CN117646009A - 一种控制水稻粒长的基因OsRanBP1及其基因工程应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程领域，公开了一种控制水稻粒长的基因OsRanBP1及其基因工程应用。该基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1，过量表达水稻基因OsRanBP1可以增加水稻粒长和叶夹角，利于水稻粒型的遗传改良。OsRanBP1功能缺失突变体籽粒粒长变短，叶夹角减小，穗长减少；本发明OsRanBP1基因可用于水稻产量性状的遗传改良。

Description

一种控制水稻粒长的基因OsRanBP1及其基因工程应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，涉及一种控制水稻粒长的基因OsRanBP1及其基因工程应用。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是一半以上人口的主食，随着世界人口的增加，提高水稻产量是保障粮食安全的重要途径。籽粒大小包括籽粒长度、宽度和厚度，都是直接影响水稻粒重和产量的决定因素，是育种选择的重要目标性状(Xing et al.,2010；Zuo etal.2014；Zhao et al.2022)。近年来，许多与籽粒大小有关的基因已被挖掘。这些基因参与不同的调控途径，包括G蛋白信号通路，泛素蛋白酶体介导的降解途径，丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号通路，植物激素，和转录调控等。

控制颗粒长度的基因包括GRAIN SIZE 3(GS3)(Fan et al.2006)，GRAIN LENGTH4(GL4)(Wu et al.2006)，THOUSAND GRAIN WEIGHT 3/GRAIN LENGTH 3.3(TGW3/GL3.3)(Xia et al.2018；Ying et al.2018)，GRAIN LENGTH 7(GL7)(Wang et al.,2015)，GRAINSHAPE 9(GS9)(Zhao et al.2018)。控制籽粒宽度的包括GRAIN WIDTH 2(GW2)(Song etal.2007)，GRAIN WIDTH 5(GW5)(Weng et al.2008)，和GRAIN WIDTH 8(GW8)(Wang etal.2012)。控制千粒重的包括GRAIN WIDTH 6a(GW6a)(Song et al.2015)和THOUSANDGRAIN WEIGHT 6(TGW6)(Ishimaru et al.2013)。

GS3是水稻中克隆的一个同时控制水稻籽粒长度和重量的主要QTL(Fan etal.2006,2009)。GL4基因的一个单核苷酸突变影响了水稻的千粒重和单株产量(Wu etal.2017)，TGW3/GL3.3是籽粒长度的负调控因子，协同改变颖壳细胞的大小和和数量(Yinget al.2018)，并且与GS3具有遗传上位效应，与该基因一起作用时籽粒显著变大(Xia etal.2018)。GL7通过串联重复拷贝数变化同时调节水稻粒长和改善水稻外观质量(Wang etal.2015)。GW2和GW5通过泛素-蛋白酶体途径调节籽粒宽度和重量(Song et al.2007；Wenget al.2008)。GW7通过调节细胞分裂影响籽粒长度，而GW8同时调节籽粒的大小和品质(Wang et al.2012)，GW8可直接结合GW7启动子并抑制其表达(Wang et al.2015)。

本实验室前期发现水稻粒长关键控制因子qGL3/OsPPKL1将OsGSK3去磷酸化稳定其表达从而实现对油菜素甾醇(brassinosteroid，BR)信号的调控，为了进一步研究qGL3调控BR的分子网络和水稻粒长的分子机制，本实验室选取m-qgl3和NIL^qgl3材料以及他们对应的野生型材料DJ和9311进行磷酸化蛋白质组学分析，发现了一个磷酸化水平显著下降的核质转运蛋白OsRanBP1。

发明内容

本发明的目的在于公开一个调控水稻籽粒长度的基因OsRanBP1的克隆与水稻粒长性状的基因工程应用。过量表达水稻基因OsRanBP1可以增加水稻粒长，可应用于水稻粒型的遗传改良。OsRanBP1功能缺失突变体籽粒粒长变短，穗长减少，可用于水稻产量性状的遗传改良。

本发明的第一个目的是提供OsRanBP1基因，所述OsRanBP1基因的cDNA序列如SEQID NO.1所示：

ATGGCAGACGAGGAGCATGCTCCAACGTCTAGGAAGAGGGTTGCAGGTACCCAAATCAACAAGGATAATCCTGAGCCTGATGATGACTCAACTGAGCAAGAGATGGGGACATTTAAGAGAGCTAGTGAGGAAGTGATGGCAACACGGAGAATTGTAAAGGTTCGACGCCAGCAGCCCTCATCAGCTCCTTCTAATCCTTTCTCTGCAATCAGATTTACCCCCAGTGATACCAGCGCCCAAGCAACTATCCCTGTCTCAGAGCCTCAACCTTCTGATGTCATTACAGCGAATGCAAAGGATAGTTCAAGTGAGAAAGCTGATGAGGGAAGCAATGGCAGTGGGAAAGATGCTTTACCTGTAACTGACAAGAGTGCAGGTTCTAGTGAGGTAGCTGAGACAGAAAAGGATGGATCAGATCTGAAAGGATCAGATGAAAAAGCCAAGTCCAGTGACTCAATTGAACCACCTTCTCAACCTGTTGAGACCACTGACGAAGCAAAAGACTTGGGGGGCGGATCAGTGGTAGCTGGAGAGGCCAAGGAAGATAACAGCAAGGCATCTGATATCGAGGACAAAACAGCAAAAGAGGGAGATGCTGAAGAAGAGGATGGAGCAAATGAGGCTGGAGCTGAAGACAAAATTAGCAAGGGTGATGATGAGAAGAAAGATGGAGATGAATCAGAGACAAAGGATGGATCGTCTGAGGAGCAGAAGGATGCTGATAACAAGGGGCAGTCGTCATCACCAACACCCCTTTTCTCTTTCAAGAACCTGTCGAGTGGCCAAAATGCCTTCACAGGACTGGCTGGAACTGGATTTTCAGGCTCTTCATTTTCATTTGGATCAGGCTCTAAAGAAAGCTCGAGTGCTCCCCTGTTTGGGCTAAAGACTGATGGCTCATCATTCCCATCTTTTAGTATTGGTGCTTCGAATAATGGGAGTTCCTCCCCTGCGCTTGCGACTTCGGCAGAAGCTCCCAAGAAATTTGCTATGCCAGAGGGCCCAGTTGAAACTGGTGAAGAGAATGAGAAGGCCATATTCACAGCCGACTCAGCATTGTATGAATACTTGGATGGGGGTTGGAAAGAAAGAGGAAAGGGGGAACTAAAGTTGAACATCCCAGTATCTGGTGGCGAGAGGTCTCGTCTCGTCATGAGAACCAAGGGCAATTACAGGCTAGTTCTTAACGCAAGCCTTTACGAGGACATGTCGCTGAAGGACATGGACAAGAAGGGCGTGACGTTTGCCTGTATGAACAGCATCGGCGACTCGCAGAGCGGGCTTGCCACATTTGCTCTGAAGTTCAGGGATACCAGCATCAGGGAGGAGTTCAAAGCTGCGGTGGAGATGCACAAGGCGAAAAAGGCGTCCGGCACACTCAAGACACCCGAGAACTCCCCGAAGGCATCAGATGATTGA

进一步的，所述OsRanBP1基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第二个目的是提供含有前述的水稻基因OsRanBP1基因的过量表达载体。

进一步的，所述的过量表达载体是将前述水稻OsRanBP1基因插入植物双元表达载体pCAMBIA1300s的KpnⅠ和SalⅠ酶切位点间所得。

本发明的第三个目的是提供前述的OsRanBP1基因在改变水稻种子长度中的应用。

进一步的，过表达前述的OsRanBP1基因能够增加水稻粒长，敲除或沉默前述的OsRanBP1基因能够减少水稻粒长。

本发明的第四个目的是提供过表达前述的OsRanBP1基因或前述过量表达载体在改良水稻产量中的应用。

进一步的，过表达前述的OsRanBP1基因或前述过量表达载体能够增加水稻粒长和/或增加叶夹角。

本发明的第五个目的时提供敲除或沉默前述的OsRanBP1基因在改良水稻产量中的应用。

有益效果

1、本发明公开了水稻OsRanBP1基因的粒型基因工程应用，该基因来自水稻(Oryzasativa L.)，过量表达该基因可以增加水稻粒长，利于水稻粒型的遗传改良。

2、本发明中的OsRanBP1基因也控制水稻叶夹角和穗长，为水稻增加光合效率等高产优质育种提供了新资源。

3、本发明中的OsRanBP1基因功能缺失突变体籽粒粒长变短，穗长减少，为水稻性状调控和筛选提供新的有效途径。

附图说明

图1.OsRanBP1的基因编辑和过量表达转基因材料的构建

图1A.OsRanBP1基因编辑材料的验证；

图1B.过量表达载体pCAMBIA1300s酶切位点示意图；

图1C.利用Western Blot技术验证OsRanBP1基因编辑和过量表达转基因材料。

图2.OsRanBP1转基因材料的籽粒表型

图2A.OsRanBP1的基因编辑和过量表达转基因株系的籽粒对比图，右侧为去掉颖壳的糙米图片；

图2B.OsRanBP1的基因编辑和过量表达转基因株系的粒长统计图。

图3.OsRanBP1的基因编辑和过量表达转基因株系的叶夹角和稻穗表型

图3A和图3B.分别为OsRanBP1的基因编辑和过量表达转基因株系的叶夹角和穗的对比图；

图3C.OsRanBP1的基因编辑和过量表达转基因株系的叶夹角统计图；

图3D.OsRanBP1的基因编辑和过量表达转基因株系的穗长统计图。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

实施例1构建OsRanBP1的过量表达和敲除OsRanBP1基因的基因编辑载体

1、过表达载体构建：

(1)选用50粒水稻品种‘中花11’(ZH11)饱满的种子，利用10％的次氯酸钠溶液消毒20min，并用纯水冲洗5次去除种子表面的次氯酸钠，将种子浸泡在纯水中待露白后播种在营养土中，于人工气候培养箱(16h光照/8h黑暗，白天30℃夜晚26℃)中生长。待幼苗生长至3-4叶期时，取保存的水稻幼苗样品，参照Invitrogen公司的Trizol法提取水稻RNA。RNA的质量以及浓度通过1％琼脂糖凝胶电泳分析，获得符合质量的总RNA进一步用于合成cDNA第一链。cDNA第一链的合成参照Vazyme公司反转录系统的操作手册进行。

(2)以反转录合成的cDNA第一链为模板，采用PCR方法进行OsRanBP1的克隆。采用引物对：F1：CCGCCGTTTCTGGTAATCT(SEQ ID NO.3)，R1：ATGGACTCGGTGCATTGTG(SEQ IDNO.4)进行PCR扩增，将克隆片段连入pEasy Blunt Simple载体，转入大肠杆菌菌株DH5α中，测序筛选得到含有SEQ ID NO.1所示的水稻OsRanBP1基因cDNA序列的重组质粒T-OsRanBP1。

(3)根据水稻OsRanBP1基因的cDNA序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物对：F2：GCTTTCGCGAGCTCGGTACCATGGCAGACGAG(SEQ ID NO.5)，包含入KpnⅠ限制性内切酶位点，R2：GCCCTTGCTCACCATGGTACCATCATCTGATG(SEQ ID NO.6)，包含SalⅠ限制性内切酶位点。以步骤(2)获得的测序正确的重组质粒T-OsRanBP1为模板，进行PCR扩增，将扩增产物插入植物双元表达载体pCAMBIA1300s的KpnⅠ和SalⅠ酶切位点间(图1B)，获得过量表达载体pCAMBIA1300s-OsRanBP1。

转基因植株的获得：将获得的过量表达载体pCAMBIA1300s-OsRanBP1通过热激法转入农杆菌菌株EHA105，利用农杆菌介导的水稻遗传转化将过量表达载体的T-DNA区整合到水稻粳稻品种中花11的基因组中，从而获得OsRanBP1过量表达的转基因水稻。

2、敲除OsRanBP1基因的基因编辑载体构建：

在OsRanBP1外显子区域选取2个靶点，两靶点距离500bp，靶点以NGG结尾，靶点与其他非目标基因特异性差而与目标基因特性佳，脱靶效应低。

靶点1序列为：5'-AGGAGCATGCTCCAACGTCT-3'(SEQ ID NO.7)，

靶点2序列为：5'-AGTGGTAGCTGGAGAGGCCA-3'(SEQ ID NO.8)。

设计含有靶点序列的引物MT1-OsRanBP1-BsF：

ATATATGGTCTCTGGCGGGAGCATGCTCCAACGTCTGTT(SEQ ID NO.9)、MT2-OsRanBP1-BsR：ATTATTGGTCTCTAAACTGGCCTCTCCAGCTACCACC(SEQ ID NO.10)、MT1-OsRanBP1-F0：TGGGAGCATGCTCCAACGTCTGTTTTAGAGCTAGAAATAGC(SEQ ID NO.11)、MT2-OsRanBP1-R0：AACTGGCCTCTCCAGCTACCACCGCTTCTTGGTGCC(SEQ ID NO.12)，利用上述引物对pCBC-MT1T2质粒进行扩增。

将所得片段与pBUE411载体利用T4 Ligase(NEB)酶切连接，随后转化入DH5α感受态，涂布于卡那LB固体培养基平板37℃培养24h，阳性单克隆用OsU3-FD3：GACAGGCGTCTTCTACTGGTGCTAC(SEQ ID NO.13)和TaU3-RD：CTCACAAATTATCAGCACGCTAGTC(SEQ ID NO.14)引物扩增，OsU3-FD3和TaU3-FD2：TTGACTAGCGTGCTGATAATTTGTG(SEQ IDNO.15)测序确认。与目的序列比对成功的菌液用于扩繁并转入农杆菌用于构建转基因材料，获得OsRanBP1功能缺失突变体。

实施例2鉴定OsRanBP1的基因编辑和过量表达转基因株系

设计用于验证cr-osranbp1突变体的引物cr-osranbp1-F：CCTGCGTAAGTTTTACGACATCAT(SEQ ID NO.16)/cr-osranbp1-R：GAGATGCTGAAGAAGAGGATGGAG(SEQ ID NO.17)，提取cr-osranbp1突变体cr1-osranbp1、cr2-osranbp1以及野生型‘ZH11’植株的总DNA，以上述DNA为模板进行PCR扩增，目的片段697bp，将条带大小正确的产物送至公司测序，测序结果用于鉴定转基因植株的突变情况(图1A)。

为了验证转基因植株中OsRanBP1的蛋白表达量，从爱博泰克公司购入OsRanBP1的蛋白抗体，利用western-blot实验进行分析，结果显示，与野生型‘ZH11相比’，cr-osranbp1突变体材料的两个株系中OsRanBP1的蛋白含量显著降低；相反，过表达材料的两个纯合株系OX1-OsRanBP1、OX2-OsRanBP1的蛋白表达量大幅度升高(图1C)，因而这些转基因植株株系均可用于本研究中后续的实验分析。

实施例3培育OsRanBP1的基因编辑和过量表达转基因株系

将分别经过阳性验证的实施例1培育的OsRanBP1转基因材料植株和野生型ZH11种植于南京农业大学白马教学基地，每个株系种3行，每行8株，常规土肥管理。种子成熟后，分别将各组水稻的穗茎节剪下进行穗长测量，将植株的倒二叶连同茎秆剪下测量叶夹角，收获的种子在42℃烘干5天后进行粒长考种分析。

发现cr-osranbp1的粒长较野生型显著变短，而OsRanBP1过量表达植株的粒长较野生型显著增长(图2)。

观察OsRanBP1转基因植株成熟期叶片的叶夹角发现，cr-osranbp1的叶夹角较野生型无显著差异，而OsRanBP1过量表达植株的叶夹角显著增大(图3A和3C)。

进一步测量OsRanBP1转基因植株穗长发现，cr-osranbp1的穗长较野生型显著变短，而OsRanBP1过量表达植株的穗长较野生型无显著差异(图3B和3D)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.OsRanBP1基因，其特征在于，所述OsRanBP1基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的OsRanBP1基因，其特征在于，所述OsRanBP1基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.含有权利要求1所述的水稻基因OsRanBP1基因的过量表达载体。

4.根据权利要求3所述的过量表达载体，其特征在于，所述的过量表达载体是将权利要求1所述水稻OsRanBP1基因插入植物双元表达载体pCAMBIA1300s的KpnⅠ和SalⅠ酶切位点间所得。

5.权利要求1所述的OsRanBP1基因在改变水稻种子长度中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，过表达权利要求1所述的OsRanBP1基因能够增加水稻粒长，敲除或沉默权利要求1所述的OsRanBP1基因能够减少水稻粒长。

7.过表达权利要求1所述的OsRanBP1基因或权利要求3所述过量表达载体在改良水稻产量中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，过表达权利要求1所述的OsRanBP1基因或权利要求3所述过量表达载体能够增加水稻粒长和/或增加叶夹角。

9.敲除或沉默权利要求1所述的OsRanBP1基因在改良水稻产量中的应用。