CN102584970A

CN102584970A - 水稻侧根发生调控基因OsLRD1及其编码的蛋白质

Info

Publication number: CN102584970A
Application number: CN2012100314584A
Authority: CN
Inventors: 吴平; 陈新爱; 毛传澡; 郝西; 石江华
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2012-02-13
Filing date: 2012-02-13
Publication date: 2012-07-18

Abstract

本发明涉及植物基因工程领域，旨在提供一种水稻侧根发生调控基因OsLRD1及其编码的蛋白质。该基因的核苷酸序列与SEQ ID NO：1所示的序列一致；该蛋白质的氨基酸序列与SEQ ID NO：2所示的序列一致。本发明还提供了所述的基因、或在该基因的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸生成的等位基因或衍生物在构建转基因水稻中的用途；以及包含所述的基因、或在该基因的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸生成的等位基因或衍生物的转基因植物细胞。本发明提供了新的控制根系发育的基因，提供了新的用于从遗传学角度来改良根系结构的方法和技术。

Description

水稻侧根发生调控基因OsLRD1及其编码的蛋白质

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。具体的说，本发明涉及一种图位克隆技术克隆的水稻OsLRD1基因的基因组序列，功能获得性转基因实验和自身抑制突变体的筛出证明该基因控制侧根的发育。

背景技术

从土壤中吸收营养和水分以及锚定是植物根系的两大基本功能。水稻作为研究根系的第二大模式植物，相比拟南芥有着更加重要的农业生产意义。全世界有25亿人以水稻作为主要的粮食，全球约有9％的可用耕地用于种植水稻。水稻占人均能量消耗的21％人均蛋白摄入的15％。水稻根系构型为须根系。种子萌发后产生种子根，但种子根一般会退化甚至消亡，同时可在根茎结合部产生很多不定根，种子根和不定根上都可以进一步长出侧根(严小龙等2007)。由于侧根庞大的数量，极大的增加了水稻从外界吸收水分和矿物质的能力。

水稻的侧根发生源自临近原生韧皮部的中柱鞘细胞的分裂。发育的过程和拟南芥侧根的发育过程比较相似。首先两个临近的中柱鞘细胞进行垂周分裂，继而进行多次的垂周、平周分裂形成侧根原基，原基逐渐膨大，并逐步穿过皮层，到最终突破表皮。水稻的侧根有大小侧根之分。小侧根呈现出固定的生长模式，数量很多。而直径大一些的侧根称为大侧根。这种类型的侧根没有固定的生长模式，直径比主根小，数量很少。大侧根的上面可以再长侧根，而小侧根是不会再长侧根的(Kawata Shin-ichiro，1976；Rebouillat，2010)。

到目前为止，拟南芥中关于侧根发生发育的调控已有很多分子水平的研究，如IAA3(Tian and Reed，1999)，IAA14(Fukaki et al.，2002)，IAA18(Uehara et al.，2008)，IAA19(Tatematsu et al.，2004)and IAA28(Rogg et al.，2001)，但在单子叶作物中的研究却是鲜有报道。仅在最近玉米中报道了一个Zmrum突变体，这个基因的突变造成玉米缺少胚根，主根生长受到抑制且侧根也大量减少，但是茎生根上的侧根发育却是正常(von Behrens et al.，2011)。

我们通过EMS处理的Kasalath突变体库筛选到水稻侧根缺陷突变体Oslrd1，并且克隆了控制侧根发育的Oslrd1基因。LRD1与玉米和拟南芥中的ORC3同源性较高(Witmeret al，2003)。

本发明是首次发现ORC3具有控制水稻侧根发育的功能，由于侧根的正常发生发育对维持水稻生长发育以及高产稳产是必不可少的，因此在分子育种中存在较大的应用潜力。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种水稻侧根发生调控基因OsLRD1及编码的蛋白质。

为解决技术问题，本发明的解决方案是：

提供一种水稻侧根控制基因OsLRD1编码的蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列与SEQ IDNO：2所示的序列一致。

所说的氨基酸序列还包括在Seq.ID.No.2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个氨基酸生成的植物衍生物。

本发明还提供了前述蛋白质的基因，该基因的核苷酸序列与SEQ ID NO：1所示的序列一致。

所说的核苷酸序列还包括在Seq.ID.No.1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸生成的植物突变体、等位基因和衍生物。

本发明还提供了前述的基因、或在该基因的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸生成的等位基因或衍生物在构建转基因水稻中的用途。

本发明还提供了一种转基因植物细胞，包含前述的基因、或在该基因的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸生成的等位基因或衍生物。

本发明的目的是提供一种从水稻侧根突变体Oslrd1中克隆的新基因OsLRD1，如SeqID No.1所示的基因组DNA序列，也包括与Seq ID No.1所示的基因组DNA序列至少有80％同源性的基因序列。本发明中的Seq ID No.2所示的蛋白质序列，其中进行一个或几个替换，插入或缺失所获得的功能类似物。另外，也包括在Seq ID No.1中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物，具有相同功能的序列也能达到本发明的目的。本发明提供了一种用OsLRD1基因进行高效的植物转化的方法，具体地说，本发明提供了具有Seq ID No.1所示序列的基因片段的载体。

相对于现有技术，本发明的有益效果在于：

本发明提供了新的控制根系发育的基因，提供了新的用于从遗传学角度来改良根系结构的方法和技术。

附图说明

图1为OsLRD1的组织表达分布。

A，LRD1基因在根(R)、根茎结合部(SB)、茎(S)、叶(L)及穗中的表达(RT-PCR)，以看家基因Actin作为内参照；B，pLRD1::GUS转野生型的转基因株系的GUS染色结果，(a)主根根尖，(b和c)侧根原基、(d)侧根根尖、(e)根茎结合部、(f)叶鞘、(g)花粉囊和(h)子房；C，OsLRD1蛋白的亚细胞定位。(左)GFP通道信号图，(右)白光通道和GFP通道信号重叠图，上层为空白载体35S::GFP信号，下层为35S::LRD1::GFP信号。

图2为OsLRD1基因的超表达转基因株系表型。

A，OsLRD1基因的序列结构及其编码蛋白的二级结构，外显子以实心黑方框表示，外显子之间是内含子，LRD1_N表示ORC3_N superfamily结构域。B，OsLRD1基因的超表达转基因株系表型，从左到右依次为野生型，两个超表达转基因株系OX1，OX2。C，野生型与超表达转基因株系的侧根统计结果。左边为野生型，中间和右边为两个超表达转基因株系OX1，OX2。

图3为水稻OsLRD1基因干涉转基因株系的表型。

A，7天苗龄的野生型(左)，OsLRD1基因干涉转基因株系少侧根(中)和无侧根株系(右)的全株照，bars＝2cm。B，7天苗龄的野生型(左)，OsLRD1基因干涉转基因株系少侧根(中)和无侧根株系(右)的全株照。Bars＝1cm。C，7天苗龄的野生型(左)，OsLRD1基因干涉转基因株系少侧根(中)和无侧根株系(右)的侧根原基表型。Bars＝1cm。

图4为回复载体pCAMBIA1300的结构示意图。

具体实施方式：

下面结合附图对理解本发明作进一步的详细描述，但并非对发明作限定。

根据本实验室从籼稻(Oryza Sativa L.ssp indica)地方品种Kasalath突变体库筛选到的一个位于10号染色体长臂上的水稻侧根发育缺陷隐性点突变体Oslrd1，该突变体的侧根发育依赖于温度调控，即在高于35度时，侧根原基发生但不突出根表皮，表现为光根，在26度条件下，侧根又恢复到野生型状态。

OsLRD1基因超表达转基因株系的侧根数目并未受到OsLRD1表达量的提高而增加，我们还利用RNA干涉技术获得降低LRD1表达量的转基因株系，转基因苗表现为少侧根、无侧根的表型，经Southern和RT-PCR验证，证实LRD1的表达降低引起少侧根和无侧根表型，并且侧根的数目与LRD1的表达呈剂量效应。上述结果证明了少侧根或无侧根转基因株系的确是由于LRD1的表达降低引起的，表明本发明获得了使野生型侧根减少的转基因水稻。

上述结果表明，我们克隆的水稻OsLRD1基因具有一定的应用价值，可以通过利用该基因对作物品种进行转基因改造。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。

实施例1 OsLRD1基因的表达模式

根据TIGR数据库中(http://www.tigr.org/tdb/e2k1/osa1/)的水稻基因注释信息，设计引物用Kasalath野生型DNA为模板进行扩增，经测序验证扩增产物，获得Kasalath OsLRD1启动子序列约2.9kb，经测序验证，将2.9kb的启动子序列连接至pCAMBIA1300-GUS载体中，经酶切和PCR鉴定，将得到的正确克隆的质粒通过农杆菌菌株EHA105介导的水稻遗传转化体系导入到野生型Kasalath水稻中，经过侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗移栽，得到转基因植株T0。采用T1代转基因苗观察OsLRD1基因的组织表达模式。

实施例2，OsLRD1基因序列分析及其超表达转基因株系的表型

根据TIGR数据库中(http://www.tigr.org/tdb/e2k1/osa1/)的水稻基因注释信息，设计引物用Kasalath野生型cDNA为模板进行扩增，经测序验证扩增产物，获得Kasalath OsLRD1全长cDNA，长度约为2.1kb的DNA片段，在CaMV 35S启动子驱动下连接至pCAMBIA1300的载体片段连接，电击转化电击感受态大肠杆菌DH5a。蓝白斑筛选挑选白斑进行菌液PCR检测，检测为阳性的克隆用M13正反向引物进行测序以确定其是否包含全部的基因组序列。将得到的正确克隆的质粒通过农杆菌菌株EHA105介导的水稻遗传转化体系导入到野生型水稻中，经过侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗移栽，得到转基因植株，OsLRD1基因超表达后对水稻侧根数目并无显著影响(图2A和图2B)。

实施例3，OsLRD1基因的干涉转基因株系表型

以LRD1基因的cDNA保守区序列设计引物，基于PCR方法从pNW55(http://wmd2.weigelworld.org)载体中扩增得到artificial microRNA片段，再将artificial microRNA片段连接至pGEMH-T Easy载体中，电击转化电击感受态大肠杆菌DH5a。蓝白斑筛选挑选白斑进行菌液PCR检测，检测为阳性的克隆用M13正反向引物进行测序以确定其是否包含正确的基因组序列。经BamH I/Pst I酶切下来的约550bp片段连接到pCAMBIA1300载体中，将得到的正确克隆的质粒通过农杆菌菌株EHA105介导的水稻遗传转化体系导入到野生型中，经过侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗移栽，得到转基因植株。经表型观察和目的基因的表达水平检验LRD1RNAi的转基因植株表现为没有或只有极少侧根，且主根及植株矮小，其侧根数目与LRD1的表达水平呈剂量效应(图1)。

Claims

1.一种水稻侧根控制基因OsLRD1编码的蛋白质，其特征在于，该蛋白质的氨基酸序列与SEQ ID NO：2所示的序列一致。

2.一种编码权利要求1所述蛋白质的基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列与SEQ ID NO：1所示的序列一致。

3.权利要求2所述的基因、或在该基因的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸生成的等位基因或衍生物在构建转基因水稻中的用途。

4.一种转基因植物细胞，其特征在于，包含权利要求2所述的基因、或在该基因的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸生成的等位基因或衍生物。