CN109628462B - 一种水稻根系伸长控制基因OsKSR7及编码的蛋白质 - Google Patents

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CN109628462B CN201811523310.6A CN201811523310A CN109628462B CN 109628462 B CN109628462 B CN 109628462B CN 201811523310 A CN201811523310 A CN 201811523310A CN 109628462 B CN109628462 B CN 109628462B
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朱俊兆
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants

Abstract

本发明公开了一种水稻根系伸长控制基因OsKSR7及编码的蛋白质,该蛋白的编码基因如序列表SEQ ID NO:1所示的碱基序列,该蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示,是一个转运蛋白,与根系伸长相关;该碱基序列若发生突变,如编码区DNA的206位的胸腺嘧啶被腺嘌呤取代,编码的氨基酸序列的25位色氨酸突变为精氨酸,这样该蛋白就抑制根系的伸长,具体在植株表现为主根、不定根和侧根都变短。该蛋白及其编码基因的应用,可以为水稻的根系改良和杂交育种或转基因植物的开发创造条件。

Description

一种水稻根系伸长控制基因OsKSR7及编码的蛋白质
技术领域
本发明涉及水稻生长发育,具体涉及一种水稻根系伸长控制基因OsKSR7及编码的蛋白质。
背景技术
水稻根系构型为须根系,能不断地从茎节最靠近中柱维管的分生区细胞发生不定根,最后由数量众多的不定根及其侧根构成了它的根系结构。根系作为水稻生长发育必 不可少的器官,间接地决定着水稻地上部产量、品质、抗逆及广适性等诸多农艺性状的 表现。根系伸长的主要细胞学基础之一是根尖分生组织的细胞分裂,根尖分生组织功能 或结构的缺陷会导致短根发生。根系的伸长另外一个主要细胞学基础是根尖伸长区细胞 的伸长,这与细胞壁形成、纤维素的合成和微管组织形成等相关。尽管根长对植物产量 和抗性有重要的作用,但水稻根系因不能被人们直接收获食用故根系性状不被重视,人 们对水稻根系性状的认识深度与广度远不及对于地上部产量与品质性状,其基础理论 与应用研究严重滞后。因此,重点挖掘控制水稻根长的基因,分离、克隆一系列控制根 长的基因便于定向改良水稻根系性状,如授权公告号为CN102161985的发明专利,就公 开了与水稻根系生长有关的基因KSR1,该基因KSRI及编码的蛋白质有些碱基和氨基酸发 生突变,水稻根系表现为短根系。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种水稻根系伸长控制基因OsKSR7及编码的蛋 白质,该蛋白是转运蛋白,在氨基酸取代或缺失等情况下,能抑制水稻根系的伸长,使水稻出现短根系现象,可以为水稻的根系改良和杂交育种或转基因植物的开发创造条 件。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:一种水稻根系伸长控制基因OsKSR7,该 控制基因OsKSR7的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。
上述水稻根系伸长控制基因OsKSR7所编码的蛋白质,其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。控制基因OsKSR7序列由7681个碱基组成,自5端第134-136位为起始密码子,其编码的蛋白质由793个氨基酸组成,为转运蛋白。
水稻根系伸长控制基因OsKSR7所示的DNA序列中206位的胸腺嘧啶(T)被腺嘌呤(A) 取代,水稻根系伸长控制基因OsKSR7突变为短根系突变基因-OsKSR7突变体。
水稻根系伸长控制基因OsKSR7所编码的蛋白质所示的氨基酸序列中25位色氨酸(Trp) 突变为精氨酸(Arg),水稻根系表达为短根系。
该OsKSR7可人工合成,也可先合成其编码基因,再进行生物表达得到。
与现有技术相比,本发明的优点在于一种水稻根系伸长控制基因OsKSR7及编码的蛋白质,该蛋白的编码基因如序列表SEQ ID NO:1所示的碱基序列,该蛋白的氨基酸 序列如序列表SEQ ID NO:2所示,是一个转运蛋白,与根系伸长相关;该碱基序列若 发生突变,如206位的胸腺嘧啶(T)被腺嘌呤(A)取代,编码的氨基酸序列的25位色 氨酸(Trp)突变为精氨酸(Arg),这样该蛋白就抑制根系的伸长,具体在植株表现为 主根、不定根和侧根都变短。该蛋白及其编码基因的应用,可以为水稻的根系改良和杂 交育种或转基因植物的开发创造条件。
附图说明
图1是野生型(WT)和Osksr7突变体正常水培7天的表型比较;
a,WT(左)和Osksr7突变体(右)的全株照,bar=2cm;b,WT(左)和Osksr7(右) 的根部照,bar=2cm;c和d,WT和Osksr7突变体的主根在体视镜下的观测结果, bars=0.5mm;
图2是OsKSR7基因的图位克隆和基因结构;
STS1和STS2和是定位用到的多态标记,OJ1115_A03、OSJNBb0013M05和OSJNBa0041K10 代表BAC克隆,Rec代表重组子;内含子用实线表示,外显子用实心方框表示;
图3野生型(WT)、Osksr7突变体和两株T2代转基因回复株系(OV1和OV2)的表型图。
具体实施方式
以下结合附图、实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1突变体的表型及遗传分析
从甲基磺酸乙酯诱变的籼稻(Oryza Sativa L.ssp indica)品种Kasalath突变体库中筛选到一个水稻短根系Osksr7突变体,即DNA序列中206位的胸腺嘧啶(T)被腺 嘌呤(A)取代,水稻根系伸长控制基因OsKSR7突变为短根系控制基因,编码的蛋白质 所示的氨基酸序列中25位色氨酸(Trp)突变为精氨酸(Arg)。8天苗龄的Osksr7突变 体的根系伸长受到严重抑制,主根、不定根和侧根都变短(图1),水稻根系表达为短根 系。以此Osksr7突变体为父本,与野生型Kasalath杂交,获得子一代F1植株与野生型 Kasalath完全一致,说明Osksr7为隐性突变。F1代自花授粉所得的F2中,正常植株与 短根植株的分离比为257/81=3.41,卡方检测结果为0.32<χ2 0.05,1=3.84,正常植株与 短根植株的比例符合一对基因控制的3:1分离比,表明该突变体是隐性单基因突变体。
实施例2基因预测和序列分析
根据精细定位的结果,定位区间有两个BAC克隆:OSJNBb0013M05和OSJNBa0041K10(图2)。根据TIGR(http://www.tigr.org/tdb/e2k1/osa1/)的水稻基因注释信息, 对该区段内基因预测分析,该区间共有25个预测的基因,其中4个基因为功能预测基 因,用Kasalath野生型和Osksr7突变体DNA模板对候选的4个基因进行扩增,扩增产 物分别测序,测序结果进行比对分析,发现基因号为LOC_Os11g24560的DNA序列的206 位的胸腺嘧啶(T)被腺嘌呤(A)取代,从而导致编码的氨基酸序列的25位色氨酸(Trp) 突变为精氨酸(Arg),命名该基因为OsKSR7。
实施例3OsKSR7功能互补实验
根据OsKSR7基因的CDS序列信息,设计扩增完整CDS的引物,引物序列如下(加 下划线的为酶切位点):
OsKSR7-OVU:5’AAAGGTACCTCCCCATCCCCACCACCTCTC 3’
OsKSR7-OVL:5’AAAGGATCCAATCTCCCACAACTCAGACCT 3’;
采用上海生工RNA提取试剂盒(SK1321)提取水稻kasalash叶片总RNA,以Ol igo(dt)-18为引物,以所提取的总RNA为模板进行反转录合成第一链cDNA。以此cDNA 为模板,利用PrimeSTAR HS DNA Polymerase扩增全长CDS,PCR条件:98℃预变性10s, 然后进入循环反应(98℃10s,58℃10s,72℃,1min),循环数为30,最后再延伸10min 结束。琼脂糖电泳割胶回收PCR产物,连A尾纯化并连接到pMD19-T载体。连接产物热 击转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,37℃培养16h后挑阳性单克隆测序,测序鉴定序列 无误后用KpnI和BamHI在37℃双酶切过夜,连入经同样双酶切的pCAMBIA1300改(35S) 载体中,命名为35S-OsKSR7OVER。连接产物以相同的方法热击转化大肠杆菌DH5α感受 态,涂布在含有kan抗性的LB平板培养16h后挑取单克隆,摇菌抽提质粒双酶切并通 过琼脂糖胶检测正确后电击转化农杆菌EHA105。酶切检测正确的质粒通过农杆菌株系 EHA105介导的水稻遗传转化体系导入到突变体Osksr7中,经过侵染、共培养、筛选具 有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗移栽,得到转基因植株。农杆菌(EHA105)介 导的水稻遗传转化体系主要应用Hiei等人(1994)报道的方法基础上进行优化。该转基 因植株中分离的Osksr7突变体的根系长度回复成野生型(图3),说明Osksr7的表型确 实是有OsKSR7突变引起的。最后,还需要注意的是,以上列举的仅是本发明的若干个 具体实施例。显然,本发明不限于以上实施例,还可以有许多变形。本领域的普通技术 人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形,均应认为是本发明的保护范 围。
序列表
<110> 宁波大学
<120> 一种水稻根系伸长控制基因OsKSR7及编码的蛋白质
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7681
<212> DNA
<213> 水稻根系伸长控制基因OsKSR7()
<400> 1
aacaaggcaa aagccgcgac gcgacgcgag cgcgacgaga gacagacacc acgcgcacct 60
cctccgatct gctcgctccc catccccacc acctctccga ccgccgctcg ccgcgccacc 120
gcgcccaccc tccatggcgg ccgatccctc cgcggccgcg gcggccgccc cggacccgga 180
cggccccgac gccgtccgcc tcacctggaa cgcctggccg cgctccaagg tggaggcgag 240
ccgctgcgtc gtgccgctcg ccgccgcgat ctccccggtc cgctcgcccg agtcgctcgc 300
ctcgccgccg ctcccttacc cgccgctccg ctgcaagccc ccctgctcgg ccctcctcaa 360
ccccttcgcc cgcgtcgact tcgctgccaa gatctggatc tgcccgctct gcttctcccg 420
caaccacttc ccgccccact acgccgccat ctccgagtcc aacgtccccg ccgagctctt 480
cccgcagtgc tccaccgtcg agtacctcct cgccggcgcc gccccggccg ccggcgtgcc 540
cctccaccag ggcggcccgc ccgcgccgcc gcccccggta ttcctcttcg tgatcgacac 600
ctgcgtcatc gaggaggagc tcgagtacgt caagatgtcc atgcggaagg ccgtcgcgct 660
cctgccggag cacgcgctcg tcggcctcgt cacgttcggg acgcaggtgc atctgcacga 720
gctcgggttc tccgatctca gcaagatcta cgtcttccgg ggcaccaagg agatctccaa 780
ggagcagatt ttggatcagc ttgggttggc gggtgcgggg cgtccgggtt tccccaagat 840
gcctcagcag ccaggggggc ctcagatcaa cgggatgcat cccccggcaa cggccggggt 900
gactaggttc ttgctcccgg tgtcagactg cgaatgcacg ctcagcacgg tgagaaattg 960
tgttcatggc catttgattt cggggttttc agtacaagga agcataagtt tttgttcttt 1020
tgcagctgct ggacgagttg cagcctgacc agtggccggt ggagaccggg aaccgtgcga 1080
tccggtgcac gggtgttgcg ttgagtgtgg cggctggctt gctcggggct tgtatgcctg 1140
ggactggcgc aaggatcatt gcgcttcttg gtggtccatg caccgagggt cctggaatgg 1200
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actttaggca cagttctatt gaatgttttt cctcctttct tcaaaatgca taatactata 1440
tcagttaatt tgatatctca ttatacgttc aatcagtttc ttgattaaag catatacaac 1500
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tgttggtgat gctcccccct gaattaaccc gagcacgatg caaataaact ctaaaaatga 1620
aagtgcatag ttcagattgt gctatttgtt agaaagtaat tcgttacccc tagaacatca 1680
attgcacctt tcagaattgc agaactccaa aaacttctgt ttgttattct ttgtccccct 1740
ctaatatttt ctccatgctt ctgttcattt ttcatgatgc tttgaagtcc caatttaata 1800
ctttactggg caatgcagat tgtgtcgaaa gatttgtcag agccagttag atcacataag 1860
gatcttgata aggatgcagc tcctcacttc cagaaagctg tcaaatttta cgatggcctt 1920
gccaaacaat tggtcagtca aggccatgtc ttagatgttt ttgcatctgc tcttgatcag 1980
gtatgtatag tattctcttt agccagcagc ttgtggtcat acttaaatta aagcttctat 2040
gctcagcaga gtttgcatgt tgctggaatc tcacaactgt acattgtttg tatccagact 2100
gttgttttgg agctatgctc acaacatatg ttccgaatac tattgcctgt cctttcaaga 2160
tactgtagaa tgaatattca aatattttaa ttctgggaat atccaagcta catttgttaa 2220
agaggtggaa accctagtga aaccaccatg ctttatataa cagcataacc agacatattt 2280
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tcatacaaat atatgtattg ttgtcaactg tagaacttga tacaacatag tccatgaaaa 2400
tatttattga tagttcattt tgtgaggatc aagttgtctg cataccaatc cagtgatcat 2460
gaaagtagat taatatttga taaacgggca tgactatttt ttgtttcact tctagtgaaa 2520
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cattgcatac ttcaattctc aatcattagg catttcataa ctgctgattg tgatacacat 2640
gacctgaact cattttctgt tttttctaca aaaaatggtt ggaacaccta caggttggcc 2700
ttgccgagat gaaggtcgct attgagagaa caggtggcct tgttgtctta tctgaaagct 2760
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tctttctgtt gaccaattgt gcgaacaaaa gatatatttt gtactgtaac agcttggttt 3120
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tgtaacaagg tacctttcat ttttattctg ttgcctccag tgtaagaatg gcttgatgtt 3600
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aaatctgttc tttagttcct atactatgtt gttgaatact gctaaactat atctcaacaa 3780
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tttatttaat gatagggcaa gtaagggcaa atatgttgcg gttttgactt taactgacat 4080
ctatttgact gtaggaatta gtcgagggtt ttgaccagga aactgcagct gttgtgttgg 4140
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gtgatactta catccaccca ctgtcagtgt tggccaaacg gtccatttca cattaaatga 4380
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tggctatata taggagtttg tgtaatgtgc caaagcattc tttcttttca cttagttgct 4800
ttcctgcttt ttttagtaaa ttcatgatgt catctcagtc acttccatac aacaatgcca 4860
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tatatctttg aactgaaaat gtaacagaga cattgccttc atttgtaagg tgtattacta 4980
attgacatat ttatctactt gattcaatta acattttttt aaaccttgtg tgcatatcat 5040
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ttgtcccttt tgtgttgcta atgaaactat gtagatggat cgttaacgtt ttttgttgac 5160
catccttgta ggaagagttc gatgcaacac ggtggcttga tagatccctc atacggcttt 5220
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gttgcacttt ttttttttgg ttatctttag gaaatccttg ccttattaat actagcattt 5400
tccttgtcac aggttttcaa taacagtcca gatgagacag cttatttccg gatgttactc 5460
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caattgtact gtagttatca cttcagaaga aacattggtc agacttccta ggctttggta 5820
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tttcagtgac ggccctttat aatccatttg tctagcacaa tactactgaa aacttgtata 6060
tattacataa aaactcaaag tcaacttgag atttgaaaat gcgaaccaga ggacgaaaaa 6120
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ccaaaatggt tttcaaaact cttctatgaa gacctcgcag agacgttaca tatttgataa 6240
gtccgcattg ttgaccacac atgtttaaat atattggatc tatgttcttc tatgattgtc 6300
aattgaactt tttcgtgtat ataggttagc tgatgttttg atgcaaccta ttgacaagct 6360
agaacttcca tgtttatgat gcttaatata actctccgta tttgtttcag caatttgcac 6420
aattgttgca agctcctcac gaggaggctc aaataataat taaaggacga tttcctgctc 6480
caagactagt tgtctgtgac caacatggct cacaggtatg ttatcacagt tgttattttt 6540
ctttcttaat tgttcctact accattaatg gcttgtactc tccatgcagt taactggaaa 6600
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ttatcttgat aatagcataa atgtgtgaag ttgttctcaa acttttatgt actcaatttg 6780
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atgtataagt tgtccccata atattattta tccatcatat atacttcttt atattgacct 7620
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t 7681
<210> 2
<211> 793
<212> PRT
<213> 水稻根系伸长控制基因OsKSR7编码的蛋白质()
<400> 2
Met Ala Ala Asp Pro Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Pro Asp Pro Asp
1 5 10 15
Gly Pro Asp Ala Val Arg Leu Thr Trp Asn Ala Trp Pro Arg Ser Lys
20 25 30
Val Glu Ala Ser Arg Cys Val Val Pro Leu Ala Ala Ala Ile Ser Pro
35 40 45
Val Arg Ser Pro Glu Ser Leu Ala Ser Pro Pro Leu Pro Tyr Pro Pro
50 55 60
Leu Arg Cys Lys Pro Pro Cys Ser Ala Leu Leu Asn Pro Phe Ala Arg
65 70 75 80
Val Asp Phe Ala Ala Lys Ile Trp Ile Cys Pro Leu Cys Phe Ser Arg
85 90 95
Asn His Phe Pro Pro His Tyr Ala Ala Ile Ser Glu Ser Asn Val Pro
100 105 110
Ala Glu Leu Phe Pro Gln Cys Ser Thr Val Glu Tyr Leu Leu Ala Gly
115 120 125
Ala Ala Pro Ala Ala Gly Val Pro Leu His Gln Gly Gly Pro Pro Ala
130 135 140
Pro Pro Pro Pro Val Phe Leu Phe Val Ile Asp Thr Cys Val Ile Glu
145 150 155 160
Glu Glu Leu Glu Tyr Val Lys Met Ser Met Arg Lys Ala Val Ala Leu
165 170 175
Leu Pro Glu His Ala Leu Val Gly Leu Val Thr Phe Gly Thr Gln Val
180 185 190
His Leu His Glu Leu Gly Phe Ser Asp Leu Ser Lys Ile Tyr Val Phe
195 200 205
Arg Gly Thr Lys Glu Ile Ser Lys Glu Gln Ile Leu Asp Gln Leu Gly
210 215 220
Leu Ala Gly Ala Gly Arg Pro Gly Phe Pro Lys Met Pro Gln Gln Pro
225 230 235 240
Gly Gly Pro Gln Ile Asn Gly Met His Pro Pro Ala Thr Ala Gly Val
245 250 255
Thr Arg Phe Leu Leu Pro Val Ser Asp Cys Glu Cys Thr Leu Ser Thr
260 265 270
Leu Leu Asp Glu Leu Gln Pro Asp Gln Trp Pro Val Glu Thr Gly Asn
275 280 285
Arg Ala Ile Arg Cys Thr Gly Val Ala Leu Ser Val Ala Ala Gly Leu
290 295 300
Leu Gly Ala Cys Met Pro Gly Thr Gly Ala Arg Ile Ile Ala Leu Leu
305 310 315 320
Gly Gly Pro Cys Thr Glu Gly Pro Gly Met Ile Val Ser Lys Asp Leu
325 330 335
Ser Glu Pro Val Arg Ser His Lys Asp Leu Asp Lys Asp Ala Ala Pro
340 345 350
His Phe Gln Lys Ala Val Lys Phe Tyr Asp Gly Leu Ala Lys Gln Leu
355 360 365
Val Ser Gln Gly His Val Leu Asp Val Phe Ala Ser Ala Leu Asp Gln
370 375 380
Val Gly Leu Ala Glu Met Lys Val Ala Ile Glu Arg Thr Gly Gly Leu
385 390 395 400
Val Val Leu Ser Glu Ser Phe Gly His Ser Val Phe Lys Asp Ser Phe
405 410 415
Lys Arg Ile Phe Glu Gly Gly Glu Gln Ser Leu Asp Leu Ser Phe Asn
420 425 430
Gly Thr Leu Glu Ile Asn Cys Ser Lys Asp Ile Lys Val Gln Gly Ile
435 440 445
Ile Gly Pro Cys Thr Ser Leu Glu Lys Lys Gly Ala Leu Cys Ala Asp
450 455 460
Thr Val Val Gly Gln Gly Asn Thr Thr Ala Trp Lys Met Cys Gly Leu
465 470 475 480
Asp Arg Asn Thr Ser Leu Thr Val Phe Phe Asp Val Ser Pro Ser Glu
485 490 495
Arg Ser Ser Gln Pro Gly His Gln Asn Pro Asp Leu Tyr Ile Gln Phe
500 505 510
Val Thr Ser Tyr Gln His Pro Glu Gly Gln Met Arg Ile Arg Val Thr
515 520 525
Thr Ile Cys Arg Lys Trp Val Asp Gly Ser Thr Asn Thr Glu Glu Leu
530 535 540
Val Glu Gly Phe Asp Gln Glu Thr Ala Ala Val Val Leu Ala Arg Tyr
545 550 555 560
Ile Ser Leu Lys Met Glu Met Glu Glu Glu Phe Asp Ala Thr Arg Trp
565 570 575
Leu Asp Arg Ser Leu Ile Arg Leu Cys Ser Arg Phe Gly Asp Tyr Arg
580 585 590
Lys Asp Asp Pro Ser Ser Phe Ser Leu His Ser Asn Phe Ser Leu Phe
595 600 605
Pro Gln Phe Met Phe Asn Leu Arg Arg Ser Gln Phe Val Gln Val Phe
610 615 620
Asn Asn Ser Pro Asp Glu Thr Ala Tyr Phe Arg Met Leu Leu Asn Arg
625 630 635 640
Glu Ser Ile Thr Asn Ser Val Ala Met Ile Gln Pro Ser Leu Ile Ser
645 650 655
Phe Ser Phe Asp Leu Pro Pro Ser Pro Val Phe Leu Asp Val Ala Ser
660 665 670
Ile Ala Ala Asp Arg Ile Leu Leu Leu Asp Ala Tyr Phe Ser Val Val
675 680 685
Ile Phe His Gly Met Thr Ile Ala Gln Trp Arg Asn Met Gly Tyr Gln
690 695 700
Asn Gln Pro Glu His Gln Gln Phe Ala Gln Leu Leu Gln Ala Pro His
705 710 715 720
Glu Glu Ala Gln Ile Ile Ile Lys Gly Arg Phe Pro Ala Pro Arg Leu
725 730 735
Val Val Cys Asp Gln His Gly Ser Gln Ala Arg Phe Leu Leu Ala Lys
740 745 750
Leu Asn Pro Ser Ala Thr Tyr Asn Ser Ala His Asp Val Pro Pro Gly
755 760 765
Ser Asp Ile Ile Phe Thr Asp Asp Val Ser Phe Gln Val Phe Cys Glu
770 775 780
His Leu Gln Arg Leu Ala Val Gln Ser
785 790

Claims (2)

1.一种水稻根系伸长控制基因OsKSR7,其特征在于该控制基因OsKSR7的核苷酸序列为在SEQ ID NO:1所示的基础上,所示的DNA序列中第206位的胸腺嘧啶被腺嘌呤取代,该控制基因OsKSR7为短根系突变体。
2.权利要求1所述的一种水稻根系伸长控制基因OsKSR7所编码的蛋白质,其特征在于该蛋白质的氨基酸序列为在SEQ ID NO:2所示的基础上,该蛋白质的氨基酸序列中第25位色氨酸突变为精氨酸,水稻根系表达为短根系。
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