CN117987458A - 调控玉米光周期敏感性的基因及其编码蛋白与应用 - Google Patents

调控玉米光周期敏感性的基因及其编码蛋白与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了调控玉米光周期敏感性的基因及其编码蛋白与应用。具体地公开了氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质ZmNPR1I在调控植物开花时间和光周期敏感性中的应用。本发明从玉米中克隆了调控光周期敏感性的基因ZmNPR1I，并通过转基因实验证明了其在抑制玉米光周期敏感性、调节玉米开花期、开花时间中所发挥的作用。本发明的ZmNPR1I蛋白及其编码基因ZmNPR1I可以调控植物的开花期、开花时间和/或光周期敏感性，可通过抑制ZmNPR1I基因表达或干扰ZmNPR1I基因来培育或选育弱光周期敏感性的玉米品种。本发明所提供的ZmNPR1I蛋白及其编码基因在玉米育种中具有重要的应用价值。

Description

调控玉米光周期敏感性的基因及其编码蛋白与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及调控玉米光周期敏感性的基因及其编码蛋白与应用。
背景技术
玉米(Zea mays L.)是重要的粮食作物，是饲料加工中主要成分。随着人民生活水平的日益提高，对肉蛋奶的需求也在不断增加。在耕地面积有限的情况下，只有稳定提高玉米的单产，才能满足对玉米产量不断增加的需求。选育高产品种的关键在于具有优质的种植资源。玉米又是典型的短日照植物，在向高纬度的地区传播的时候，能否正常开花和结实的关键是光周期敏感不能太强。有这样一个驯化选择的障碍存在，致使玉米在温带的遗传多样显著降低。具有抗病、抗虫和抗逆等很多优良品质的热带种质，因无法适应长日照条件，在向高纬度引种的过程中被淘汰。因为长日照引起的生育期延长，是提高玉米产量的关键因素。由此看来，将最优质的品种种植在最适宜的地区，成为玉米高产的最优解。这个过程要通过自然选择去实现，会是相当漫长的过程；靠人工选择，也是一个非常耗时耗力的过程。要是能克隆一个抑制玉米光周期敏感性的基因，减弱热带种质的光周期敏感性，不失为加快选择过程的一条捷径。
玉米中调控开花期的途径主要有四条，包括光周期途径，自主途径，年龄途径和赤霉素途径。它们最终都汇集到了Zea mays CENTRORADIALIS8(ZCN8)基因，即玉米中与FT同源的成花素基因，由它直接促进开花。光周期途径对于玉米驯化后的成功传播尤为关键，也决定了热带种质在改良温带玉米品种方面的应用。目前，在玉米中克隆的通过光周期途径调控开花期的基因有conz1(CONSTANS of Zea mays)，ZmCCT10，ZmCCT9和ZmCOL3(CONSTANS-LIKE3)，都属于CCT家族的基因。可见CCT家族基因在调控玉米光周期敏感性方面，发挥着重要作用。而玉米中CCT家族的基因总共有55个，这些基因在调控开花期时，很可能表现出叠加的效应。这就造成在选育弱光周期敏感性的材料时，要兼顾多个位点的基因型。同时，CCT家族基因往往具有一应多效性。比如，ZmCCT10不仅调控玉米的光周期敏感性，也介导了玉米对生物胁迫和非生物胁迫的抗性。弱光周期敏感性的ZmCCT10等位基因，也会降低玉米对茎腐病的抗性。比较经济有效的策略就是克隆抑制光周期敏感性的基因，能同时抑制多个光周期基因的光周期敏感性，而对其他性状没有影响。迄今为止，在克隆抑制光周期敏感性的基因方面的研究还比较少。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何调控植物开花时间和/或光周期敏感性。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质的应用，所述应用可为下述任一种：
D1)在调控植物开花时间中的应用；
D2)在培育开花时间提前或延迟的植物中的应用；
D3)在调控植物光周期敏感性中的应用；
D4)在培育弱光周期敏感性的植物中的应用；
所述蛋白质名称为ZmNPR1I，可为下述任一种：
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；
A2)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
为了使A1)中的蛋白质便于纯化或检测，可在由序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接标签蛋白。
所述标签蛋白包括但不限于：GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、His标签蛋白(His-tag)、MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、Flag标签蛋白、SUMO标签蛋白、HA标签蛋白、Myc标签蛋白、GFP(绿色荧光蛋白)、CFP(青色荧光蛋白)、YFP(黄绿色荧光蛋白)、mCherry(单体红色荧光蛋白)或AviTag标签蛋白。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质ZmNPR1I的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质ZmNPR1I的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质ZmNPR1I且具有蛋白质ZmNPR1I功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
上述应用中，所述蛋白质ZmNPR1I可来源于玉米(Zea mays L.)。
本发明还提供了与所述蛋白质ZmNPR1I相关的生物材料的应用，所述应用可为下述任一种：
E1)在调控植物开花时间中的应用；
E2)在培育开花时间提前或延迟的植物中的应用；
E3)在调控植物光周期敏感性中的应用；
E4)在培育弱光周期敏感性的植物中的应用；
所述生物材料可为下述任一种：
B1)编码所述蛋白质ZmNPR1I的核酸分子；
B2)抑制或降低所述蛋白质ZmNPR1I编码基因表达的核酸分子；
B3)含有B1)和/或B2)所述核酸分子的表达盒；
B4)含有B1)和/或B2)所述核酸分子的重组载体、或含有B3)所述表达盒的重组载体；
B5)含有B1)和/或B2)所述核酸分子的重组微生物、或含有B3)所述表达盒的重组微生物、或含有B4)所述重组载体的重组微生物；
B6)含有B1)和/或B2)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B3)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B7)含有B1)和/或B2)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B3)所述表达盒的转基因植物组织；
B8)含有B1)和/或B2)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B3)所述表达盒的转基因植物器官。
进一步地，B3)所述表达盒、B4)所述重组载体、B5)所述重组微生物、B6)所述细胞系、B7)所述转基因植物组织和B8)所述转基因植物器官均可表达B1)和/或B2)所述核酸分子。
上述应用中，B1)所述核酸分子可为下述任一种：
C1)编码序列是SEQ ID No.1的DNA分子；
C2)核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子。
SEQ ID No.1所示的DNA分子(ZmNPR1I基因)编码氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质ZmNPR1I。
ZmNPR1I基因可为调控植物光周期敏感性的基因或调控植物开花时间的基因。
B1)所述核酸分子还可包括在SEQ ID No.1所示核苷酸序列基础上经密码子偏好性改造得到的核酸分子。
本发明所述的蛋白质ZmNPR1I的编码序列(CDS)可以为任意能够编码蛋白质ZmNPR1I的核苷酸序列。考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。
本文所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如gRNA、mRNA、siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。
进一步地，所述B2)可为降低ZmNPR1I基因(SEQ ID No.1)表达量的核酸分子。
进一步地，B2)所述核酸分子可为sgRNA、microRNA、siRNA、shRNA和/或反义寡核苷酸。
进一步地，所述sgRNA、microRNA、siRNA、shRNA和/或反义寡核苷酸用于抑制ZmNPR1I基因的表达。
进一步地，B2)所述核酸分子可为sgRNA。
进一步地，所述sgRNA用于敲除ZmNPR1I基因。
进一步地，所述sgRNA的靶序列可为SEQ ID No.3。
本领域技术人员熟知，除了利用基因编辑技术可以抑制ZmNPR1I基因的表达，还可以利用基因敲减(基因敲低，gene knock-down)技术从转录后水平或翻译水平使ZmNPR1I基因表达失活或基因沉默。所述基因敲减技术包括RNA干扰、Morpholino干扰、反义核酸、核酶或显性负抑制突变但不限于此。此外，利用病毒(如慢病毒、腺相关病毒)表达的shRNA或siRNA抑制ZmNPR1I基因的表达，进行ZmNPR1I基因的沉默也是本领域技术人员所熟知的。
本发明还提供了一种降低植物光周期敏感性或使植物开花时间提前的方法，所述方法可包括通过降低目的植物中所述蛋白质ZmNPR1I的编码基因的表达量来降低植物光周期敏感性或使植物开花时间提前。
上述方法中，所述降低目的植物中所述蛋白质ZmNPR1I的编码基因的表达量可为利用基因突变、基因敲除、基因编辑或基因敲减技术使目的植物基因组中所述蛋白质ZmNPR1I的编码基因活性下降或失活。
上述方法中，所述利用基因编辑技术使目的植物基因组中所述蛋白质ZmNPR1I的编码基因活性下降或失活可利用CRISPR/Cas9系统进行，所述CRISPR/Cas9系统可包括表达靶向所述蛋白质ZmNPR1I的编码基因的sgRNA的载体，所述sgRNA的靶序列可为SEQ IDNo.3。
上述方法中，所述方法还包括进一步筛选获得稳定遗传的ZmNPR1I基因纯合突变体的步骤。
本发明还提供了一种增强植物光周期敏感性或使植物开花时间延迟的方法，所述方法可包括通过提高目的植物中所述蛋白质ZmNPR1I的编码基因的表达量来增强植物光周期敏感性或使植物开花时间延迟。
上述方法中，所述提高目的植物中所述蛋白质ZmNPR1I的编码基因的表达量可为通过将所述蛋白质ZmNPR1I的编码基因导入所述目的植物实现。
进一步地，所述导入包括但不限于：使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转染植物细胞或组织，并将转染的植物细胞或组织培育成植株。
进一步地，所述蛋白质ZmNPR1I的编码基因的核苷酸序列可为SEQ ID No.1。
所述蛋白质ZmNPR1I或所述生物材料也在本发明的保护范围内。
本文中，所述植物可为作物(如农作物)。
本文中，所述植物可为下述任一种：
G1)单子叶植物；G2)禾本科植物；G3)玉蜀黍属植物；G4)玉米。
本文所述调控植物开花时间可为调控植物开花期。
本文所述调控植物开花时间可为使植物开花时间提前或延迟。
本文所述调控植物开花时间可为延长或缩短植物开花时间。
本文所述调控植物开花期可为延长开花期或缩短开花期。
所述开花期包括玉米从播种到抽雄的天数(DTH，Days to heading)，从播种到散粉的天数(DTA，Days to anthesis)和从播种到吐丝的天数(DTS，Days to silking)。
本文所述调控植物光周期敏感性可为降低或增强植物光周期敏感性，具体体现在玉米因光周期改变而造成开花期改变(如开花时间提前或延迟)。
本文所述调控植物光周期敏感性可为降低玉米对光周期的敏感性。
本文所述光周期敏感性表现为开花时间。
本实验前期研究中，将ZmCCT10的9种不同抗病单倍型，导入到7个易感茎腐病的骨干自交系，并不断的回交获得了63个高背景恢复率的改良系。随后对这些改良系的茎腐病抗性和开花时间等性状进行多年多点的评估。从中筛选出最优单倍型，并将获得的抗茎腐病改良系应用于玉米育种。对这63个改良系的茎腐病进行评估，发现所有的材料与轮回亲本相比，茎腐病抗性都得到显著提升。在对开花时间的评估中，观察到在海南短日照条件下，改良系与轮回亲本开花时间的差异并不显著；而在北京长日照条件下，改良系比轮回亲本的开花时间都推迟。由于遗传背景的差异，推迟的时间从2天到7天不等。有时候开花时间的延长，在玉米生产中弊大于利，这就对利用ZmCCT10改良茎腐病抗性造成了障碍。但是我们注意到在长日照条件下，9个A5302改良系的开花时间与它们的轮回亲本A5302相比，差异并不显著。我们猜测在A5302中含有一个抑制光周期敏感性的基因，能抑制ZmCCT10介导的光周期敏感性，但不影响ZmCCT10对茎腐病的抗性。如果能克隆这样的基因，既有助于消除ZmCCT10应用的障碍，又有助于拓宽热带种质在温带地区的利用。
本发明从玉米中克隆了调控光周期敏感性的基因ZmNPR1I，并通过转基因实验证明了其在抑制玉米光周期敏感性、调节玉米开花期、开花时间中所发挥的作用：1)增强ZmNPR1I基因的表达，能增强玉米对光周期的敏感性，使开花期显著推迟，显著延迟玉米开花时间；2)利用CRISPR-Cas9的技术，编辑植物中ZmNPR1I基因的DNA序列，使得ZmNPR1I蛋白的功能丧失，能降低玉米对光周期的敏感性，使开花期显著提前，开花时间显著提前。
本发明的ZmNPR1I蛋白及其编码基因ZmNPR1I可以调控植物的开花期、开花时间和/或光周期敏感性，可通过抑制ZmNPR1I基因表达或干扰ZmNPR1I基因来培育或选育弱光周期敏感性的玉米品种。本发明所提供的ZmNPR1I蛋白及其编码基因在玉米育种中具有重要的应用价值。
附图说明
图1为QTL定位群体构建的流程示意图。
图2为叶片数和开花期的多数据系列散点图矩阵。
图3为三个开花期性状的累计面积图。
图4为在全基因组检测调控三个开花期相关性状的QTL。
图5为qPss3的连续精细定位。
图6为在不同日照条件下评估qPss3影响开花期的遗传效应。
图7为qPss3对光周期敏感基因ZmCCT10和ZmCCT9的遗传效应。
图8为开花期与茎腐病之间的联系。
图9为ZmCCT10、ZmCCT9和qPss3不同基因型下的茎腐病发病程度。
图10为近等基因系间开花性状差异。
图11为近等基因系间茎尖分生组织发育。
图12为近等基因系间植株形态和茎腐病抗性。
图13为在近等基因系中用RT-PCR检测相关基因表达。
图14为在近等基因系中用qRT-PCR检测相关基因表达。
图15为在近等基因系中用Western Blot检测相关蛋白表达。
图16为pBECXUN(CAUC2829)载体的图谱。其中：载体背景为pCXUN(王国梁lab)；RB&LB：T-DNA区的左右边界；白背景箭头框：强启动子；灰背景矩形框：终止子；XcmI：酶切位点，插入基因CDS的区域；ccdB：普通大肠杆菌细胞的细胞毒性基因，用于提高目的阳性克隆获得率；Bar：抵抗双丙氨膦筛选压的基因；CTP2：定位于叶绿体的信号肽，对草甘膦抗性表达起作用；CP4MSTm：为CP4MST突变XcmI位点，抵抗草甘膦筛选压的基因；KanR：卡那霉素抗性基因：用于阳性克隆筛选。
图17为XcmI酶酶切载体pBECXUN(CAUC2829)后电泳。
图18为从玉米自交系B73中扩增ZmNPR1I基因。
图19为菌落PCR鉴定阳性克隆。
图20为提取阳性克隆的质粒送测序。
图21为用Bar引物挑选转基因阳性植株。
图22为用Bar引物检测基因型。
图23为以cDNA为模板检测相关基因的表达量。
图24为ZmNPR1I过表达材料中检测相关基因表达。
图25为ZmNPR1I过表达材料的开花时间表型。
图26为pXUE411C-BG载体的图谱。
图27为ZmNPR1I基因编辑植株的测序结果。
图28为ZmNPR1I基因编辑植株的开花期表型。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量实验，如无特别说明，均设置三次重复，结果取平均值。
玉米光周期敏感改良系Chang7-2H1/H5和Chang7-2H5/H5、玉米光周期不敏感改良系A5302H1/H5、玉米自交系Chang7-2H1/H1、禾谷镰刀菌培养及人工接菌方法在文献“Li YP,TongLX,Deng LL,Liu QY,Xing YX,Wang C,Liu BS,Yang XH,Xu ML(2017)Evaluation ofZmCCT haplotypes for genetic improvement of maize hybrids.Theoretical andApplied Genetics 130:2587-2600”中公开过，公众可从中国农业大学获得，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
玉米自交系B73在文献“Lee M,Sharoppva N,Beavis W D,et al.Expanding thegenetic map of mazie with the intermated B73×Mo17(IBM)population.Plantmolecular biology,2002,48(5-6):453-461.”中公开过，公众可从中国农业大学获得。
检测基因型的芯片，GoldenGate maize 6K SNP chip，购自美国的Illumina公司，产品目录号为WG-500-1001。
在获得过表达转基因玉米时所用到的遗传转化载体为pBECXUN(CAUC2829)，该载体来自中国农业大学玉米功能基因组平台，公众可从中国农业大学获得。
载体扩繁用到的感受态细胞为Trans1-T1 Phage Resistant化学感受态细胞，购自北京全式金生物技术股份有限公司，目录号：CD501。
遗传转化用到的农杆菌感受态细胞为EHA105 Chemically Competent Cell，购自上海唯地生物技术有限公司，目录号：AC1010。
玉米叶片总RNA的提取所用到的试剂为TRIzol，购自北京华越洋生物科技有限公司，目录号：GT0241。
cDNA的合成利用的是EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA SynthesisSuperMix试剂盒，购自北京全式金生物技术股份有限公司，目录号：AE311。
目的基因表达量的检测使用的方法是实时荧光定量PCR法，所用到的试剂为TBGreen Premix Ex Taq II，购自宝日医生物技术(北京)有限公司，目录号：RR420A。
实施例1、玉米开花期QTL的初定位
以光周期敏感改良系Chang7-2H1/H5和光周期不敏感改良系A5302H1/H5为亲本，通过一次杂交再一次自交，获得两套初定位群体，Susceptible(S)Population和Resistant(R)Population(图1)。这两套群体具有相似的遗传背景，但在ZmCCT10位点的基因型有所不同，S Population是H1/H1型，而R Population是H5/H5型。我们预想通过这样两套特殊的群体，分别进行开花期QTL检测。然后，再将检测结果进行比对，筛选只在R Population存在的QTL。这样的QTL可能就是抑制光周期敏感性的QTL。初定位群体的基因型检测使用的是GoldenGate maize 6K SNP chip(Illumina，San Diego，California，USA)，总共包含了5,259个SNP分子标记。因为芯片检测对DNA的质量要求较高，我们用紫外分光光度计(NanoDrop1000，Thermo Fisher Scientific，Waltham，Massachusetts，USA)对每个样品的DNA质量进行了质控。
本实验调查的衡量玉米开花期的性状包括：抽雄天数，散粉天数和吐丝天数。抽雄天数(DTH)：玉米抽雄是指植株雄穗尖端露出顶叶(3－5cm)的时候，抽雄天数就是统计从播种到抽雄所需天数。散粉天数(DTA)：玉米散粉是指植株雄穗主轴有三分之一以上开始散粉的时候，散粉天数就是统计从播种到散粉所需天数。吐丝天数(DTS)：玉米吐丝是指植株雌穗的花丝从苞叶中伸出2cm左右的时候，吐丝天数就是统计从播种到吐丝所需天数。为保证数据的准确性，性状调查是在每天固定的时间点，按照固定的行进路线，对每一株玉米的生长状况进行统计。为排除前期出苗状况对最终开花时间的影响，我们也统计了播种36天后的叶片数。初定位群体最终的表型数据如图所示，可见不同的开花期数据间表现出很强的相关性(图2)。与我们起初预期的一样，两套初定位群体也表现出因ZmCCT10位点基因型的差异，而造成的开花期差异。S Population的开花时间要早于R Population(图3)。
QTL初定位过程中的分子标记连锁分析，遗传图谱构建和QTL定位都是在QTLIciMapping软件中完成的。首先，使用软件中的BIN功能删除在F2群体中完全连锁的冗余标记。同时，也将缺失率≥20％和最小等位基因频率≤0.05的无效标记一并删除。运行完BIN功能后，会获得一个过滤掉冗余标记和无效标记的文件，其扩展名为“.map”。将这个文件导入到MAP功能中，来构建遗传连锁图谱。因为标记的物理位置已知，在对标记进行分组和排序的时候，直接选择“By Anchor”。最后会生成一个扩展名为“.bip”的文件，里面包含了构建的遗传连锁图谱的所有信息。因为是双亲群体，随后将这个文件导入到BIP功能来进行QTL分析，点击BIP功能中的“MAP”可以用来绘制遗传连锁图谱。QTL检测和效应评估采用的方法为完备区间作图法(inclusive composite interval mapping，ICIM)。该方法因其两步定位的策略可以对遗传背景进行很有效的控制。在将重组频率(r)转化为遗传距离(cM，m)的时候，选择的是Kosambi算法，具体计算公式为：
最终，在S Population和R Population中检测到的QTL如图4所示。在RPopulation中我们总共检测到17个QTL，其中4个QTL调控DTH，6个QTL调控DTA，7个QTL调控DTS(表1)。在S Population中我们总共检测到9个QTL，其中1个QTL调控DTH，4个QTL调控DTA，4个QTL调控DTS(表2)。通过比对，我们确实在R Population中找到一个单独存在的QTL，位于3号染色体，将其命名为qPss3。qPss3，可能就是我们寻找的抑制光周期敏感性QTL。
表1、R群体中检测到的QTL及其相应的参数值
表2、S群体中检测到的QTL及其相应的参数值
实施例2、qPss3的精细定位
精细定位引物设计，在maize GDB(http://www.maizegdb.org/)上公布的B73v4.0参考基因组中，查看QTL定位区段内的序列信息，寻找合适的物理位置进行分子标记的开发。位置选择的原则是尽量能将定位区间等分，一般是开发4对引物将定位区间5等分。二是尽量能避开基因组上的高度重复序列，一般在注释基因附近的序列重复率较低。然后下载目标位置处的序列信息。先用SSR hunter软件查找序列中的SSR序列，优先选择重复元件碱基数较多，重复次数也较多的SSR序列。将这些SSR序列上传到在线引物设计网站IDT(http://sg.idtdna.com/Primerquest/Home/Index)，引物的参数一般选择网站默认的参数，注意扩增片段要跨SSR序列。用网站推荐的引物和多种迥异的扩增程序，扩增两个亲本和F1杂交种，再电泳检测，挑选那些有多态性和特异性的共显性引物。用挑出引物和高保真酶扩增两个亲本、PCR产物送测序，确保扩增出来的序列能比对到参考基因组相对应的位置。如果没有合适的SSR序列，将整段序列都上传到IDT网站进行引物的设计。为了提高设计成功效率，先设计能扩增1,500bp—2,000bp的长片段引物。如果长片段引物有多态性，再根据测序的结果，针对差异序列设计引物，以达到优化引物的目的。在精细定位的过程中，我们总共开发了18对分子标记(表3)。检测基因型时，先用SDS法提取DNA，再进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，后用琼脂糖凝胶电泳分离，最后放置在凝胶成像仪中成像。
表3、qPss3精细定位过程中用到的分子标记列表
QTL精细定位的方法采用重组后代验证法，该方法强调影响精细定位的关键要素有三个：标记密度、重组频率和准确的表型鉴定。在每一代中，利用遗传连锁图谱的高密度分子标记，来筛选在QTL定位区段内发生重组的单株，自交或回交留种。将产生的后代种植在一个小区内，用定位区段内杂合区间的引物检测所有植株的基因型，并调查每个植株的表型。根据基因型数据，可以将后代分为两组(回交)或三组(自交)基因型不同的小组，统计每组的表型数据。利用单因素方差分析(ANOVA)检测不同基因型之间的表型值是否有显著差异。如果是自交后代，在方差分析显著后，再用t-test检测两个纯合亲本基因型间的表型差异是否显著。如果表型差异显著，则说明这些后代的重组亲本在杂合区间内携带能引起表型差异的目标QTL。最后，通过比较不同重组单株在杂合区间内是否携带QTL和供体亲本片段的大小，可以精确定位目标QTL的区间。
为了能精细定位qPss3，我们从R群中挑选出了杂合区段能覆盖整个qPss3定位区间的F2单株，并允许它们自交。我们将这些自交后代种在海南三亚的冬季苗圃，利用qPss3区间两侧的分子标记筛选重组单株。最终，我们获得了8个F3重组单株，并将这些重组单株全部自交获得了F4后代。为了能准确的确定这些重组单株的重组断点，我们在qPss3的定位区间内开发了9个新的分子标记。利用这些标记对8个F3重组单株的重组类型进行划分，总共得到了8种重组类型(I-VIII，图5a)。2018年，我们将来自这8个重组单株的894个自交后代全部种在了北京，在长日照条件下调查它们与开花时间相关的三个性状，DTH、DTA和DTS。我们选择位于杂合区段内的分子标记，对所有的F4植株进行了基因型分型，以确定每株的基因型属于纯合A5302(A5302/A5302)、纯合Chang7-2(Chang7-2/Chang7-2)和杂合(A5302/Chang7-2)中的哪一种。再来计算每组基因型中开花时间性状的平均值，并利用单因素方差分析来检验它们之间的差异是否显著。如果基因型之间的表型差异显著(p<0.05)，则表明杂合区段中存在qPss3；如果差异不显著，则表明qPss3缺失或qPss3位于杂合区段之外。重组类型I-IV相较于重组类型V-VIII，至少有一个开花时间性状在三种基因型间存在显著差异(p<0.05)。关键重组类型I(含有qPss3)和V(不含qPss3)，可以将qPss3定位区间的左边界限定在分子标记P3211，右边界限定在分子标记P3290。参照B73的基因组序列(B73 RefGen_v4)，这两个分子标记之间的物理距离大约为7.9Mb。
考虑到F3重组单株的数据不足以将qPss3限定在一个很小的定位区间内，我们构建了一个F5群体来筛选更多的重组单株，用于进一步的精细定位。在2018年海南的冬季苗圃中，我们获得了23个F5重组单株，可以将它们划分为16种重组类型(图5b)。2019年在北京(LD)，我们调查了2609株F6植株的表型(DTH、DTA和DTS)和基因型。我们发现，重组类型I-VII和XIII-XV在三组基因型之间表现出开花时间性状的显著差异(p<0.05)，而其余的重组类型(VIII-XII，XVI)都没有显著差异(p>0.05)(图5b)。关键重组类型I和II可以帮助我们将右侧边界从分子标记P3290缩小至P3228；另外两个关键重组类型XIII和XIV，让我们进一步确定左侧边界就为分子标记P3211。参照B73的基因组序列(B73 RefGen_v4)，这两个分子标记之间的物理距离大约为1.7Mb。
2019年，我们在海南种植了更大的F7群体，在qPss3新定位的区间内，共筛选到33个重组单株，并将它们划分为13种重组类型(图5c)。2020年，我们在北京(LD)检测了2525株F8植株的基因型，并对它们的表型(DTH、DTA和DTS)进行了统计。在13个重组类型中，II、V、VII、VIII、XI和XII型的开花时间差异在三组基因型之间显著(p<0.05)。而其余重组类型(I、III、IV、VI、IX、X和XIII型)的开花时间差异在三组基因型之间不显著(p>0.05)(图5c)。许多重组类型的断点都非常接近，这使得我们能够将qPss3缩小到一个相对较小的定位区间。关键重组类型III、IV、XI和XII可以将右侧边界标记从P3228移动到PO32247-1，而关键重组类型II、IX和X可以将左侧边界标记从P3211移动到P32235-3。在qPss3定位区间纯合的双交换重组类型VI，开花时间性状在三组基因型之间没有显著差异，进一步证实了精细定位的结果。参照B73的基因组序列(B73 RefGen_v4)，这两个分子标记之间的物理距离大约为120kb。
2020年，我们在海南总共筛选到了12个F9重组单株，并将它们划分为7种重组类型(图5d)。2021年在北京(LD)，我们调查了992株F10植株的表型(DTH、DTA和DTS)和基因型。我们发现，重组类型I，III-V在三组基因型之间表现出开花时间性状的显著差异(p<0.05)，而其余的重组类型(II，VI和VII)都没有显著差异(p>0.05)(图5d)。关键重组类型V和VII可以帮助我们将右侧边界从分子标记PO32247-1缩小至P32237-1；关键重组类型I，让我们进一步确定左侧边界就为分子标记P32235-3。参照B73的基因组序列(B73 RefGen_v4)，这两个分子标记之间的物理距离大约为17kb。
实施例3、在不同日照条件下qPss3影响开花期的遗传效应
在精细定位过程中，我们对qPss3在不同日照条件下影响DTH、DTA和DTS的遗传效应进行了评估。2019年，根据上面提到的精细定位结果，我们挑选出了杂合区段包含qPss3的重组单株所产生的后代。我们将这些植株汇集到一起，然后利用精细定位中的基因型数据重新分组，再计算每组基因型中DTH、DTA和DTS的平均值(图6a)。在qPss3位点，A5302等位基因与Chang7-2等位基因相比，以完全显性的方式分别将DTH、DTA和DTS提前了大约2.0天，2.0天和2.7天。同样的，2020年北京，qPss3分别将DTH、DTA和DTS提前了大约1.7天，1.7天和1.8天(图6b)。
2017年和2018年，在海南(SD)冬季苗圃，我们也评估了qPss3对开花时间的遗传效应。在短日照条件下，明显有别于长日照条件下，qPss3对DTH、DTA和DTS都没有影响，三组基因型间各个性状的差异都没有达到显著水平(图6c，d)。这两季用于检测基因型的分子标记分别为SSR317-T1和P3248。这些结果进一步证实，qPss3仅在长日照条件下以完全显性的方式抑制ZmCCT10介导的光周期敏感性，开花时间显著提前。
实施例4、qPss3对不同光周期敏感基因的遗传效应
为了验证qPss3对光周期敏感性的抑制作用，我们从Chang7-2H1/H1(qPss3位点处为隐性基因型，ZmCCT10位点处为H1/H1)与R群纯合单株(qPss3位点处为显性基因型，ZmCCT10位点处为H5/H5)杂交的后代中，开发了一个次级F2分离群体。我们从它们杂交的后代中选择了一个F1单株自交，以产生在qPss3位点和ZmCCT10位点都在分离的F2群体。然后利用这个群体来研究不同基因型组合间的开花时间差异。从双因素方差分析的结果来看，ZmCCT10和qPss3都能显著影响开花时间，因为DTH、DTA和DTS的F值都大于F临界值(表4)。此外，它们之间的相互作用也会显著影响开花时间，因为F(interaction)＝26.39(DTH)/23.18(DTA)/24.49(DTS)>2.37＝F0.05(4,1871)。这种影响是否是抑制光周期敏感性？qPss3位点处纯合显性基因型(+/+)与纯合隐性基因型(-/-)相比，能强烈抑制纯合H5/H5基因型在延迟开花时间方面的作用，并且对其它两种基因型H1/H1和H1/H5也有一定的抑制作用(图7)。qPss3位点处杂合基因型(+/-)在抑制ZmCCT10介导的开花时间延迟方面，具有与纯合显性基因型(+/+)几乎相同的效果。
表4、用不等重复双因素方差分析研究ZmCCT10和qPss3对相关性状的影响
巧合的是，我们发现在这个F2群体中，ZmCCT9位点也像之前报道的，按照启动子上游57kb处的Harbinger-like转座子存在或缺失，而处于分离状态。于是，我们还研究了qPss3对ZmCCT9介导的光周期敏感性是否也有抑制作用。从双因素方差分析的结果来看，F(interaction)＝13.93(DTH)/18.23(DTA)/15.96(DTS)>2.37＝F0.05(4,1871)，ZmCCT9和qPss3之间确实存在能显著影响开花时间的相互作用(表5)。我们进一步观察到，qPss3位点的纯合显性基因型(+/+)和杂合基因型(+/-)都有效地抑制了ZmCCT9位点纯合无转座子基因型(AA)引起的光周期敏感性，导致开花时间明显提前。ZmCCT9位点另外两种基因型(Aa和aa)没有表现出显著的光周期敏感性。有趣的是，qPss3位点处的杂合基因型(+/-)似乎比纯合基因型(+/+)更能有效地抑制光周期敏感性(图7)。以上这些结果表明，qPss3可能是编码有CCT结构域蛋白基因引起的光周期敏感的抑制因子。
表5、用不等重复双因素方差分析研究ZmCCT9和qPss3对相关性状的影响
实施例5、qPss3对ZmCCT10调控茎腐病的遗传效应
由于受气候和环境条件的影响，玉米茎腐病的自然发病率在不同年份和不同地块间有很大的差异。在评估玉米茎腐病抗性的时候，为了确保田间发病的一致性，我们会将所有的材料种植在病圃，并对每一株人工接种病原菌。人工接种的病原菌为四种禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)亚种的混合菌。
对茎腐病的调查分三次进行。第一次调查茎腐病抗性的时间是接种后的40天左右，然后再每隔1周进行两次调查。第一次是根据叶片是否提前枯萎来判断抗感；第二次是根据茎基部是否松软来判断抗感；第三次是将茎秆基部连同根一起纵向劈开，观察内部髓组织的腐烂状况和红色真菌菌丝生长情况来判断抗感。最后将三次的统计结果整合到一起，使用一个包含HR、R、MR、MS、S和HS的六级评估系统，对每株玉米的茎腐病严重程度进行评估。其中“HR”表示高抗，“HS”表示高感(表1)。在评估一个群体的感病程度的时候我们引入了病情指数(disease severity index，DSI)的概念。先分别将0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0按序赋值给六级的茎腐病严重程度等级，来对等级进行量化，以便于计算DSI(表6)。DSI的计算公式如下：
公式中“1”表示给高感植株所赋予的值。
表6、茎腐病症状评估和表型界定
2020年北京，我们利用实施例4中qPss3、ZmCCT10和ZmCCT9三个位点同时分离的F2群体，人工接种了禾谷镰刀菌(F.graminearum)，来调查这些植株对茎腐病的抗性。我们没有发现以往报道的现象，即当茎腐病抗性越高时，开花时间也越晚(图8a)。DSI与DTH、DTA和DTS之间的相关系数分别为-0.19、-0.18和-0.21。通常，ZmCCT10位点两种基因型(H5/H5和H5/H1)能导致茎腐病抗性显著增加；而qPss3位点两种能导致开花时间提前的基因型(+/+和+/-)，没有显著影响茎腐病抗性(图9a，b)。在双因素方差分析的结果中，F(qPss3)＝2.57<3.01＝F0.05(2,1871)，这也表明对茎腐病抗性没有影响(表4)。这些结果表明，ZmCCT10介导的抗病性与开花时间无关，至少在本研究群体中是这样的。这种效应的缺失至少部分是由于qPss3，它似乎解除了ZmCCT10介导的开花时间和茎腐病抗性之间的强相关性。
为了进一步了解qPss3对这两类性状的影响，我们统计了qPss3位点和ZmCCT10位点9种不同基因型组合下的茎腐病抗性。整体而言，qPss3部分降低了ZmCCT10介导的茎腐病抗性。然而当qPss3(+/-)位点和ZmCCT10(H1/H5)位点同时处于杂合状态时的植株，依旧表现出对茎腐病很强的抗性，类似于在qPss3位点为隐性基因型(-/-)时，H1/H5和H5/H5基因型所表现出的抗性(图8b)。事实上，在双因素方差分析的结果中，F(interaction)＝9.51>2.37＝F0.05(4,1871),表明qPss3和ZmCCT10之间的相互作用削弱了ZmCCT10介导的茎腐病抗性(表4)。这些观察结果表明，在某些基因型中，qPss3介导的抑制光周期敏感性导致开花提前，但不会降低茎腐病抗性。
同时，我们还研究了ZmCCT9对茎腐病抗性的影响，发现茎腐病抗性在三种基因型之间并没有显著差异(图9c)。此外，ZmCCT9和qPss3位点的9种基因型组合中，没有一种在DSI值上表现出显著差异。双因素方差分析的结果也表明，ZmCCT9、qPss3及其它们之间的相互作用对茎腐病抗性都没有影响(表5)。最后，我们计算了qPss3、ZmCCT10和ZmCCT9位点上所有27种基因型组合下的开花时间性状和DSI值。当这些基因型按照开花时间从晚到早排布时，开花时间较早的9种基因型在ZmCCT10位点均为H1/H1，并表现出严重的茎腐病。开花时间最迟的9种基因型大多为纯合H5/H5，而开花时间居中的9种基因型主要是杂合H1/H5(图8c)。当ZmCCT10和ZmCCT9位点都是光周期敏感类型等位基因时，qPss3促进开花的效应能达到5.0天以上；显著强于当单位点是光周期敏感类型时，大约为3.0天的qPss3遗传效应。对于在ZmCCT10位点为H1/H5的基因型，我们没有观察到开花时间与茎腐病抗性之间的密切联系。值得注意的是，在qPss3和ZmCCT10位点都处于杂合型的植株表现出较高的茎腐病抗性和适中的开花时间，这种可能是最佳的等位基因组合。这种等位基因组合有望在优良玉米品种的选育中发挥十分重要的价值。
实施例6、ZmNPR1I基因的获得和克隆
为了能克隆qPss3的功能基因，从精细定位群体中开发了一对近等基因系NIL-qPss3Chang7-2和NIL-qPss3A5302(一对遗传背景相似，只在目标QTL区段基因型不同的材料)，并对其相关性状进行观察。
首先，调查了这对近等基因系的开花期性状。与NIL-qPss3Chang7-2相比，NIL-qPss3A5302的DTH、DTA和DTS提前大约2.6天、2.4天和2.8天(图10)。观测茎尖分生组织的发育过程，近等基因系之间的开花时间差异从V10期就已经开始显现(图11)。从散粉期植株的形态来看，近等基因系间不管是株高、穗位高，还是总叶片和穗上叶片数，并没有明显差别(图12a)。最后，通过人工接种禾谷镰刀菌发现不管是NIL-qPss3A5302还是NIL-qPss3Chang7-2对茎腐病都表现出很高的抗性(图12b)。
为了测定候选基因的表达，首先用TRIzol提取了近等基因系的RNA和蛋白质。再用北京全式金生物技术有限公司的EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNASynthesis SuperMix试剂盒(目录号：AE311)合成了cDNA。
进一步检测了定位区间两侧基因的表达，以表达量的差异显著性为标准来确定候选基因。
在用RT-PCR检测目的基因表达情况之前，要先用内参基因(选用GADPH)对样本cDNA浓度进行调整，使所有样本的cDNA浓度趋于一致。
根据RT-PCR的结果，只有Zm00001d039997(ZmNPR1I)基因在叶片和SAM(茎尖分生组织，shoot apical meristem)中都有很稳定的表达，且在叶片中的表达似乎在近等基因系间存在差异(图13)。
为检测ZmNPR1I在近等基因系间差异表达的真实性，我们利用qRT-PCR和WesternBlot测定ZmNPR1I的表达量。
将反转录生成的cDNA稀释50倍进行qRT-PCR扩增，检测目的基因在不同样本间的差异表达情况。qRT-PCR数据的分析方法采用的2-ΔΔCt法。在进行qRT-PCR之前，先根据自己样本的特性选择合适的内参基因，就是找在不同样本间表达量稳定的基因做内参。
根据qRT-PCR的结果，ZmNPR1I在NIL-qPss3Chang7-2中的表达，从光照6小时开始要显著高于在NIL-qPss3A5302中的表达(图14)。ZmCCT10在NIL-qPss3A5302中的表达量要显著高于在NIL-qPss3Chang7-2中的表达量。ZmNPR1I和ZmCCT10的表达似乎存在一种拮抗关系，当ZmNPR1I表达量高时会抑制ZmCCT10的表达。而NIL-qPss3A5302中成花素基因ZCN8的表达量要高于NIL-qPss3Chang7-2，最终造成开花时间提前。
在Western Blot的结果中，ZmNPR1I和ZmCCT10在蛋白水平也存在这种拮抗关系(图15)。在NIL-qPss3Chang7-2中，ZmNPR1I的转录水平较高，最后的蛋白翻译水平也较高。而升高的ZmNPR1I蛋白水平，又会抑制ZmCCT10的蛋白水平。以上结果暗示ZmNPR1I很可能是qPss3的功能基因。
本实施例从玉米自交系B73中分离克隆出ZmNPR1I基因。ZmNPR1I基因的编码序列如SEQ ID No.1所示，其编码的蛋白质名称为ZmNPR1I蛋白，ZmNPR1I蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
实施例7、ZmNPR1I转基因功能验证
为确认ZmNPR1I是qPss3的功能基因，创制了转基因材料来验证ZmNPR1I基因在不同日照条件下调控开花期方面的功能。
一、构建过表达转ZmNPR1I基因玉米
1、重组表达载体的构建
先用XcmI酶酶切载体pBECXUN(CAUC2829)(图16)，同时从玉米自交系B73中扩增ZmNPR1I基因。最后，以TA连接的将上述两个片段连接到一起。利用热激转化的方法，将重组的载体转入到Trans1-T1Phage Resistant化学感受态细胞，进行扩繁。再挑取单克隆扩繁后提取质粒送测序，将测序得到的序列与目的序列进行比对。选择序列完全相匹配的质粒转入到农杆菌EHA105后，送中国农业大学玉米功能基因组平台进行遗传转化。
2、转基因玉米的获得
转基因玉米是从中国农业大学玉米功能基因组平台获得，中国农业大学玉米功能基因组平台培育转基因玉米采用的方法为农杆菌介导的遗传转化法。该方法的简要步骤如下：首先，分离未成熟的玉米胚将其与携带有目的基因载体的农杆菌共培养；其次，诱导转化后的未成熟胚产生愈伤组织；然后，愈伤组织再生并进行阳性苗筛选。最后，我们会从转基因平台获得不同转基因阳性事件的T0代种子。一般根据实验的需求，我们会将T0代种子与定位群体的亲本先进行杂交，再不断回交。获得特殊遗传背景下的转基因种子。
3、转基因玉米ZmNPR1I基因的表达量分析
将转基因玉米种子种植在大田，待植株长到5叶期的时候取叶片，提取DNA。再用检测重组载体上Bar的引物(Bar-F：5’-GAAGGCACGCAACGCCTACGA-3’，Bar-R：5’-CCAGAAACCCACGTCATGCCA-3’)检测基因型，来鉴别转基因阳性植株和转基因阴性植株。再待植株长到8叶期的时候，分别取转基因阳性植株和转基因阴性植株的叶片，用TRIzol试剂提取总RNA。用EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒，将总RNA反转录成cDNA。再以cDNA为模板，用TB Green Premix Ex Taq II试剂检测相关基因的表达量。这些基因包括内参基因18s rRNA，目的基因ZmNPR1I和ZmCCT10，以及与玉米开花时间紧密相关的成花素基因。通过实时荧光定量PCR获得的数据，采用2-ΔΔCt法进行分析。得到的结果是经过内参基因表达水平校准的实验组中目的基因相对于对照组中目的基因增加或减少的倍数。具体的计算方法为：
ΔCT(test)＝CT(target,test)-CT(reference,test)
ΔCT(control)＝CT(target,control)-CT(reference,control)
然后，用对照组的ΔCT值归一化实验组的ΔCT值：ΔΔCT＝ΔCT(test)-ΔCT(control)。
最后计算表达水平比率：实验组相对对照组的表达量＝2-ΔΔCT。
4、转基因玉米的开花时间性状考察
考察转基因玉米开花时间的性状包括：抽雄天数，散粉天数和吐丝天数。
抽雄天数(DTH)：玉米抽雄是指植株雄穗尖端露出顶叶(3－5cm)的时候，抽雄天数就是统计从播种到抽雄所需天数。
散粉天数(DTA)：玉米散粉是指植株雄穗主轴有三分之一以上开始散粉的时候，散粉天数就是统计从播种到散粉所需天数。
吐丝天数(DTS)：玉米吐丝是指植株雌穗的花丝从苞叶中伸出2cm左右的时候，吐丝天数就是统计从播种到吐丝所需天数。
为保证数据的准确性，性状调查是在每天固定的时间点，按照固定的行进路线，对每一株玉米的生长状况进行统计。
详细的操作流程如下所示：
用XcmI酶酶切载体pBECXUN(CAUC2829)后，电泳鉴定酶切效果，显示条带大小符合载体的实际大小(图17)。用引物ZmNPR1I-F：5’-ATGGACGCGAGCGCGGCCAC-3’和ZmNPR1I-R：5’-CTACGCCTGG ACGCGCGCCG-3’，从B73中扩增ZmNPR1I基因，从电泳结果可见扩增条带大小大致为450bp，与ZmNP R1I基因的实际大小一致(图18)。将上述两个条带切胶回收，采用TA连接的方式进行连接，构成完整的重组表达载体。再将连接好的载体通过热激转化的方式转入到Trans1-T1 Phage Resistant感受态细胞，进行扩繁。随后，挑取单克隆通过PCR鉴定的方法筛选阳性克隆(图19)。再将阳性克隆进行扩繁后提取质粒送测序，将得到的序列与目的序列进行比对，确保构建的载体准确无误(图20)。将构建好的重组表达载体转入到农杆菌EHA105后，送中国农业大学玉米功能基因组平台进行遗传转化。
经过大约一年时间，我们从中国农业大学玉米功能基因组平台获得了含有重组pBECXUN(CAUC2829)载体的T0代转基因种子，共计4包。这4包T0代转基因种子属于不同的转基因事件，分别命名为：OE#1，OE#2，OE#3和OE#4。将这些种子种植于海南，用Bar引物挑选转基因阳性克隆(图21)。将OE#1和OE#2事件中的转基因阳性植株与Chang7-2H1/H1进行杂交，将OE#3和OE#4事件中的转基因阳性植株与Chang7-2H5/H5进行杂交，以此获得T1代种子。随后将T1代种子，种植在北京长日照条件下，待植株待植株长到5叶期的时候取叶片，提取DNA。再用Bar引物检测基因型，来鉴别转基因阳性植株和转基因阴性植株(图22)。再待植株长到8叶期的时候，分别取转基因阳性植株和转基因阴性植株的叶片，用TRIzol试剂提取总RNA。将总RNA反转录成cDNA。再以cDNA为模板检测相关基因的表达量，获得每个样本中各个被检测基因的Ct值(样品反应曲线与阈值线相交处的PCR循环数)(图23)。再用2-ΔΔCt法计算目的基因相对于对照组中目的基因增加或减少的倍数。一般每种材料取3个样本为3个生物学重复，最后用3个生物学重复的均值表示最终值。经过量化的目的基因表达量用图表进行展示(图24)。
图24a显示的4个转基因事件中，ZmNPR1I在转基因阳性植株(Transgenic plants)和转基因阴性植株(Nontransgenic plants)中的表达量。从图中的展示的结果可以看出，ZmNPR1I在转基因阳性植株中的表达量都要高于转基因阴性植株，且差异都达到了显著水平。图24b显示的4个转基因事件中，ZmCCT10在转基因阳性植株和转基因阴性植株中的表达量。从图中的展示的结果可以看出，ZmCCT10在转基因阳性植株中的表达量都要低于转基因阴性植株，且差异都达到了显著水平。图24c显示的4个转基因事件中，ZCN8在转基因阳性植株和转基因阴性植株中的表达量。从图中的展示的结果可以看出，ZCN8在转基因阳性植株中的表达量都要低于转基因阴性植株，且差异都达到了显著水平。从表达量检测的结果可以看出，在获得的4个ZmNPR1I过表达事件中，ZmNPR1I的表达量都得到了提升。并且ZmNPR1I与ZmCCT10之间存在相互拮抗的关系，即转基因阳性植株中ZmNPR1I的表达量升高，会造成ZmCCT10的表达量降低。ZmNPR1I与ZCN8之间也存在相互拮抗的关系，即转基因阳性植株中ZmNPR1I的表达量升高，也会造成ZCN8的表达量降低。
最后统计所有T1代植株的开花时间表型，将结果用图表展示(图25)。从图中的展示的结果可以看出，ZmNPR1I过表达材料的四个转基因事件中，转基因阳性植株的开花时间都要晚于转基因阴性植株，且差异达到了极显著水平。DTH，DTA和DTS三个开花时间性状，都表现出这样的规律。在OE#1事件中，转基因阳性植株的DTS比转基因阴性植株晚了3.1天。在OE#2事件中，转基因阳性植株的DTS比转基因阴性植株晚了2.6天。在OE#3事件中，转基因阳性植株的DTS比转基因阴性植株晚了2.9天。在OE#4事件中，转基因阳性植株的DTS比转基因阴性植株晚了4.4天。整体呈现，转基因阳性植株开花时间推迟的天数，在B73与Chang7-2H5 /H5杂交的背景中，要多于在B73与Chang7-2H1/H1杂交的背景中。这与qPss的遗传效应，在R群中强于S群的结果相一致。
以上结果表明，过表达ZmNPR1I基因可以显著延迟玉米开花时间。
二、构建ZmNPR1I基因敲除玉米
1、基因编辑载体的构建
ZmNPR1I基因编辑载体的构建是委托中国农业大学转基因平台完成的，所用到的载体为pXUE411C-BG(图26)。载体构建的大致流程为：
1)登录到网站http://www.genome.arizona.edu/crispr/CRISPRsearch.html，筛选靶点。靶点最好带酶切位点【Cas9切割点(离PAM/NGG 3bp)位于酶切位点中】。也可以手动设计靶点，然后到http://www.rgenome.net/cas-offinder/网站评估脱靶情况。
2)设计引物，引物结构如下：
MT1T2-BsF:5’-AATAATGGTCTCAGGCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’，
MT1T2-F0:5’-GNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’，
MT1T2-R0:5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNCGCTTCTTGGTGCC-3’，
MT1T2-BsR:5’-ATTATTGGTCTCTAAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’。
将1个19-nt靶点序列(5’-GGAGTTCTACGCCATCCTG-3’，SEQ ID No.3)替换引物F0/BsF中的19-ntN；另一个19-nt靶点的倒转互补序列替换-R0/BsR中的19-nt N。
3)PCR扩增：以稀释100倍的pCBC-MT1T2为模板进行四引物PCR扩增。-BsF/-BsR为正常引物浓度；-F0/-R0稀释20倍。
4)纯化回收PCR产物，建立如下酶切-连接体系(restriction-ligation)：
反应体系：PCR片段：2μl；pBUE411：2μl；10x NEB T4 Buffer：1.5μl；10x BSA：1.5μl；BsaI(NEB)：1μl；T4 Ligase(NEB)/高浓度：1μl；ddH2O：6μl。
反应条件：依次在37℃放置5小时，50℃放置5分钟，80℃放置10分钟。
5)取5μl转化大肠杆菌感受态。用卡那(Kan)抗性的培养板筛选。以OsU3-FD3和TaU3-RD为引物进行菌落PCR鉴定，并用引物OsU3-FD3和TaU3-FD2测序确认。
OsU3-FD3：5’-GACAGGCGTCTTCTACTGGTGCTAC-3’，
TaU3-RD：5’-CTCACAAATTATCAGCACGCTAGTC-3’，
TaU3-FD：5’-TTAGTCCCACCTCGCCAGTTTACAG-3’，
TaU3-FD2：5’-TTGACTAGCGTGCTGATAATTTGTG-3’。
6)选择序列完全相匹配的质粒转入到农杆菌EHA105后，送中国农业大学玉米功能基因组平台进行遗传转化。
2、ZmNPR1I基因敲除玉米的获得
ZmNPR1I基因敲除玉米是从中国农业大学玉米功能基因组平台获得，中国农业大学玉米功能基因组平台培育转基因玉米采用的方法为农杆菌介导的遗传转化法。该方法的简要步骤如下：首先，分离未成熟的玉米胚将其与携带有目的基因载体的农杆菌共培养；其次，诱导转化后的未成熟胚产生愈伤组织；然后，愈伤组织再生并进行阳性苗筛选。最后，我们会从转基因平台获得不同转基因阳性事件的T0代种子。一般根据实验的需求，我们会将T0代种子与定位群体的亲本先进行杂交，再不断回交。获得特殊遗传背景下的转基因种子。
3、基因编辑植株的测序
将ZmNPR1I基因敲除玉米种植在大田，等植株长到5片叶的时候。取叶片提取DNA，以KO-F和KO-R为引物进行扩增。扩增产物先用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，从中挑选纯合被编辑的植株。再将扩增产物送生物公司进行测序，测序引物也是KO-F和KO-R。将测序结果与ZmNPR1I基因的原始序列进行比对，确定ZmNPR1I基因被编辑的类型。
KO-F：5’-ATGGACGCGAGCGCGGCCAC-3’，
KO-R：5’-CGCCTGGACGCGCGCCGAGC-3’。
4、基因编辑植株的开花时间性状考察
考察基因编辑植株开花时间的性状包括：抽雄天数，散粉天数和吐丝天数。为保证数据的准确性，性状调查是在每天固定的时间点，按照固定的行进路线，对每一株玉米的生长状况进行统计。
详细的操作流程如下所示：
经过大约一年时间的等待，我们从中国农业大学玉米功能基因组平台获得了ZmNPR1I基因敲除玉米的T0代转基因种子。将T0代转基因种子与A5302H1/H1进行回交，拿到T1代转基因种子。再将T1代转基因种子种在大田。等植株长到5片叶的时候，取叶片提取DNA，以KO-F和KO-R为引物进行扩增。扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，从中挑选杂合带型的植株进行自交，获得T2代转基因种子。种植T2代转基因种子。等植株长到5片叶的时候，取叶片提取DNA，以KO-F和KO-R为引物进行扩增。扩增产物先用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，再挑选纯合被编辑植株的扩增产物送生物公司进行测序，测序引物也是KO-F和KO-R(图27)。将测序结果与ZmNPR1I基因的原始序列进行比对，最终获得了4种类型的基因编辑事件(图28)。将这4个事件分别命名为KO#1，KO#2，KO#3和KO#4。KO#1事件与ZmNPR1I基因的原始序列(WT)相比，缺失了23bp。KO#2事件与ZmNPR1I基因的原始序列(WT)相比，缺失了22bp。KO#3事件与ZmNPR1I基因的原始序列(WT)相比，缺失了65bp。KO#4事件与ZmNPR1I基因的原始序列(WT)相比，缺失了89bp。这些缺失的序列都位于ZmNPR1I蛋白的关键结构域NPR1_interact结构域中。分别找到与每个基因编辑事件所对应的杂合被编辑植株进行自交，获得T3代转基因种子。
将T3代转基因种子种植在大田。等植株长到5片叶的时候，取叶片提取DNA，以KO-F和KO-R为引物进行扩增。扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，总共会有3种类型的条带，对应纯合被编辑植株(ZmNPR1I-KO)，杂合被编辑植株(Heterozygous)和野生型植株(WT)。最后统计所有T3代植株的开花时间表型，分不同基因编辑事件将结果用图表展示(图28)。
在图28a中，纯合编辑材料(ZmNPR1I-KO#1)的三个开花时间性状都要早于野生型(WT)，且差异达到了显著水平。DTH性状在两者间相差了2.07天，DTA性状在两者间相差了2.29天，DTS性状在两者间相差了1.90天。在图28b中，纯合编辑材料(ZmNPR1I-KO#2)的三个开花时间性状都要早于野生型(WT)，且差异达到了显著水平。DTH性状在两者间相差了3.54天，DTA性状在两者间相差了2.40天，DTS性状在两者间相差了2.32天。在图28c中，纯合编辑材料(ZmNPR1I-KO#3)的三个开花时间性状都要早于野生型(WT)，且差异达到了显著水平。DTH性状在两者间相差了2.80天，DTA性状在两者间相差了3.03天，DTS性状在两者间相差了3.76天。在图28d中，纯合编辑材料(ZmNPR1I-KO#4)的三个开花时间性状都要早于野生型(WT)，且差异达到了显著水平。DTH性状在两者间相差了2.74天，DTA性状在两者间相差了1.83天，DTS性状在两者间相差了2.65天。在ZmNPR1I-KO#1，ZmNPR1I-KO#2和ZmNPR1I-KO#4事件中，杂合编辑类型(Heterozygous)植株的开花时间表型与纯合编辑类型相近，两者之间的差异大多未达到显著水平。
以上结果表明，将ZmNPR1I基因敲除后可以显著缩短玉米开花时间。
综上可见，ZmNPR1I基因就是qPss3的功能基因，具有调控玉米开花时间的功能。过表达ZmNPR1I基因可以显著延迟玉米开花时间(图25)。将ZmNPR1I基因敲除后可以显著缩短玉米开花时间(图28)。qPss3调控开花时间的遗传效应受光周期影响，只在长日照条件下起作用，而在短日照条件下不起作用(图6)。所以ZmNPR1I是通过光周期途径来调控玉米开花的。qPss3调控开花时间的遗传效应还受到ZmCCT10位点的影响。当ZmCCT10位点是光周期敏感单倍型H5H5时，qPss3促进开花的效应强于当ZmCCT10位点是光周期不敏感单倍型H1H1时(图7)。也就是说qPss3调控玉米开花是通过抑制ZmCCT10对光周期的敏感性来发挥作用的。所以qPss3能抑制玉米的光周期敏感性。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (10)

1.蛋白质的应用，其特征在于，所述应用为下述任一种：
D1)在调控植物开花时间中的应用；
D2)在培育开花时间提前或延迟的植物中的应用；
D3)在调控植物光周期敏感性中的应用；
D4)在培育弱光周期敏感性的植物中的应用；
所述蛋白质为下述任一种：
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；
A2)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蛋白质来源于玉米。
3.与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料的应用，其特征在于，所述应用为下述任一种：
E1)在调控植物开花时间中的应用；
E2)在培育开花时间提前或延迟的植物中的应用；
E3)在调控植物光周期敏感性中的应用；
E4)在培育弱光周期敏感性的植物中的应用；
所述生物材料为下述任一种：
B1)编码权利要求1或2中所述蛋白质的核酸分子；
B2)抑制或降低权利要求1或2中所述蛋白质编码基因表达的核酸分子；
B3)含有B1)和/或B2)所述核酸分子的表达盒；
B4)含有B1)和/或B2)所述核酸分子的重组载体、或含有B3)所述表达盒的重组载体；
B5)含有B1)和/或B2)所述核酸分子的重组微生物、或含有B3)所述表达盒的重组微生物、或含有B4)所述重组载体的重组微生物；
B6)含有B1)和/或B2)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B3)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B7)含有B1)和/或B2)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B3)所述表达盒的转基因植物组织；
B8)含有B1)和/或B2)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B3)所述表达盒的转基因植物器官。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，B1)所述核酸分子为下述任一种：
C1)编码序列是SEQ ID No.1的DNA分子；
C2)核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子。
5.一种降低植物光周期敏感性或使植物开花时间提前的方法，其特征在于，所述方法包括通过降低目的植物中利要求1或2中所述蛋白质的编码基因的表达量来降低植物光周期敏感性或使植物开花时间提前。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述降低目的植物中利要求1或2中所述蛋白质的编码基因的表达量为利用基因突变、基因敲除、基因编辑或基因敲减技术使目的植物基因组中权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因活性下降或失活。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述利用基因编辑技术使目的植物基因组中权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因活性下降或失活是利用CRISPR/Cas9系统进行，所述CRISPR/Cas9系统包括表达靶向所述蛋白质的编码基因的sgRNA的载体，所述sgRNA的靶序列为SEQ ID No.3。
8.一种增强植物光周期敏感性或使植物开花时间延迟的方法，其特征在于，所述方法包括通过提高目的植物中权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因的表达量来增强植物光周期敏感性或使植物开花时间延迟。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述提高目的植物中权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因的表达量为通过将权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因导入所述目的植物实现。
10.权利要求1或2中所述的蛋白质或权利要求3或4中所述的生物材料。
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