGAAAAAGATTGAAGC3’

STS3U-5’CAGTGATTCGTTTGAAAT3’

STS3L-5’CCCTGTTGTTTGTATGAC3’

最终将基因锁定在STS标记为STS2和STS3(第6染色体上具体物理位置分别为4873357bp和4926248bp)之间，重组子分别为1/1476和3/1476，且重组的号码不同。该区间有52.9kb大小(图2a)。

实施例3基因预测和序列分析

根据精细定位的结果，OsKASI基因位于BAC克隆P0528E04上(图2a)。根据TIGR (http://www.tigr.org/tdb/e2k1/osa1/)的水稻基因注释信息，对定位的染色体区段内基因预测分析，该区间共有7个预测的基因，用Kasalath野生型和OskasI突变体DNA模板对候选的7个基因进行扩增，扩增产物分别测序，测序结果进行比对分析，发现基因号为LOC_Os06g09630(β-酮酰-酰基载体蛋白合酶I)基因的DNA序列的1511bp的胞嘧啶(C)被胸腺嘧啶(T)取代，从而导致编码的氨基酸序列的257位丙氨酸(Ala)突变为缬氨酸(Val)。命名该基因为OsKASI。

实施例4OsKASI功能互补实验

根据OsKASI基因的CDS序列信息，设计扩增完整CDS的引物，引物序列如下(加下划线的为酶切位点)：

OsKASI-OVU：5’AAAGAGCTCATGCAGAGCCTCCTCCTCCCCA3’

OsKASI-OVL：5’AAATCTAGAGTAACGTTGCCGGCTGTC3’；

采用上海生工RNA提取试剂盒(SK1321)提取水稻kasalash叶片总RNA，以Oligo(dt)-18为引物，以所提取的总RNA为模板进行反转录合成第一链cDNA。以此cDNA为模板，利用PrimeSTAR HS DNA Polymerase扩增全长ORF，PCR条件：98℃预变性10s，然后进入循环反应(98℃10s，58℃10s，72℃，1min)，循环数为30，最后再延伸10min结束。琼脂糖电泳割胶回收PCR产物，连A尾纯化并连接到pMD19-T载体。连接产物热击转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，37℃培养16h后挑阳性单克隆测序，测序鉴定序列无误后用SacI和XbaI在37℃双酶切过夜，连入经同样双酶切的pCAMBIA1300改(35S)载体中(图4)，命名为35S-OsKSR4OVER。连接产物以相同的方法热击转化大肠杆菌DH5α感受态，涂布在含有kan抗性的LB平板培养16h后挑取单克隆，摇菌抽提质粒双酶切并通过琼脂糖胶检测正确后电击转化农杆菌EHA105；

酶切检测正确的质粒通过农杆菌株系EHA105介导的水稻遗传转化体系导入到突变体Oskas1中，经过侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗移栽，得到转基因植株。农杆菌(EHA105)介导的水稻遗传转化体系主要应用Hiei等人(1994)报道的方法基础上进行优化。该转基因植株中分离的OskasI突变体的根系长度回复成野生型(图3)，说明OskasI的表型确实是有OsKASI突变引起的；

为了检测表型回复的转基因阳性植株是否超表达了OsKASI基因，采用Trizol法分别提取Kasalath和2个转基因回复株系叶片的总RNA，逆转录成cDNA。半定量反应时，各样品的cDNA模板量先通过OsActin基因的表达量调成一致(扩增条件：58℃，26个循环)，再扩增目的基因。目的基因的上游引物序列(5’-3’)为：GGGCACAGAAAGATAACTCC；下游引物序列(5’-3’)为：CACAGTTCACGGCACC。PCR反应条件为：94℃预变性4min，然后进入循环反应即94℃，30s；58℃，30s；72℃，30s，28个循环。最后再延伸10min结束。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

<110> 宁波大学

<120> 一种水稻根系伸长控制基因OsKASI及编码的蛋白质

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3387

<212> DNA

<213>水稻根系伸长控制基因OsKASI

<400> 1

cgagcccaga cctccaccat cgccaccacc tccgcctcgt ttccatcgcc accacctcct 60

cccgccgccg ccgccgccac cgccgcgatg cagagcctcc tcctccccac cttcgccgcg 120

gcctccgccg cccccccgcg gagggggcgc gtgcctcccg ccggtcgcgc ctcggtctcc 180

gtgcgcgcgt ccgcgtccgc ggcggcggtg gcgccgagga gggagacgga tccgaggaag 240

agggtggtga tcacggggat ggggctggtg tccgtgttcg ggaacgacgt cgacgcctac 300

tacgaccgcc tcctcgccgg ggagagcggg attggcccca tcgaccgctt cgacgcctcc 360

aacttcccca cccgcttcgc cggccagatc cggggcttct cctccgaggg ctacatcgac 420

ggcaagaacg accgccgcct cgacgactgc ctccgctact gcatcgtcag cggcaagaag 480

gccctcgagt ccgccggcct cgccctcggc tccaaatcca tggacaaggt atttttcaaa 540

tgcactagta tcttttgctt cctcatgttc tcacatcctg ttaaaagttc ttagctagtg 600

gaggtacgag attccgattc gtagaaagtg tctcctgtgg tttagcactt ttgatagatc 660

agatcagcag ctgattcttt tatgaaatgg tggtgggatt tttttcccca tttctgtgat 720

agtatctgag tgagtatagt agagagtcct agtatcgact cgacaagtgg agtaggcatt 780

attgcaatcc tggtgtgtgt atatttctat ttaattatca taaagaaggt tgttgagggt 840

ccatgtattt ctgttggcca tggaaggtta tagggggcgt atctgtttta aattgctgtc 900

aagtatcaat gcaatgcaga tggattcatt tcaagtttaa aaagattagt tcaacactat 960

agaggttttg tctggagcaa aacgaaaaaa aaaactgttt ttgcatttta ccattttatg 1020

atgtagaaat attttcaaat cacacccttt tgggcccatg tttcgttggt tgtatatagt 1080

tggcgatagc ttcatcagtt cactctgcta tcaatttttc attgcttgta ctatgggtga 1140

aaggatacct ggtgctaatt agtaaatgtt acatcgttgc agattgaaaa gactcgggct 1200

ggtgtacttg tgggcaccgg tatgggtggt cttacagtgt tctctgatgg tgttcagaat 1260

cttattgaga aggggcacag aaagataact ccattcttca ttccgtatgc cataacaaac 1320

atgggatctg cccttcttgg aatggacatt ggtttcatgg gtccaaacta ctccatctca 1380

actgcatgtg ctacctcgaa ctactgtttc tatgctgcag caaaccatat tcgcagaggc 1440

gaagccgatg tgatgattgc tggtggcact gaagccgcaa ttattccgat tggtgtcggt 1500

gggtttgtcg cgtgtagagc actttcacag aggaacgatg accccaaaac agcatcaaga 1560

ccttgggacc aagaccgtga tggttttgtc atgggtgaag gagctggagt actggtatgt 1620

ttagtgaaca tattcaagtt tcaggttttc actctgttaa acatcttcta atcatttagc 1680

tctgccaaat taaaaaaagg tcatggagag cctagaacat gcaatgaagc gtgacgcacc 1740

aataattgcg gagtatttag gaggtgccgt gaactgtgat gcttaccata tgactgaccc 1800

gagatctgat ggccttggtg tttcgtcttg cattaagcaa agtcttgcag atgctggcgt 1860

tgcaccggag gaggtaatcc aaatattaca actttaaaga gcactcttat gtgttagttc 1920

tgtcatctgt aaaattgtat acctttttga tctggcagct gatacataag ctatgattta 1980

taatctgtcc tttggttttt tgtggggtgt taggattctt gtgtttgtta tgccagctat 2040

ttttaacacc aattccagcg atatttgccc tgttggaaaa agaaggtttt ccgtttgatg 2100

ttctagaatt gatgttttca ccatgagctc tggttgctat tctgtatttt gtttacaatt 2160

aatcaattgt tgtgtgtatt tattgcaaat tgtatggttt tgtttgggca aataatttga 2220

tgaaatttca tgtgtattta aatcacaaac gttttttttg caggtcaact acataaatgc 2280

tcatgcaacg tccaccctag ctggtgatct ggcagaggtg aacgccatta ggcaagtctt 2340

caaggatcca tcagagatta aaataaatgc aaccaaggtg cttttatgtt ccttatgtgt 2400

tttacctcca aattcaagga gactatacat tgccttccta atacaatctt ctgtttgcag 2460

tccatgattg gacattgcct tggtgcggct ggtggcttgg aagccattgc aactgttaaa 2520

gctataacca ctggatgggt ccatccaagc ataaaccagt ttgtaagtac cattttaaaa 2580

catcacttgc taatttacct agcctgccag tgggaacctg aggcacatta tggctagaaa 2640

aactaagggc tacattctta ttaatcacag aacccggagc cagctgttga atttgacacg 2700

gtacctaatg taaaaaagca acatgaagtg aatgttggtg agtaacaatg catgtggttt 2760

actgtattac tccgccatca atttcctctt cctcatattt gttttgtgtt gctatacagg 2820

tatctcgaat tcctttggat ttggtggaca caattcagtt gtagtatttg caccatttaa 2880

gccttaactt gctgcatgtt acacaaatct tggccagaat agtaaatgtc ttttcaggaa 2940

gttctgagtt attctgcatg tcttttcttt gggtgaagca actgttgatt tgacagccgg 3000

caacgttaca atgaactgga tctgagatta attccatttt aggcactccc atcttccatt 3060

gaaattgaga gctctgtata acgttgtttt gcataatttg caattgattc tacctacttc 3120

tgtataatgg aaaatgtggg aatttctaga attgtcatgt agaagcaaaa gttagatctc 3180

ctgttccata gaaatgcttg agccaaggaa ttgcttgtct gtaatttgta tctggtctag 3240

aaaaatgttc tcttcatttt tttttcttgt ccagtatgcc aatgtccgtc tagtggaata 3300

aaatgtattc agttttgctt aacttgctcg gctaatagct tggttcgatg agatgaaata 3360

ttctagattt cgccctgaat gtgtaca 3387

<210> 2

<211> 465

<212> PRT

<213>水稻根系伸长控制基因OsKASI编码的蛋白质

<400> 2

Met Gln Ser Leu Leu Leu Pro Thr Phe Ala Ala Ala Ser Ala Ala

1 5 10 15

Pro Pro Arg Arg Gly Arg Val Pro Pro Ala Gly Arg Ala Ser Val

20 25 30

Ser Val Arg Ala Ser Ala Ser Ala Ala Ala Val Ala Pro Arg Arg

35 40 45

Glu Thr Asp Pro Arg Lys Arg Val Val Ile Thr Gly Met Gly Leu

50 55 60

Val Ser Val Phe Gly Asn Asp Val Asp Ala Tyr Tyr Asp Arg Leu

65 70 75

Leu Ala Gly Glu Ser Gly Ile Gly Pro Ile Asp Arg Phe Asp Ala

80 85 90

Ser Asn Phe Pro Thr Arg Phe Ala Gly Gln Ile Arg Gly Phe Ser

95 100 105

Ser Glu Gly Tyr Ile Asp Gly Lys Asn Asp Arg Arg Leu Asp Asp

110 115 120

Cys Leu Arg Tyr Cys Ile Val Ser Gly Lys Lys Ala Leu Glu Ser

125 130 135

Ala Gly Leu Ala Leu Gly Ser Lys Ser Met Asp Lys Ile Glu Lys

140 145 150

Thr Arg Ala Gly Val Leu Val Gly Thr Gly Met Gly Gly Leu Thr

155 160 165

Val Phe Ser Asp Gly Val Gln Asn Leu Ile Glu Lys Gly His Arg

170 175 180

Lys Ile Thr Pro Phe Phe Ile Pro Tyr Ala Ile Thr Asn Met Gly

185 190 195

Ser Ala Leu Leu Gly Met Asp Ile Gly Phe Met Gly Pro Asn Tyr

200 205 210

Ser Ile Ser Thr Ala Cys Ala Thr Ser Asn Tyr Cys Phe Tyr Ala

215 220 225

Ala Ala Asn His Ile Arg Arg Gly Glu Ala Asp Val Met Ile Ala

230 235 240

Gly Gly Thr Glu Ala Ala Ile Ile Pro Ile Gly Val Gly Gly Phe

245 250 255

Val Ala Cys Arg Ala Leu Ser Gln Arg Asn Asp Asp Pro Lys Thr

260 265 270

Ala Ser Arg Pro Trp Asp Gln Asp Arg Asp Gly Phe Val Met Gly

275 280 285

Glu Gly Ala Gly Val Leu Val Met Glu Ser Leu Glu His Ala Met

290 295 300

Lys Arg Asp Ala Pro Ile Ile Ala Glu Tyr Leu Gly Gly Ala Val

305 310 315

Asn Cys Asp Ala Tyr His Met Thr Asp Pro Arg Ser Asp Gly Leu

320 325 330

Gly Val Ser Ser Cys Ile Lys Gln Ser Leu Ala Asp Ala Gly Val

335 340 345

Ala Pro Glu Glu Val Asn Tyr Ile Asn Ala His Ala Thr Ser Thr

350 355 360

Leu Ala Gly Asp Leu Ala Glu Val Asn Ala Ile Arg Gln Val Phe

365 370 375

Lys Asp Pro Ser Glu Ile Lys Ile Asn Ala Thr Lys Ser Met Ile

380 385 390

Gly His Cys Leu Gly Ala Ala Gly Gly Leu Glu Ala Ile Ala Thr

395 400 405

Val Lys Ala Ile Thr Thr Gly Trp Val His Pro Ser Ile Asn Gln

410 415 420

Phe Asn Pro Glu Pro Ala Val Glu Phe Asp Thr Val Pro Asn Val

425 430 435

Lys Lys Gln His Glu Val Asn Val Gly Ile Ser Asn Ser Phe Gly

440 445 450

Phe Gly Gly His Asn Ser Val Val Val Phe Ala Pro Phe Lys Pro

455 460 465

Claims

1.一种水稻根系伸长控制基因OsKASI，其特征在于该控制基因OsKASI的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所示的DNA序列中一个或几个碱基对错义突变。

2.如权利要求1所述的一种水稻根系伸长控制基因OsKASI，其特征在于所示的DNA序列中1511位的胞嘧啶被胸腺嘧啶取代。

3.权利要求1所述的一种水稻根系伸长控制基因OsKASI编码的蛋白质，其特征在于该蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所示的氨基酸序列中一个或几个氨基酸错义突变。

4.如权利要求3所述的一种水稻根系伸长控制基因OsKASI编码的蛋白质，其特征在于该蛋白质的氨基酸序列的257位丙氨酸突变为缬氨酸，水稻根系表达为短根系。