CN101646781A - 自身免疫病的诊断和治疗靶标及其用途 - Google Patents

自身免疫病的诊断和治疗靶标及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明描述了在I型自身免疫性糖尿病(T1D)、其他自身免疫病及其他糖尿病相关疾病和病症中鉴定ZnT8作为自身抗原靶标。本发明还描述了基于该发现的各种治疗、诊断和预后工具及方法。本发明公开了鉴定出ZnT8的遗传变异在疾病过程的起始和自身免疫性向临床糖尿病的进展中起着重要作用。

Description

自身免疫病的诊断和治疗靶标及其用途
相关申请的交叉引用
本申请引入2006年12月29日提交的美国临时申请60/882,815的全文作为参考。
发明领域
本发明大致涉及自身抗原靶标的鉴定，具体来说是I型自身免疫性糖尿病(T1D)的自身抗原靶标，更具体的说，蛋白ZnT8作为新的自身抗原，本文描述了基于所述自身抗原的治疗、诊断及预后工具和方法。
发明背景
自身免疫病是由抗机体自身组织的免疫应答引起的疾病。自身免疫病导致一种或多种机体组织的破坏、器官的异常生长或器官功能的变化。所述疾病可能只影响一种器官或组织类型，或可能影响多种器官和组织。
人和NOD小鼠模型中的1型自身免疫性糖尿病(T1D)是一种多基因T细胞依赖性自身免疫病，其特征为胰岛β细胞的选择性破坏(1-3)，源于易感个体中对β细胞抗原耐受性的障碍，所述易感个体在关键的免疫调节机制方面具有先天缺陷(5)(例如，对自身显示致病性而不是保护性免疫应答的个体)。与β细胞具有相同发育谱系(developmental lineage)并且经常直接接触β细胞的胰腺外分泌和内分泌细胞基本上不受影响，并且一旦β细胞损失则胰岛炎消退，这表明自身免疫性靶标主要是β细胞特异性的。许多已知的糖尿病自身抗原(诸如胰岛素和IGRP)反映了这种细胞特异性，但是，已知免疫靶标的列表是无论如何也不全面的。这尤其涉及被免疫系统的细胞武器识别的抗原，但是尽管进行了十多年的研究，但主要CD4+致糖尿病T细胞的靶标仍然是不清楚的。近年来利用免疫筛选步骤只出现少数几个新靶标，所述免疫筛选步骤最初鉴定出这类分子为GAD65、IA-2和ICA 69。
许多具有强T1D遗传倾向性的个体从不患有明显的疾病(单卵双生儿有一个糖尿病成员时，50％的这种双生儿保持不一致)，而非种系编码的因素显著影响T1D进展的速度(7)。这种低的外显率和易变的自然史表明环境因素以及免疫应答自身随机性质的重要性。将这种平衡向更易致耐受(toleragenic)环境迁移的治疗策略具有防止或减缓自身免疫向破坏性胰岛炎进展的潜能。
在NOD小鼠的早期胰腺浸润中出现有限数量的胰岛细胞反应性T细胞克隆(16；17)，疾病进展看起来涉及表位传播(18)和早期T细胞应答的亲和力成熟(19)以及新的自身抗原的募集(20)。已经从前期糖尿病或新近糖尿病NOD小鼠的脾、淋巴结或胰岛浸润中分离出许多胰岛特异性CD4+和CD8+T细胞克隆(21-25)，所述小鼠的同源抗原很难确定，看起来不对应于任何人类糖尿病自身免疫的任一已知血清学标记物，诸如GAD65，胰岛素颗粒膜蛋白ICA512(IA-2)和phogrin(IA-2β)(20)，羧肽酶E(26)，ICA69(27)和硫酸糖脂(28)。自体反应性T细胞的分子靶标可以包括β细胞未经确认的组分，或本质上不会引发体液免疫的已知β细胞蛋白。因此，确定它们的同源抗原仍然是一个重要目标，随着基因组和蛋白质组技术的最新发展，现在其是一个现实的目标。因此，利用对从NIT1胰岛素瘤细胞的H-2Kd分子洗脱的蛋白质组肽进行的敏感生物测定和分析的组合(29)，最近证明被彻底研究的NY8.3CD8+克隆的靶标(23)是源自β细胞蛋白IGRP(胰岛葡糖6-磷酸酶相关蛋白)的肽。
尽管体液免疫自身对疾病发病机理可能不起什么作用(30)，但B-淋巴细胞分子靶标的鉴定仍是一个重要目标，因为B细胞在T1D的抗原呈递中起作用(31)。此外，循环的自身抗体为糖尿病自身免疫提供有效的临床前标记物。高亲和力抗体的产生是T依赖性过程，因此有理由预期被自身抗体识别的分子还将是自体反应性致糖尿病T细胞的靶标。该假设至少对于胰岛素、phogrin和GAD65来说是正确的(32-34)。已知靶标的列表尽管很长，但还是远远不够全面的。这被以下事实突出显示：通过人胰腺的免疫组化确定的前-T1D的血清学诊断仍然是最灵敏的指标，仅仅因为它定义了不属于分子术语中确定的自身抗原的其他靶标。
关于在T1D及其他自身免疫病中是否存在初始或起始自身抗原还存在持续的争论。对于TID来说，目前NOD小鼠中最佳候选物是胰岛素(33；35-38)，但基于胰岛浸润中识别该抗原的T细胞的前体频率还表明IGRP可能也起着重要作用(29；39；40)。另一种看法是该疾病由正常致耐受机制的破坏导致的多克隆活化引起，所述机制将另外产生针对相同分子的调控细胞(41)。考虑到后一情况，本发明人假设作为T1D中自身免疫重要靶标的任意分子是基于抗原疗法的候选物。基于用胰岛素(42；43)、GAD65(44-48)、HSP 65(49)和IGRP(50)的天然表位免疫的NOD小鼠中的有效免疫耐受策略看起来证明了这点。此外，本发明人对IA-2和phogrin的初步研究表明，当给初生NOD小鼠施用时，已知的小鼠和人肽表位(肽7(51))同样延缓疾病的出现。在这方面，其他已知的T细胞靶标，包括IAPP(52)、IMOGEN 38(53-57)看起来还未被表征。
自身抗原和病毒蛋白间推定的分子模拟性质的实例是基于科学文献中大量的序列同源性(58)。例如，就T1D来说，已经提出过GAD65与柯萨奇B3P2-C蛋白(59)或人巨细胞病毒主要DNA结合蛋白(60)的交叉反应性，及IA-2与轮状病毒VP7(61)或柯萨奇B4VP1(62)的交叉反应性。类似地，还假定了胰岛素原与GAD65的模拟(63)。能够想象得到，通过建立并加强免疫网络，与分子模拟物的接触可以引发自身免疫或者预防该分子模拟物。对由传染原引发的人自身免疫的流行病学研究还不是特别有益的，这可能是因为疾病的长期前驱症状及无法鉴定涉及的特定生物(或常见病原体的罕见血清型)(14)。本质上对“卫生假说”非常重要的保护性应答是更难建立的。
非肥胖糖尿病(NOD)小鼠是目前人T1D最好的模型(8)，其中疾病进展的三个阶段是明显的，即，自体反应性T细胞的扩增(“检查点0”)，它们向胰岛的归巢(“检查点1”)，及从良性的胰岛周围炎向导致β细胞损伤的侵袭性胰岛炎转变(“检查点2”)(9)。已经假定通过“检查点0”与小岛细胞凋亡的波动一致，所述小岛细胞凋亡导致胰淋巴结中细胞抗原呈递的增强。相关假设表明此时(当存在断奶时)接触肠中的新抗原导致Th1极化T细胞的活化，所述T细胞随后迁移至胰腺并干扰引流区淋巴结，这样的话引起针对小岛细胞抗原的免疫原性应答。在人T1D中还表明存在生后小岛细胞凋亡(10)、先天性β细胞异常(11)及饮食(12；13)或肠病毒(14)引发的类似参与，尽管目前，它们的相对作用(如果有的话)及作为偶然因素的普遍性仍存在争论。尽管如此，很明显小岛细胞抗原对疾病过程非常重要(15)，对其分子特征的详细了解对于免疫治疗的合理设计及监测并鉴定高危个体非常重要。
仅在美国就有超过2百万1型糖尿病患者，他们都需要终身多次每日给药胰岛素以维持生命。这些个体中的大多数将在其一生中患有糖尿病并发症，据估计在任何年龄，他们的寿命可以减少直至三分之一。因此预防或甚至减缓疾病的进展将具有巨大的社会和经济效益。存在大量针对糖尿病预防和逆转的实验性方法，它们在T1D的啮齿类动物模型中被证明非常有效，目前正处于临床试验阶段。例如，利用抗CD3单克隆抗体的初步发现是尤其有希望的。为了能够有效，任何基于免疫的疗法都需要诊断性试验来确定介入是否是合适的以及什么时候相对于疾病的分期实施治疗。一旦治疗开始，必须评价其短期和长期效果。基于针对自身抗原的体液或细胞自身反应性的诊断测试(用于监测疾病进展)对于做出治疗患者的任何决定及治疗结果的后续监测非常重要。
因此，在本领域一直需要改进的针对T1D的诊断分析，以及新的基于疾病靶标的免疫治疗。此外，在一种自身免疫病诸如T1D中鉴定的许多靶标还是其他自身免疫病的靶标，从而扩展了各种自身免疫病的可用诊断和治疗方法。
发明概述
本发明的一个实施方案涉及ZnT8的各种片段。一方面，所述片段包括ZnT8的至少10个C端氨基酸，基本上由ZnT8的至少10个C端氨基酸组成，或由ZnT8的至少10个C端氨基酸组成。一方面，所述片段包括ZnT8的至少25个C端氨基酸，基本上由ZnT8的至少25个C端氨基酸组成，或由ZnT8的至少25个C端氨基酸组成。另一方面，所述片段包括ZnT8的至少50个C端氨基酸，基本上由ZnT8的至少50个C端氨基酸组成，或由ZnT8的至少50个C端氨基酸组成。另一方面，所述片段包括ZnT8的至少75个C端氨基酸，基本上由ZnT8的至少75个C端氨基酸组成，或由ZnT8的至少75个C端氨基酸组成。仍在另一方面，所述片段包括ZnT8的至少100个C端氨基酸，基本上由ZnT8的至少100个C端氨基酸组成，或由ZnT8的至少100个C端氨基酸组成。一方面，所述片段包括ZnT8的至少101个C端氨基酸，基本上由ZnT8的至少101个C端氨基酸组成，或由ZnT8的至少101个C端氨基酸组成。一方面，所述片段包括ZnT8的至少102个C端氨基酸，基本上由ZnT8的至少102个C端氨基酸组成，或由ZnT8的至少102个C端氨基酸组成。仍在另一方面，所述片段包括ZnT8的至少104个C端氨基酸，基本上由ZnT8的至少104个C端氨基酸组成，或由ZnT8的至少104个C端氨基酸组成。一方面，所述片段包括ZnT8的至少350个C端氨基酸，基本上由ZnT8的至少350个C端氨基酸组成，或由ZnT8的至少350个C端氨基酸组成。另一方面，所述片段包括至少氨基酸序列SLTIQMES(SEQ ID NO：2的346-353位)，基本上由至少氨基酸序列SLTIQMES(SEQ ID NO：2的346-353位)组成，或由至少氨基酸序列SLTIQMES(SEQ ID NO：2的346-353位)组成。一方面，所述片段包括ZnT8的至少10个N端氨基酸，基本上由ZnT8的至少10个N端氨基酸组成，或由ZnT8的至少10个N端氨基酸组成。一方面，所述片段包括ZnT8的至少25个N端氨基酸，基本上由ZnT8的至少25个N端氨基酸组成，或由ZnT8的至少25个N端氨基酸组成。另一方面，所述片段包括ZnT8的至少50个N端氨基酸，基本上由ZnT8的至少50个N端氨基酸组成，或由ZnT8的至少50个N端氨基酸组成。一方面，所述片段包括ZnT8的至少74个N端氨基酸，基本上由ZnT8的至少74个N端氨基酸组成，或由ZnT8的至少74个N端氨基酸组成。
在本发明上述方面中的任意一项，所述片段可以包括选自E352和S353的氨基酸位置(相对于SEQ ID NO：2)。
在本发明上述方面中的任意一项，ZnT8可以是人ZnT8(SEQ ID NO：2)。一方面，所述片段包括SEQ ID NO：2的位置325。另一方面，ZnT8是SEQ IDNO：2的多态性变体。另一方面，所述片段包括SEQ ID NO：2的位置325，在本发明该方面的一个实施方案中，325位的氨基酸是色氨酸、谷氨酰胺或精氨酸。
本发明的另一个实施方案涉及ZnT8的片段，包括SEQ ID NOs：8-24或40-65中任一所示片段，基本上由SEQ ID NOs：8-24或40-65中任一所示片段组成，或由SEQ ID NOs：8-24或40-65中任一所示片段组成。
本发明的一个实施方案涉及嵌合蛋白，包括本文所述的任意两个或更多个片段，基本上由本文所述的任意两个或更多个片段组成，或由本文所述的任意两个或更多个片段组成。一方面，嵌合蛋白包括ZnT8的N端片段和ZnT8的C端片段。另一方面，嵌合蛋白包括ZnT8的两个C端片段，其中每一片段包括氨基酸325位，并且其中每一片段在325位包括不同的氨基酸。一方面，一个片段包括325位的精氨酸，其中第二片段包括325位的色氨酸。
本发明的另一个实施方案涉及ZnT8的片段或同系物，包括被抗ZnT8抗体选择性结合的至少一个ZnT8表位。一方面，抗ZnT8抗体是获自特定个体的抗体。一方面，所述个体患有或被怀疑患有I型糖尿病。
本发明的另一个实施方案涉及ZnT8的片段或同系物，包括被ZnT8特异性T细胞受体特异性识别的至少一个ZnT8表位。一方面，权利要求30的ZnT8的片段或同系物，其中所述个体患有或被怀疑患有I型糖尿病。
在上述实施方案的任意一项中，一方面，所述片段或嵌合蛋白与至少一个靶向基团复合以将该片段或嵌合蛋白靶向到组织或机体的细胞或部位。一方面，所述靶向基团靶向于T细胞。另一方面，靶向基团靶向于ZnT8特异性自体反应T细胞。
在上述实施方案中的任意一项中，一方面，所述片段或嵌合蛋白与毒素复合，以在T细胞或B细胞中诱导凋亡，或另外对T细胞或B细胞是有毒性的。
在上述实施方案的任意一项中，一方面，所述片段或嵌合蛋白与可检测的标记物连接。
本发明的另一个实施方案涉及ZnT8的同系物，包括与天然存在的ZnT8蛋白具有低于99％同一性并且与SEQ ID NO：2具有至少90％同一性的蛋白。一方面，所述蛋白与SEQ ID NO：2具有至少95％同一性。另一方面，所述蛋白包括SEQ ID NO：2的位置325，其中325位的氨基酸是精氨酸、色氨酸或谷氨酰胺。
本发明的另一个实施方案涉及包括ZnT8或其变体或片段的疫苗，其中所述疫苗引发抑制或消除个体中ZnT8特异性自体反应T细胞的免疫应答。
本发明的另一个实施方案涉及抗体或其抗原结合片段，它们选择性结合ZnT8或其片段或变体，并抑制或降低个体中ZnT8特异性自身免疫应答。一方面，所述抗体是单克隆抗体。
本发明的另一个实施方案涉及一种诊断易患或正患有自身免疫病的个体的方法，包括检测个体试样中选择性结合ZnT8的抗体，其中与阴性对照相比，如果检测到个体中抗体的增加表明个体易患或正患有自身免疫病。一方面，所述方法包括检测选择性结合人ZnT8的抗体，其中325位的氨基酸是精氨酸、色氨酸和/或谷氨酰胺。
本发明的另一个实施方案涉及一种诊断易患或正患有自身免疫病的个体的方法，包括检测个体试样中ZnT8特异性的T细胞应答，其中与阴性对照相比，如果检测到个体中ZnT8特异性T细胞应答的增加表明个体易患或正患有自身免疫病。一方面，所述方法包括检测对包含325位精氨酸的人ZnT8特异的T细胞应答。一方面，所述方法包括检测对人ZnT8特异的T细胞应答，其中325位的氨基酸是精氨酸、色氨酸和/或谷氨酰胺。
在上述方法的任意一项中，当个体易患或正患有自身免疫病时，所述方法可以进一步包括给该个体施用靶向于个体的ZnT8表位的治疗剂，所述ZnT8表位包括325位的氨基酸。一方面，所述治疗剂个体中ZnT8的是蛋白、肽或激动剂，它们使个体的免疫应答耐受ZnT8蛋白。一方面，所述治疗剂刺激抗ZnT8蛋白的免疫应答。
在上述方法的任意一项中，一方面，自身免疫病是I型糖尿病。
本发明的另一个实施方案涉及一种监测个体的I型糖尿病自身免疫从最初的良性自身反应性到破坏性胰岛炎的进展的方法，包括检测个体试样中选择性结合ZnT8的抗体，其中与相同个体中抗体的先前测量值相比，检测到个体中抗体的增加表明该个体正向破坏性胰岛炎发展。一方面，所述方法包括检测选择性结合人ZnT8的抗体，其中325位的氨基酸是精氨酸、色氨酸和/或谷氨酰胺。
本发明的另一个实施方案涉及一种监测个体的I型糖尿病自身免疫从最初的良性自身反应性到破坏性胰岛炎的进展的方法，包括检测个体试样中ZnT8特异性T细胞应答，其中与相同个体中ZnT8特异性T细胞应答的先前测量值相比，检测到个体中ZnT8特异性T细胞应答的增加表明该个体正向破坏性胰岛炎发展。一方面，所述方法包括检测对包含325位精氨酸、色氨酸和/或谷氨酰胺的人ZnT8特异的T细胞应答。
本发明的另一个实施方案涉及一种监测用于预防I型糖尿病、延缓I型糖尿病发病或改善前驱糖尿病个体的自身免疫的治疗效果的方法，包括检测个体试样中选择性结合ZnT8的抗体，其中与相同个体中抗体的先前测量值相比，检测到个体中抗体水平降低或基本上相同表明所述治疗是有效的，其中与同个体中抗体的先前测量值相比，检测到个体中抗体增加表明所述治疗是无效的。一方面，所述方法包括检测选择性结合人ZnT8的抗体，其中325位的氨基酸是精氨酸、色氨酸和/或谷氨酰胺。
本发明的另一个实施方案涉及一种监测用于预防I型糖尿病、延缓I型糖尿病发病或改善前驱糖尿病个体的自身免疫的治疗效果的方法，包括检测个体试样中ZnT8特异性的T细胞应答，其中与相同个体中ZnT8特异性T细胞应答的先前测量值相比，检测到个体中ZnT8特异性T细胞应答水平降低或基本上相同表明所述治疗是有效的，其中与同个体中ZnT8特异性T细胞应答的先前测量值相比，检测到个体中ZnT8特异性T细胞应答增加表明所述治疗是无效的。一方面，所述方法包括检测对包含325位精氨酸、色氨酸和/或谷氨酰胺的人ZnT8特异的T细胞应答。
在上述检测抗体方法的任意一项中的一方面，所述方法可以包括使用以下分析法，其选自但不限于：放射免疫沉淀分析，ELISA，时间分辨荧光分析和发光分析。一方面，所述方法包括使用竞争性铕分析。
在上述检测T细胞应答方法的任意一项中的一方面，所述方法可以包括使用以下分析法，其选自但不限于：T细胞增殖分析，利用可溶性MHC四聚体的结合分析，利用可溶性T细胞受体的结合分析，和ELISPOT分析。
在上述确定方法的任意一项中，在一个实施方案中，所述方法包括使用ZnT8或其片段或变体，包括但不限于，本文描述的任一ZnT8片段。
本发明的另一个实施方案涉及用于进行本文所述任意方法的分析试剂盒。所述试剂盒包括：(a)ZnT8蛋白或其变体或片段；(b)用于检测选择性结合ZnT8的抗体的试剂；和/或用于检测ZnT8特异性T细胞应答的试剂。
本发明的另一个实施方案涉及一种预防自身免疫病、延缓自身免疫病发病或改善患有自身免疫病的个体的自身免疫(包括改善该疾病的任意一种或多种症状)的方法，包括给需要其的个体施用引发ZnT8特异性免疫应答的药剂，所述ZnT8特异性免疫应答保护患者被自身免疫病靶向的细胞或组织。一方面，所述自身免疫病是I型糖尿病，并且其中所述药剂保护胰岛的β细胞。
本发明的另一个实施方案涉及一种预防自身免疫病、延缓自身免疫病发病或改善患有自身免疫病的个体的自身免疫(包括改善该疾病的任意一种或多种症状)的方法，包括给需要其的个体施用药剂，所述药剂靶向于个体的ZnT8特异性T细胞，并诱导ZnT8特异性T细胞的坏死或凋亡。一方面，所述自身免疫病是I型糖尿病，并且其中所述药剂诱导ZnT8特异性T细胞的坏死或凋亡。
本发明的另一个实施方案涉及一种预防自身免疫病、延缓自身免疫病发病或改善患有自身免疫病的个体的自身免疫(包括改善该疾病的任意一种或多种症状)的方法，包括给需要其的个体施用诱导个体中ZnT8特异性T细胞耐受性的药剂。一方面，所述自身免疫病是I型糖尿病，并且其中所述药剂诱导个体中ZnT8特异性T细胞的耐受性。
在上述治疗方法的任意一项中，一方面，所述药剂是ZnT8、其同系物、其片段或其合成模拟物。一方面，所述药剂是如本文任意地方所述的片段或嵌合蛋白，同系物，或其片段。一方面，所述药剂是与个体的天然自身抗体竞争结合个体的ZnT8的抗体。一方面，所述药剂对包含325位精氨酸的人ZnT8的多态性变体具有特异性。一方面，所述药剂对包含325位色氨酸的人ZnT8的多态性变体具有特异性。一方面，所述药剂对包含325位谷氨酰胺的人ZnT8的多态性变体具有特异性。
本发明的另一个实施方案涉及ZnT8、其变体、其片段、其合成模拟物或结合所述ZnT8的抗体、其同系物或其片段在基本上如本文所述的诊断、预后或治疗方法中的用途。
本发明的另一个实施方案涉及基本上如本文所述的任意方法、药剂、ZnT8片段、同系物、变体、嵌合蛋白、融合蛋白或编码上述物质的核酸，或选择性结合上述物质的抗体。
本发明的附图简述
图1是显示针对Slc30A8的糖尿病特异性自身抗体的图示。
图2A和2B显示果蝇S2细胞中膜结合的糖尿病自身抗原的表达和纯化。图2A是数字化图象，显示mIGRPV5His构建体的表达在S2细胞中被诱导，以及用抗V5抗体印迹的细胞膜组分(CMF)。图2B是显示对IGRP-CMFT细胞杂交瘤(克隆1-76-54)进行应答分析的图示。
图3显示基于EST序列变异修正的ZnT8的基因结构及预测的选择性翻译产物。对于显示的选择性翻译产物，MYHCH的“起始”序列对应于SEQID NO：2的50-54位，MEFLER的“起始”序列对应于SEQ ID NO：2的1-6位。
图4A显示人ZnT8的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，其中用暗灰色突出显示预测的跨膜结构域。
图4B显示预测的ZnT8的膜拓扑结构，并显示环的氨基酸位置。
图5显示针对ZnT8C端探针的标准分析。
图6是显示利用不同ZnT8构建体的盲DASP研究结果的图示。
图7证明ZnT8检测患者的自身抗体，所述患者对ICA和金标准生化抗体是阴性的。
图8A-8C是一系列图表，显示在新发病群体中就胰岛素(图8A)、GAD(图8B)和IA2(图8C)而言自身抗体与ZnT8的关系。
图9A-9D是一系列图表，显示相对于年龄来说，疾病发病时自身抗体的表达(图9A＝ZnT8；图9B＝GAD；图9C＝胰岛素；图9D＝IA2)。
图10A和10B是显示在两个不同患者中使用ZnT8自身抗体作为T1D预测标记物，表明在图10A和10B中显示。
图11是显示疾病发病时T1D患者的糖尿病自身抗体状况的表格。
图12A和12B是显示ZnT8抗体分析的受试者工作特性(receiver operatorcharacteristics)的图示(图12A显示免测沉淀指数，图12B显示灵敏度)。
图13是显示与ZnT8ORF、C端和N端反应性的关系的图示。
图14A和14B显示研究ZnT8的N端和C端是否能够相互作用产生新的表位的实验的结果；该实验利用作为免测沉淀分析中标准品的2个糖尿病血清库进行，第一个基于针对C端探针的强应答来选择(图14A)，第二个基于N端的反应性(图14B)。
图15A显示小鼠Slc30A8(顶部；显示的是SEQ ID NO：4的267-367位)、人Slc30A8(中间；显示的是SEQ ID NO：2的268-369位)和小鼠Slc30A3(底部；序列是SEQ ID NO：25)比对的序列。
图15B显示对于自身抗体反应来说，对C端探针修饰的作用(引用序列显示限制性酶切位点是SEQ ID NO：2的336-369位)。
图15C显示对于自身抗体反应来说，在带电残基处(K340，H345和E352)具有点突变的C端探针的影响。
图16显示对于自身反应性非常重要的ZnT8C端的残基。
图17显示利用缺失突变体和小鼠/人嵌合体的表位绘图。显示的小鼠ZnT8序列是SEQ ID NO：4的267-367位；显示的人ZnT8序列是SEQ IDNO：2的268-369位。
图18显示用于直接诱变研究的分子模型。
图19显示被T1D自身抗体靶向的区域中ZnT8残基的保守性(Mse N端序列是SEQ ID NO：4的1-74位；Hum N端序列是SEQ ID NO：2的1-75位；Xen N端序列是SEQ ID NO：38；Mse C端序列是SEQ ID NO：4的267-367；Hum C端序列是SEQ ID NO：2的268-369位；Xen C端序列是SEQ IDNO：39)。
图20显示人Slc30A家族成员之间的序列同源性。
图21A-2C显示根据CR限制性自身抗体应答(图21A)、CW限制性自身抗体应答(图21B)和CQ自身抗体应答(图21C)，小鼠ZnT8的定点诱变鉴定结构中的主要表位。
图22A-22D显示小鼠ZnT8的多位点突变概括了与hCArg反应性血清的人ZnT8反应(图22A＝与hCArg反应性血清的mCArg探针；图22B＝mCArg(Arg Glu Lys Lys)；图22C＝与hCTrp反应性血清的mCTrp探针；图22D＝与hCTrp反应性血清的mCArg(Arg Glu Lys Lys)探针)。
图23A-23D显示用人多态性探针检测的抗体水平与小鼠定点突变体之间的关系(图23A显示hC Arg-Gln指数对mC Arg指数；图23B显示mCArg，hCArg和hC Arg-Gln指数；图23C显示mCTrp指数对hC Trp-Gln指数；图23D显示mCTrp，hCTrp和hC Trp-Gln指数)。
图24A-24D显示Slc30A8aa325多态性与ZnT8A的关系。图24D显示基于针对单个探针或探针组合的应答进行区分的应答的水平和频率。图24C显示对普通Arg和Trp变体应答之间的关系，基于只对Trp(垂直的)和Arg(水平的)应答的95％截断将其分为5个区，对角线代表针对分析中两种探针假定15％CV的等同应答±3SD的边界。图24A和24B在检查针对Gln探针及Arg和Trp探针的应答之间的关系时使用相同分层。
图25显示相对于编码aa325的基因型ZnT8A的发生率。
图26显示基因型与对hCR和hCW探针的反应性之间的相关性。
图27显示与糖尿病发病年龄有关的Slc30A8基因型。
图28A-B显示Slc30A8基因型与抗体水平比较(图28A显示相对于基因型的Slc30A8自身抗体反应水平；图28B显示相对于基因型的其他自身抗体反应水平)。
图29显示现有ZnT8分析的概述。
图30显示针对组合N端、C端、腔环(luminal loops)、细胞溶质环和多态性残基的不同ZnT8构建体的自身反应性。
图31A-31F显示发病后0-2年的抗体与C-肽比较(图31A-C与C-肽比较；图31D-F与GADA和IA-2A比较)。
图32A显示发病后5-10年的ZnT8A和C-肽水平。
图33A显示检出率变化的原则(黑色为检出ZnT8；白色未检出)。
图33B显示增加ZnT8抗体测量的不同效果。
图34显示，人胎儿胰腺的实时PCR显示高胰岛特异性。
图35显示，新确诊的T1D患者显示针对ZnT8合成肽的外周T细胞应答。
图36显示自身抗体预吸附实验确认了利用重组蛋白来区别不同的ZnT8表位。
发明详述
本发明广泛涉及自身抗原靶标的鉴定，具体的是I型自身免疫性糖尿病(T1D)的自身抗原靶标，更具体的是蛋白ZnT8作为新的自身抗原，本文描述了基于所述自身抗原的治疗、诊断及预后工具和方法。本发明还涉及ZnT8中遗传变异的鉴定，本文描述了所述遗传变异在疾病过程的起始和自身免疫性向临床糖尿病的进展中起着重要作用。这些发现允许本发明人提供新的诊断工具，所述诊断工具可用于提高对病程的预后评价及监测在疾病的临床前期治疗介入的有效性。所述分子本身、衍生的肽、肽类似物和第二免疫药剂还作为预防发病或自身免疫性向临床疾病进展的治疗介入的基础。当个体一出生就能确定其基因型的能力为实施治疗性检测提供独特的优势，因为预防自身免疫性过程的出现比一旦其确立再让其逆转要容易。
过去，正如以上讨论的，胰岛素被定义为基于其组织结合的候选基因，GAD65和IA-2来自于患者血清免疫沉淀来自放射性标记的胰岛的蛋白的能力(64-66)，和IGRP作为结合MHC H-2Kd(刺激源自自发性糖尿病小鼠的T细胞克隆)的肽。本发明人已经回答了以下问题：基于现在关于自身抗原的细胞和分子生物学的理解，以及可用的通过微阵列分析在不同组织中研究和分析基因组范围表达的工具，是否能够开发出更加系统化的方法来鉴定靶向自身抗原。目标是产生一系列将包括至关重要的糖尿病自身抗原的候选基因，其可能从在β细胞中表达的15,000个或类似基因转录物中具有超过50个蛋白。然后可以使用有效的分析检测针对这种分子的细胞和体液免疫应答。本研究的结果在下文描述，尤其着重于新的靶向自身抗原(即ZnT8)的发现。
更具体地，抗原呈递和T细胞识别的结构生物学为新的T1D自身抗原的鉴定提供相对较少的线索，因为MHC和T细胞受体分子均具有较宽的肽结合特异性范围和相对较低的亲和力。已经证明很难鉴定天然表位，即使已经详细了解模拟位肽的结合特性，这只是因为接触残基的数量较少并且保守的氨基酸取代可以轻易被接受。本发明人在本文中描述了在基因组范围基础上鉴定候选自身抗原的基于知识的算法的开发。最初基于实验信息假设“理想”自身抗原的大量主要和次要属性，然后据此评估。然后评估抗原与每一理想属性的一致性以获得“自身抗原分数”，从而得到最佳候选物的有序表。然后在开始鉴定候选物的短列表之前(基于NOD小鼠中自发性和激发的细胞介导的自身免疫性应答及NOD小鼠和人血清中测定的体液自身反应性)，考虑基于基因本体论功能和信息诸如基因位置的中间分析。支持该方法的微阵列数据已经被大量获得。因此，首先通过人类受试者的血清学分析筛选候选抗原，然后利用转基因小鼠的HLA-DR3、-DR4、DQ2-和-DQ8HLAA2及其他I型HLA糖尿病易感性等位基因筛选针对候选抗原的细胞介导的免疫应答。
利用该方法，本发明人已经鉴定锌转运蛋白蛋白(ZnT8，亦称为Slc30A8)作为用于与T1D有关的预后、诊断和治疗方法的新的自身抗原靶标。ZnT8是一种看起来是被限定于人和小鼠胰岛的胰岛素生成β细胞中的蛋白。本发明人已经证明，ZnT8是患有T1D的人类受试者中自身抗体的靶标，并且已经鉴定出ZnT8的多态性变体作为1型糖尿病易感性、自身免疫性状况、自身抗体特异性和疾病进展及严重性的遗传标志物。ZnT8的自身抗体在临床疾病发展前出现，被认为是初期糖尿病的新标记物。
此外，本发明人发现ZnT8自身抗体靶向于分子的两个不同区域，这些区域中的一个包括3个不同氨基酸(在确定免疫应答的特异性和程度方面均起重要作用)之一。在自身免疫性和糖尿病发展之前的任何时间利用单核苷酸多态性分析确定个体的基因型提供关于编码的变体氨基酸的信息，因此可用于做出关于治疗和护理的临床决定。此外，本发明允许准确分析针对ZnT8的自身抗体的特异性，并进一步根据免疫系统靶向的ZnT8的变体形式对抗体进行分类。目前，取决于分子的325位变体氨基酸的同一性(Arg、Trp或Gln)的3种主要形式(在本文中被称为“异表位(isoepitopes)”)及包括保守氨基酸(aa325不依赖的)的第四表位已被识别。个体的应答可以被分为8种不同的应答之一：(1)无；(2)Arg325-限制性的；(3)Trp325-限制性的；(4)Gln325-限制性的；(5)Arg325-和Trp325-限制性的；(6)Arg325-和Gln325-限制性的；(7)Trp325-和Gln325-限制性的；和(8)氨基酸325-不依赖的。在本文中提出自身抗体应答的这种层化以提供有关疾病进展的信息，对于决定如何利用抗原特异性治疗剂来治疗T1D自身免疫性非常重要。更具体地，本发明人表明：
●60％的新发病TID患者对于针对ZnT8的自身抗体是阳性的；
●20-30％的T1D患者对于针对ZnT8的自身抗体是阳性的，而通过生化(GAD、Ins和IA2自身抗体)或组织学手段(胰岛细胞质自身抗体)测量，所述患者对其他自身抗体是阴性的；
●针对ZnT8的自身抗体的鉴定使患者从低风险(高于1)变为高风险类型(高于2)；
●在利用GAD的单一分析形式中，抗ZnT8分析检测到90％的新发病T1D患者；
●本发明能够大规模筛选患者；
●ZnT8自身抗体靶向于分子的两个不同区域(N端和C端)，其后者包括3个不同氨基酸(在确定免疫应答的特性和程度方面均起重要作用)之一。
●针对上面鉴定位点的自身抗体复合基因编码的序列，因此确实是自身反应性的，等位基因以高(75％)、中(25％)和低(1％)频率存在，在人种间显示显著变异；
●在3岁前患有糖尿病的幼儿具有比预期更高ZnT8的CC(对于Arg325基因型是纯合的)频率(75％vs 55％)和更低的ZnT8的CT基因型(对于Arg325和Trp 325基因型是杂合的)频率(35％vs 40％)。年龄更大的儿童显示与正态群体中报道的类似的基因型频率。因此，CC基因型可以被认为是糖尿病的危险因素。
在本发明之前，在为了鉴定与胰腺β细胞特异性相关的分子的出版物中鉴定和报道了编码ZnT8一部分的部分核苷酸序列，作为mRNA其在胰腺β细胞中比在α细胞、肝或肾中的表达更高(Neophytou et al.，1996，Diabetes 45：127-133)。两个克隆的部分核苷酸序列保存于
Figure A20078005185900221
登录号为Z47772(克隆23)和Z47779(克隆41)。但是，该出版物没有鉴定出ZnT8的全长核苷酸或氨基酸序列，该出版物也没有鉴定或证明所述部分序列编码潜在的自身抗原。
完整的ZnT8分子最初在2004年由瑞士的一个小组克隆，该小组主要研究重金属离子转运蛋白(参见Chimienti et al.，Biometals 2005Aug；18(4)：313-7；Chimienti et al.，Diabetes 2004Sep；53(9)：2330-7；和Seve et al.，BMCGenomics 2004May 23；5(1)：32，每篇均在此完整引入作为参考)。利用生物信息学方法和免疫组织化学，Chimienti等观察到分子在胰岛中表达，他们还报道了其与胰岛素分泌颗粒的结合。此外，Chimienti等人教导了当在HeLa细胞中过表达时，ZnT8导致胞内囊泡中的锌积聚，表明ZnT8是参与细胞质锌向胞内囊泡转运的ZnT。但是，在这些报告中未提及ZnT8是潜在的自身抗原，因此，也未提及其在如本文描述的那些诊断或治疗方法中的用途。
本发明人对ZnT8作为1型糖尿病中自身抗原的重要作用的发现基于在本发明人实验室进行的一系列新近实验，其具体解决了以下问题：在新发病的1型糖尿病患者中ZnT8是否是体液自身反应性的靶标。本发明人进行的初步研究提示，大约10％患者对ZnT8显示中等自身反应性(参见实施例)。所述分析法的进一步发展(利用分子的COOH末端(C端)片段取代全长ZnT8的)(如下所述)显著增加该分析法的灵敏性，这样的话在疾病发病时直至70％的T1D受试者被检测是阳性的(相对低于1％的配对对照)。与目前在T1D受试者中使用的基于公知分子：胰岛素、谷氨酸脱羧酶(GAD65)和IA-2(PTrN)的体液自身反应性分析法相比，这种灵敏性与其相当或更好。本发明人还证明ZnT8是独立的疾病标记物，因此，完善并扩展了基于抗体的分析法的灵敏性。通过检查10年间收集的一系列样品，显示在前驱糖尿病的发展过程中ZnT8抗体出现得比其他抗体更晚，因此它可以指示胰岛炎的最终破坏期，所以它是早期临床疾病的标记物。
此外，本发明人发现ZnT8自身抗体靶向于分子的两个不同区域，这些区域中的一个包括3个不同氨基酸(在确定免疫应答的特性和程度方面均起重要作用)之一。因为可以通过基因组的核苷酸序列确定变体氨基酸序列，因此有可能确定编码的变体氨基酸。本发明人第一次证明，针对该位点的自身抗体匹配基因编码的序列，因此确实是自身反应性的。所述基因显示3个已知的等位基因，其以高(75％)、中(25％)和低(1％)频率存在，并在人种间显示显著的变异。这对如何诊断自身免疫性及如何指导治疗性检测有启示作用，因为根据所需结果，针对正确(自身)或错误(非自身)编码的序列是有益或有害的。例如，免疫治疗的目的可以是诱导免疫耐受性，或相反，分别通过使用或去除免疫元件来编排免疫系统，诸如破坏性效应T细胞或保护性调控T细胞。
在本发明之前，没有理由怀疑ZnT8可能是被免疫系统的抗体或细胞武器识别的自身抗原。实际上，就本发明人所知，ZnT8还没有在自身免疫性糖尿病背景下被研究，在免疫学范围内也没有关于该分子的其他公开数据。如上所述，在其他自身免疫病和糖尿病范围内存在关于使用自身抗原作为诊断剂和治疗剂的文献报告。但是，这些指向分子诸如胰岛素、谷氨酸脱羧酶(GAD65)、IA2、phogrin和热休克蛋白60，它们从结构、细胞生物学和免疫观点看均与ZnT8无关。
此外，尽管通过例如磷酸化或瓜氨酸化(citrullination)鉴定蛋白的单氨基酸差异或单氨基酸的翻译后改造是以前就有的，但没有理由怀疑这种变化将是如本发明人显示的自身抗体特异性的具体决定因素。实际上，单核苷酸多态性(SNP)编号rs13266634和rs16889462，其编码人ZnT8编码序列的非同义变化，已公开于国家生物技术信息中心(NCBI)的单核苷酸多态性数据库。该SNP编码ZnT8中氨基酸325位的选择性Arg或Trp(SEQ ID NO：2)，其与本发明人研究中鉴定的多态性变体一致。但是，就本发明人所知，之前还没有鉴定出该SNP与1型糖尿病(T1D)的关系。基因组范围的关联研究鉴定出ZnT8包含大量与2型糖尿病相关的SNPs，包括上面引用的rs13266634(Sladek et al.，2007，Nature.2007Feb 22；445(7130)：881-5.电子出版2007Feb 11)，最近还发表了ZnT8多态性与β细胞功能之间关系的在线报告(Staiger et al.，2007，PLoS ONE.2007 Sep 5；2(9)：e832)。但是，2型糖尿病不是自身免疫病，就本发明人所知，之前还没有鉴定出该SNP与1型糖尿病的关系。此外，没有证明2型糖尿病患者显示ZnT8自身抗体。
已经鉴定出其他T1D自身抗原(即GAD65和IA2)序列中的多态性变体；但是，在1型糖尿病中这些都不涉及这些自身抗原的自身反应性的变化。在IA2中，似乎有mRNA的选择性剪接，其以组织特异性方式存在，可以想象得到导致逃脱免疫监视。但是，这不等同于本发明人在本文中报道的遗传变异类型，即，与自身抗体对分子的特异性识别有关的单氨基酸改变。因此，本发明人的所述发现是没有前例的。本文描述了以下发现，由普通多态性编码的ZnT8的两种形式定性诱导不同的免疫应答，从而将自身抗体测定提高到新的水平。它还提示，分子的不同形式可用于靶向于免疫系统的不同组分，以引起不同的免疫结果。
因此，本发明人在本文中描述了编码ZnT8的基因、其衍生的核酸分子、所述基因和核酸分子编码的ZnT8蛋白或其片段以及所述基因和蛋白的同系物及相关药剂(例如，抗体，激动剂，拮抗剂)，和ZnT8的多态性变体在开发各种诊断和治疗工具及分析法中的用途，和所述基因、核酸、蛋白、同系物、和/或相关药剂和/或包括上述物质的组合物或制剂在开发各种诊断和治疗工具及分析法中的用途或靶向作用。所述工具及分析法包括，但不限于：
1.在人和实验动物中用于检测糖尿病相关自身免疫性的分析法，基于针对ZnT8的抗体应答，分子的特定结构域及衍生自该蛋白的肽。这种分析法以放射免疫沉淀分析法、ELISAs、时间分辨荧光和化学发光(luminescence)分析法的形式提供，尽管本发明还包括其他形式。这种分析法可用于：
a.预测个体或受试者组中对1型糖尿病患病的易感性；
b.监测自身免疫性从初始的良性自身反应性向破坏性胰岛炎的进展；和/或
c.监测目的在于预防或改善前驱糖尿病状况下自身免疫性的治疗的效果。这种治疗可以基于广泛的潜在免疫抑制性药剂，包括那些根据ZnT8分子本身设计的药剂。
2.在人和实验动物中用于检测糖尿病相关自身免疫性的表位特异性自身抗体分析法，基于针对ZnT83种变体形式的探针，并使用编码所述3种形式的重组蛋白作为竞争剂或阻断剂。这种分析法可以采用放射免疫沉淀分析法、ELISAs、时间分辨荧光和化学发光分析法的形式，尽管本发明还包括其他形式。这种分析法可用于：
a.如上文(1)，通常根据抗体的发生率、应答水平、抗体滴度或应答的亲合力、亲和性或克隆形成能力预测个体和受试者组中对1型糖尿病患病的易感性；
b.在特定个体中确定3个表位中哪个作为靶标，及在疾病和治疗过程中确定应答特异性的变化以便测量进展和针对治疗的应答；
c.通过基因型的组合确定免疫应答的可能靶向表位特异性，从而预先确定最佳治疗形式；和/或
d.监测目的在于预防或改善前驱糖尿病状况下自身免疫性的治疗的效果。这种治疗可以基于广泛的潜在免疫抑制性药剂，包括那些根据ZnT8分子本身设计的药剂。
3.在人和实验动物中用于检测糖尿病相关自身免疫性的分析法，基于针对所述蛋白和衍生肽的T淋巴细胞反应性，利用淋巴细胞增殖性应答、MHCI型和II型四聚体试剂和ELISPOT分析。
4.针对抗原的标记抗体，基于自身抗体与标记抗体的竞争的测定作为分析工具。
5.抗自发性抗体作为配体的模拟物。
6.基于抗原、结合抗原的抗体和/或结合细胞的抗原或抗体的治疗剂。
7.基于ZnT8的试剂用于进一步的诊断目的。这些包括针对所述分子、肽、肽模拟物和变异肽的多克隆及单克隆抗体，当它们在体内施用时，能够影响病程，或可以在体外使用以刺激来自自身免疫受试者的T细胞采取不同表型，从而变得更具有耐受性。
8.抗原特异性免疫治疗剂(基于同源肽表位或结合其MHC分子的变异肽)及对T细胞有毒性的试剂(它们将与肽/MHC复合物结合)，或识别抗原肽的单克隆抗体，或模拟物诸如分离的分子或与另一分子组分复合的分子(诸如肽/MHC复合物或肽/T细胞受体复合物，它们将作为正常肽相互作用和信号转导的激动剂或拮抗剂)。根据个体的基因型和当时优势抗体的表位特异性，治疗剂可以符合抗体的特异性，或不符合以刺激可选的免疫应答。
9.使用ZnT8分子作为重组蛋白，以保护性而不是破坏性的方式改变免疫系统的应答。这包括使用重组蛋白，该蛋白的化学或物理改造形式，衍生自该蛋白的肽序列，化学或物理改造的肽及肽同系物，可以用作疫苗。
10.制备含ZnT8表位特异性肽或试剂(诸如小分子或抗体)的效应分子的偶联物或组合，以高度特异性的靶向于维持自身免疫反应的免疫过程。这基于以下原理，抗体是特异性B细胞的产物，B细胞还充当针对自身反应性T细胞的抗原递呈细胞，而T细胞反过来提供信号以活化B细胞并造成其分化。
11.基于人和小鼠ZnT8mRNA的cDNA构建体，包括缺失，嵌合构建体，单个或多个位点的点突变以改变编码序列，及使用这种构建体作为诊断剂或研究免疫应答的特异性；
12.表位标记的融合蛋白，包括GFP、GST、NUS和聚组氨酸序列，在用于哺乳动物细胞、酵母和大肠杆菌中表达ZnT8的载体中，及使用这种构建体作为诊断剂或研究免疫应答的特异性。
13.用于在哺乳动物细胞中转导和表达ZnT8的腺病毒构建体，包括多态性变体及表位标记的报告蛋白构建体，及使用这种构建体作为诊断剂或研究免疫应答的特异性。
图20显示在人类中识别的Slc30A基因的10种变体的比较，尽管这些中的1种(Slc30A9)可能不是真正的同系物，考虑到其低的氨基酸序列同一性和相似性(在上文括号中显示)。ZnT8的最接近亲缘物是Slc30A2(溶酶体蛋白)、Slc30A3(与突触小泡有关的蛋白)和Slc30A4。用Slc30A8激发的兔抗体显示与Slc30A3的交叉反应性，这表明反应性或交叉反应性还可能存在于其他人类自身免疫病中，像多发性硬化。相反，针对Slc30A8反应性T细胞的糖尿病Slc30A8自身抗体还可能以其他组织作为靶标，从而导致糖尿病的并发症。因此，本发明的工具和方法被认为适用于T1D以外的自身免疫病，诸如但不限于，全身性红斑狼疮，重症肌无力，风湿性关节炎，多发性硬化，乳糜泻，自身免疫性甲状腺炎，艾迪生氏病，格雷夫斯氏病和风湿性心脏炎。本发明的方法适用于任意自身免疫病，其中Slc30A8(ZnT8)或同系物是靶标或自身抗原(自身抗体或T细胞自身抗原)。
此外，本发明人已经证明，在一些情况下含有ZnT8自身抗体的个体显示对Slc30A基因家族(编码其他ZnT转运蛋白)的其他成员的反应性。例如，本发明人证明对ZnT3的一些反应性，ZnT3通常被认为是神经元特异的亚型。该发现的重要启示在于，这种反应性在胰腺外的组织中可能造成病理性结果。众所周知糖尿病尤其是1型糖尿病与周围神经病有关，而抗原的交叉反应性可能体现这些疾病之间的联系。因此，本发明的工具和方法被认为适用于通过抗原交叉反应性联系的其他疾病，包括但不限于，周围神经病。
本文显示的本发明方面包括下列临床观察：
·前驱糖尿病(prediabetes)：
-ZnT8自身抗体通常出现较早，在GADA和IAA及IA2A之后
-其出现不存在严格的先后(hierarchy)，ZnT8可以比糖尿病早1-12年
·新发病(new onset)
-发病2-3年后ZnT8的流行增加，60-80％在16-18年达到最大
·发病后(post onset)
-通过C肽测量，ZnT8在发病后下降，半衰期为1年，可能与β细胞群的损失平行。
-ZnT8的持续性低于GAD或IA2。
-在没有可测量的C肽情况下ZnT8可以持续，反之亦然。
ZnT8核酸，蛋白，多态性变体，同系物，片段，抗体，和组合物
ZnT8基因，结构信息，核酸和氨基酸序列
在一个实施方案中，本发明包括使用编码ZnT8的基因，以及源自或包括该基因的编码区和/或调控区一部分的核酸分子，和包括该基因的任意多态性变体的核酸分子。本发明还包括使用任意ZnT8蛋白，其同系物或片段，包括其任意多态性变体，或其激动剂或拮抗剂，包括由上述引用的基因或核酸分子编码的那些。新的ZnT8核酸分子和蛋白(包括各种新的ZnT8的同系物，变体，片段，融合蛋白，和嵌合蛋白)及其激动剂和拮抗剂，均被本发明包括为物质的组成。本发明进一步包括可用于本发明各种方法的ZnT8抗体，其抗原结合片段和抗原结合肽。
锌转运蛋白蛋白8(ZnT8，亦称为Slc30A8)是由ZnT8基因编码的369个氨基酸的蛋白。与其他ZnT蛋白一样，ZnT8包含6个跨膜结构域，在跨膜结构域IV和V之间包含组氨酸富集环(参见Chimienti et al.，2004，Diabetes，上文，和本文所示图4)。该蛋白只在胰腺中转录，更具体的，只在胰岛的β细胞中表达。如Chimienti等所述，同上，ZnT8基因位于染色体8q24.11上，包含8个外显子，跨越37kb。人ZnT-8蛋白的cDNA和推定氨基酸序列提供于Chimienti等，同上，该出版物显示人ZnT8的基因结构、染色体定位和推定的剪接(参见Chimienti等的图1A，同上)。编码人ZnT8的cDNA序列和推定的氨基酸序列显示于Chimienti等(同上)的图1B，其中还显示了预测的ZnT8跨膜结构域。Chimienti等(同上)的图1C显示了hsZnT-8、mmZnT-8和rnZnT-8氨基酸序列的比较，用黑色框标明相同的残基。在本文中编码人ZnT8的核酸序列用SEQ ID NO：1表示。SEQ ID NO：1编码人ZnT8蛋白，其氨基酸序列在本文中用SEQ ID NO：2表示。小鼠ZnT8也是本领域公知的。编码小鼠ZnT8的核酸序列用SEQ ID NO：3表示。SEQ ID NO：3编码小鼠ZnT8蛋白，其氨基酸序列在本文中用SEQ ID NO：4表示。编码人ZnT8的核苷酸序列还描述于国家生物技术信息中心(NCBI)数据库，登录号NM_173851(gi：64762488)。人ZnT8的氨基酸序列也可参见NCBI数据库，登录号NP_776250(gi：64762489)。编码大鼠ZnT8的核苷酸序列也是已知的。本文引用的数据库登录号和出版物中包含的所有信息也在此引入作为参考。这些序列的各种多态性变体、片段、嵌合蛋白和融合蛋白在本文其他地方描述，也包括在本发明中。
Chimienti等，同上，图3A-D，提供ZnT8结构分析的进一步描述，包括预测的ZnT8跨膜结构域和组氨酸富集域的位置，所述组氨酸富集域是ZnT家族的其他成员共有的(参见Chimienti等)。这些结构模体在大鼠和小鼠ZnT-8中是保守的。在人ZnT8蛋白中，相对于SEQ ID NO：2，保守的组氨酸出现在197、203和205位。在小鼠中，SEQ ID NO：4196位的组氨酸对应人His197，SEQ ID NO：4204位的组氨酸对应人His205。因此，在本发明之前可以获得大量有关ZnT8核酸和氨基酸序列的结构和功能信息。
本发明包括的ZnT8的同系物、变体、片段和表位
本发明还包括许多天然存在和合成得到的ZnT8变体(同系物)，包括基因中的核苷酸和氨基酸多态性，通过选择性起始位点编码的蛋白，和各种片段，融合蛋白及嵌合蛋白，和编码所述片段、融合蛋白及嵌合蛋白的核酸分子。这些多核苷酸和蛋白或肽可用于本发明的各种诊断、治疗和研究应用，如下文所述。
在本发明的一个实施方案中，可用于本文所述任意方法的ZnT8的同系物或变体包括下列氨基酸序列，基本上由下列氨基酸序列组成，由下列氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与野生型ZnT8蛋白的氨基酸序列、尤其是本文描述的人ZnT8蛋白(参加上文的讨论)至少约45％，或至少约50％，或至少约55％，或至少约60％，或至少约65％，或至少约70％，或至少约75％，或至少约80％，或至少约85％，或至少约90％，或至少约95％相同，或至少约95％相同，或至少约96％相同，或至少约97％相同，或至少约98％相同，或至少约99％相同(或45％到99％之间的任意百分比同一性，全整数增加)。在一个实施方案中，同系物包括下列氨基酸序列，基本上由下列氨基酸序列组成，或由下列氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与ZnT8蛋白天然存在的氨基酸序列低于100％相同，低于约99％相同，低于约98％相同，低于约97％相同，低于约96％相同，低于约95％相同，等等，按1％增加，到低于约70％相同。
本发明还包括各种天然存在和合成得到的ZnT8变体，它们是通过选择性起始位点编码的蛋白，以及其片段(肽)，融合蛋白，或其嵌合蛋白，可用于本文描述的任意诊断、治疗或研究方法。例如，具有选择性起始位点的人ZnT8的天然变体在本文中用SEQ ID NO：5表示。该蛋白跨越SEQ ID NO：2的氨基酸50到367位。参照图3，显示的基因结构是本发明人通过比对公开的EST序列和基因推断的。但是它不同于被认为是“正常的”8外显子基因结构。具体来说，评价大约210个EST序列，并鉴定显著的剪接位点变化，其可能导致组织表达的潜在变化，因为5’UTR被改变。在外显子4被剪接的情况下，序列越过阅读框和截短的转录物，通常是MEFLERAYLVNDKAAKMYAFTLERRSCK*(SEQ ID NO：6)，尽管另一种截短形式是用SEQ ID NO：7(MEFLERTYLVNDKAAKMYAFTLERRSRK*)表示，其中第7位是苏氨酸取代丙氨酸，第27位是精氨酸取代半胱氨酸。看起来下游Met可以用作选择性起始位点，产生该序列NH2末端的截短型。如果这以组织特异性方式(例如在胸腺而不在胰腺中)存在，然后出现可以被免疫系统靶向的隐蔽表位。本发明人的实验室有证据证明，这种出现有助于针对其他糖尿病相关自身抗原(IA-2和IGRP)的自身反应性。选择性翻译产物也可以作为“外来”肽表位被呈现给免疫系统。此外，已经鉴定了全长ZnT8蛋白的天然多态性变体，其包括但不限于，用组氨酸取代SEQ ID NO：218位的酪氨酸，用缬氨酸取代SEQ ID NO：2261位的丙氨酸，和用色氨酸或谷氨酰胺取代SEQ ID NO：2325位的精氨酸。本发明特别对ZnT8的多态性变体(尤其是在325位)感兴趣，将在下文详细描述。包括所述多态性的蛋白、变体、片段、嵌合蛋白和融合蛋白，及编码它们的核苷酸均被本发明包括。
参照图4A和4B，预测NH2和COOH末端位于膜的相同一侧。就参考序列而言，N末端是74aa，就具有选择性起始位点的亚型而言，N末端是25aa。94aa的COOH末端包括1型糖尿病中的主要体液免疫决定簇。该表位隐含于全长分子，位于aa268和358之间，这是通过去除最后15aa造成的对抗原性的最小影响来证明的。令人惊讶的是，这是一个在不同物种的ZnT转运蛋白间高度保守的区域。因此，有可能产生抗ZnT8蛋白的自身反应性(只针对胰腺β细胞)，其还可以通过传染性生物的同源蛋白产生。对于另一糖尿病自身抗原IA2已经观察到类似的联系(未公开的工作)。这是一个通则，然后就可以假设T1D中的自身免疫性可能由含类似Zn转运蛋白的微生物的轻度感染引发。同样，有可能用传染原的指定表位进行免疫。第二更弱的表位位于不保守的N末端。
鉴定出的表位看起来位于细胞内部，就像自身抗原IA2和GAD65一样。参照图4B，位于附图顶端的短环(包括用97-105；164-168和239-252位表示的位置)将可能朝向分泌途径的细胞元件的内腔。这有可能包括内质网，高尔基体，胰岛素分泌颗粒和最终包括细胞间隙。有可能它们暴露于细胞表面，在胰岛素颗粒的正常胞吐作用期间、正常分泌期间或如果细胞以某些方式被损伤。因此本文包括针对呈现这些环的肽的抗体用于检测ZnT8，它从而可以用作体内成像β细胞群的生物标记物，以测定细胞活性(分泌更多等于更暴露)和在正常发育期间监测从其他来源诸如干细胞的β细胞生成。本发明的一种抗体被提议激发抗小鼠ZnT8的腔结构域2序列(SEQ ID NO：4的163-183位，或ERLLYPDYQIQAGIMITVSGC)用于细胞生物学应用。此外，已经制备出针对人C末端(作为与谷胱甘肽S转移酶的融合蛋白)的抗体(参见下文)。利用本文提供的教导，可以产生针对N端和C端区域序列的其他抗肽抗体。还可以制备抗磷酸肽抗体。
在第二胞内结构域和C端环中存在分子磷酸化的潜在位点。这些位点的磷酸化可以决定分子在细胞中的定位及其作为Zn转运蛋白的活性。新一代治疗剂以蛋白激酶作为靶标，因此有可能通过药物施用调节体内的蛋白活性。
第三胞内环(描述为图4B中SEQ ID NO：2的残基196-215)富含组氨酸残基(SEQ ID NO：2的197、203和205位)，其在结合Zn和其他重金属中可能是重要的。这可能属于分子将锌从细胞质转移到包膜小室内腔(构成分泌途径)的机制。
在本发明的一个实施方案中，包括ZnT8的片段用于诊断和治疗方法，或用于抗体的产生。根据本发明，ZnT8蛋白、蛋白部分(片段，部分，结构域，等等)或蛋白区域或表位的大小底限是足以作为产生抗体的表位或保守结合表面或作为体外分析的靶标的大小。在一个实施方案中，本发明的蛋白长度为至少约4，5，6，7或8个氨基酸(例如，适合作为抗体表位或作为分析法中的可检测肽)，或长度为至少约25个氨基酸，或长度为至少约50个氨基酸，或长度为至少约100个氨基酸，或长度为至少约150个氨基酸，等等，在4个氨基酸和直到ZnT8蛋白全长或其部分或更长之间的任意长度，为全整数(例如，8，9，10，...25，26，...300，301，...)。就任意物种的ZnT8蛋白而言，本发明包括任意长度的任意N端片段、C端片段、其嵌合体或缺失片段，其中人ZnT8是优选的，包括其任意多态形式。表1和图15-19、21和25，例如，描述了有关ZnT8的表位和异表位定位的其他信息，包括对于自身反应性非常重要的C末端残基的鉴定。所述信息允许在本文描述的任意诊断、预后和治疗方法中设计、产生和使用ZnT8的各种片段和同系物。
正如以上的讨论，图4A和4B显示预测的ZnT8蛋白的跨膜结构域。这些结构域给分析法的设计提出一个问题，因为它们通常被脂质围绕并且非常有粘性，所以该蛋白或者沉淀或者不折叠。这类区域可能是T细胞的靶标，因此被包括用于本发明的片段，但它们不太可能是抗体的靶标。全长序列显示对循环抗体的反应性，并且所述反应性在糖尿病中比在对照中更高。但是该分析法只检测了新近发病个体中的10-20％。因此，本发明人提供选择性探针，即下文阐述的N端、C端和Zn结合环探针。
用于本发明的尤其优选的ZnT8蛋白片段是ZnT8的任意N端或C端片段，其中C端片段是特别优选的。另一种优选的ZnT8片段是ZnT8N端和C端片段的混合物或杂交物(嵌合体)。尤其优选的ZnT8片段包括来自人ZnT8的约C端110残基到约C端8残基的任意C端片段，基本上由来自人ZnT8的约C端110残基到约C端8残基的任意C端片段组成，或由来自人ZnT8的约C端110残基到约C端8残基的任意C端片段组成。尤其优选的C端片段包括人ZnT8的101和102C端残基。
可用于本发明各种实施方案的各种蛋白、变体、嵌合蛋白和片段显示下文的表1。任何蛋白、变体、嵌合蛋白或片段可添加一个、两个或更多个氨基酸残基(例如，在片段N端的甲硫氨酸，如对于下文的C端片段所示)。此外，根据提供的这些构建体和实施例提供的信息，本领域技术人员能够轻易地产生其他构建体，其中添加的氨基酸被缺失，嵌合体结构域的顺序被逆转，或本文描述的两个或更多个片段或其部分被组合产生其他嵌合蛋白。
表1
N3探针(N端片段)SEQ ID NO：2的aa1-74Mr＝8576pl＝6.72
MEFLERTYLVNDKAAKMYAFTLESVELQQKPVNKDQCPRERPEELESGGMYHCHSGSKPTEKGANEYAYAKWKL(SEQ ID NO：8)
C4Probe(C端片段)SEQ ID NO：2的aa268-369Mr 11235Pl＝4.95
MKDFSILLMEGVPKSLNYSGVKELILAVDGVLSVHSLHIWSLTMNQVILSAHVATAASRDSQVVRREIAKALSKSFTMHSLTIQMESPVDQDPDCLFCEDPCD(SEQ ID NO：9)
截短的C端探针1(在本文描述的分析法中是有活性的)
MKDFSILLMEGVPKSLNYSGVKELILAVDGVLSVHSLHIWSLTMNQVILSAHVATAASRDSQVVRREIAKALSKSFTMHSLTIQMES(SEQ ID NO：10)
截短的C端探针2(在本文描述的分析法中是无活性的)
MKDFSILLMEGVPKSLNYSGVKELILAVDGVLSVHSLHIWSLTMNQVILSAHVATAASRDSQVVRREIAKALSKSFTM(SEQ ID NO：11)
突变的C端探针(在本文描述的分析法中是具有降低的活性)
MKDFSILLMEGVPKSLNYSGVKELILAVDGVLSVHSLHIWSLTMNQVILSAHVATAASRDSQVVRREIAKALSASFTMASLTIQMAAPVDQDPDCLFCEDPCD(SEQ ID NO：12)
锌结合环
VLTVVLHQRCLGHNHKEVQANASVRA(SEQ ID NO：13)
M275探针SEQ ID NO：2的aa275-369Mr 10414Pl＝5.21
MEGVPKSLNY SGVKELILAV DGVLSVHSLH IWSLTMNQVI LSAHVATAASRDSQVVRREI AKALSKSFTM HSLTIQMESP VDQDPDCLFC EDPCD(SEQ IDNO：14)
M282探针SEQ ID NO：2的aa283-369Mr 9703Pl＝5.15
MNYSGVKELI LAVDGVLSVH SLHIWSLTMN QVILSAHVAT AASRDSQVVRREIAKALSKS FTMHSLTIQM ESPVDQDPDC LFCEDPCD(SEQ ID NO：15)
M282探针SEQ ID NO：2的aa290-369Mr 8699Pl＝5.08
MILAVDGVLS VHSLHIWSLT MNQVILSAHV ATAASRDSQV VRREIAKALSKSFTMHSLTI QMESPVDQDP DCLFCEDPCD(SEQ ID NO：16)
M300探针SEQ ID NO：2的aa300-369Mr 7845Pl＝5.50
MHSLHIWSLT MNQVILSAHV ATAASRDSQV VRREIAKALS KSFTMHSLTIQMESPVDQDP DCLFCEDPCD(SEQ ID NO：17)
M305探针SEQ ID NO：2的aa300-369Mr 7257Pl＝4.74
MWSLTMNQVI LSAHVATAAS RDSQVVRREI AKALSKSFTM HSLTIQMESPVDQDPDCLFC EDPCD(SEQ ID NO：18)
C4探针SEQ ID NO：2的Δaa293-369Mr 2827Pl＝4.68(Sall切割)MDFSILLMEG VPKSLNYSGV KELILA(SEQ ID NO：19)
C4探针SEQ ID NO：2的Δaa325-369Mr 6109Pl＝6.13(Hpall切割)MDFSILLMEG VPKSLNYSGV KELILAVDGV LSVHSLHIWS LTMNQVILSAHVATAAS(SEQ ID NO：20)
C4探针SEQ ID NO：2的Δaa344-369Mr 8282Pl＝8.87(Hphl切割)
MDFSILLMEG VPKSLNYSGV KELILAVDGV LSVHSLHIWS LTMNQVILSAHVATAASRDS QVVRREIAKA LSKSFT(SEQ ID NO：21)
C4探针SEQ ID NO：2的Δaa351-369Mr 9093Pl＝8.87(BstXI切割)
MDFSILLMEG VPKSLNYSGV KE LILAVDGV LSVHSLHIWS LTMNQVILSAHVATAASRDS QVVRREIAKA LSKSFTMHSL TIQMESPVDQ DPDCLFCEDPCD(SEQ ID NO：22)
C4探针SEQ ID NO：2的Δaa357-369Mr 9752Pl＝6.86(BstNI切割)
MDFSILLMEG VPKSLNYSGV KELILAVDGV LSVHSLHIWS LTMNQVILSAHVATAASRDS QVVRREIAKA LSKSFTMHSL TIQMESPVD(SEQ ID NO：23)
C4野生型SEQ ID NO：2的aa268-369Mr 11235Pl＝4.95(突变用下划线表示)
MDFSILLMEG VPKSLNYSGV KELILAVDGV LSVHSLHIWS LTMNQVILSAHVATAASRDS QVVRREIAKA LSKSFTMHSL TIQMESPVDQ DPDCLFCEDPCD(SEQ ID NO：24)
其他C4突变探针(SEQ ID NO：9，含有相对于SEQ ID NO：2位置的突变)：
K340A；Mr＝11177pl＝4.74
H345A；Mr＝11168pl＝4.74
E352A；Mr＝11176pl＝5.17
S353A；Mr＝11218pl＝4.95
S353D；Mr＝11262pl＝4.77
三元组K340A，H345A，E345A；Mr＝11053pl＝4.67
小鼠ZnT8氨基酸序列变体
mSLC30a8C端Met266，Gln324
MKDFSILLME GVPKGLSYNS VKEIILAVDG VISVHSLHIW SLTVNQVILSVHVATAASQD SQSVRTGIAQ ALSSFDLHSL TIQIESAADQ DPSCLLCEDP QD(SEQID NO：40)
mSLC30a8C端Met266，Arg324
MKDFSILLME GVPKGLSYNS VKEIILAVDG VISVHSLHIW SLTVNQVILSVHVATAASRD SQSVRTGIAQ ALSSFDLHSL TIQIESAADQ DPSCLLCEDP QD(SEQ ID NO：41)
mSLC30a8C端Met266，Trp324
MKDFSILLME GVPKGLSYNS VKEIILAVDG VISVHSLHIW SLTVNQVILSVHVATAASWD SQSVRTGIAQ ALSSFDLHSL TIQIESAADQ DPSCLLCEDP QD(SEQ ID NO：42)
mSLC30a8C端Met266，Lys339(插入)
MKDFSILLME GVPKGLSYNS VKEIILAVDG VISVHSLHIW SLTVNQVILSVHVATAASQD SQSVRTGIAQ ALSKSFDLHS LTIQIESAAD QDPSCLLCED PQD(SEQ ID NO：43)
mSLC30a8C端Met266，Arg324，Lys339(插入)
MKDFSILLME GVPKGLSYNS VKEIILAVDG VISVHSLHIW SLTVNQVILSVHVATAASRD SQSVRTGIAQ ALSKSFDLHS LTIQIESAAD QDPSCLLCED PQD(SEQ ID NO：44)
mSLC30a8C端Met266，Trp324，Lys339(插入)
MKDFSILLME GVPKGLSYNS VKEIILAVDG VISVHSLHIW SLTVNQVILSVHVATAASWD SQSVRTGIAQ ALSKSFDLHS LTIQIESAAD QDPSCLLCED PQD(SEQ ID NO：45)
Met266REKK突变体TGIAQALS331-338＞REIAKALSK332-340
MKDFSILLME GVPKGLSYNS VKEIILAVDG VISVHSLHIW SLTVNQVILSVHVATAASQD SQSVRREIAK ALSKSFDLHS LTIQIESAAD QDPSCLLCED PQD(SEQ ID NO：46)
Met266RREKK突变体(R325；TGIAQALS331-338＞REIAKALSK332-340
MKDFSILLME GVPKGLSYNS VKEIILAVDG VISVHSLHIW SLTVNQVILSVHVATAASRD SQSVRREIAK ALSKSFDLHS LTIQIESAAD QDPSCLLCED PQD(SEQ ID NO：47)
Met266WREKK突变体(R325；TGIAQALS331-338＞REIAKALSK332-340
MKDFSILLME GVPKGLSYNS VKEIILAVDG VISVHSLHIW SLTVNQVILSVHVATAASWD SQSVRREIAK ALSKSFDLHS LTIQIESAAD QDPSCLLCED PQD(SEQ ID NO：48)
人ZnT8氨基酸序列变体
hSLC30a8C端267Met，325Arg
MKDFSILLME GVPKSLNYSG VKELILAVDG VLSVHSLHIW SLTMNQVILSAHVATAASRD SQVVRREIAK ALSKSFTMHS LTIQMESPVD QDPDCLFCED PCD(SEQ ID NO：49)
hSLC30a8C端267Met，325Gln
MKDFSILLME GVPKSLNYSG VKELILAVDG VLSVHSLHIW SLTMNQVILSAHVATAASQD SQVVRREIAK ALSKSFTMHS LTIQMESPVD QDPDCLFCED PCD(SEQ ID NO：50)
hSLC30a8C端267Met，325Trp
MKDFSILLME GVPKSLNYSG VKELILAVDG VLSVHSLHIW SLTMNQVILSAHVATAASWD SQVVRREIAK ALSKSFTMHS LTIQMESPVD QDPDCLFCED PCD(SEQ ID NO：51)
hSLC30A8连接子序列
PSTPPGSSGG G(SEQ ID NO：52)
hSLC30a8C端二聚体1Met，59Arg，连接子，172Arg(59和172位对应于野生型中的aa325)
MKDFSILLME GVPKSLNYSG VKELILAVDG VLSVHSLHIW SLTMNQVILSAHVATAASRD SQVVRREIAK ALSKSFTMHS LTIQMESPVD QDPDCLFCEDPCDPSTPPGS SGGGKDFSIL LMEGVPKSLN YSGVKELILA VDGVLSVHSLHIWSLTMNQV ILSAHVATAA SRDSQVVRRE IAKALSKSFT MHSLTIQMESPVDQDPDCLF CEDPCD(SEQ ID NO：53)
hSLC30a8C端二聚体1Met，59Arg，连接子，172Gln
MKDFSILLME GVPKSLNYSG VKELILAVDG VLSVHSLHIW SLTMNQVILSAHVATAASRD SQVVRREIAK ALSKSFTMHS LTIQMESPVD QDPDCLFCEDPCDPSTPPGS SGGGKDFSIL LMEGVPKSLN YSGVKELILA VDGVLSVHSLHIWSLTMNQV ILSAHVATAA SQDSQVVRRE IAKALSKSFT MHSLTIQMESPVDQDPDCLF CEDPCD(SEQ ID NO：54)
hSLC30a8C端二聚体1Met，59Arg，连接子，172Trp
MKDFSILLME GVPKSLNYSG VKELILAVDG VLSVHSLHIW SLTMNQVILSAHVATAASRD SQVVRREIAK ALSKSFTMHS LTIQMESPVD QDPDCLFCEDPCDPSTPPGS SGGGKDFSIL LMEGVPKSLN YSGVKELILA VDGVLSVHSLHIWSLTMNQV ILSAHVATAA SWDSQVVRRE IAKALSKSFT MHSLTIQMESPVDQDPDCLF CEDPCD(SEQ ID NO：55)
hSLC30a8C端二聚体1Met，59Gln，连接子，172Gln
MKDFSILLME GVPKSLNYSG VKELILAVDG VLSVHSLHIW SLTMNQVILSAHVATAASQD SQVVRREIAK ALSKSFTMHS LTIQMESPVD QDPDCLFCEDPCDPSTPPGS SGGGKDFSIL LMEGVPKSLN YSGVKELILA VDGVLSVHSLHIWSLTMNQV ILSAHVATAA SQDSQVVRRE IAKALSKSFT MHSLTIQMESPVDQDPDCLF CEDPCD(SEQ ID NO：56)
hSLC30a8C端二聚体1Met，59Gln，连接子，172Arg
MKDFSILLME GVPKSLNYSG VKELILAVDG VLSVHSLHIW SLTMNQVILSAHVATAASQD SQVVRREIAK ALSKSFTMHS LTIQMESPVD QDPDCLFCEDPCDPSTPPGS SGGGKDFSIL LMEGVPKSLN YSGVKELILA VDGVLSVHSLHIWSLTMNQV ILSAHVATAA SRDSQVVRRE IAKALSKSFT MHSLTIQMESPVDQDPDCLF CEDPCD(SEQ ID NO：57)
hSLC30a8C端二聚体1Met，59Gln，连接子，172Trp(59和172位对应于野生型中的aa325)
MKDFSILLME GVPKSLNYSG VKELILAVDG VLSVHSLHIW SLTMNQVILSAHVATAASQD SQVVRREIAK ALSKSFTMHS LTIQMESPVD QDPDCLFCEDPCDPSTPPGS SGGGKDFSIL LMEGVPKSLN YSGVKELILA VDGVLSVHSLHIWSLTMNQV ILSAHVATAA SQDSWVVRRE IAKALSKSFT MHSLTIQMESPVDQDPDCLF CEDPCD(SEQ ID NO：58)
hSLC30a8C端二聚体1Met，59T rp，连接子，172Trp
MKDFSILLME GVPKSLNYSG VKELILAVDG VLSVHSLHIW SLTMNQVILSAHVATAASWD SQVVRREIAK ALSKSFTMHS LTIQMESPVD QDPDCLFCEDPCDPSTPPGS SGGGKDFSIL LMEGVPKSLN YSGVKELILA VDGVLSVHSLHIWSLTMNQV ILSAHVATAA SWDSQVVRRE IAKALSKSFT MHSLTIQMESPVDQDPDCLF CEDPCD(SEQ ID NO：59)
hSLC30a8C端二聚体1Met，59Trp，连接子，172Arg
MKDFSILLME GVPKSLNYSG VKELILAVDG VLSVHSLHIW SLTMNQVILSAHVATAASWD SQVVRREIAK ALSKSFTMHS LTIQMESPVD QDPDCLFCEDPCDPSTPPGS SGGGKDFSIL LMEGVPKSLN YSGVKELILA VDGVLSVHSLHIWSLTMNQV ILSAHVATAA SRDSQVVRRE IAKALSKSFT MHSLTIQMESPVDQDPDCLF CEDPCD(SEQ ID NO：60)
hSLC30a8C端二聚体1Met，59Trp，连接子，172Gln
MKDFSILLME GVPKSLNYSG VKELILAVDG VLSVHSLHIW SLTMNQVILSAHVATAASWD SQVVRREIAK ALSKSFTMHS LTIQMESPVD QDPDCLFCEDPCDPSTPPGS SGGGKDFSIL LMEGVPKSLN YSGVKELILA VDGVLSVHSLHIWSLTMNQV ILSAHVATAA SQDSQVVRRE IAKALSKSFT MHSLTIQMESPVDQDPDCLF CEDPCD(SEQ ID NO：61)
hSLC30a8N端/C端融合野生型Trp325变体
MEFLERTYLV NDKAAKMYAF TLESVELQQK PVNKDQCPRE RPEELESGGMYHCHSGSKPT EKGANEYAYA KWKLCSGGGK DFSILLMEGV PKSLNYSGVKELILAVDGVL SVHSLHIWSL TMNQVILSAH VATAASWDSQ VVRREIAKALSKSFTMHSLT IQMESPVDQD PDCLFCEDPC D(SEQ ID NO：62)
hSLC30a8N端/C端融合野生型Arg325变体
MEFLERTYLV NDKAAKMYAF TLESVELQQK PVNKDQCPRE RPEELESGGMYHCHSGSKPT EKGANEYAYA KWKLCSGGGK DFSILLMEGV PKSLNYSGVKELILAVDGVL SVHSLHIWSL TMNQVILSAH VATAASRDSQ VVRREIAKALSKSFTMHSLT IQMESPVDQD PDCLFCEDPC D(SEQ ID NO：63)
hSLC30a8N端/C端融合野生型Trp325变体-选择性起始密码子
MYHCHSGSKP TEKGANEYAY AKWKLCSGGG KDFSILLMEG VPKSLNYSGVKELILAVDGV LSVHSLHIWS LTMNQVILSA HVATAASWDS QVVRREIAKALSKSFTMHSL TIQMESPVDQ DPDCLFCEDP CD(SEQ ID NO：64)
hSLC30a8N端/C端融合野生型Arg325变体-选择性起始密码子
MYHCHSGSKP TEKGANEYAY AKWKLCSGGG KDFSILLMEG VPKSLNYSGVKELILAVDGV LSVHSLHIWS LTMNQVILSA HVATAASRDS QVVRREIAKALSKSFTMHSL TIQMESPVDQ DPDCLFCEDP CD(SEQ ID NO：65)
hSLC30a8C端/N端融合野生型Arg325变体
MKDFSILLME GVPKSLNYSG VKELILAVDG VLSVHSLHIW SLTMNQVILSAHVATAASRD SQVVRREIAK ALSKSFTMHS LTIQMESPVD QDPDCLFCEDPCDGGGMEFL ERTYLVNDKA AKMYAFTLES VELQQKPVNK DQCPRERPEELESGGMYHCH SGSKPTEKGA NEYAYAKWKL CS(SEQ ID NO：66)
序列hSLC30a8无TM节段Trp325变体
MEFLERTYLV NDKAAKMYAF TLESVELQQK PVNKDQCPRE RPEELESGGMYHCHSGSKPT EKGANEYAYA KWKLCSASDA AHLLIDSSKP PSKRLTFGWHRAECERLLYP DYQIQATLHQ RCLGHNHKEV QANASVRKPE YKKDFSILLMEGVPKSLNYS GVKELILAVD GVLSVHSLHI WSLTMNQVIL SAHVATAASWDSQVVRREIA KALSKSFTMH SLTIQMESPV DQDPDCLFCE DPCD(SEQ ID NO：67)
表1列出的序列由本发明人设计，以检测患者自身反应性的各种特征，并设计分析法，其能够更好的在患者之间进行鉴别，或相反地，是泛反应性的。下面列表显示本发明人如何根据患者自身反应性(患者血清样品)将如上所述的序列分类。不在括号内的序列表示鉴定出针对包含该序列的构建体的患者反应性；括号内显示的序列表示降低的活性或者改变的活性，这可能是还有待确定的其他特异性造成的。对于一个特定样品类型来说，序列号识别的缺失表示缺乏反应性。就Gln325限制性反应性来说，信息是有限的，因为在已经检验的超过500位患者中迄今为止只鉴定出1位患者血清。
●N端反应性样品：SEQ ID NOs：8，63，64，65
●Arg325-限制性反应性：SEQ ID NOs：9，10，(11)，(12)，14，15，(16到21)，(22)，23，(24 to 30)，(40)，41，(42)，(43)，44，47，49，(52)，53，54，55，57，60，63，65
●Trp325-限制性反应性：SEQ ID NOs：(40)，(41)，42，(43)，45，48，51，(52)，55，58，59，60，61，62，64
●Gln325-限制性反应性：SEQ ID NOs：40，(41)，(42)，50
●氨基酸325非依赖的：SEQ ID NOs：9to 16，(17到21)，22，23，24，(25到30)，(40，41)，42，(43)，47到51，(52)，53到65
本发明还包括ZnT8蛋白，其包括抗原肽或T细胞表位(也称为主要组织相容性复合体(MHC)结合肽)，基本上由抗原肽或T细胞表位(也称为主要组织相容性复合体(MHC)结合肽)组成，或由抗原肽或T细胞表位(也称为主要组织相容性复合体(MHC)结合肽)组成。这类肽包括能够以下列方式结合MHC蛋白的任意肽，所述方式使得MHC-肽复合物能够结合T细胞受体(TcR)，在优选的实施方案中，从而诱导T细胞应答(例如，刺激性或致耐受应答，如下所述)。MHC-结合肽(结合MHC分子，并且与MHC分子一起被T细胞受体识别)被认为是抗原肽。实际上，在抗原结合MHC蛋白前，通过抗原水解产生的肽先经历水解。I型MHC蛋白通常呈递来自细胞的细胞质中主动合成蛋白的抗原肽。与此相反，II型MHC蛋白通常呈递来自外源蛋白(进入细胞内吞途径)或者内质网(ER)中合成蛋白的抗原肽。胞内运输使得抗原肽与MHC蛋白结合。所获MHC肽复合物然后转移到细胞表面，在那里它被提供与TcR相互作用。
肽与MHC肽结合沟的结合可以控制被TcR识别的MHC和/或肽氨基酸残基的空间排列。这种空间控制部分是由肽和MHC蛋白之间形成的氢键造成的。优选的，T细胞表位的长度为约5到约40个氨基酸残基，更优选的为约6到约30个氨基酸残基，和甚至更优选的为约8到约20个氨基酸残基，和甚至更优选的在约9到11个氨基酸残基之间，包括长度为5到40个氨基酸之间的任意大小肽，全整数增加(即，5，6，7，8，9...40)。尽管天然MHCII型结合肽在约9-40个氨基酸之间变化，在几乎所有的情况下，所述肽可以截短到约9-11个氨基酸核心，而不损失MHC结合活性或T细胞识别。
与多核苷酸和蛋白或肽有关的一般定义和实施方案
除非另外指出，本发明的实施将使用分子生物学(包括重组技术)，微生物学，细胞生物学，生物化学，核酸化学和免疫学的常规技术，这是本领域技术人员公知的。这类技术在下列文献中有详尽解释，诸如，Methods ofEnzymology(酶学方法)，Vol.194，Guthrie et al.，eds.，Cold Spring HarborLaboratory Press(1990)；Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验手册)，第二版(Sambrook et al.，1989)和Molecular Cloning：A LaboratoryManual(分子克隆：实验手册)，第三版(Sambrook and Russel，2001)，(本文中统称为“Sambrook”)；Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学实验方法)(F.M.Ausubel et al.，eds.，1987，包括直到2001的补充)；PCR：ThePolymerase Chain Reaction(PCR：聚合酶链式反应)，(Mullis et al.，eds.，1994)；Harlow and Lane(1988)Antibodies，A Laboratory Manual(抗体，实验手册)，Cold Spring Harbor Publications，New York；Harlow and Lane(1999)UsingAntibodies：A Laboratory Manual(使用抗体：实验手册)Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(本文中统称为“Harlow and Lane”)，Beaucage et al.eds.，Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry(核酸化学实验方法)John Wiley&Sons，Inc.，New York，2000)。
根据本发明，分离的多核苷酸(还称为分离的核酸分子)是已经从其天然环境转移(例如，已经过人工处理)的核酸分子，其天然环境是自然界中发现所述核酸分子的基因组或染色体。因此，“分离的”不是必需反映核酸分子纯化的程度，但表示该分子不包括完整的基因组或完整的染色体(其中发现自然界中的该核酸分子)。用于本发明的多核苷酸通常是本发明基因(正义或非正义链)的一部分，它们适合用作鉴定指定样品中全长基因(或其部分)的杂交探针或PCR引物，或适用于编码ZnT8蛋白或其片段，或适合作为治疗剂(例如，反义或适体)。分离的核酸分子可以包括基因或基因的一部分(例如，调控区或启动子)，例如，以产生报告构建体或重组蛋白。包括基因的分离的核酸分子不是包括该基因的染色体的片段，而是包括该基因相关的编码区和调控区，但没有相同染色体上天然存在的其他基因。分离的核酸分子还可以包括侧翼(即，序列的5′和/或3′端)有额外核酸的指定核酸序列，所述额外的核酸在自然界中通常不在指定核酸序列的侧翼(即，异源序列)。分离的核酸分子可以包括DNA，RNA(例如，mRNA)，或DNA或RNA的衍生物(例如，cDNA)。尽管短语“核酸分子”主要是指物理上的核酸分子，短语“核酸序列”主要是指核酸分子中核苷酸的序列，但这两个短语可以互换使用，尤其是当其涉及能够编码蛋白的核酸分子或核酸序列时。优选的，利用DNA重组技术(例如，聚合酶链式反应(PCR)扩增，克隆)或化学合成来产生本发明的分离的核酸分子。
本发明核酸分子或多核苷酸的大小底限如下：足以编码具有所需生物活性的蛋白，足以形成探针或寡核苷酸引物，所述探针或寡核苷酸引物能够与编码天然蛋白的核酸分子的互补序列形成稳定的杂交物(例如，在中等、高或非常高的严谨性条件下)，或另外在本文所述的分析法或任意治疗方法中用作靶标或药剂。如果多核苷酸是寡核苷酸探针或引物，该多核苷酸的大小取决于核酸组成，核酸分子与互补序列之间的百分比同源性或同一性，以及杂交条件本身(例如，温度，盐浓度，和甲酰胺浓度)。用作寡核苷酸探针或引物的多核苷酸的大小底限是长度为至少约5个核苷酸，优选的范围为约5到约50或约500个核苷酸或更多(1000，2000，等等)，包括其中的任意长度，整数增加(即，5，6，7，8，9，10，...33，34，...256，257，...500...1000...)，和优选的为约10到约40个核苷酸，和最优选的长度为约15到约40个核苷酸。一方面，如果核酸分子是富含GC的，则寡核苷酸引物或探针的长度为至少约12到约15个核苷酸，如果它们是富含AT的，则长度为至少约15到约18个碱基。除了实际极限外，对本发明核酸分子的最大值没有限制，因为所述核酸分子可以包括蛋白编码序列的一部分或编码全长蛋白的核酸序列。
根据本发明，寡核苷酸探针(或简单地，探针)是大小范围最常见从长约8个核苷酸到数百个核苷酸的核酸分子。这种分子通常被用于鉴定样品中的靶核酸序列，通过在严谨杂交条件下与所述靶核酸序列杂交。如本文使用的，严谨杂交条件是指标准杂交条件，在该条件下核酸分子用于鉴定类似的核酸分子。这类标准条件公开于，例如，Sambrook et al.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual(分子克隆：实验手册)，Cold Spring Harbor Labs Press，1989.Sambrook et al.，同上，在此完整引入作为参考(具体参见，第9.31-9.62页)。此外，计算合适杂交和洗涤条件(以实现允许不同错配程度的核苷酸杂交)的公式公开于，例如Meinkoth et al.，1984，Anal.Biochem.138，267-284；Meinkoth et al.，同上，在此完整引入作为参考。
更具体的，本文涉及的中等严谨杂交和洗涤条件，是指在杂交反应中允许与核酸分子具有至少约70％核酸序列同一性的核酸分子分离的条件(即，该条件允许核苷酸的约30％或更低错配)。本文涉及的高严谨杂交和洗涤条件，是指在杂交反应中允许与核酸分子具有至少约80％核酸序列同一性的核酸分子分离的条件(即，该条件允许核苷酸的约20％或更低错配)。本文涉及的非常高严谨杂交和洗涤条件，是指在杂交反应中允许与核酸分子具有至少约90％核酸序列同一性的核酸分子分离的条件(即，该条件允许核苷酸的约10％或更低错配)。正如以上的讨论，本领域技术人员可以使用Meinkoth等(同上)的公式计算合适的杂交和洗涤条件以实现所述特定水平的核苷酸错配。这类条件将取决于形成的是DNA:RNA或DNA:DNA杂交物而不同。计算出的DNA:DNA杂交物的解链温度比DNA:RNA杂交物低10℃。在具体实施方案中，DNA:DNA杂交物的严谨杂交条件包括在以下条件杂交：离子强度为6X SSC(0.9M Na+)，温度为约20℃到约35℃(低严谨)，更优选的，约28℃到约40℃(更严谨)，甚至更优选的，约35℃到约45℃(甚至更严谨)，并利用合适的洗涤条件。在具体实施方案中，DNA:DNA杂交物的严谨杂交条件包括在以下条件杂交：离子强度为6X SSC(0.9M Na+)，温度为约30℃到约45℃，更优选的，约38℃到约50℃，甚至更优选的，约45℃到约55℃，并利用类似的严谨洗涤条件。这些值基于对大于约100个核苷酸的分子、0％甲酰胺和约40％的G+C含量的解链温度的计算。或者，可以按Sambrook等所述(上文，第9.31到9.62页)通过经验计算Tm。通常，洗涤条件应当尽可能严谨，并与选择的杂交条件相适应。例如，杂交条件可以包括盐和温度条件(低于计算的具体杂交物的Tm约20-25℃)的组合，洗涤条件通常包括盐和温度条件(低于计算的具体杂交物的Tm约12-20℃)的组合。适用于DNA:DNA杂交物的杂交条件的实例包括，在约42℃6X SSC(50％甲酰胺)中杂交2-24小时，然后是洗涤步骤(包括室温下用约2X SSC一次或多次洗涤)，继之以在更高温度和更低离子强度下另外洗涤(例如，在约37℃约0.1X-0.5X SSC中至少一次洗涤，然后在约68℃约0.1X-0.5X SSC中至少一次洗涤)。
PCR引物也是核酸序列，尽管PCR引物通常是用于聚合酶链式反应的长度相当短的寡核苷酸。本领域技术人员利用来自靶序列的序列信息，能够轻易地开发和制备PCR引物和杂交探针。(参见，例如，Sambrook et al.，上文或″Molecular Biotechnology(分子生物技术)，″第二版，Glick和Pasternak，ASM Press，Washington D.C.，1998，第555-590页)。
了解本发明某些核酸分子的核酸序列允许本领域技术人员，例如，(a)制备所述核酸分子的拷贝和/或(b)获得包括所述核酸分子至少一部分的核酸分子(例如，包括全长基因、全长编码区、调节性调控序列、截短编码区的核酸分子)。这种核酸分子可以通过各种方式获得，包括传统的克隆技术，利用寡核苷酸探针筛选相应文库或DNA，及利用寡核苷酸引物PCR扩增相应文库或DNA。待筛选或从其扩增核酸分子的优选文库包括哺乳动物基因组DNA文库。克隆和扩增基因的技术公开于，例如，Sambrook等，如上。
如本文使用的，反义核酸分子被定义为通过高严谨条件下与编码蛋白的基因杂交，降低该蛋白表达的分离的核酸分子。这种核酸分子与编码蛋白的基因足够类似，使得该分子能够在高严谨条件下与编码天然蛋白的基因或RNA的编码或互补链杂交。
RNA干扰(RNAi)是一种方法，其中双链RNA和在哺乳动物系统中，短干扰RNA(siRNA)，用于抑制或沉默互补基因的表达。在靶细胞中，siRNA展开并与RNA诱导的沉默复合物(RISC)结合，其然后被引导到与siRNA互补的mRNA序列，由此RISC切割mRNA。
核酶是一种RNA片段，其通过结合靶标RNA基团并使其灭活(通过在特定切割位点切割磷酸二酯主链)发挥作用。核酶可以作为核酸分子的靶向运输载体，或可选择的，核酶可以例如靶向和结合编码生物标记物的RNA，从而有效抑制所述生物标记物的翻译。
适体是合成核酸(通常是RNA，也可以是DNA)的短链，根据它们以高亲和力和特异性结合预定具体靶分子的能力，选自随机组合核酸文库。适体呈现指定的三维结构，能够区别结构上有细微差别的化合物。
重组核酸分子是包括编码ZnT8蛋白或本文描述的其他蛋白的任意核酸序列中至少之一的分子。在一个实施方案中，重组核酸分子被可操作的连接到至少一个表达调控序列，其在宿主细胞中能够有效调节核酸分子的表达。优选的，利用DNA重组技术(例如，聚合酶链式反应(PCR)扩增，克隆)产生重组核酸分子。重组核酸分子包括重组载体，其是任意核酸序列，通常是异源序列，被可操作的连接到编码蛋白(例如，ZnT8)的分离的核酸分子，其能够启动蛋白的重组生成，或能够在体外(in vitro)、离体(ex vivo)或体内(in vivo)将核酸分子输送入本发明的宿主细胞。这类载体可以包含不是在插入载体的分离核酸分子附近天然存在的核酸序列。载体可以是RNA或DNA，原核或真核的，在本发明中优选的是病毒或者质粒。重组载体可用于核酸分子的克隆、测序和/或在其他方面控制。优选的重组载体被用于核酸分子的表达，其还可以被称作表达载体。优选的重组载体能够在转染的宿主细胞中表达，具体来说，在转染的哺乳动物宿主细胞体内表达。
在本发明的重组分子中，核酸分子被可操作的连接到包含调控序列的表达载体，所述调控序列诸如转录控制序列，翻译控制序列，复制起点及其他调控序列，它们与宿主细胞相容并控制本发明核酸分子的表达。短语“可操作的连结”是指采用以下方式将核酸分子连结到表达控制序列，该方式使得当所述分子被转染(即，转化、转导或转染)入宿主细胞时可以表达。
转录控制序列是控制转录的起始、延伸和终止的序列。尤其重要的转录控制序列是那些控制转录起始的序列，诸如启动子、增强子、操纵子和抑制序列。合适的转录控制序列包括可以在本发明的宿主细胞中起作用的任意转录控制序列。各种合适的转录控制序列是本领域技术人员已知的。尤其优选的转录控制序列包括诱导型启动子，细胞特异性启动子，组织特异性启动子(例如，胰岛素启动子)和增强子。本发明的转录控制序列还可以包括天然存在的转录控制序列，其在分离前与待表达蛋白天然结合。在一个实施方案中，转录控制序列包括诱导型启动子。
一类可用于本发明重组核酸分子的重组载体是重组病毒载体。这种载体包括编码本发明ZnT8蛋白的重组核酸序列，其被包装在病毒包膜中，在施用后所述重组核酸序列可以在动物的宿主细胞或体外表达。可以使用各种重组病毒载体，包括但不限于，那些基于甲病毒，痘病毒，腺病毒，疱疹病毒，慢病毒，腺相关病毒和逆转录病毒的重组病毒载体。尤其优选的病毒载体是基于腺病毒和腺相关病毒的病毒载体。适于基因输送的病毒载体是本领域公知的，可由技术人员选择用于本发明。现有病毒载体的详细讨论提供于″Molecular Biotechnology(分子生物技术)，″第二版，Glick和Pasternak，ASMPress，Washington D.C.，1998，第555-590页，其内容在此完整引入作为参考。
用于转染本发明重组核酸分子的合适宿主细胞包括可以被转染的任意微生物，昆虫，或动物细胞。宿主细胞可以是未转染的细胞或已经转染至少一种核酸分子的细胞。
根据本发明，术语“转染”用于表示能够将外源核酸分子(即，重组核酸分子)插入细胞的任意方法。术语“转化”可以与术语“转染”互换使用，其条件是当该术语用于表示将核酸分子导入微生物细胞(诸如细菌和酵母)时。在微生物系统中，术语“转化”用于描述由于微生物获得外源核酸造成的遗传性改变，并与术语“转染”是基本上同义的。但是，在动物细胞中，转化具有第二种含义，例如，它可以表示细胞变为癌性后培养物中细胞生长特性的变化。因此，为避免混淆，术语“转染”优选的是指将外源核酸导入动物细胞，术语“转染”在本文中使用时通常包括动物细胞的转染及微生物细胞的转化，从而使得该术语涉及外源核酸向细胞的导入。因此，转染技术包括，但不限于，转化，电穿孔，显微注射，脂质体转染，吸附，感染和原生质体融合。
如本文使用的，就包括ZnT8蛋白的本发明分离的蛋白或多肽来说，它是一种已从其天然环境转移的蛋白(即，已经过人工处理)，包括全长蛋白，融合或嵌合蛋白，或该蛋白的任意片段或同系物。这类蛋白可以包括，但不限于，纯化的蛋白，部分纯化的蛋白，重组产生的蛋白，合成产生的蛋白，膜结合蛋白，与脂质复合的蛋白，可溶性蛋白及与其他蛋白结合的分离的蛋白。这样的话，“分离的”不表示蛋白被纯化的程度。优选的，本发明分离的蛋白是重组产生的。此外，再次举例来说，“人ZnT8蛋白”或“源自”人ZnT8蛋白的蛋白是指来自人(智人)的ZnT8蛋白(通常包括天然存在的ZnT8蛋白的同系物)，或根据已知的天然存在的智人ZnT8蛋白的结构(例如，序列)以及也可能是功能另外产生的ZnT8蛋白。换言之，人ZnT8蛋白包括任意ZnT8蛋白，如本文详细所述，其与天然存在的智人ZnT8蛋白具有基本上类似的结构及功能，或是天然存在的智人ZnT8蛋白的活性(即，具有生物活性)同系物。这样的话，人ZnT8蛋白可以包括纯化的，部分纯化的，重组的，突变/改变的及合成的蛋白。根据本发明，术语“改变”和“突变”可以可以互换使用，尤其当涉及本文描述的蛋白的氨基酸序列(或核酸序列)的改变/突变时。可用作本发明拮抗剂或激动剂的分离的蛋白可以从其天然来源分离，重组产生或合成产生。
本发明还包括融合蛋白和嵌合蛋白。融合蛋白是通过将本发明的蛋白或肽(例如，ZnT8或其变体或片段)与融合伴侣(融合部分)结合(通常是重组的，尽管本发明包括化学及其他类型的结合)产生的蛋白。用于本发明的合适融合伴侣包括，但不限于，具有以下功能的融合伴侣：增强蛋白的稳定性；增强或允许蛋白从宿主细胞分泌；提供其他生物活性；和/或协助从宿主细胞纯化蛋白(例如，通过亲和层析)。合适的融合伴侣可以是具有所需功能(例如，赋予增加的稳定性、溶解性、作用或活性；提供其他活性；和/或简化蛋白的纯化)的蛋白或其任意大小的结构域或片段。融合伴侣可以连接到感兴趣蛋白(例如，ZnT8)的氨基和/或羧基端，并且容易被切割，以便能够直接回收表达的外源蛋白。嵌合蛋白类似于融合蛋白，上述术语可以互换使用，除了在嵌合蛋白的情况下，融合伴侣最常见的是感兴趣的第二蛋白(或其片段)，诸如具有所需生物活性的第二蛋白。因此，嵌合蛋白可能具有所述蛋白/肽组分中每种/两种的活性，或由蛋白结构域组合产生的新活性。
在一个优选的实施方案中，利用体外翻译系统(诸如基于网织红细胞裂解物、小麦胚芽、酵母和细菌的系统)产生蛋白(包括肽和同系物)。该系统优选的正确翻译后加工蛋白，例如，通过蛋白水解和/或糖基化。体外翻译系统的产物是本发明方法最常使用的，尽管本发明不限于这类产物。
如本文使用的，术语“同系物”或“变体”用于表示通过对天然存在的蛋白或肽的较小改变而不同于天然存在的蛋白或肽(即，“原型”或“野生型”蛋白)的蛋白或肽，其保持天然存在形式的基本蛋白和侧链结构。这种改变包括，除了不限于：在1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多几条氨基酸侧链中的改变；改变1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多几个氨基酸，包括缺失(例如，蛋白或肽的截短形式)、插入和/或取代；1个或几个原子立体化学的改变；和/或次要衍生，包括但不限于：甲基化，糖基化，磷酸化，乙酰化，豆蔻酰化，异戊烯化，棕榈酸化(palmitation)，酰胺化和/或糖基化磷脂酰肌醇的添加。与天然存在的蛋白或肽相比，同系物可以具有增强、降低或基本上类似的特性。同系物可以包括蛋白的激动剂或蛋白的拮抗剂。
同系物可以是天然等位基因变异或遗传多态性，或任意自然突变的结果。编码蛋白的核酸的天然存在的等位基因变体或遗传多态性是与编码该蛋白的基因存在于在基因组中基本上相同基因座的基因，但由于天然变异，其具有类似但不相同的序列。等位基因变体通常编码与被比较的基因编码的蛋白具有类似活性的蛋白。单核苷酸多态性(SNP)是当基因组中的单核苷酸在物种成员之间或个体的配对染色体之间不同时存在的DNA序列变异。由于人群间的变异，在一个地理或种族中常见的SNP等位基因可能在另一种族中更罕见。此外，人DNA序列的变异可能影响人如何患有疾病及如何对病原体、化学制剂、药物、疫苗和其他试剂产生应答，这已经被本文中针对ZnT8基因中存在的多态性的自身抗体应答所作证。
一类等位基因变体可以编码相同的蛋白，但由于遗传密码的简并性所以具有不同的核酸序列。等位基因变体还可以包括基因的5′或3′未翻译区(例如，在调控性控制区)。等位基因变体是本领域技术人员公知的。
同系物可以利用本领域已知的用于蛋白制备的技术产生，包括但不限于，对分离的天然存在蛋白的直接改变，直接蛋白合成，或利用例如经典或重组DNA技术来影响随机或靶向诱变，对编码蛋白的核酸序列进行改变。
根据本发明，分离的蛋白(包括其生物活性的同系物或片段)，具有活性野生型或天然存在的对照蛋白的至少一种生物活性特征(其可以不同，取决于所述同系物或片段是否是蛋白的激动剂或拮抗剂，或是否描述了蛋白的激动剂或拮抗剂模拟物)。通常，蛋白的生物活性或生物作用是指由蛋白显示或行使的任意功能，其归因于蛋白的天然存在形式，通过体内(即，在蛋白的天然生理环境中)或体外(即，在实验室条件下)测量或观察得到。
本发明ZnT8蛋白的生物活性包括将锌输送出细胞，或将锌固定在胞内小室。更具体的，本发明的ZnT8生物活性包括将细胞质锌转移到胰岛β细胞的胞内囊泡。用于本发明的ZnT8的其他生物学活性包括诱导抗ZnT8的免疫应答，包括细胞及体液免疫应答，以及在分析法中被结合剂识别的能力(例如，形成可以被ZnT8特异结合剂识别的初级或三级结构或构象表位)。
导致蛋白表达降低或蛋白活性降低的修饰、活性或相互作用被称作灭活(完全或部分的)，下调，作用减弱，或蛋白的作用或活性降低。类似地，导致蛋白表达增加或蛋白活性增加的修饰、活性或相互作用被称作蛋白的扩增、过量产生、活化、增强、上调或作用增加。本发明蛋白尤其是ZnT8蛋白的生物活性可以利用本领域已知的用于蛋白生物活性的任意分析法进行测量或评价。这类分析可以包括，但不限于，结合分析(包括各种免疫分析)，确定蛋白和/或相关蛋白的内化或定位的分析，锌运输分析(例如，zinquin分析，描述于Chimienti et al.，2004，Diabetes，上文)和/或用于测定下游细胞事件(由蛋白的活性造成)的分析。
如本文使用的，除非另作说明，百分比(％)同一性是指利用以下方法进行同源性鉴定：(1)BLAST 2.0Basic BLAST同源性搜索，利用标准缺省参数的用于氨基酸搜索的blastp和用于核酸搜索的blastn，其中利用默认值对询问序列进行低复杂性区域过滤(描述于Altschul，S.F.，Madden，T.L.，
Figure A20078005185900481
A.A.，Zhang，J.，Zhang，Z.，Miller，W.&Lipman，D.J.(1997)″Gapped BLAST andPSI-BLAST：a new generation of protein database search programs(缺口BLAST和PSI-BLAST：新一代蛋白数据库搜索程序).″Nucleic Acids Res.25：3389-3402，在此完整引入作为参考)；(2)BLAST 2比对(利用如下所述的参数)；(3)和/或PSI-BLAST，利用标准缺省参数(位置特异性迭代BLAST(Position-Specific Iterated BLAST))。应注意到由于BLAST 2.0Basic BLAST和BLAST 2之间标准参数的一些差异，利用BLAST 2程序有两条特定序列被识别为具有显著的同源性，而在BLAST 2.0Basic BLAST中利用其中一条序列作为询问序列进行的搜索未能在最佳配对(top matches)中鉴定出第二序列。此外，PSI-BLAST提供自动化、易于使用形式的“模式”搜索，这是一种寻找序列同系物的灵敏方法。该程序首先进行缺口BLAST数据库搜索。PSI-BLAST程序利用返回的来自任意显著比对的信息构建位置特异性分数矩阵，其取代询问序列用于下一轮数据库搜索。因此，应了解可以利用这些程序中的任意一项确定百分比同一性。
如Tatusova和Madden所述，(1999)，″Blast 2sequences-a new tool forcomparing protein and nucleotide sequences(Blast 2sequences-一种用于比较蛋白和核苷酸序列的新工具)″，FEMS Microbiol Lett.174：247-250，在此完整引入作为参考，可以利用BLAST 2Sequence对两条特定序列进行彼此比对。BLAST 2序列比对是在blastp或blastn中利用BLAST 2.0算法进行，在两条序列之间进行缺口BLAST搜索(BLAST 2.0)以便在所获比对中导入缺口(缺失和插入)。为了阐明本文，BLAST 2序列比对利用下列标准缺省参数进行。
对于blastn，利用0BLOSUM62矩阵：
配对奖励＝1
错配罚分＝-2
开放缺口(5)和延伸缺口(2)罚分
缺口x_降低(50)预期(10)字大小(11)过滤(开)
对于blastp，利用0BLOSUM62矩阵：
开放缺口(11)和延伸缺口(1)罚分
缺口x_降低(50)预期(10)字大小(3)过滤(开)。
如本文使用的，指定蛋白的“激动剂”是指特征为具有激动(例如，刺激，诱导，增加，增强，或模拟)天然存在蛋白的生物活性的能力的任意化合物，包括任意同系物、结合蛋白(例如，抗体)、试剂(它们与蛋白或被蛋白结合的受体相互作用)，或药物/化合物/肽设计或筛选的任意合适产物，它们的特征在于具有以类似于天然激动剂(其是对照蛋白)的方式激动(例如，刺激，诱导，增加，增强)天然存在蛋白的生物活性的能力。
类似地，“拮抗剂”是指抑制(例如，拮抗，降低，减少，阻断，逆转，或改变)上述蛋白的指定激动剂(包括该蛋白自身)作用的任意化合物。更具体的，拮抗剂能够以与蛋白活性有关的方式发挥作用，这样的话天然激动剂或对照蛋白的生物活性以对该蛋白的天然作用拮抗(例如，抗、逆转或相反)的方式被降低。这种拮抗剂可以包括，但不限于，蛋白，肽，或核酸(包括核酶，RNAi，适体，和反义)，抗体及其抗原结合片段，或提供拮抗效应的药物/化合物/肽设计或筛选的产物。
指定蛋白诸如ZnT8的同系物，包括肽和非肽激动剂和拮抗剂(类似物)，可以是药物设计或筛选的产物，也可以利用本领域已知的各种方法产生。这种同系物可以被称作模拟物。可用于本发明设计或挑选模拟物或其他治疗化合物的药物设计的各种方法公开于Maulik et al.，1997，MolecularBiotechnology：Therapeutic Applications and Strategies(分子生物技术：治疗应用和策略)，Wiley-Liss，Inc.，其在此完整引入作为参考。
如本文使用的，模拟物是指能够模拟天然存在肽的生物作用的任意肽或非肽化合物，通常是因为模拟物具有模拟天然存在肽的基本结构的基本结构，和/或具有天然存在肽的显著生物学特性。模拟物可以包括，但不限于：与原型具有实质改变的肽，诸如与天然存在的肽没有侧链相似性(这种改变，例如，可能降低其对降解的敏感性)；抗个体基因型和/或催化抗体，或其片段；分离的蛋白的非蛋白部分(例如，碳水化合物结构)；或合成或天然的有机分子，包括例如通过组合化学鉴定的核酸和药物。可以利用本领域已知的各种方法设计、选择和/或另外鉴定这类模拟物。
可以获得模拟物，例如，利用分子多样性策略(允许快速构建大的、化学多样性分子文库的相关策略的组合)，天然或合成化合物的文库，尤其是利用化学或组合文库(即，序列或大小不同但具有类似结构单元的化合物的文库)，或通过推理性、定向或随机药物设计。参见例如，Maulik et al.，上文。
在分子多样性策略中，利用生物学、酶学和/或化学方法，例如从肽、寡核苷酸、碳水化合物和/或合成有机分子合成大的化合物文库。开发分子多样性策略中的临界参数包括亚基多样性、分子大小和文库多样性。筛选这种文库的一般目标是利用组合筛选的连续应用以获得所需靶标的高亲和力配体，然后通过随机或者定向设计策略优化先导分子。分子多样性的方法详细描述于Maulik，et al.，如上。
在推理性药物设计步骤中，可以通过例如，核磁共振(NMR)或X-射线晶体衍射法分析调节化合物的三维结构。然后可以使用该三维结构预测潜在化合物的结构，诸如通过例如计算机模拟预测潜在的调节剂。预测的化合物结构可用于优化衍生的前导化合物，例如，通过分子多样性方法。此外，预测的化合物结构可以通过以下方法产生，例如，化学合成，DNA重组技术，或通过从天然来源(例如，植株，动物，细菌和真菌)分离模拟位。
Maulik等还公开了，例如，定向设计的方法，其中用户指导从相应挑选片段的片段文库产生新分子的步骤；随机设计，其中用户使用遗传或其他方法随机突变片段及它们的组合并同时应用选择标准来评价候选配体的适合性；和基于网格的方法，其中用户计算三维受体结构和小片段探针之间的相互作用能，然后将良好探针位点结合到一起。
本发明的抗体和抗原结合伴侣
本发明还包括抗体及其抗原结合片段(它们选择性结合ZnT8)，以及这种抗体及其抗原结合片段在本文描述的任意一项方法中的用途。可以利用从蛋白获得的结构信息(例如，蛋白至少一部分的氨基酸序列)产生选择性结合蛋白的抗体。如本文使用的，术语“选择性结合”是指一种蛋白与另一种(例如，抗体，其片段，或抗原的结合伴侣)的特异性结合，其中通过任意标准分析(例如，免疫分析)测定，结合水平统计上显著高于该分析的背景对照。例如，当进行免疫分析时，对照通常包括只包含抗体或抗原结合片段(即，没有抗原)的反应孔/管，其中无抗原时抗体或其抗原结合片段的反应性量(例如，与孔的非特异性结合)被认为是背景。可以利用本领域的各种方法标准检测结合，包括但不限于：Western印迹，免疫印迹，酶联免疫吸附分析(ELISA)，放射免疫分析(RIA)，免测沉淀，表面等离子体共振，化学发光，荧光极化，磷光，免疫组织化学分析，基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱法，微细胞计数法，微阵列，显微镜检查，荧光活化细胞分选(FACS)，和流式细胞术。
根据本发明，指定蛋白或肽或其他分子的“表位”通常被定义为(对抗体来说)更大分子的部分或位点，抗体或其抗原结合片段将与该分子结合，并且将产生的抗体抗该分子。术语表位可以与术语指定蛋白或抗原的“抗原决定簇”、“抗体结合位点”或“保守结合表面”互换使用。更具体地，表位可以用参与抗体结合的氨基酸残基以及它们在三维空间的构象(例如，构象表位或保守结合表面)来定义。表位可以小至约4-6个氨基酸残基包括在肽中，或包括在蛋白的更大部分，当涉及表位的三维结构(尤其是涉及抗体结合表位)时，无需由邻接氨基酸残基组成。抗体结合表位通常是构象表位而不是连续表位(即，线性表位)，或换言之，由氨基酸残基限定的表位在蛋白或多肽(抗体与其结合)的表面三维空间内排列。如上所述，构象表位不是由氨基酸残基的邻接序列组成，相反，残基可能广泛分布于初级蛋白序列，经由蛋白在三维空间折叠成其天然构象而聚集形成结合表面。因此，本发明包括任意蛋白或肽，它们包括或由下列物质组成：任意ZnT8表位，以及抗体，抗原结合片段，或结合ZnT8蛋白任意表位的其他结合伴侣(结合肽)。
本发明的“异表位”是以变体形式或亚型(天然或通过合成设计)存在的表位，诸如包含多态性变体氨基酸位置的表位。异表位的实例在本文中描述为包含325位的ZnT8表位，其中一种异表位包含325位的精氨酸，两种其他变体天然存在于该位置(Trp325和Gln325)。这三种变体是异表位。
本领域技术人员可以利用已知技术鉴定和/或组装构象表位和/或连续表位，包括突变分析(例如，定点诱变)；防止蛋白水解降解(蛋白足迹法)；模拟位分析，利用例如，合成肽和肽扫描，BIACORE或ELISA；抗体竞争作图；组合肽库筛选；基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱法；或三维模拟(例如，利用任意合适的软件程序，包括但不限于，MOLSCRIPT 2.0(AvatarSoftware AB，Heleneborgsgatan 21C，SE 11731Stockholm，Sweden)，图形显示程序O(Jones et.al.，Acta Crystallography，vol.A47，p.110，1991)，图形显示程序GRASP，图形显示程序INSIGHT。例如，技术人员可以使用分子取代或其他技术及相关蛋白的已知三维结构来模拟ZnT8的三维结构，并预测与该结构结合的抗体的构象表位。实际上，技术人员可以使用这类技术中的一种或任意组合来确定抗体结合表位。
可用于本发明的抗体包括多克隆和单克隆抗体，二价和单价抗体，双或多特异性抗体，包含该抗体的血清，已经被不同程度纯化的抗体，和完整抗体的任意功能同等物。本发明分离的抗体包括包含该抗体的血清，或已经被不同程度纯化的抗体。可选择地，完整抗体的功能同等物，诸如抗原结合片段，其中一个或多个抗体结构域被截短或缺失(例如，Fv，Fab，Fab′，或F(ab)2片段)，以及遗传改造的抗体或其抗原结合片段，包括单链抗体或可以结合超过一个表位的抗体(例如，双特异性抗体)，或可以结合一个或多个不同抗原的抗体(例如，双或多特异性抗体)，也可在本发明中使用。
遗传改造的抗体包括那些通过标准重组DNA技术产生的抗体，涉及编码抗体可变区和/或恒定区的DNA的操作和再表达。具体实例包括，嵌合抗体，其中抗体的VH和/或VL结构域来自于对于抗体剩余部分来说不同的来源，和CDR移植抗体(及其抗原结合片段)，其中至少一个CDR序列和任选的至少一个可变区骨架氨基酸来来源于一个来源，可变区和恒定区的剩余部分(视情况而定)来源于不同的来源。嵌合及CDR移植抗体的构建描述于，例如，欧洲专利申请：EP-A 0194276，EP-A 0239400，EP-A 0451216和EP-A0460617。
通常，在抗体的制备中，合适的实验动物，诸如，例如，但不限于，兔，绵羊，仓鼠，豚鼠，小鼠，大鼠，或鸡，被暴露于抗原(要求该抗原是抗体所针对的)。通常，动物用有效量的抗原(被注射入该动物)免疫。抗原的有效量是指诱导动物产生抗体所需要的量。然后允许动物的免疫系统在预定时间段内产生应答。免疫步骤可以重复，指导发现免疫系统产生针对所述抗原的抗体。为了获得对抗原特异的多克隆抗体，从包含所需抗体的动物收集血清(或就鸡而言，可以从鸡卵收集抗体)。这类血清可用作试剂。通过例如用硫酸铵处理血清，可以从血清(或鸡卵)进一步纯化多克隆抗体。
可以根据Kohler和Milstein的方法(Nature 256：495-497，1975)产生单克隆抗体。例如，从免疫动物的脾(或任意合适的组织)回收B淋巴细胞，然后与骨髓瘤细胞融合得到能够在合适培养基中连续生长的杂交瘤细胞群。通过检测杂交瘤产生的抗体结合所需抗原的能力来挑选产生所需抗体的杂交瘤。
本发明还扩展到非抗体多肽，有时被称为抗原结合伴侣或抗原结合肽，它们被设计成能选择性结合感兴趣的蛋白。设计这种多肽(具有指定的配体特异性)的实例可参见Beste等(Proc.Natl.Acad.Sci.96：1898-1903，1999)，在此完整引入作为参考。
根据本发明，本文术语“抗原”常规使用涉及：蛋白的任意部分(肽，部分蛋白，全长蛋白)，其中蛋白是天然存在的或合成衍生自，细胞组成(全细胞，细胞裂解物或破坏的细胞)，生物(完整生物，裂解物或破坏的细胞)或碳水化合物或其他分子，或其部分，其中抗原引发抗原特异性免疫应答(体液和/或细胞免疫应答)，或可选的作为耐受原，抗相同或类似的抗原(在施用该抗原的动物的细胞和组织内遭遇)。
在本发明的一个实施方案中，当需要刺激免疫应答时，术语“抗原”可以与术语“免疫原”互换使用，在本文中用于描述引发体液和/或细胞免疫应答(即，是免疫原性的)的抗原，这样的话给动物施用免疫原(例如，通过本发明的疫苗)引发抗相同或类似抗原(在动物组织内遭遇)的抗原特异性免疫应答。在另一个实施方案中，当需要抑制抗指定抗原的免疫应答时，抗原可以包括耐受原。根据本发明，“耐受原”用于描述采用以下形式、量或施用途径提供的抗原，这样的话存在减弱或改变的对抗原的免疫应答，优选的免疫系统细胞对接触耐受原或表达或呈递这种耐受原的细胞的应答的无应答性、无反应性、其他失活或缺失。
“接种抗原”可以是免疫原或耐受原，但是用于疫苗的抗原，其中生物反应(免疫应答、耐受性的引发)由抗接种抗原引发。
指定抗原的免疫原性结构域(部分，片段，表位)可以是抗原的任意部分(例如，肽片段或亚基或抗体表位或其他构象表位)，包含当给动物施用时作为免疫原(或耐受原，对于致耐受结构域来说)的至少一个表位。例如，单个蛋白可以包含多种不同的免疫原性结构域。就体液免疫来说，免疫原性结构域不必是蛋白内的线性序列。
作为通称，表位在本文中被定义为指定抗原内的单个免疫原性位点(足以引发免疫应答)，或指定抗原内的单个致耐受位点(足以抑制、去除免疫应答或使免疫应答失活)。正如以上的讨论，本领域技术人员认可T细胞表位与B细胞表位在大小和组成方面不同，并且通过I型MHC途径呈递的表位不同于通过II型MHC途径呈递的表位，表位可以是线性序列或构象表位(保守的结合区域)。这取决于免疫应答的类型。抗原可以小至单个表位，或更大，可以包括多个表位。这样的话，抗原大小可以小至约5-12个氨基酸(例如，肽)和大至：全长蛋白，包括多聚体和融合蛋白，嵌合蛋白，全细胞，全微生物，或其部分(例如，全细胞的裂解物或微生物的提取物)。
本发明的组合物和制剂(formulation)
ZnT8蛋白，同系物(包括突变的肽)，片段，肽，肽和非肽模拟物，及抗体和其抗原结合片段可以被包含在用于本发明的组合物、制剂，尤其是疫苗中。这种组合物、制剂或疫苗，可以包括药学上可接受的载体，其包括药学上可接受的赋形剂和/或载体。如本文使用的，药学上可接受的载体是指适合将可用于本发明方法的组合物、制剂或疫苗输送到合适的体内或体外位点的任意物质。优选的药学上可接受的载体能够采用以下形式维持待输送的药剂(例如，ZnT8蛋白，同系物(包括突变的肽)，片段，肽，肽和非肽模拟物，及抗体和其抗原结合片段其)，这种形式使得药剂到达靶细胞或靶位点时，该药剂能够作用于所述细胞或位点(例如能够诱导免疫应答)。本发明的合适赋形剂包括输送或辅助输送的赋形剂或配方，但不是特异性的将药剂靶向于表位(本文中还称为非靶向载体)。药学上可接受的赋形剂的实例包括，但不限于水，磷酸盐缓冲液，Ringer′s液，葡萄糖溶液，包含血清的溶液，Hank′s液，其他水性生理平衡液，油类，酯和乙二醇。水性载体可以包含要求近似受体生理条件的合适辅助剂物质，例如，通过增强化学稳定性和等渗性。合适的辅助剂物质包括，例如，醋酸钠，氯化钠，乳酸钠，氯化钾，氯化钙，及其他用于产生磷酸盐缓冲液的物质，Tris缓冲液，和碳酸氢盐缓冲液。辅助剂物质还可以包括防腐剂，诸如硫柳汞，m-或o-甲酚，福尔马林和安息油醇。本发明的组合物可以通过常规方法灭菌和/或冻干。
一类药学上可接受的载体包括能够将本发明的组合物缓慢释放入动物的控释剂。如本文使用的，控释剂包括可用于本发明控释赋形剂的试剂。合适的控释赋形剂包括，但不限于，生物相容性聚合物，其他聚合基质，胶囊，微胶囊，微粒，丸剂制品，渗透泵，扩散装置，脂质体，脂质微球(lipospheres)，和透皮输送系统。合适的载体还包括，但不限于脂质体，病毒载体或其他载体，包括核酶。天然的包含脂质的载体包括细胞和细胞膜。人工的的包含脂质的载体包括脂质体和微胶粒。本发明的载体可被改造靶向于患者的特定位点，从而使试剂靶向该位点并在该处使用。合适的改造包括控制载体脂质部分的化学式，和/或向赋形剂中导入能够使载体特异性靶向优选位点(例如，优选的细胞类型)的靶向剂。
疫苗是用于免疫或耐受动物抗特定抗原的特定类型的组合物。因此，疫苗包括引发针对抗原或其免疫原性或致耐受部分(作为疫苗施用的结果)的至少一种化合物或试剂。疫苗的施用优选导致预防或治疗效果，其中后来的暴露于抗原(或抗原的来源)引发抗抗原(或来源)的免疫应答，所述免疫应答在动物中减轻或预防疾病。这种免疫应答通常增强或抑制针对抗原的免疫应答，就ZnT8来说，优选的疫苗抑制抗ZnT8和/或胰岛β细胞的疫苗。接种的概念是本领域公知的。通过施用本发明的治疗组合物引发的免疫应答可以是与未施用疫苗时相比，免疫应答任意方面(例如，细胞应答，体液免疫，细胞因子生成)的任意可检测变化。
本发明的方法
本发明还包括利用鉴定ZnT8作为涉及I型糖尿病(T1D)的新自身抗原的各种方法。这种方法包括用于监测疾病进展或治疗效果的诊断分析，以及预防和治疗方法，包括免疫治疗方法和疫苗策略。ZnT8还可以被用作鉴定可用于T1D的诊断、预防和/或治疗的化合物的新靶标。本发明的方法利用如上所述的ZnT8蛋白，肽，模拟物，同系物，抗体，或甚至核酸分子中的任意一种。在一些实施方案中，这种试剂与其他诊断或治疗部分组合以增加方法的有效性。例如，除ZnT8之外其他自身抗原(例如，胰岛素，胰岛素瘤抗原，和/或谷氨酸脱羧酶)的检测可以与ZnT8的检测组合以增强诊断分析法的有效性、灵敏性和特异性，并且各种治疗部分(例如，毒素，消炎剂，抗原)可以与ZnT8试剂组合或连接以增强对患者的治疗效果。
因此，本发明的实施方案涉及检测糖尿病相关自身免疫性(即，I型糖尿病或T1D)的方法和分析。这种分析可以被用作诊断分析(例如，为了鉴定正患有T1D的患者或一组受试者或预测对T1D的易感性)或用作预后/监测分析。后一分析可用于监测患者或一组受试者中自身免疫性的进展(从自身免疫反应的初始良性(非破坏性的)症状到指示明显T1D的破坏性胰岛炎)。后一分析还可以用于监测治疗效果，其针对前驱糖尿病受试者中自身免疫性的预防和/或治疗或改善。例如，可以给受试者施用一种或多种免疫抑制性或预防性试剂，包括但不限于基于ZnT8分子自身的试剂，然后可以利用本发明的分析监测T1D的进展或非进展。所述分析可以基于检测受试者中针对ZnT8的自身抗体应答，或检测受试者中针对ZnT8抗原表位的T淋巴细胞反应性。所述分析可以单独使用或彼此结合使用。
在一个实施方案中，本发明包括抗体分析，其检测受试者中特异性结合ZnT8的抗体的存在或缺失。本发明的方法基于患者血清中抗ZnT8抗体的水平，可用于有效鉴定或选择最可能将患有或正患有的I型糖尿病的患者，包括预测因素诸如发病时间，或监测疾病的进展或阶段。所述方法还可用于有效鉴定或选择对具体治疗方法有应答或没有应答的患者(即，该方法用于指示对特定患者的治疗方法或显示对特定患者的治疗方法不可取)。
在本发明自身抗体分析的一个方面，检测由ZnT8基因和蛋白多态性确定的特异性异表位。异表位特异性的诊断可以用简单的诊断试验实现，所述诊断试验可以基于结合特异性配体(可以是完整的蛋白或源自它的肽)的抗体。特异性的进一步分析可以通过以下方法实现：测定过量的所述蛋白的特异性变体或衍生肽与抗体竞争和配体相互作用的能力。用于这种分析的分析平台可以是放射免疫沉淀，ELISA，发光时间分辨荧光或大量其他一般分析形式。
方法通常包括利用任意合适的技术检测患者或受试者样品(试样)中选择性结合ZnT8的自身抗体。患者抗体结合的水平可以针对阳性对照(例如，阳性血清对照)标准化，并与实验测定的或预定的抗原(ZnT8)的截止值(阴性对照水平)进行比较和分析，以便确定试样是否包含临床上或相反相关的抗ZnT8抗体的水平。所述分析可以包括筛选除了ZnT8之外的其他自身抗原(包括但不限于，胰岛素，胰岛素瘤抗原和谷氨酸脱羧酶)的能力。
本发明的该方法或分析更具体的包括提供一种ZnT8抗原，可以检测抗该ZnT8抗原的患者抗体。ZnT8抗原可以是任意合适的ZnT8衍生的抗原，包括全长ZnT8蛋白，或其同系物、片段、融合蛋白、突变的肽或肽模拟物，它们可以检测患者中抗ZnT8的血清抗体。ZnT8抗原包含至少一个抗体表位。尤其优选的ZnT8抗原是ZnT8蛋白的C端肽，其在上文被详细描述。
依照本发明，是在根据本文所述信息的预期用途能够有效筛选抗体的条件下进行分析。有效条件包括，但不限于，允许细胞生长的合适培养基、温度、pH和氧条件。通常，在竞争或非竞争性条件下将患者的试样与ZnT8抗原接触，检测、定量试样中自身抗体与ZnT8抗原的结合并与阴性和/或阳性对照进行比较。用于检测样品中抗ZnT8的自身抗体的技术可以包括任意合适的分析，包括但不限于，ELISA(直接或间接的)，放射免疫沉淀分析，时间分辨荧光和化学发光分析。这种分析形式是本领域公知的。
用于本发明该实施方案的优选分析是竞争性铕分析。这种分析已经详细描述于美国临时申请号60/822,786，其在此完整引入作为参考。该方法通常包括进行竞争性抗体分析，其中检测方法使用铕荧光。该方法更具体的包括以下步骤：将抗原(受试者抗体与其选择性结合)固定到基质上，诸如分析板的孔或其他合适的基质；封闭基质上的非特异性结合位点；向板中加入试样(例如，来自进行抗体评价的受试者的血清样品)，其中在存在或不存在抗原的液体形式的条件下预孵育试样(即，竞争步骤)；和最终，利用基于铕的检测系统检测结合固定抗原的抗体，诸如与试剂(例如，生物素)偶联的二抗，然后是结合第一试剂(例如，链霉亲和素)的第二试剂(用铕标记)。然后利用标准的检测方法检测铕发射的荧光水平。因为所述分析是竞争性分析，从与抗原预孵育的样品计数的荧光中减去未与抗原预孵育的样品计数的荧光，获得结果水平。该水平可以针对阳性对照(例如，阳性血清对照)标准化，并与实验测定的或预定的抗原(ZnT8)的截止值(阴性对照水平)进行比较和分析，以便确定试样是否包含临床上或相反相关的抗ZnT8抗体的水平。
根据本发明，术语“试样”一般可用于表示任一类型的样品，其被认为包含或可能包含将通过本发明检测的抗体。试样包括准备好的样品，诸如源自天然样品或合成产生的样品，及更优选的获自待测受试者(个体，患者，动物)的任意生物样品。因此样品包括细胞上清液，体液，组织或其他培养基，它们可能包含待检测的抗体。适于取样的体液包括，但不限于，血液，粘液和母乳，和最优选的是血液或血清样品，其中血清是尤其优选的。
正如以上的讨论，本发明的分析可被安排用于检测一种抗体特异性(即，ZnT8)，超过一种(例如，2，3，4，5，6，7，8，9，或10)抗体特异性(即，检测结合不同抗原或相同抗原的不同表位或其组合的抗体)，或多种(＞10)抗体特异性。换言之，所述方法被安排用于在单次分析或实验中检测一种、超过一种或多种不同的抗体(例如，通过将不同的抗原和/或抗原表位(一组抗原和/或表位)加入单个板或分析基质的不同孔中，以便所述分析利用尽可能多的不同抗体(只要有效)筛选单个样品)。此外，所述分析可被安排以高通量方式筛选多个受试者，以便获得关于受试者群体的信息。
本发明的方法具有数种不同的用途。本发明的方法可用于为了任意目的检测样品中的抗体，包括临床(例如，诊断、预后和治疗)和研究目的。本发明的方法可以利用人或非人动物样品进行。首先，所述方法可用于诊断T1D，或更重要的诊断受试者患T1D的可能性或T1D发病的时间。所述受试者可以是被怀疑患有T1D的个体，已知易患T1D的个体，或被推测是健康的但经历常规或诊断筛选的个体。所述受试者还可以是先前被诊断患有T1D的个体，或已经开始治疗的个体，和正监视T1D进展的个体。术语“诊断(diagnose，diagnosis，diagnosing)”及其变形是指疾病或病症的鉴定(基于其体征和症状)。本文中，“阳性诊断”表明鉴定出疾病或病症，或患疾病或病症的可能性。与此相反，“阴性诊断”表明未鉴定出疾病或病症，或患疾病或病症的可能性。
在本发明的另一个实施方案中，所述方法可用于选择被预测将从T1D的治疗步骤受益或不受益的患者。类似地，所述方法可用于指示对特定患者的具体治疗步骤或显示对特定患者的具体治疗步骤不可取。在该实施方案中，所述方法通常包括以下步骤：(a)进行本发明的方法用于检测本文详细描述的抗体；(b)将患者样品中的抗体水平与选自以下组的抗体的对照水平进行比较：(1)与对治疗步骤的反应性有关的抗体的对照水平；和(2)与对治疗步骤的非反应性有关的抗体的对照水平；和(c)挑选被预测将受益于治疗步骤的患者，如果相对于与对治疗步骤的非反应性相关的抗体的对照水平，患者样品中的抗体水平统计上更类似于与对治疗步骤的反应性有关的抗体的对照水平；或(d)挑选被预测将不会受益于治疗步骤的患者，如果相对于与对治疗步骤的反应性相关的抗体的对照水平，患者样品中的抗体水平统计上更类似于或低于与对治疗步骤的非反应性有关的抗体的对照水平。例如，这种方法可用于指示给患者施用消炎剂或施用选择性靶向ZnT8或另一种自身抗原或其表达的试剂，或显示给患者施用消炎剂或施用选择性靶向ZnT8或另一种自身抗原或其表达的试剂不可取。该实施方案的其他方面对本领域技术人员来说是显而易见的。
利用本发明的方法根据抗体检测的阳性诊断或预后指示，样品中存在的抗体水平统计上显著高于同类样品中实验确定的或预定的阴性或“正常”抗体水平(即，“正常”水平是在未患T1D的受试者中发现的抗体检测水平或其平均值)。为了确定阳性诊断或预后，试样中检测出的抗体水平比设定或确定的基线增加的量是统计上有显著意义的(即，至少95％置信水平，或p＜0.05)。标准化或产生样品中抗体水平“指数”的方法是本领域已知的。利用本发明的方法根据抗体检测的阴性诊断或预后指示，未在样品检测出抗体，或样品中存在的抗体水平统计上没有显著高于(和可以低于)一种水平(该水平统计上显著高于实验确定的或预定的阴性或“正常”抗体水平)。
本发明的另一个实施方案包括T淋巴细胞分析，其检测受试者中特异性结合ZnT8的T细胞的存在或缺失。如同上面讨论的抗体分析一样，本发明的所述方法可以基于患者血清中抗ZnT8的T细胞应答性水平有效鉴定或选择最有可能将患有或正患有I型糖尿病的患者，包括预测以下因素，诸如发病时间，或监测疾病的进展或阶段。所述方法还可用于有效鉴定或选择对具体治疗方法有应答或没有应答的患者(即，该方法用于指示对特定患者的治疗方法或显示对特定患者的治疗方法不可取)。
在该实施方案的一个方面，所述方法包括根据ZnT8多态性检测本文描述的异表位。分析可以区别小肽，通常是8到20个氨基酸长度，其编码蛋白序列，包括分子的可变区或恒定区。这种T细胞应答通常在外周血中监测，但也可用于获自身体其他部分的淋巴细胞群。用于这种分析的分析平台可以基于增殖、细胞因子产生或活化的其他标记物，它们是表面或胞内蛋白标记物或脂质或碳水化合物。这些分析的判断通常还涉及对个体的HLA 1型和2型基因型的了解。
在本发明的这些实施方案中，在检测患者试样的ZnT8特异性T淋巴细胞(T细胞)应答的分析法中提供包含至少一个ZnT8T细胞表位的ZnT8抗原。包括T细胞表位的ZnT8蛋白和抗原已在上文详细描述。例如，在一个实施方案中，体外翻译系统的产物可用于本分析。分析形式可以是用于抗原的任意合适的T淋巴细胞分析，包括但不限于，T淋巴细胞增殖分析，利用MHCI型和II型四聚体试剂的分析，流式细胞分析和ELISPOT分析。因此，合适的分析可以包括基于细胞的分析和不基于细胞的分析。就后者来说，可以使用可溶性T细胞受体，例如，在检测结合可溶性MHC分子(例如，四聚体试剂)的ZnT8抗原的结合或免疫分析中。在前一种情况下，检测抗原与细胞表面T细胞受体的结合，通常通过检测细胞的增殖或细胞的细胞因子产生。在抗体分析中，本发明的T细胞分析可用于检测患者样品中超过一种或多种自身抗原，和/或检测多个受试者中的T细胞应答。
如同所述抗体分析一样，根据ZnT8T细胞应答的检测的阳性诊断或预后指示，患者样品中存在的ZnT8特异性T细胞(自体反应性T细胞)的水平统计上显著高于同类样品中实验确定的或预定的这种T细胞应答的阴性或“正常”水平(即，“正常”水平是在未患T1D的受试者中发现的T细胞应答水平或其平均值)。为了确定阳性诊断或预后，试样中检测出的ZnT8-特异性T细胞应答水平比设定或确定的基线增加的量是统计上有显著意义的(即，至少95％置信水平，或p＜0.05)。标准化或产生样品中ZnT8-特异性T细胞应答水平“指数”的方法是本领域已知的。利用本发明的方法根据ZnT8特异性T细胞应答检测的阴性诊断或预后指示，未在样品检测出ZnT8特异性T细胞应答，或样品中存在的这种应答的水平统计上没有显著高于(和可以低于)一种水平(该水平统计上显著高于实验确定的或预定的这种应答的阴性或“正常”水平)。
本发明还包括用于进行如上所述的任意一项诊断方法的试剂盒。所述试剂盒包括(a)ZnT8抗原(包括如上所述的任意一种蛋白、肽或模拟物)，用于液相中的分析或固定在基质上(可以提供已经固定的抗原或以适于固定的形式提供抗原)；和(b)用于检测抗体与抗原的结合的试剂，和/或用于检测T细胞受体与抗原的结合的试剂(在基于细胞或不基于细胞的分析中)。用于进行所述分析的其他试剂还可以包括，诸如，但不限于，缓冲液，二抗，用于读取所述分析的可检测标记和试剂，可溶性结合蛋白(例如，可溶性MHC，可溶性T细胞受体)，和其他有用的试剂。
本发明的另一个实施方案涉及在治疗和预防性策略中基于鉴定ZnT8作为重要的自身抗原开发和使用各种试剂给受试者接种以在个体中预防、延缓或改善I型糖尿病的发病，抑制或破坏抗胰岛β细胞的自体反应性T细胞应答，和/或将抗胰岛β细胞的免疫应答从破坏性应答变为破坏性更低或保护性更高的应答。
在一个实施方案中，ZnT8蛋白、肽、同系物、模拟物、ZnT8抗体或其抗原结合片段，及其他ZnT8衍生的或基于ZnT8的试剂(包括肽或抗体的化学或物理改造形式)在体外或体内给受试者施用，以便改变T1D发展或发病的过程，和/或在受试者中诱导ZnT8特异性的T淋巴细胞应答，其是致耐受或保护性的，而不是破坏性的。在一个实施方案中，这种试剂作为疫苗施用。这种ZnT8相关的试剂已经在上文描述。
在另一个实施方案中，将基于ZnT8的抗原特异性试剂(被设计成靶向于ZnT8特异性自体反应性T细胞)以及在T细胞中诱导凋亡或对T细胞有毒性的药剂给受试者施用。该方法可以在体内或体外进行。例如，形成肽-结合沟的可溶性MHC分子(参见，例如，美国专利号5,820,866)与ZnT8抗原或致耐受肽(根据该实施方案包括ZnT8的突变肽和同系物，它们结合MHC并引发T细胞应答)结合。这种复合物可以与毒素或其他试剂进一步复合(通过任意共价或非共价技术)，当T细胞通过它们的T细胞受体结合MHC-肽复合物时，所述毒素或其他试剂将诱导T细胞的坏死或凋亡。
适用于本发明作为与ZnT8肽和同系物复合(结合，偶联)的试剂的毒素包括对细胞有毒性的(坏死或凋亡)任意毒素或蛋白、试剂或分子，包括可用于本文所述治疗环境的任意毒素。这种毒素包括，但不限于，Fas配体，美洲商陆抗病毒蛋白，肉毒毒素，蓖麻毒，等等。
此外，从本文描述的遗传、自身抗体和T细胞分析获得的知识可用于决定使用具体的治疗方式。这种方式可基于与ZnT8或Slc30A8无关的试剂，或抗原特异性试剂，诸如单独的或与另一试剂(例如毒素)连接的重组ZnT8蛋白、ZnT8衍生肽，细胞诸如淋巴细胞，蛋白诸如HLA分子或免疫球蛋白，或单独的或与另一试剂连接的Slc30A8DNA。治疗可基于抗原或编码它的核酸或抑制其表达，可以根据所需结果进行调整与异表位匹配或者不匹配。与具有自身反应性的患者的异表位匹配可能是保护性的，通过诱导耐受性体质。另一方面，与其不匹配是一种免疫形式，其也可以被控制用于有益效果。起初就知道个体的异表位状况将是重要的，因为这将决定按照哪条途径和使用哪种亚型的药剂。
这种治疗方法将与目标在于检测治疗剂效果的诊断分析结合。一些情况下这种诊断将是上文提及的自身抗体和T细胞分析的重复；但是产生的一些试剂可应用于疾病特异性目标。例如，包含或编码治疗剂的异表位可应用于B淋巴细胞，以扩增、活化或除去特定细胞类型。治疗效果可以按照靶细胞类型的群来评价，例如，使用与荧光分子的酶偶联的异表位肽标记B细胞群，然后可以通过流式细胞术进行计数和表型表征。这种步骤还可以用于这种细胞群的分离，通过筛选步骤或荧光活化的细胞分选。
上述用于本发明预防和治疗方法的试剂可以单独施用，在组合物、制剂或疫苗中施用，和/或与用于T1D的预防或治疗的其他试剂联合施用(一起或连续地)。正如以上的讨论，将本发明的组合物或药剂以有效输送该药剂到靶细胞或靶位点的方式给患者施用，这样的话所述药剂可以作用于该位点和/或对所述细胞起作用。合适的施用方案包括任意体内或体外施用方案。有效施用方案(即，以有效方式施用本发明的组合物或药剂)包括合适的剂量参数和施用模式(在受试者或细胞中产生组合物或药剂的所需活性)，诸如对自身抗原ZnT8的自体反应性T细胞的耐受性，胰岛炎的预防或减少和/或胰岛β细胞的破坏，及发病的预防、延缓，或T1D严重性的改善。优选的患者获得来自所述施用的一些可测量的、可见的或感觉得到的受益。可以通过实验，例如，利用体外细胞培养，体内动物模型，和最终，临床试验(如果患者是人)，确定有效的剂量参数。可以利用本领域标准的针对具体疾病或病症(患者患有或具有患病的风险)的方法测定有效的剂量参数。这种方法包括，例如，存活率、副作用(即，毒性)和发病、疾病的进展或消退的测定。
给药途经包括体内、体外和离体途径。体内途径包括，但不限于，静脉内施用，腹腔内施用，肌内施用，节点内施用，冠状动脉内施用，动脉内施用(例如，进入颈动脉)，皮下施用，透皮输送，气管内施用，皮下施用，关节内施用，心室内施用，吸入(例如，气雾剂)，颅内，脊柱内，眼内，耳，鼻内，口服，肺部施用，导管的注入，和直接注射入组织。在本发明的一个优选实施方案中，通过肠胃外途径(例如，皮下，皮内，静脉内，肌内和腹腔途径)施用组合物。可以利用本领域标准的方法进行静脉内、腹腔内、皮内、皮下和肌内施用。耳输送可以包括滴耳剂，鼻内输送可以包括滴鼻剂或鼻内注射，和眼内输送可以包括滴眼剂。气雾剂(吸入)输送还可以利用本领域标准的方法进行(参见，例如，Stribling et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA189：11277-11281，1992，其在此完整引入作为参考)。可以将本发明的药剂或组合物与载体(能够抵抗动物肠内消化酶的降解)络合，进行口服输送。这种载体的实例，包括塑料胶囊或片剂，诸如本领域已知的那些。
体外是指在患者体外进行调控步骤的一部分，诸如通过输送药剂或组合物到细胞群(或将细胞与药剂或组合物接触)，其中细胞已从患者取出，并将处理后的细胞返回到患者。这种细胞可以包括，例如，T细胞，其中T细胞被诱导改变它们在体内接触ZnT8时产生的免疫应答类型。给宿主细胞的培养物施用组合物的体外和离体途径通过以下方法实现，包括但不限于，转染，转化，电穿孔，显微注射，脂质体转染，吸附，原生质体融合，蛋白载体的使用，离子载体的使用，用于细胞透化的去污剂的使用，和在培养物中将化合物与靶细胞和/或靶蛋白简单混合(例如，结合)。
对于蛋白、小分子(即，药物设计的产物)或抗体来说，优选的这类药剂的单次剂量通常包括约0.01微克×千克-1到约10毫克×千克-1动物体重。更优选的药剂的单次剂量包括约1微克×千克-1到约10毫克×千克-1动物体重。更优选的药剂的单次剂量包括约5微克×千克-1到约7毫克×千克-1动物体重。甚至更优选的药剂的单次剂量包括约10微克×千克-1到约5毫克×千克-1动物体重。如果药剂是肠胃外输送，另一种尤其优选的药剂的单次剂量包括约0.1微克×千克-1到约10微克×千克-1动物体重。
由本文所述方法产生的预防或治疗效果不必是治愈具体的疾病或病症(例如，I型糖尿病)，而是还可以包括以下结果：大部分情况下包括前驱糖尿病或明显T1D的发病的延缓，或疾病破坏性方面的改善，这样的话与没有所述治疗情况下的预期相比，完全的胰岛损伤将被推迟更长时间，从而给予患者更长的时间来完成对胰岛素疗法的依赖，其他治疗介入，和疾病的下游有害健康影响。如本文使用的，短语“预防疾病”是指减轻疾病的症状；减少疾病的出现或发病，和/或减轻疾病的严重性。保护患者是指给患者施用本发明的药剂或组合物时，其预防疾病出现和/或治愈或减轻疾病症状、体征或病因的能力。像这样，保护患者免患疾病包括预防或延缓疾病发生(预防性治疗)和治疗患有疾病或处于疾病早期的患者(治疗性治疗)。术语，“疾病”泛指与哺乳动物正常健康状态的任何偏离，包括存在疾病症状时的状态，以及其中存在偏离(胰岛β细胞的破坏)但症状还未显示的病症。
本发明的另一个实施方案涉及一种鉴定可用于本文描述的诊断分析，或本文描述的本发明预防或治疗方法的化合物的方法。这种方法包括以下步骤：将基于ZnT8的药剂(例如，ZnT8核酸分子，蛋白或肽，同系物，模拟物，或抗体或其片段，或ZnT8特异性T细胞受体)与推定的调控化合物接触，并检测相互作用和/或由推定的调控化合物与基于ZnT8的药剂相互作用产生的作用。这种分析可以是基于细胞或不基于细胞的。例如，可以利用如上所述的ZnT8蛋白(包括片段及其同系物)鉴定选择性结合ZnT8的抗体及其抗原结合片段。可以使用ZnT8抗体或ZnT8特异性T细胞受体鉴定ZnT8同系物，肽模拟物，突变肽和片段，它们可用于诊断或治疗分析。基于ZnT8的试剂可用于设计新的合成试剂，包括模拟物，用于本文描述的诊断或治疗方法。还可以使用ZnT8核酸分子，蛋白，肽，模拟物或抗体来鉴定在个体中可以抑制或改变针对ZnT8的免疫应答的各种调控化合物。
这种方法的步骤通常包括将基于ZnT8的试剂与推定的调控化合物接触，利用各种分析测量对基于ZnT8的试剂的作用，诸如检测ZnT8mRNA转录(例如，通过聚合酶链式反应(PCR)，逆转录酶-PCR(RT-PCR)，原位杂交，Northern印迹，报告基因的序列分析或检测)；检测ZnT8翻译(例如，通过免疫印迹，酶联免疫吸附分析(ELISA)，放射免疫分析(RIA)，免测沉淀，免疫组织化学和免疫荧光)；和/或检测ZnT8生物活性(例如，通过检测本文描述的任意一项ZnT8活性，或通过检测这种活性的抑制或遏制)。该方法中检测到的化合物可用于本文描述的诊断、预防或治疗方法。
根据本发明，本文描述的方法和分析适用于作为脊椎动物类哺乳纲成员的患者，包括但不限于，灵长类动物，家畜和家养宠物(例如，伴侣动物)。最常见，患者是人类患者。
提供下列实施例是用于说明目的，而不是用于限制本发明的范围。下文和本文其他处公开的每篇出版物或其他参考文献均在此完整引入作为参考。
实施例
实施例1
下列实施例描述将ZnT8(亦称Slc30a8)首次鉴定为新的糖尿病自身抗原。
本发明人利用人U133和小鼠MOE430Affymetrics芯片(实际上覆盖了完整基因组)以及Panchip 5.0(报告小鼠胰腺中的基因转录物)进行寡核苷酸微阵列实验。从正常小鼠、糖尿病模型(NOD和ob/ob)及IAPP基因和Ngn 3缺陷小鼠的分离的胰岛，以及小鼠胰腺肿瘤细胞系(αTC1-6胰高血糖素瘤，βTC3和Min6胰岛素瘤和mPAC导管瘤系)获得数据。分析所述数据，高亮显示具有小岛细胞型特异性表达的转录物，以及它们在胰腺α-和β-细胞之间的分布。使用基于基因本体论(GO)注释的进一步分析来产生人和小鼠候选自身抗原的基因列表。在10个得分最高的候选物中，5个是已知的糖尿病自身抗原，促使本发明人对高得分转录物(对应于ZnT8)中的一种作为新发病的T1D人类受试者中体液自身免疫性的靶标进行验证原则(proof-of-principle)实验。开发的针对该候选物的血清学分析在20％的糖尿病受试者中检测到免疫反应性，而在对照中没有检测到(＜2.5％)。现在的计划利用体液和细胞介导的自身免疫性的分析寻求检查所述列表中的这种和其他基因候选物。
具体来说，覆盖几乎所有编码的小鼠mRNAs范围(转录组)的基因微阵列的出现使得能够鉴定在胰岛中表达的基因亚组。大量公开的研究已经记载了在胰岛组织、特异性小岛细胞类型和胰岛来源的细胞系中表达的基因(67)(Shalev，2002)(68)。此外，研究报告了胰岛对生理和病理生理处理(诸如在体外用葡萄糖或炎性细胞因子刺激)的应答，及载有突变基因(影响胰功能或发育)的小鼠的胰岛的应答。令人遗憾地，目前该数据的大部分不能从中央库公共数据库获得，或在各种微阵列平台上，使得数据标准化非常困难。本发明人利用人U133和小鼠MOE430寡核苷酸芯片(实质上报告了每个物种的全部转录物)进行了超过50次微阵列实验。这包括来自正常小鼠、糖尿病模型(NOD和ob/ob)及IAPP基因和Ngn 3缺陷小鼠的数据。后者完全缺失胰腺内分泌腺细胞，因此在不同妊娠时间点的分析允许鉴定在整个发育期间相对于外分泌和导管组织在内分泌腺细胞中高表达的转录物(69)。已经将这些数据与来自45个组织类型(Novartis数据集和Unigene表达模式)的较大非胰腺组织库的阵列数据和dbEST序列数据进行比较。小鼠胰腺肿瘤细胞系(αTC1-6胰高血糖素瘤，βTC3和Min6胰岛素瘤和mPAC导管瘤系)的分析进一步允许产生预示分数，以选择有可能显示小岛细胞型特异性表达的转录物，以及它们在α-和β-细胞之间的分布。这些细胞系表达与肿瘤细胞表型有关的基因，因此还对来自表达自身抗原Phogrin(与EGFP相连，受大鼠胰岛素2启动子的控制)的转基因小鼠的分离胰腺β细胞进行分析。表2列出一些基因，对于这些基因通过ANOVA分析确定转录物，首先是在任意胚胎学年龄的Ngn3野生型和敲除小鼠(胰腺内分泌腺和前体)中差别表达，其次是存在于成年小鼠胰岛。然后基于在αTC和βTC细胞系中的相对表达将所述列表进行划分。所述方法成功地预测了参与胰岛发育的大多数已知转录调控组分的小岛细胞特异性，诸如Ipf1，Arx，Pax4，Pax6，Brn4，NeuroD及数个α和β细胞基因的已知细胞类型特异性。已知的神经内分泌转录物诸如PTPRN(IA-2)、激素原转化酶(Pcsk1，Pcsk2，Cpe)和granins(Chga，Chgb Scg2，Sgne1)属于常见的αTC和βTC转录物的库。根据预测，与other胰岛内分泌腺细胞有关的基因不表达(Ppy，Pyy和ghrelin)。在已知基因中存在一些意外，例如WilliamsBeuren综合征染色体区域14基因作为显示β细胞特异性的转录物出现。该转录因子是糖酵解和葡萄糖异生作用酶的重要调节因子，与肝起源的2型糖尿病形式有关(70)。它通常被认为分布广泛。利用原位杂交分析追踪(数据未显示)显示，实际上转录物被发现于发育胰腺的区域(此处出现内分泌腺细胞)，在成年胰腺中，转录物限于胰岛，其分布符合β细胞的特异性。
表2.检查基因转录物(在Ngn3ko胰腺中e12.5、e15.5或e18.5被去除)在内分泌腺细胞系αTC和βTC和成年胰岛中的表达。胰岛内分泌腺细胞的组分用下划线表示；已知的自身抗原用黑体字突出显示。
Figure A20078005185900661
表2还显示已知T1D自身抗原的分布，用黑体字突出显示。这种相对简单的生物信息学分析显示，胰岛素1和2，IGRP(G6Pc-rs)，IAPP和IA-2(PTPRN)位于它们的预期细胞位置，但GAD65不是这种情况。但是大部分研究者包括本发明人未在小鼠胰岛中检测到后者，尽管它在人胰岛中是高丰度的(71)。上述分析强调了以下事实，许多自身抗原显示细胞类型特异性。但是其自身不足以确定候选物，因此改进所述生物信息学方法以考虑大量被认为是自身抗原候选物属性的特征，同时根据存在/缺席呼叫(present/absentcall)不排除候选物。模型基本上考虑了下列特征：
1.自身抗原显示对靶细胞的特异性，尽管这不必是绝对的。
2.大多数自身抗原在靶细胞中以中等到高水平表达。
3.T1D自身抗原看起来与调节分泌途径的元件物理相关。
4.细胞介导的自身免疫的许多靶标看起来是膜结合型的。
5.大部分还在胸腺的外周抗原表达细胞中表达。
6.数个显示选择性剪接的组织特异性模式。
特征1-4可以是基于微阵列数据集的交集和组成基因的注释进行评价。人们认为有可能基于这类数据推算出“自身抗原指数”，尽管重点放于对抗原性有贡献的具体结构、分子生物学和细胞生物学特征正在确定，就像与细胞介导的应答相比对体液介导的应答的相对贡献一样。为解决这个问题，本发明人编译了2组基因，一组针对小鼠，一组针对人，基于对内分泌胰腺表达的丰度和特异性(表3)；小鼠数据源自表2中的数据，关于表达数据的人类数据源自79个人类组织的Novartis GeneAtlas(72)。在GeneSpring和GeneSpeed中进行分析，后者是由Jan Jensen及其同事在科罗拉多丹佛的Barbara Davis Center开发的蛋白结构域数据库。
表3
A：小鼠β细胞转录物选择308个转录物，依据是它们不存在于缺失Ngn3的小鼠胰腺，存在于成年胰岛，及它们存在于β-TC细胞系。在UnigeneEST表达数据库中查询这些基因中的每一种，以确定每种基因在38个不同小鼠组织包括胰腺(但不包括胰岛)中转录的频率。列表显示每百万EST克隆频率，以及与所有组织中的总数相比在胰腺中注明的转录物百分比(特异性)。丰度和特异性的结果用于分选数据。编码已知糖尿病自身抗原的转录物被突出显示。
B：人转录物最初查询代表71个不同人组织的Novartis定制寡核苷酸阵列，以确定胰岛数据集中的哪种基因显示与所有其他组织的中值显著不同的信号(ANOVA截断＜0.0002)。筛选出这些转录物的子集(显示比所有组织的中值高5倍的信号)，以去除显示低信号强度(＜200)的转录物，并且相对于胰岛所述子集在胰腺中的表达水平更高。然后将符合这些标准的140个基因用于查询Unigene EST表达数据库，以确定每种基因在52个不同人组织包括胰腺中的转录频率。列表显示胰腺的每百万EST克隆频率(丰度)，以及相对于所有组织来说，胰腺中转录物的百分比(特异性)。数据按Abu*Spec指数分类。编码已知糖尿病自身抗原的转录物被突出显示。
在所述两种情况下，已知的糖尿病自身抗原在所述列表中出现靠前，甚至次要的体液自身免疫靶标诸如ICA69和GAD67也属于最前面的100个候选物。两种列表上的转录物显著重叠，它们的相对丰度和组织特异性相似，除了GAD65外，与人相比时，它在小鼠中表达很少。位于最前面100个中的许多蛋白是分泌颗粒蛋白或与分泌途径有关的膜蛋白，这通过检查SWISSPROT，Prosite和EPCONdb数据库的基因本体论(GO)功能得到确定。
为了解决这些基因列表是否能够真正预测自身抗原靶标的问题，本发明人开发了针对Slc30a8(现被称为ZnT8)的免测沉淀分析，Slc30a8是一种跨膜阳离子转运蛋白，其在小鼠和人类基因列表中表现靠前，是具有中等丰度但高组织特异性的转录物。利用克隆序列的体外翻译及人类血清(来自接受胰岛素疗法之前44例新发病受试者及40岁和HLA配对对照)，开发出一种放射免疫沉淀分析法(图1)。具体来说，从人胰岛cDNA扩增Slc30A8，并将其克隆入pCDNA3定向拓扑载体，验证序列，在利用5μCi 35S甲硫氨酸的网织红细胞裂解物体外翻译反应中用作模板(0.5μg)。将人血清样品(5μl)与20,000dpm翻译产物在50μl包含0.1％NP40的Tris缓冲盐溶液中4℃温育过夜。将固定的Protein A添加到每种温育液中，利用过滤分离免疫球蛋白结合的放射性并通过闪烁计数测定。
T1D血清样品中的9个显示显著高于对照血清观察到的结合水平(MannWhitney非参数双尾检验)，高达所述分析中存在的放射性配体的50％。自身抗体在早期发病(＜8岁)和年龄更大的患者(＞8岁)中都存在。在9例阳性患者中，6例经检测还对胰岛素自身抗体显示阳性，5例对GAD显示阳性，6例对IA-2显示阳性。Slc30a8看起来是独立的疾病标记物。
诊断血清学分析及用于细胞介导的自身免疫性的分析的进一步发展需要产生至少功能上纯的、折叠成天然构象并不含促有丝分裂杂质的抗原。这不是一个小问题，尤其是对于跨膜蛋白像Slc30a8和IGRP来说，它们在过表达时对细菌和真核细胞是倾向于有毒性的。
就IGRP来说，本发明人先前就能够表达天然形式的高水平抗原，通过利用受调控的金属硫蛋白启动子驱动的构建体稳定转染果蝇S2细胞。已经利用IGRP反应性的T细胞杂交瘤克隆检测了这种细胞的粗制膜组分(CMF)，所述杂交瘤克隆通过将IGRP免疫NOD小鼠的引流淋巴结细胞与BWZ36淋巴瘤系(在IL-2启动子的控制下稳定表达LacZ)融合产生(73)。
例如，在图2A显示的数字化图象中，S2细胞用mIGRP V5His构建体稳定转染，并用0.5mM Cu诱导表达，细胞膜组分(CMF)用抗V5抗体进行印迹。用TX-100有效提取蛋白，将其与金属螯合物亲和层析柱结合，并在非变性条件下用咪唑洗脱。图2B是显示对IGRP-CMF T细胞杂交瘤(克隆1-76-54)进行应答分析的图示。将T细胞杂交瘤(2x105细胞/孔)与作为APCs的辐射NOD脾细胞(1x106细胞/孔)和抗原(IGRP-CMF或S2-CMF，10μg蛋白/孔)温育过夜。对β半乳糖苷酶活性进行分光光度法分析。图2A-3B显示，IGRP生成受金属硫蛋白启动子的紧密调节(图2A)，粗制膜组分可以被哺乳动物APCs加工以诱导来自IGRP反应性T细胞杂交瘤克隆的IGRP特异性应答(图2B)，利用氯-酚红-β-半乳糖苷作为底物测定。推定抗原的昆虫细胞表达与T细胞增殖或杂交瘤活化分析的组合提供了一种通用但有效的标准操作方案集合，它们应当适应各种蛋白，包括可溶性和膜组分及需要糖基化和其他翻译后修饰的蛋白。
实施例2
下列实施例描述了鉴定体液和细胞介导的自身免疫的其他靶标的分析，通过进一步评价表3中潜在候选物的候选名单(参见实施例1)。
最初，对于不熟悉的候选物和只用ESTs表示的分子，获得全长克隆，对人和小鼠胰腺组织进行原位杂交分析以验证它们在β细胞中的表达。
在人类受试者中通过血清学分析筛选候选抗原。
这些分析最好在人类受试者中进行，由于免疫应答基因的遗传多样性和复杂性，它们很可能显示更宽的自身免疫应答谱。还可以利用半自动化方法采用96孔模式以每个样品低成本每天筛选大量样品。Barbara Davis Center已经保存了数以万计的样品，根据HLA单倍型、对与T1D有关的分子(胰岛素，GAD65，IA2，phogrin)的自身反应性、与乳糜泻有关的分子(转谷氨酰胺酶IgA)的自身反应性及与多内分泌腺疾病有关的分子包括影响肾上腺皮质(21β-羟化酶Addisons(74))和甲状腺(TSH受体(75))的自身反应性进行充分注释和分析。可以获得来自新发病患者的超过20,000份血清，以及数量较少的来自未患有T1D的同卵双生的样品和获自糖尿病患者一级亲属的系列样品，跨越的疾病阶段从抗体阴性，到单个和多个抗体阳性，和疾病发病。
首先开发出两种分别基于放射免疫沉淀和时间分辨荧光检测(TRF)方法的分析法。这两种分析法均需要克隆和表达候选抗原，本发明人采用一种通用方法，其起始于逆转录的mRNA或经验证的MGC质粒(其作为PCR模板，利用被设计成能将序列插入Invitrogen GATEWAY进入载体的引物)。基于进入载体，所述序列通过单步重组就可被指向体外翻译，细菌重组蛋白的产生，腺病毒或杆状病毒生成。
对于放射性沉淀分析，在利用网织红细胞裂解物和5μCi 35S甲硫氨酸的偶联转录/翻译反应(TNT试剂盒；Promega)中，将克隆的受CMV启动子控制的cDNA用作模板(0.5μg)。将96孔板中的血清样品(5μl)与20,000dpm翻译产物在50μl包含0.1％NP40的Tris缓冲盐溶液中4℃温育过夜。然后将固定的Protein A添加到每种温育液中以捕获免疫球蛋白结合的放射性，然后利用过滤回收并通过闪烁计数测定放射性。在每次分析中运行阳性和阴性标准血清以实现标准化和归一化。
为了进行TRF分析，根据情况cDNA在大肠杆菌或昆虫细胞中被表达为组氨酸标记的构建体，并通过金属螯合物层析纯化。96孔板用纯化的蛋白(1-10μg/ml)包被，封闭，然后与血清在50μl包含0.1％NP40的Tris缓冲盐溶液中4℃温育过夜。利用与铕偶联的小鼠抗人IgG(DELFIA)和酸性pH下的时间分辨荧光测量法(Victor 2多通道计数器)确定与板结合的免疫球蛋白。在这两种类型的分析中，利用抗体与重组抗原的预吸附作为对照以检测特异性并排除异嗜性抗体假象。就膜结合的抗原而言，可能证明必需利用结构域特异性构建体而不是全长分子进行，但这可以通过设计扩增特异性结构域的引物及按如上所述的相同方法克隆来实现。
最初目标是筛选190份新发病T1D血清和190份配对对照的库，确定每种分析的特异性和灵敏性，利用受试者工作曲线分析来确定可接受的截断和Mann Whitney非参数检验来确定统计显著性(Prism软件；Graphpad Inc.)。通过进一步优化分析步骤以最小化背景并最大化信号/噪音来追踪糖尿病血清的阳性结果。真正的阴性结果(低背景和信号/噪音为1)之后可进一步改进所述分析，例如在体外翻译分析中引入胰腺微粒体。利用无疏水性结构域的构建体，不同的阻断剂，不同的免疫球蛋白捕获方法及将试验血清与重组抗原预吸附的样品对比，通过降低分析中噪音的共同努力，具有低疾病特异性的分析有时可以被改进。指向故障排除的努力的程度将明显取决于问题的本质和疾病特异性的自身反应性是否是可疑的这一指示。对有希望的分析法进行追踪，通过将其应用于其他可用的临床样品以回答以下问题：在自然病史中自身反应性何时存在，自身反应性与其他自身抗原的重叠，以及是否存在与患者的年龄或HLA状况的关联。本发明人实验室和Barbara Davis Center的大量出版物用做所述研究的模板(76；77)。
在HLA-DR3、-DR4和-DQ8转基因小鼠中筛选针对候选抗原的细胞介导 的免疫应答。
本发明人先前的数据显示，B10.M背景下HLA-DQ8+I-A βo/o小鼠可以引发针对phogrin表位肽2和7的CD4+T细胞回忆应答，并且相同的肽被人类新发病患者(其中许多具有DR4/DQ8单倍型)中的外周T细胞作为靶标(78)。这些先前的研究支持以下预测，人HLA-DQ8对小鼠I-Ag7具有类似的结合特异性，而且所述-DQ8分子在小鼠或人共刺激和辅助分子的环境下可以呈递抗原。它们确认了小鼠转基因模型作为鉴定与人类疾病有关的表位的方法的应用，即使当HLA转基因不是在严格地糖尿病易感的背景下携带。为了评价任何候选抗原(在1A型糖尿病人中可以被MHC易感基因座呈递)的T细胞表位的完整谱，利用转基因HLA-DQ8、-DR3(DRB1*0301)和-DR4(DRB1*0401)小鼠作为代表已知的糖尿病易感基因座和HLA-DR2(DRB1*1502)作为与糖尿病无关的“保护性”II型分子的对照，对用人重组蛋白免疫后的T细胞回忆应答进行分析。
动物：产生HLA-DR和-DQ转基因小鼠的数个品系来评价这些分子在塑造疾病(诸如T1D、实验性自身免疫性脑炎和全身性红斑狼疮)中免疫应答的作用(79；80)。本发明人从Dr.Chella David(Department of Immunology，Mayo Clinic，Rochester，MN)处获得HLA-DQ8+I-Aβo/o，-DR2，-DR3和-DR4转基因小鼠，并在我们的中心建立这些小鼠的群落。最近从Dr.GretaSonderstrup，Stanford University获得具有人CD4的第二HLA-DR4系，其数量目前正在扩增。利用I-A βo/o I-Eao/o背景的基因组构建体制备HLA-DQ8(DQA1*0301/DQB1*0302)小鼠，因此产生HLA-DQ8作为唯一的II型分子。基因组-DR2(DRB 1*1502)及-DR4(DRB 1*0401)和-DR3(DRB 1*0301)的cDNA构建体与小鼠I-Ea或人DRa转基因配对。通过对取自尾部的DNA进行PCR，将所有的转基因动物根据MHC表达进行基因分型，对PBMCs和脾细胞进行FACS分析以确定人转基因的表达水平并监测小鼠MHC基因产物的表达。
抗原呈递细胞(APCs)：辐射过的(20-35Gy)同基因小鼠脾细胞或源自骨髓的DCs被用于CD4+细胞的体外刺激，通过在蛋白抗原(1-100μg/ml)或肽(0.1-10μg/ml)存在的条件下共温育。使用时，在用25号注射器针头灌洗后，从8-12周龄雄性小鼠的胫骨和股骨的骨髓制备DCs。碎片和大的细胞聚集物通过过滤(70μm网目)去除，红细胞用NH4Cl裂解，将细胞重悬于RPMI1640(包含10％热灭活的无内毒素FBS)，并添加抗生素、丙酮酸盐(1mM)、β-巯基乙醇(50μM)和10ng/ml GM-CSF。在第2天和第4天通过用新鲜培养基替换去除未粘附的细胞，第6天回收粘附不牢的细胞(主要是含有一些污染的单核细胞和粒细胞的未成熟DCs)。在这个时候细胞将与重组抗原以及0.1μg/ml细菌脂多糖(LPS)接触24-48小时，以诱导II型MHC分子的“成熟”和上调。
T细胞系和杂交瘤：利用我们先前已经使用过的策略(78)从转基因小鼠产生T细胞系和克隆，所述策略依赖于免疫(在尾巴基部皮下注射溶于50μlCFA的5-100μg重组抗原)以诱导抗原特异性应答。在免疫后8-10天从腹股沟和主动脉周淋巴结收集T细胞，检测针对抗原的CD4+回忆应答，其优选的在选择性载体系统(即用S2细胞的His标记抗原免疫；用细菌GST杂合物回忆)中产生。随后使用抗原特异性细胞产生T细胞杂交瘤。T细胞将要经受单轮体外刺激，然后聚乙二醇介导其与BWZ36胸腺瘤(其在IL-2启动子的NFAT元件控制下稳定表达LacZ)融合(73)。HAT抗性系将在RPMI/FBS中繁殖，利用有限稀释克隆，并通过将1x105个杂交瘤细胞与1x106个同基因脾细胞在RPMI/FBS和抗原中共培养进行分析。在16-24小时后，诱导的β半乳糖苷酶利用可溶性比色底物氯-酚红-β-半乳糖苷进行测量(参见图1)，或在单独的固定杂交瘤细胞中利用X-Gal。为了证明MHC限制性，还利用选择性APCs分析杂交瘤，所述APCs包括具有相同遗传背景的非转基因小鼠的脾细胞，和一组EBV转化的B淋巴样干细胞系(该细胞系是我们从T1D和对照器官供体建立的)；参见(78)。为了确认克隆形成能力和评价克隆多样性，通过反向PCR测序从总RNA制备的克隆cDNA，确定TCR使用(81)。
本发明人现有的经验(研究HLA-DQ8+和DR4+转基因动物中对phogrin细胞质结构域的T细胞应答)表明，推论的针对其他抗原的免疫原性、应答应当在这些动物中获得，并且它们可能是提供消息的。按照呈递相关肽的能力，I-Ag7和-DQ8是功能高度相似的，尽管载有这些分子的APCs不会越界呈递给限于同源分子的T细胞。因为高亲和力类型转换抗体的产生是T依赖性的步骤，可以预料从用抗原(先前在如上所述的实验中显示引发自身抗体)免疫的动物中将检测到回忆应答。但是，转换不必是真实的；不显示体液免疫的抗原仍然可以是细胞介导免疫的靶标。在本研究中HLA-DR2转基因被归入II型分子，其与糖尿病易感性无关，可以连接到与疾病无关的不同表位。本发明人先前的经验表明，利用杂交瘤而不是T细胞克隆更可能获得更高的TCRs多样性，因此我们开始的焦点是制备这种试剂。
与NOD小鼠不同，人类糖尿病受试者表达多种MHC II型分子，未来研究的一个可能领域就是在二倍转基因动物中研究各种糖尿病易感性或保护性等位基因。例如，HLA-DR3/-DQ8动物，患有更严重的胰岛炎(但不是糖尿病)，并且与亲本动物相比，显示对GAD65增强的自发应答(82；83)。不受理论约束，本发明人相信它们还可能显示对候选自身抗原增加的应答性。类似地，可以检查共表达HLA-DR3和-DR4或HLA-DR2和-DQ8的效果。
实施例3
下列实施例描述了另外的与鉴定ZnT8作为糖尿病自身免疫性的新标记物和靶标有关的实验。
编码ZnT8的cDNA可以作为糖尿病自身免疫标记物的观点来源于基因敲除小鼠(Ngn3缺失)的微阵列数据集的生物信息学分析及与其他组织中组织表达模式的比较(实施例1)。最初，所述标记物被注释为对应于Riken ESTC820002P 14的Unigene Mm.208831，然后认识到其对应于ZnT8。
本发明人制备了全长ZnT8，并进行了一系列实验，在放射免疫沉淀分析中利用新发病的糖尿病血清检测了该蛋白。原始数据表明10％的患者显示反应性，指示ZnT8可以作为用于I型糖尿病诊断分析的新自身抗原。
然后本发明人设计并制备了ZnT8的C端片段，其最终对应于全长分子的大约102个氨基酸。在分析法中对该片段的检测概述如下。
利用ZnT8片段检测来自144例新发病T1D患者(年龄1到55岁；平均年龄11.9岁)的血清，在放射免疫沉淀分析中45％是血清阳性的，与此相对，在年龄和HLA配对对照组中血清阳性＜1％。按照年龄分层显示，在年龄更大的个体中抗体显示倾向于更高，在12-15岁的糖尿病发病组中达到70％的顶点。该年龄模式类似于其他糖尿病自身抗原(GAD65和IA2)的模式，但比胰岛素抗体出现更晚。对所述新抗原的自身反应性显示与IAA、GAD和IA2的自身反应性水平无关，因此其被认为是一种独立的标记物。
分析来自9例个体的样品，所述个体从＜1岁追踪到临床糖尿病的发病。这些来自于Barbara Davis Center进行的同胞队列的DAISY研究。在前驱糖尿病的过程中这些个体中的8例是血清阳性的。在前驱糖尿病的过程中自身反应性倾向于出现更晚，通常接着出现GAD和胰岛素自身抗体。一些情况下发病时间出现在IA2自身反应性之前或之后。在1个所述受试者中，抗ZnT8是发病前检测到的唯一抗体，强调了发现这种新自身抗原的重要性。
检测了8例新发病的个体，所述个体对胰岛素GAD或IA2抗体是阴性的。在该组中，经检测2例对新抗原阳性，这再一次增强了以下观点：其具有不依赖现有标记物的预测价值。
更具体地，参照图5，该图显示ZnT8C端探针的标准分析。曲线描述了在7个分离实验中一式两份分析的稀释系列的平均值±SD。实验在3个月内进行，并使用不同的体外翻译反应。将体外翻译的35S标记探针(20000cpm)与溶于50μl PBS pH7.4(包含0.15％Tween 20、1％BSA和0.01％叠氮钠)的5μl血清温育过夜，然后添加20μl 50％(按体积计算)Protein A琼脂糖珠子悬液。45分钟后，通过过滤回收珠子，清洗4次，然后干燥，添加30μl闪烁剂，进行液体闪烁计数。对ZnT8ORF和N端探针进行比较分析。阳性样品：9例新发病糖尿病血清的库在合并的对照血清中二倍稀释；对照样品：来自糖尿病同胞的9例年龄、性别和HLA匹配的样品的库；非特异性结合：无血清添加。
图6显示利的不同ZnT8构建体的盲DASP研究的结果。将体外翻译的35S标记构建体(20000cpm)与溶于50μl PBS pH7.4(包含0.15％Tween 20、1％BSA和0.01％叠氮钠)的5μl血清温育过夜，然后添加20μl 50％(按体积计算)Protein A琼脂糖珠子悬液。45分钟后，通过过滤回收珠子，清洗4次，然后干燥，添加30μl闪烁剂，进行液体闪烁计数。免疫沉淀放射性可以表示为相对于从合并血清制备的标准品和16例个体对照血清组的分数，如下所示：抗原性指数＝(cpm试验品-平均cpm对照)/(cpm标准品-平均对照)。所有分析都重复3次。DASP提供100个参考样品作为对照和50个匹配的新发病糖尿病样品。分析截断被定义为对应于平均对照+4SD的指数，对于ORF、N端和C端分析分别是0.1543、0.1555和0.0129。在译码时，这对应于98％、998％和99％。据此8％、4％和60％的糖尿病样品检测为阳性。
如图6所述，大量对照血清在ORF和N端分析中始终检测为阳性。该分析灵敏性更低，相对于C端分析显示降低的信号：噪音比。尽管糖尿病和对照样品之间的差异在所有分析中都是显著的(P＜0.0001Mann Whitney秩和检验)，但最有效的分析是利用C端构建体(C4探针SEQ ID：24)。C端分析更好的性能可能与探针(不存在跨膜结构域)更好的溶解性和/或其他隐含表位的暴露有关。
图7所示实验证明ZnT8检测患者的自身抗体，所述患者对ICA和金标准生化抗体是阴性的。用于检测糖尿病自身抗体的初始金标准品是ICA(胰岛细胞质抗体)，一种复杂、耗时和相对主观的分析，需要将血型O人类受试者的组织学胰腺切片与血清接触，然后与荧光标记的二抗温育，由经过训练的观察者进行显微镜鉴定。它还没有完全被3种生化抗体分析(胰岛素GAD和IA2)取代，因为存在ICA+ve但生化抗体阴性的个体。因此对于包括超过60000例受试者的大规模糖尿病预防试验1，ICA被用作确定T1D患者高风险一级亲属群体中自身免疫性的方法。
对30例新发病患者(他们是ICA阳性，但胰岛素、GAD和IA2阴性)血清的分析显示，24％对ZnT8C端探针有反应，表明ZnT8可能是ICA分析中检测到的抗体的组分。更值得注意的是发现对ICA以及胰岛素、insulin，GAD和IA2阴性的个体样品中30例(20.3％)对ZnT8抗体检测为阳性。这表明C端探针检测到的表位可能隐含于ORF分子，该结论得到后续研究的证实。存在以下可能性，对ZnT8的反应性可能不是泛泛的与自身免疫性有关，而是特异性的与糖尿病有关。一系列24份个体(对抗DNA抗体检测为阳性)样品在ZnT8自身抗体分析中是阴性的。
图8A-C显示在新发病群体中就Ins(图8A)、GAD(图8B)和IA2(图8C)中的每一种而言自身抗体与ZnT8的关系。在该实验中，自身抗体与ZnT8C端探针之间的关系与3种金标准品进行比较。数据来源于BDC采集的175例新发病的患者。结果显示为采用对数尺度的抗原指数，以显示数据的全部范围及其重叠。
图9A-9D显示相对于年龄来说，疾病发病时自身抗体的表达(图9A＝ZnT8；图9B＝GAD；图9C＝胰岛素；图9D＝IA2)。具体来说，该实验显示发病时ZnT8血清阳性在年长受试者中更高，而胰岛素自身反应性降低。数据来源于237例受试者，他们糖尿病发病的年龄在9个月到18岁之间。数据按1年间隔分类，得到与年龄有关的频率模式。ZnT8C端反应性随着发病年龄增加，而胰岛素反应性显示预期的降低，如公开的研究中所述。GAD反应性也倾向于增加，尽管不是那么显著。检测年长受试者中自身反应性的标记物弥补了年长个体中胰岛素作为标记物的低效应用。发病后不能使用胰岛素，因为将产生针对外源胰岛素(用于治疗疾病)的抗体。该实验证明ZnT8抗体能够提供良好指标以检测老年糖尿病(LADA或1.5型糖尿病)的潜在自身免疫性，所述糖尿病在年长受试者中经常被误诊为2型糖尿病并被不当治疗。在美国可能存在与1型患者同样多的LADA患者。
图10A和10B显示研究ZnT8自身抗体作为T1D预测标记物的实验的结果。在一组43例个体(他们从9个月大追踪到糖尿病)的样品中回顾分析针对ZnT8的自身抗体及针对胰岛素、GAD65和IA2的3种金标准抗体。来自9例个体的一系列结果在此显示作为实例。抗体反应性表示为cpm，用先证者(proband)减去对照除以对照应答的标准偏差。分析中截断由灰色区域定义，其等于3SD或大约1％概率(阳性分析将偶然产生)。图10A组显示的患者不产生针对胰岛素的自身抗体，但在1.5岁对IA2和GAD检测为阳性。IA2抗体被短暂表达，但在4岁时恢复。期间发展出高并且持续的对ZnT8的反应性。此后IA2抗体恢复，5年后个体患有临床糖尿病。图10B显示的患者不产生针对胰岛素、IA2或GAD65的自身抗体，但在2岁时(临床疾病前18个月)显示ZnT8Abs。
图11是显示发病时糖尿病自身抗体状况的图表。ZnT8自身抗体的测量为3种金标准自身抗原IA2、胰岛素和GAD65提供额外的预测功效。已公开的研究显示检测到的抗体数量而不是抗体滴度是疾病的最有效预测因素。尽管如此，一些人患有T1D而从不显示针对3种金标准抗体IA2、GAD65和胰岛素的抗体。这表明可能存在遗漏的反应性，该结论还得到自身抗原免疫组化分析(其比INS、GAD和IA2Abs的组合测量检测更多的患者)的证实。但是ICA分析是耗时和主观的。对于只显示金标准抗体之一的个体来说，5年内的患病相对风险较低，但2种或更多种抗体表明预后不良，将提示治疗介入(如果可用的话)。图11的上部显示对患糖尿病个体进行临床诊断时的抗体状况。结果来自于对50例新发病糖尿病受试者及100例年龄配对对照(由糖尿病自身抗原标准计划(Diabetes Autoantigen Standardization Program)提供)和先前部分所示数据的盲研究。在添加了ZnT8自身反应性的分析后，抗体阴性的个体数量从14％显著降低到8％，另外12％被指定为更高的风险。另一方面，在被列为抗体阴性的7例个体中，43％实际上具有针对ZnT8的抗体。在“低风险”1Ab组的7例个体中，再一次，3例(43％)对ZnT8抗体检测为阳性，使他们处于更高的风险类型。
对于金标准3，胰岛素自身抗体很难检测，并且在实验室之间分析的重现性很差。如果放弃胰岛素分析并用ZnT8分析取代将有以下优点：0Ab患者的数目仍将从14减少到8％，将会有类似数量的双阳性和三阳性患者。将需要进行纵向系列实验以证明存在额外的诊断效力，但可以合理推断ZnT8/GAD/IA2将是优于INS/GAD/IA2的组合。此外，有可能避免使用125I标记的配体，并进行抗胰岛素分析所需的抗原预吸附。
图11的部分记载了抗体如何在不同类型的患者之间分布。在该组中ZnT8C端抗体经常作为唯一的抗体出现，再次与GAD类似，证明其预测的价值。在挑选的个体种群(ICA阳性，但对3种金标准品是阴性的)中，25％是ZnT8C端阳性的。
图12A和12B显示ZnT8抗体分析的受试者工作特性。数据来源于Barbara Davis Center(Denver，Colorado)的新发病患者的组合，样品集由DASP提供。该组合覆盖发病时年龄从1.5岁到59岁的个体。从对应的16例对照血清组的3SD限制性确定截断。通过在每种情况下比较对照和糖尿病组产生ROC曲线。图12A显示免测沉淀指数，图12B显示每种分析的灵敏性和特异性之间的关系。
图13显示与ZnT8ORF、C端和N端探针的抗体反应性之间的关系。数据来源于Barbara Davis Center的新发病患者的组合，样品集由DASP提供，共227例个体。最前面的50例C端阳性患者包括了大多数对ZnT8ORF和ZnT8N端探针的反应性检测为阳性的个体。在对N端探针和ORF的反应性之间存在显著的相关性，但在ORF和C端探针之间不存在。这表明参与N端反应性的表位是被ORF探针检测到的那些表位的亚群，但C端检测到其他患者，是比ORF翻译产物更好的自身反应指示物。这可能是因为跨膜区错误折叠并扭曲了正常C端的折叠，导致ORF探针未能正确折叠。C端可以包括其他表位，其中一些可以是隐含的，除非其从完整的分子释放。
图14A和14B的实验研究了ZnT8的N端和C端是否会相互作用产生新的表位(这取决于所述两种结构域)或N端序列是否可以掩盖C端表位。
该实验利用糖尿病血清的2个库进行，所述糖尿病血清对C端探针具有强应答，但N端反应性是较低(图14A)或较高的(图14B)。利用所述两种混合物，很明显对N端和C端的反应性是独立的，并且探针混合时免疫沉淀的放射性等于单独探针的总和。该实验的其他变化包括Zn离子的添加或内源Zn的螯合，它们作为可能的因素参与这些结构域的相互作用。来自上文这些的结果是没有差别的，表明N端和C端相互作用不影响免疫反应性。
参照图15A-15C，这些图显示目的在于定位ZnT8C端自身抗体表位的实验的结果。图15A显示小鼠Slc30A8(顶部；显示的是SEQ ID NO：4的267-367位)、人Slc30A8(中间；显示的是SEQ ID NO：2的268-369位)和小鼠Slc30A3(底部；序列是SEQ ID NO：25)比对的序列。因为小鼠Slc30A8和Slc30A3不被大多数T1D血清识别，该数据表明变异残基很可能对预测人Slc30A8序列中的表位非常关键。本发明人假设最后的11个氨基酸(PDCLFCEDPCD；SEQ ID NO：2的359-369位)因此可能是抗原表位；但是缺失该区域的探针(BstN1消化，图15B；参照显示限制性酶切位点的序列是SEQ ID NO：2的336-369位)与野生型C端一样有效的被9例糖尿病血清的库免疫沉淀(图15B)。削减另6个氨基酸减弱了自身抗体结合，削减12个氨基酸消除了抗体结合，表明该区域是特别重要的。这些探针的序列提供于本文的表1。
如图15C所示，在带电残基(K340、H345和E352)处对C端探针进行点突变，所述带电残基可能有助于抗原性，并对丝氨酸353进行点突变，丝氨酸353是推定的酪蛋白激酶及可能的翻译后修饰的磷酸化位点。当用相同的糖尿病血清库检测时，很明显这些残基中的每一种都有助于免疫反应性，在3个带电残基都被改变的突变体中(AAA)被被证明是累加的。这些探针的序列提供于本文的表1。
利用覆盖该区域的重叠20mer合成肽作为潜在的阻断剂进行进一步的实验(数据未显示)。它们阻断结合的能力最多是中等的(降低＜33％)，表明自身抗体表位实际上可能是构象型的，而不是简单的线性序列。进一步的方法是产生Slc30A8和Slc30A3的嵌合分子，其保留C端区域的一般构象但允许关键序列被替换以干扰二级结构。这些嵌合分子还将用于绘制针对蛋白的T细胞应答。
图16显示对于自身反应性非常重要的ZnT8C端的残基，并显示动物物种间指定表位的保守性。截短型和突变型突变体(如上文表1)表明，核心序列SLTIQMES(SEQ ID NO：2的346-353位)是针对人Slc30A8的自身抗体反应性的关键，并且单个残基E352和S353对抗体结合做出重要的贡献。全部序列在不同脊椎动物物种的Slc30A8高度保守，但在最接近的哺乳动物同系物Slc30A2和Slc30A3保守性要低一些。糖尿病自身抗体检测不到表达为C端片段的后一蛋白。
有趣地是，从关系更远的细菌物种的阳离子外排(cation efflux)蛋白(其他CzcD)和两种无关蛋白(大肠杆菌的偶联转移蛋白和人REEP3)中观察到同源序列。这提出了以下可能性，分子模拟可能在对人类锌转运蛋白的自身反应性发展中起作用，或可能有助于抗原表位扩展及免疫应答的旁观活化。
总之，ZnT8是1型糖尿病前独立的自身免疫性血清学标记物，其被预期尤其可用于预测从进行性自身反应性向早期糖尿病的转变。
本文描述的分析形式允许每天筛选直至500份样品，并且能够轻易地自动化以增加其能力。人类受试者具有针对ZnT8的自身抗体的事实表明，自体反应性T细胞应答是可能性非常高的。这反过来表明，可以按照上文的详细描述开发其他的诊断分析，以及治疗和预防I型糖尿病的新的治疗方法，亦如上文详细所述。
实施例4
下列实施例描述了另外的利用缺失突变体和小鼠/人嵌合体对ZnT8的自身抗体表位作图。
在该实验中，结果在图17中显示，对包括C端自身抗体结合位点的区域的边界作图，利用一系列ZnT8肽(其中NH2或COOH端被截短)，或通过制备人和小鼠ZnT8序列的嵌合体，后者在标准分析中是没有免疫反应的。按比例显示重叠程度，缺失程度显示为缺失氨基酸的数目(缺失图)或氨基酸位置号，其中融合蛋白是接合在一起的，前面有单字母代码的氨基酸(嵌合体图)。
通过MODELLER，利用大肠杆菌Yiip阳离子外排转运蛋白的晶体结构产生人ZnT8C端的3维模型(图18)。用亮灰色突出显示的残基在人和小鼠序列之间变化，用中灰色突出显示的残基被指定为较弱的抗原候选物，基于NH2和COOH缺失构建体的免疫分析。人ZnT8325位的多态性残基在空填模型(spacefill model)中显示为暗灰色残基(该图中所有位置都是根据SEQ IDNO：2)。
白种人种群中ZnT8的主要人多态性变体(Trp325和Arg325)远离所述结构的细胞质极处的膜，很大程度上被人和小鼠之间保守的残基包围。Arg侧链伸展到溶剂中，而Trp吲哚环折回到分子，所以有可能产生非常不同的表面而不扭曲总的折叠。Gln325变体，尽管在几何位置上接近Arg侧链，被预测导致结构沿着Ser353转动。第二α螺旋部分(aa328-341)的变异残基簇(其拓扑结构基本上不受多态性的影响)被假定为表位(同等的被载有多态性变体的探针识别)的良好候选物。在这点上Arg332、Glu333、Arg336和Arg340的相邻和溶剂显露都是值得关注的。
至于图19，显示T1D自身抗体靶向区域中ZnT8残基的保守性。在大约5％的患者中N端是抗体的靶标，而达到80％的T1D受试者显示针对C端的抗体。制备含C端起始和结尾的构建体，以绘制C端表位的边界。灰色阴影区域是大部分自身反应性集中的区域。比较小鼠、人和蟾蜍的Znt8序列，显示大部分表位区域是保守的，除了氨基酸322-341之外(参照SEQ IDNO：2)。该区域包括人的主要多态性变体(325R或325W)，这在其他物种中没有发现。
实施例5
下列实施例描述了与涉及ZnT8基因和蛋白的多态性的本发明实施方案有关的实验。
小鼠ZnT8C端与人ZnT8的不同之处在于104个氨基酸中的18个，其不与新发病的糖尿病血清反应。产生基于小鼠序列的构建体，其中变异氨基酸被单独或多次替换为它们的人类对应物。该实验的结果显示于图21A-21C。每个数据点是利用人血清测定的2-7次应答的平均值，所述血清已被实现分类为限于人Arg325(CR)或Trp325(CW)多态性变体，或与Arg325、Trp325或Gln325(CQ)变体以相同程度反应。氨基酸编号参照人类序列位置(SEQ ID NO：2)。
结果显示，氨基酸325向其人类对应物的改变恢复了与CR-和CW-限制性血清的结合，但只与相应的氨基酸结合。没有单氨基酸改变能恢复CQ应答血清的反应性。但是，氨基酸332、333、336的组合取代以及在小鼠序列的aa340包括氨基酸缺失恢复了反应性。这被325位包括Arg进一步增强。
图22A-22D显示小鼠ZnT8的多位点突变概括了人ZnT8反应性。在该实验中，图22A显示小鼠序列的单个点突变，尽管仍能够检测大量人Arg反应性的抗体应答，但对大多数血清没有反应。但是，基于人和小鼠结构差异的4残基的进一步突变(REKK突变体)立刻使小鼠序列几乎与人Arg325天然结构的反应性一样(图22B)。大多数hTrp反应性血清观察不到相同的探针(图22D)。相同血清只与mTrp探针微弱反应(图22C)。
在进一步的实验中，如图23A-23D所示，利用mQ＞R325、mQ＞W325、hR325、hW325和hQ325探针分析来自171例新发病T1D受试者的ZnT8，相对于兔抗C端抗体(BUN-E)计算数据。32例个体显示hArg325限制性抗体结合，其中19例显示对mArg325探针的应答。13例显示hTrp325限制性抗体结合，其中10例显示对mArg325探针的应答。在没有人类对应物的情况下没有观察到与mArg325或mTrp325的结合。Arg325限制人和小鼠之间相关的应答，在对hQ325探针表示的结合校正后具有类似的大小。当对hTrp325限制性应答作图时，甚至在对hQ325结合校正后，mTrp325探针的结合具有较低的强度。这些数据表明，325位的氨基酸是自身抗体表位特异性的决定簇，就Arg变体来说，小鼠点突变体类似于天然的人构象。
在另一个实验中，利用氨基酸325的变体测定出新发病T1D患者中的ZnT8自身抗体应答。基于Arg、Trp和Gln变体ZnT8325的突变C端探针被用于测定300例新发病患者中的体液免疫应答。图24D显示基于针对单个探针或探针组合的应答区分的应答的水平和频率。图24C显示对普通Arg和Trp变体应答之间的关系，基于只对Trp(垂直的)和Arg(水平的)应答的95％截断将其分为5个区，对角线代表针对分析中两种探针假定15％CV的等同应答±3SD的边界。图24A和24B在检查针对Gln探针及Arg和Trp探针的应答之间的关系时使用相同分层。
图25显示ZnT8自身抗体特异性与氨基酸325处密码子的患者基因型(SNP rs13266634)之间的关系。新诊断的T1D受试者用TaqMan探针进行基因分型，并利用氨基酸325处掺入Gln(Q)、Arg(R)或Trp(W)的人ZnT8C端构建体进行血清分析。将分析截断设定成指数为0.02。在R或W之间的信号超过Q探针信号的情况下，假定相应测量值的CV是15％，被指定为具有双反应阳性，如果指数相差＞3SD。
从该数据可以得出大量重要的结论：
1)对Gln探针(hCQ)的反应性相对不受基因型影响，而在具有C等位基因(Arg编码)的个体中Arg反应性(hCR)更显著，在具有T等位基因(Trp编码)的个体中Trp活性更显著。
2)300例个体中只有一个显示与hCQ探针反应，但不与hCW或hCR反应。该个体在氨基酸325处可能编码Gln残基(核苷酸测序分析)。对Arg(仅仅Arg)显示限制性应答的个体都具有编码C等位基因。对Trp(仅仅Trp)显示限制性应答的个体都具有编码T等位基因。对于显示超过hCQ反应性的hCR和hCW反应性的个体来说相同情况是基本上成立的。
3)显示与hCR和hCW反应但不与hCQ反应的个体主要是杂合的。
这些数据概述于图26，其显示基因型与对hCR和hCW探针的反应性之间的相关性。更具体的，图26概述了以下主要发现，限于Arg325表位的反应性与C等位基因尤其是CC基因型密切相关，相反，限于Trp325表位的抗体反应性与T等位基因尤其是TT基因型相关。
图27显示与糖尿病发病年龄有关的Slc30A8基因型。在基因型与T1D被诊断的年龄之间不存在明显的相关性。但是，需要总结更多的样品，例如，具有TT基因型的个体在6岁前很少患病，尽管趋势仍然存在，对于介入来说结论是重要的。
与对照受试者文献中报道的相比，本发明人的糖尿病群体中的基因型存在一些改变。本发明人观察到56.8％CC，35.1％CT和8.1％TT(n＝285)。欧洲群体中报道的基因型频率是52.3％CC、44.1％CT和3.6％TT(n＝168)P＝0.05Fisher精确检验。但74.4％C和25.6％T的等位基因频率在两个群体中是相同的。基因型的分布与Hardy Wienberg分布(55.33％CC、38.11％CT和6.56％TT)不是显著不同。如果观察杂合子对纯合TT，差异将更加显著(P＝0.026)，可能表明存在更多的TT基因型和更少的杂合子。
种群研究没有报告染色体8(Slc30A8所在区域)上T1D相关基因的存在。尽管如此基因组范围的SNP分析显示Slc30A8T等位基因与2型糖尿病的关联，这种关联需要分析大约8000例受试者以检测到显示大约1.2的比值比和P＜0.05。
组合的免疫和基因数据的有趣特征是观察到，Arg限制性抗体在CC纯合组中的发生率高于杂合子，同样，Trp限制性抗体在TT纯合组中高于杂合子。这可能部分由于基因剂量作用，更多的抗原表达伴随更高的自身反应性。
在图28A-B中，相对于使用的探针和Slc30A8基因型显示自身抗体反应性的水平。CC基因型由169个样品代表，CT由108个样品代表，TT由23个样品代表。ZnT8hC Gln探针据预测只反映与REKK表位结合的抗体，而hC Arg探针与该表位及以Arg 325残基为中心的表位都结合。hC Trp探针报告REKK结合及以Arg 325为中心的表位。hCArg反应性的平均水平和发生率按预期方向受基因型的影响，即增加的反应性与C等位基因频率(Arg 325编码)有关(图28A)。同样地，hCTrp反应性的平均水平和发生率随T等位基因频率(Trp325编码)增加(图28A)。hC Gln反应性倾向于随C等位基因增加，尽管对于发生率或水平来说不是显著的(图28A)。与其他生化自身抗体IAA、GADA和IA2A的反应性不受Slc30A8基因型的影响(图28B)。
图29显示概括ZnT8A分析当前发展状况的实验。对一系列盲样品(blinded samples)进行分析，所述样品由疾病控制中心(CDC)的糖尿病自身抗原计划(DASP)提供，由50例新发病的糖尿病患者和99例对照组成。利用体外翻译的35S甲硫氨酸放射标记的探针(基于小鼠(m)或人(h)ZnT8序列)，采用基本的放射免疫沉淀形式进行分析。所有探针都包括ZnT8的C端104aa(C)，其在人氨基酸325位具有Gln(Q)(SEQ ID NO：50)、Arg(R)(SEQ IDNO：49)或Trp(W)(SEQ ID NO：51)。此外，通过以下方式产生抗体：利用3个甘氨酸残基的接头序列将ZnT8的N端74aa(N)与C端融合，例如hNCW，或产生C端二聚体，其具有通过柔性接头臂(SEQ ID NO：52)与hCR构建体连接的hCW构建体，以产生hCWR构建体(SEQ ID NO：60)。接头臂源自免疫球蛋白重链序列，其已知在其序列的恒定区和可变区之间提供柔性连接。接头(序列PSTPPGSSGGG；SEQ ID NO：52)能够允许单个抗体分子以更高的亲和力结合，因为它可以在2个位点与探针连接。可选择地，探针可以同时结合2个抗体分子，包括不同表位特异性的免疫球蛋白。
从完全相同的样品获得的结果显示本领域的众多当前状况和糖尿病自身反应性的特征，即：
1)与人类对应物(hGQ)(SEQ ID NO：50)相比，人T1D自身抗体对天然小鼠序列(SEQ ID NO：40)的反应性较低{mCQ相对于hCQ}。
2)在氨基酸324处(SEQ ID NO：41)(相当于人aa325)用Arg残基取代Gln残基(SEQ ID NO：49)的单个点突变增加抗体与小鼠ZnT8的结合{mCQ相对于mCR的数据}。
3)对载有325位单氨基酸改变的人探针的差别反应性{发病时自身抗体的发生率一贯遵循hCR＞hCW＞hCQ的顺序)。这是因为hCR(SEQ ID NO：49)和hCW(SEQ ID NO：51)探针具有以氨基酸325位为中心的其他表位，并且因为在本发明人的群体(主要是白种人)中针对Arg变体的抗体的出现频率高于针对Trp变体的抗体。
4)N端与C端W(SEQ ID NO：62)或R(SEQ ID NO：63)变体的融合引入以下可能性：在反应性更高的C端表位中掺入被5-8％T1D群体识别的N端表位。但是因为背景的原因，采用这种方式测量到的抗体总发生率实际上低于单独的C端探针，因此分析中的截断更高。对分子的进一步改造将纠正这点。
5)将CW和CR结构域融合入一个分子(SEQ ID NO：60)产生一种探针，其检测与CR、CW和CQ探针有反应的个体的自身反应性。此外，信号在糖尿病受试者中更高，没有背景的任何损失，产生一种性能比3种不同分析法的组合更优越的分析法。可以想像探针的进一步多聚化甚至可以进一步提高检测水平。78％的检出率与任意其他糖尿病生化自身抗体标记物相比同样高或更高。
图30显示针对组合N端、C端、腔环、细胞溶质环和多态性残基的不同ZnT8构建体的自身反应性。hCTrp minus TM(SEQ ID NO：67)是包括3个胞外(腔)和2个细胞溶质环(连接6个跨膜结构域)的构建体，其被设计成能捕获存在于这些环中的任意表位。它检测额外4％的新发病患者。hCArgN包括N和C端，但按照相反的顺序(SEQ ID NO：66)。利用该探针测量到的抗体水平与单独利用hCArg测量到的抗体水平有关，但也捕捉到一些额外的患者，尤其是那些显示低水平反应性的患者。该数据还显示，除了对包括氨基酸325的表位反应相同或对其不依赖的患者以外，325位交换Arg为Trp的多态性鉴定了众多限于只对hCArg或hCTrp的抗体应答的患者。
实施例6
下列实施例提供涉及ZnT8作为新靶标和I型糖尿病标记物的其他数据。
图31A-F显示研究结果，其中在23个新发病T1D受试者的组中随时间将针对ZnT8的自身抗体与C肽(正餐后2小时)和其他自身抗体进行比较。该分析的主要结果是，针对ZnT8的自身抗体在发病后降低，其动力学类似于β细胞群的损失，反映为C肽应答的减弱。该数据导致本发明人最初怀疑在图31A-31C的分子中存在遗传变异，可以观察到对C端构建体的应答有时与N-C融合构建体相同(图31A)或完全不同(图31B-C)。当重新测序这些探针时，显示C端是Arg325形式(SEQ ID NO：49)，N-C是分子的Trp325形式(SEQ ID NO：64)。通过利用用于克隆的2个不同胰岛来源或从杂合个体克隆产物来引入多态性变体。反应性的年平均减退对于C端是26±13％，N/C是28±9％，C-pep是32±14％，IA2是22±11(±SD n＝15)。相反GADA增加42±191％，可能因为存在该抗原的另一组织来源。
图32显示发病后5-10年的ZnT8A和C-肽水平。对先前研究(描述于上文的实施例)直至10年的追踪显示，在个体中抗体一直减退，而那些最初高水平的抗体更持久。到5+年的时候大约60％的样品中存在血清转化，在所有情况下水平平均降低90％。具有低Ab水平(＜0.4)的样品倾向于更快的血清转化。具有高水平抗体的一些样品具有残余的β细胞群，由阳性随机C肽指示。
在本文先前实施例中已经描述了对胰岛素、GAD和IA2之外的ZnT8自身抗体的测量。在这些实施例中，本发明人只测量了hCR反应性，其已经排除Trp325反应性。图33A进一步显示检出率变化的原则(黑色为检出ZnT8；白色未检出)。图33B显示增加ZnT8抗体测量的不同效果。
实施例7
下列实施例描述自身抗体预吸附实验，显示利用重组蛋白来区别不同的ZnT8表位。
利用载体诸如pGEX(产生谷胱甘肽S转移酶融合蛋白，可以在谷胱甘肽琼脂糖上纯化)或pQE系列(产生蛋白的N或C端具有多聚组氨酸标记的蛋白，可以通过金属螯合物层析纯化)已产生大量重组ZnT8分子。但是，这些被证明产生不溶性的包涵体，其很难被纯化，而且不能正确折叠重新产生自身抗原表位。本发明人发现了一种解决方案，利用整合His标签(用于金属螯合物亲和纯化)和蛋白融合伴侣(一种细菌伴侣蛋白，确保正确折叠)的载体(pET43.1载体，Novagen，EMD Biosciences)。蛋白在BL-21(DE3)细菌(Novagen)中表达。
产生基于SEQ ID NO：49(Arg325变体)、SEQ ID NO：50(Gln325变体)和SEQ ID NO：51(Trp325变体)的NUS hZnT8C端蛋白，并在Ni chalate柱上纯化，将20微克样品与T1D血清在室温下温育2小时，然后添加35S Met标记的hCArg、hCTrp和hCGln探针并进行常规放射免疫沉淀分析。
在图2C所示的实验中，选择3种血清，它们已知限于Arg 325(血清#541827命名为hCArg)，Trp325(血清#533855命名为hCTrp)，及与所有hC端构建体共有的表位(不依赖325位的氨基酸)反应(血清#BT命名为hCGln)。
结果显示血清的显著特异性，它们限于由325位多态性确定的表位。结果还显示，325无限制性的血清不能区别Trp和Arg构建体。实际上，这提供了一种确定血清对Arg325、Trp325和非限制性表位(当这些存在于相同样品中时)的相对反应性的更好方式。目前，利用单一的外部泛反应性C端标准品(BUN-E)的3种放射性分析用于标定应答，然后将数字彼此相减。利用本文描述的可用重组蛋白，使用相关的探针并测定信号被不同重组蛋白压制的程度，可以确定反应性的水平。
因此，基于ZnT8的融合蛋白(诸如本文描述的hCNUS融合蛋白)的可用性(显示预期的表位特异性)，是产生基于非同位素方法的固相自身抗体分析中的重要步骤。
实施例8
下列实施例描述编码hZnT8的腺病毒载体的产生，及其在宿主细胞中的表达。
本发明人还制备了用于表达全长hZnT8的腺病毒载体。在MOI为100时用对照腺病毒(AdLacZ)或Ad-hZnT8-V5-His()转导Cos7细胞。48小时后，收集细胞，通过SDS-PAGE和利用多克隆兔抗hZnT8的免疫印迹检测表达(数据未显示)。按照制造商的说明书在体外(RTS 100小麦胚CECF试剂盒，Roche)翻译β-葡糖醛酸酶(GUS)或hZnT8-V5-His。通过western印迹分析1μl(2％)混合物。检测到hZnT8蛋白的表达(数据未显示)。
实施例9
下列实施例显示ZnT8在各种细胞中的免疫组织化学定位。
INS-1细胞是源自胰腺β细胞的β细胞系，提供β细胞的良好细胞培养模型。用于上述分析的抗体由称为BUN-E的重组融合蛋白激发，用于鉴定Slc30A8基因编码的ZnT8的胞内定位。抗体突出显示大小约为0.2-0.5微米的胞内点状细胞器(数据未显示)。这些以与胰岛素类似的模式分布于细胞，从而标记胰岛素颗粒，先前的研究已将ZnT8定位于此处。本发明人在该实施例中描述的免疫组织化学研究(数据未显示)表明，ZnT8不是完全位于颗粒中，但与transGolgi网络标记物TGN38显示部分重叠。它不与早期内体标记物EEA1或循环内体(由转铁蛋白受体标记)定位，但与成熟溶酶体的标记物LAMP1基本重叠。总的说来，这些数据与先前的报道(ZnT8仅仅是分泌颗粒蛋白)(Chimienti et al.，上文)不同。
实施例10
下列实施例显示人胎儿胰腺的实时PCR，表明ZnT8具有高的胰岛特异性，不同于该基因家族的相关成员(ZnT1-7和ZnT9)。
按照指定年龄获得人胎儿的胰腺，提取mRNA，然后将其用于测定发育期间(9和23周妊娠)和成年胰岛中的表达水平。在第9周，胰腺主要由未分化的间充组织组成。到第23周，大体解剖(gross anatomy)类似于成年的，显示ZnT1(Slc30A1)尤其是ZnT8(Slc30A8)的表达实质上增加，参见图34。分离的胰岛具有更少的ZnT1，因为其主要限于外分泌组织。
实施例11
下列实例证明，新确诊的T1D患者显示针对ZnT8合成肽的外周T细胞应答。
该实验显示来自新近的糖尿病受试者的PBMCs产生hZnT8依赖性IFN-γ。从4例新近的糖尿病受试者分离PBMCs，并用2个连续hZnT8肽(10μg/ml)的库培养48小时，所述2个连续hZnT8肽跨越完整的人ZnT8序列，具有20mer肽，重叠7个氨基酸。洗涤后，将细胞转移到包被抗IFN-γ单克隆的ELISPOT板，再培养17小时。在洗涤去除细胞和培养基后，利用第二位点生物素化的抗IFN-g单克隆，GABA，和沉淀银溶液检测分泌的细胞因子。利用Bioreader 4000Pro X(BIOSYS)计数斑点。对照受试者不对任何肽产生显著的信号(SI≥3)，但对于破伤风类毒素/白喉毒素阳性对照显示SI＝22。所有被测的患者，但不是对照，对至少3种肽产生显著的IFN-γ应答(SI≥3)，而受试者NO3对肽库中的12种产生应答。在个体之间几乎没有观察到相关性，只有库17(E5+F5)被所有受试者识别。
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本文引用的每篇出版物均完整引入作为参考。
尽管已详细描述了本发明的各种实施方案，上述实施方案的修改或改变对本领域技术人员是显而易见的。但是，应明确了解，这种修改和改变属于如下列权利要求阐述的本发明范围。
序列表
<110>科罗拉多大学董事会(The Regents of the University of Colorado)
     Hutton，John
     Wenzlau，Jan
     Jensen，Jan
     Davidson，Howard
<120>自身免疫病的诊断和治疗靶标及其用途
<130>2848-94-PCT
<150>60/882,815
<151>2006-12-29
<160>67
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>5373
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(231)..(1340)
<400>1
agcagttttt gtaggtgaaa acaatgaagc caggtaatat tgcaaggagg ctgtaatttt     60
agcagaccta ccaacaacac tgatgtagga agctcattat tttaatttct ggagcctttt    120
aattttttct ttagaaagtg tataaataat tgcagtgctg ctttgcttcc aaaactgggc    180
agtgagttca acaacaacga caacaacagc cgcagctcat cctggccgtc atg gag       236
                                                       Met Glu
                                                       1
ttt ctt gaa aga acg tat ctt gtg aat gat aaa gct gcc aag atg tat      284
Phe Leu Glu Arg Thr Tyr Leu Val Asn Asp Lys Ala Ala Lys Met Tyr
        5                   10                  15
gct ttc aca cta gaa agt gtg gaa ctc caa cag aaa ccg gtg aat aaa      332
Ala Phe Thr Leu Glu Ser Val Glu Leu Gln Gln Lys Pro Val Asn Lys
    20                  25                  30
gat cag tgt ccc aga gag aga cca gag gag ctg gag tca gga ggc atg      380
Asp Gln Cys Pro Arg Glu Arg Pro Glu Glu Leu Glu Ser Gly Gly Met
35                  40                  45                  50
tac cac tgc cac agt ggc tcc aag ccc aca gaa aag ggg gcg aat gag      428
Tyr His Cys His Ser Gly Ser Lys Pro Thr Glu Lys Gly Ala Asn Glu
                55                  60                  65
tac gcc tat gcc aag tgg aaa ctc tgt tct gct tca gca ata tgc ttc      476
Tyr Ala Tyr Ala Lys Trp Lys Leu Cys Ser Ala Ser Ala Ile Cys Phe
            70                  75                  80
att ttc atg att gca gag gtc gtg ggt ggg cac att gct ggg agt ctt      524
Ile Phe Met Ile Ala Glu Val Val Gly Gly His Ile Ala Gly Ser Leu
        85                  90                  95
gct gtt gtc aca gat gct gcc cac ctc tta att gac ctg acc agt ttc      572
Ala Val Val Thr Asp Ala Ala His Leu Leu Ile Asp Leu Thr Ser Phe
    100                 105                 110
ctg ctc agt ctc ttc tcc ctg tgg ttg tca tcg aag cct ccc tct aag      620
Leu Leu Ser Leu Phe Ser Leu Trp Leu Ser Ser Lys Pro Pro Ser Lys
115                 120                 125                 130
cgg ctg aca ttt gga tgg cac cga gca gag atc ctt ggt gcc ctg ctc      668
Arg Leu Thr Phe Gly Trp His Arg Ala Glu Ile Leu Gly Ala Leu Leu
                135                 140                 145
tcc atc ctg tgc atc tgg gtg gtg act ggc gtg cta gtg tac ctg gca      716
Ser Ile Leu Cys Ile Trp Val Val Thr Gly Val Leu Val Tyr Leu Ala
            150                 155                 160
tgt gag cgc ctg ctg tat cct gat tac cag atc cag gcg act gtg atg      764
Cys Glu Arg Leu Leu Tyr Pro Asp Tyr Gln Ile Gln Ala Thr Val Met
        165                 170                 175
atc atc gtt tcc agc tgc gca gtg gcg gcc aac att gta cta act gtg      812
Ile Ile Val Ser Ser Cys Ala Val Ala Ala Asn Ile Val Leu Thr Val
    180                 185                 190
gtt ttg cac cag aga tgc ctt ggc cac aat cac aag gaa gta caa gcc      860
Val Leu His Gln Arg Cys Leu Gly His Asn His Lys Glu Val Gln Ala
195                 200                 205                 210
aat gcc agc gtc aga gct gct ttt gtg cat gcc ctt gga gat cta ttt      908
Asn Ala Ser Val Arg Ala Ala Phe Val His Ala Leu Gly Asp Leu Phe
                215                 220                 225
cag agt atc agt gtg cta att agt gca ctt att atc tac ttt aag cca      956
Gln Ser Ile Ser Val Leu Ile Ser Ala Leu Ile Ile Tyr Phe Lys Pro
            230                 235                 240
gag tat aaa ata gcc gac cca atc tgc aca ttc atc ttt tcc atc ctg     1004
Glu Tyr Lys Ile Ala Asp Pro Ile Cys Thr Phe Ile Phe Ser Ile Leu
        245                 250                 255
gtc ttg gcc agc acc atc act atc tta aag gac ttc tcc atc tta ctc     1052
Val Leu Ala Ser Thr Ile Thr Ile Leu Lys Asp Phe Ser Ile Leu Leu
    260                 265                 270
atg gaa ggt gtg cca aag agc ctg aat tac agt ggt gtg aaa gag ctt     1100
Met Glu Gly Val Pro Lys Ser Leu Asn Tyr Ser Gly Val Lys Glu Leu
275                 280                 285                 290
att tta gca gtc gac ggg gtg ctg tct gtg cac agc ctg cac atc tgg     1148
Ile Leu Ala Val Asp Gly Val Leu Ser Val His Ser Leu His Ile Trp
                295                 300                 305
tct cta aca atg aat caa gta att ctc tca gct cat gtt gct aca gca     1196
Ser Leu Thr Met Asn Gln Val Ile Leu Ser Ala His Val Ala Thr Ala
            310                 315                 320
gcc agc cgg gac agc caa gtg gtt cgg aga gaa att gct aaa gcc ctt     1244
Ala Ser Arg Asp Ser Gln Val Val Arg Arg Glu Ile Ala Lys Ala Leu
        325                 330                 335
agc aaa agc ttt acg atg cac tca ctc acc att cag atg gaa tct cca     1292
Ser Lys Ser Phe Thr Met His Ser Leu Thr Ile Gln Met Glu Ser Pro
    340                 345                 350
gtt gac cag gac ccc gac tgc ctt ttc tgt gaa gac ccc tgt gac tag     1340
Val Asp Gln Asp Pro Asp Cys Leu Phe Cys Glu Asp Pro Cys Asp
355                 360                 365
ctcagtcaca ccgtcagttt cccaaatttg acaggccacc ttcaaacatg ctgctatgca   1400
gtttctgcat catagaaaat aaggaaccaa aggaagaaat tcatgtcatg gtgcaatgca   1460
cattttatct atttatttag ttccattcac catgaaggaa gaggcactga gatccatcaa   1520
tcaattggat tatatactga tcagtagctg tgttcaattg caggaatgtg tatatagatt   1580
attcctgagt ggagccgaag taacagctgt ttgtaactat cggcaatacc aaattcatct   1640
cccttccaat aatgcatctt gagaacacat aggtaaattt gaactcagga aagtcttact   1700
agaaatcagt ggaagggaca aatagtcaca aaattttacc aaaacattag aaacaaaaaa    1760
taaggagagc caagtcagga ataaaagtga ctctgtatgc taacgccaca ttagaacttg    1820
gttctctcac caagctgtaa tgtgattttt ttttctactc tgaattggaa atatgtatga    1880
atatacagag aagtgcttac aactaatttt tatttacttg tcacattttg gcaataaatc    1940
cctcttattt ctaaattcta acttgtttat ttcaaaactt tatataatca ctgttcaaaa    2000
ggaaatattt tcacctacca gagtgcttaa acactggcac cagccaaaga atgtggttgt    2060
agagacccag aagtcttcaa gaacagccga caaaaacatt cgagttgacc ccaccaagtt    2120
gttgccacag ataatttaga tatttacctg caagaaggaa taaagcagat gcaaccaatt    2180
cattcagtcc acgagcatga tgtgagcact gctttgtgct agacattggg cttagcattg    2240
aaactataaa gaggaatcag acgcagcaag tgcttctgtg ttctggtagc aactcaacac    2300
tatctgtgga gagtaaactg aagatgtgca ggccaacatt ctggaaatcc tatgtcaatg    2360
ggtttggttt ggaacctgga cttctgcatt tttaaaagtt acccagagat gcttctaaag    2420
atgagccata gtctagaaga ttgtcaacca caggagttca ttgagtggga cagctagaca    2480
catacattgg cagctacaat agtatcatga attgcaatga tgtagtgggg tataaaagga    2540
aagcgatgga tattgccgga tgggcatggc cagtgatgtt tcacgtcatt gaggtgacag    2600
ctctgctgga ctttgaatta catatggagg ctctccagga agacgaagaa gagaaggaca    2660
ttctaggcaa aaagaagact aggcacaagg cacacttatg tttgtctgtt agcttttagt    2720
tgaaaaagca aaatacatga tgcaaagaaa cctctccacg ctgtgatttt taaaactaca    2780
tactttttgc aactttatgg ttatgagtat tgtagagaac aggagatagg tcttagatga    2840
tttttatgtt gttgtcagac tctagcaagg tactagaaac ctagcaggca ttaataattg    2900
ttgaggcaat gactctgagg ctatatctgg gccttgtcat tatttatcat ttatatttgt    2960
atttttttct gaaatttgag ggccaagaaa acattgactt tgactgagga ggtcacatct    3020
gtgccatctc tgcaaatcaa tcagcaccac tgaaataact acttagcatt ctgctgagct    3080
ttccctgctc agtagagaca aatatactca tcccccacct cagtgagctt gtttaggcaa    3140
ccaggattag agctgctcag gttcccaacg tctcctgcca catcgggttc tcaaaatgga    3200
aagaatggtt tatgccaaat cacttttcct gtctgaagga ccactgaatg gttttgtttt    3260
tccatatttt gcataggacg ccctaaagac taggtgactt ggcaaacaca caagtgttag    3320
tataattctt tgcttctgct tctttttgaa aatcatgttt agatttgatt ttaagtcaga    3380
aattcactga atgtcaggta atcattatgg agggagattt gtgtgtcaac caaagtaatt    3440
gtcccatggc cccagggtat ttctgttgtt tccctgaaat tctgcttttt tagtcagcta    3500
gattgaaaac tctgaacagt agatgtttat atggcaaaat gcaagacaat ctacaaggga    3560
gattttaagg attttgagat gaaaaaacag atgctactca ggggctttat gaaccatcca    3620
tcaattctga agttctgact ctcccattac cctttccctg gtgtggtcag aactccaggt    3680
cactggaagt tagtggaatc atgtagttga attctttact tcaagacatt gtattctctc    3740
cagctatcaa aacattaatg atcttttatg tctttttttt gttattgtta  tactttaagt   3800
tctggggtac atgtgcggaa catgtaggtt tgttacatag gtatacatgt gccatggtgg    3860
tttgctgcac tcatcaacct gtcatctaca ttcttttatg tctgtctttc aaagcaacac    3920
tctgttcttc tgagtagtga aatcaggtca actttaccac cagcctccat ttttaatatg    3980
cttcaccatc atccagcacc tacttaagat ttatctaggg ctctgtggtg atgttaggac    4040
ccataaaaga aatttatgcc ttccatatgt ttggttacag atgggaaatg ggaatgttga    4100
aggacatgaa agaaaggatg tttacacatt aagcatcagt tctgaagcta gattgtctga    4160
gtttgaatct tagctcttcc ctttattagc tctgtgacct cgagctagtt acttaaatgc    4220
tctgatcctc tatttcctga tcagtgaaac ctccctattc aaatgtgtga gagtttaata    4280
aattaggaca cttaaaaatg ttggagcagt gcatagcatg tagtgttcag tacatgttaa    4340
atgttgtttt ttattatgta caaacatgag tgggcacaga attttaaatc atctcaactt    4400
ttgagaaatt ttgagttatc aacaccgttc ccacaagaca gtggcaaaat tattggtgag    4460
aattaaacag ctgtttctca gaggaagcaa tggaggcttg ctgggataaa ggcatttact    4520
gagaggctgt tacctagtga gagtgatgaa ttaattaaaa tagtcgaatc cctttctgac    4580
tgtctctgaa agcttccgct tttatctttg aagagcagaa ttgtcactcc aaggacattt    4640
attaataaaa agaacaactg tccagtgcaa tgaaggcaaa gtcataggtc tcccaagtct    4700
taccccattc ctgtgaaata tcaagttctt ggcttttctc tgtcatgtag cctcaacttt    4760
ctctgaccgg gtgcatttct ttctctggtt tctaaattgc cagtggcaaa tttggatcac    4820
ttacttaata tctgttaaat tttgtgaccc aacaaagtct tttagcactg tggtgtcaaa    4880
aagaaaaaca cctcccaggc atatacattt tatagattcc tggagaatgt tgctctccag    4940
ctccatcccc acccaatgaa atatgatcca gagagtcttg caaagagaca agcctcattt    5000
tccacaatta gctctaaagt gcctccagga aatgattttc tcagctcatc tctctgtatt    5060
ccctgttttg gatcacaggg caatctgttt aaatgactaa ttacagaaat cattaaaggc    5120
accaagcaaa tgtcatctct gaatacacac atcccaagct ttacaaatcc tgcctggctt    5180
gacagtgatg aggccactta acagtccagc gcaggcggat gttaaaaaaa ataaaaaggt    5240
gaccatctgc ggtttagttt tttaactttc tgatttcaca cttaacgtct gtcattctgt    5300
tactgggcac ctgtttaaat tctattttaa aatgttaatg tgtgttgttt aaaataaaat    5360
caagaaagag aga                                                       5373
<210>2
<211>369
<212>PRT
<213>人(Homo sa piens)
<400>2
Met Glu Phe Leu Glu Arg Thr Tyr Leu Val Asn Asp Lys Ala Ala Lys
1               5                   10                  15
Met Tyr Ala Phe Thr Leu Glu Ser Val Glu Leu Gln Gln Lys Pro Val
            20                  25                  30
Asn Lys Asp Gln Cys Pro Arg Glu Arg Pro Glu Glu Leu Glu Ser Gly
        35                  40                  45
Gly Met Tyr His Cys His Ser Gly Ser Lys Pro Thr Glu Lys Gly Ala
    50                  55                  60
Asn Glu Tyr Ala Tyr Ala Lys Trp Lys Leu Cys Ser Ala Ser Ala Ile
65                  70                  75                  80
Cys Phe Ile Phe Met Ile Ala Glu Val Val Gly Gly His Ile Ala Gly
                85                  90                  95
Ser Leu Ala Val Val Thr Asp Ala Ala His Leu Leu Ile Asp Leu Thr
            100                 105                 110
Ser Phe Leu Leu Ser Leu Phe Ser Leu Trp Leu Ser Ser Lys Pro Pro
        115                 120                 125
Ser Lys Arg Leu Thr Phe Gly Trp His Arg Ala Glu Ile Leu Gly Ala
    130                 135                 140
Leu Leu Ser Ile Leu Cys Ile Trp Val Val Thr Gly Val Leu Val Tyr
145                 150                 155                 160
Leu Ala Cys Glu Arg Leu Leu Tyr Pro Asp Tyr Gln Ile Gln Ala Thr
                165                 170                 175
Val Met Ile Ile Val Ser Ser Cys Ala Val Ala Ala Asn Ile Val Leu
            180                 185                 190
Thr Val Val Leu His Gln Arg Cys Leu Gly His Asn His Lys Glu Val
        195                 200                 205
Gln Ala Asn Ala Ser Val Arg Ala Ala Phe Val His Ala Leu Gly Asp
    210                 215                 220
Leu Phe Gln Ser Ile Ser Val Leu Ile Ser Ala Leu Ile Ile Tyr Phe
225                 230                 235                 240
Lys Pro Glu Tyr Lys Ile Ala Asp Pro Ile Cys Thr Phe Ile Phe Ser
                245                 250                 255
Ile Leu Val Leu Ala Ser Thr Ile Thr Ile Leu Lys Asp Phe Ser Ile
            260                 265                 270
Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Ser Leu Asn Tyr Ser Gly Val Lys
        275                 280                 285
Glu Leu Ile Leu Ala Val Asp Gly Val Leu Ser Val His Ser Leu His
    290                 295                 300
Ile Trp Ser Leu Thr Met Asn Gln Val Ile Leu Ser Ala His Val Ala
305                 310                 315                 320
Thr Ala Ala Ser Arg Asp Ser Gln Val Val Arg Arg Glu Ile Ala Lys
                325                 330                 335
Ala Leu Ser Lys Ser Phe Thr Met His Ser Leu Thr Ile Gln Met Glu
            340                 345                 350
Ser Pro Val Asp Gln Asp Pro Asp Cys Leu Phe Cys Glu Asp Pro Cys
        355                 360                 365
Asp
<210>3
<211>1906
<212>DNA
<213>鼠(Mus musculus)
<220>
<221>CDS
<222>(334)..(1437)
<400>3
atgtgcgcgc acgcgcgcgc gcacacacac acacacacac acacacacac acacacacac     60
acacttatta caattgtacc tttgagtctc ccagaaaagc agtttctgtg agtgatagaa    120
tgagtctagg tgattttcca aggagactgt taattttcac agatttaccc acaacactga    180
tataggaggc ctcattaact caagtactgg aagaattttt ctaatttctt aggaagttgt    240
gtgaatataa taatatcagt gcttctttac ttccaaaact ggacagcgca tcaaacatca    300
gaaacaacag tatcagctcc tgtcccaact acc atg gag ttt ctt gag aga act     354
                                     Met Glu Phe Leu Glu Arg Thr
                                     1               5
tat ctt gtg aat gat caa gcc acc aag atg tac gcc ttc cct cta gac      402
Tyr Leu Val Asn Asp Gln Ala Thr Lys Met Tyr Ala Phe Pro Leu Asp
        10                  15                  20
aga gaa ctt cga cag aag cct gtg aat aaa gat cag tgt cct gga gac      450
Arg Glu Leu Arg Gln Lys Pro Val Asn Lys Asp Gln Cys Pro Gly Asp
    25                  30                  35
agg cca gag cat cca gag gca gga ggc atc tat cac tgc cac aac agc      498
Arg Pro Glu His Pro Glu Ala Gly Gly Ile Tyr His Cys His Asn Ser
40                  45                  50                  55
gcc aag gcc aca ggg aac agg tcg agc aag caa gcg cat gcc aag tgg      546
Ala Lys Ala Thr Gly Asn Arg Ser Ser Lys Gln Ala His Ala Lys Trp
                60                  65                  70
aga ctc tgt gct gct tca gca ata tgc ttc atc ttt atg gtg gca gag      594
Arg Leu Cys Ala Ala Ser Ala Ile Cys Phe Ile Phe Met Val Ala Glu
            75                  80                  85
gtg gtg ggt gga cac gtt gct ggg agt ctg gct atc ctc act gat gcg      642
Val Val Gly Gly His Val Ala Gly Ser Leu Ala Ile Leu Thr Asp Ala
        90                  95                  100
gct cat ctc tta att gac ctg act agt ttc ctg ctc agt ctc ttt tct      690
Ala His Leu Leu Ile Asp Leu Thr Ser Phe Leu Leu Ser Leu Phe Ser
    105                 110                 115
ttg tgg ttg tca tcg agg ccc cct tcc aag cgg ctg aca ttt ggg tgg      738
Leu Trp Leu Ser Ser Arg Pro Pro Ser Lys Arg Leu Thr Phe Gly Trp
120                 125                 130                 135
tat cga gca gag atc ctc ggt gcc ctg ctg tct gtc ctt tgc atc tgg      786
Tyr Arg Ala Glu Ile Leu Gly Ala Leu Leu Ser Val Leu Cys Ile Trp
                140                 145                 150
gtg gtg act ggt gtg ctg ctg tac ctt gcc tgt gag cgc ctt ttg tat      834
Val Val Thr Gly Val Leu Leu Tyr Leu Ala Cys Glu Arg Leu Leu Tyr
            155                 160                 165
cct gat tac cag atc caa gca ggt atc atg atc act gtt tca ggc tgt      882
Pro Asp Tyr Gln Ile Gln Ala Gly Ile Met Ile Thr Val Ser Gly Cys
        170                 175                 180
gca gtg gca gcc aac att gta cta act atg att ttg cac caa cgg aac      930
Ala Val Ala Ala Asn Ile Val Leu Thr Met Ile Leu His Gln Arg Asn
    185                 190                 195
ttt ggc tac aac cac aag gat gta caa gct aat gcc agt gtc cga gca      978
Phe Gly Tyr Asn His Lys Asp Val Gln Ala Asn Ala Ser Val Arg Ala
200                 205                 210                 215
gcc ttt gtg cat gcc ctg ggg gat gta ttt cag agc atc agt gtg cta     1026
Ala Phe Val His Ala Leu Gly Asp Val Phe Gln Ser Ile Ser Val Leu
                220                 225                 230
att agt gct ctc att atc tac ttt aag cct gac tac aaa att gct gat     1074
Ile Ser Ala Leu Ile Ile Tyr Phe Lys Pro Asp Tyr Lys Ile Ala Asp
            235                 240                 245
cca gtg tgc aca ttt atc ttt tcc atc ctg gtt ttg gcc agc acc gtc     1122
Pro Val Cys Thr Phe Ile Phe Ser Ile Leu Val Leu Ala Ser Thr Val
        250                 255                 260
atg atc tta aaa gac ttc tcc atc tta ctc atg gaa ggt gtt cca aag     1170
Met Ile Leu Lys Asp Phe Ser Ile Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys
    265                 270                 275
ggc ctg agt tac aac agt gtg aaa gag atc atc ctc gca gtt gat ggc     1218
Gly Leu Ser Tyr Asn Ser Val Lys Glu Ile Ile Leu Ala Val Asp Gly
280                 285                 290                 295
gtg atc tcc gtg cac agt cta cac atc tgg tca ctg act gtg aac caa     1266
Val Ile Ser Val His Ser Leu His Ile Trp Ser Leu Thr Val Asn Gln
                300                 305                 310
gtg att ctc tct gtt cat gtt gct aca gct gcc agc cag gac agc cag     1314
Val Ile Leu Ser Val His Val Ala Thr Ala Ala Ser Gln Asp Ser Gln
            315                 320                 325
tct gtg cgg aca gga att gct caa gcc ctc agc agc ttt gat ctt cac     1362
Ser Val Arg Thr Gly Ile Ala Gln Ala Leu Ser Ser Phe Asp Leu His
        330                 335                 340
tct ctt acc att cag ata gaa tct gca gca gac cag gac ccc agc tgc     1410
Ser Leu Thr Ile Gln Ile Glu Ser Ala Ala Asp Gln Asp Pro Ser Cys
    345                 350                 355
ctt ctc tgc gaa gac cct cag gac tag ctcggtcaca ctgtcagctt           1457
Leu Leu Cys Glu Asp Pro Gln Asp
360                 365
cctgtgtttc ctaggccatg ataagatgca gcaaagtttc tgcaatgcac aatgaggcag   1517
ccgtcggaat agatttgaga aagtcatgat gatgcaatgt gcacactctt cctttgtatt   1577
tatctctatc caccatgaac gaggatgcat gggatttgtc ggcttcttgg attatacact   1637
aatcagtagt tgtgctcaat tgtagtatat atagattatt cctaactgga gctgaaataa   1697
cagatgtttg caatcatagg taatgaatga ttcacttgcc tacaatagtg ggtatagttt   1757
tactcggaaa tgcctttcta ggaatccaca gcatgagaaa caaacatttg aagagaattt   1817
gaggccttag aatttgattc tgccaccata ctcaatgaga tctttatttt ttgtgaaaca   1877
gtaaaacttc cctcttttga ccttgcatg                                     1906
<210>4
<211>367
<212>PRT
<213>鼠(Mus musculus)
<400>4
Met Glu Phe Leu Glu Arg Thr Tyr Leu Val Asn Asp Gln Ala Thr Lys
1               5                   10                  15
Met Tyr Ala Phe Pro Leu Asp Arg Glu Leu Arg Gln Lys Pro Val Asn
            20                  25                  30
Lys Asp Gln Cys Pro Gly Asp Arg Pro Glu His Pro Glu Ala Gly Gly
        35                  40                  45
Ile Tyr His Cys His Asn Ser Ala Lys Ala Thr Gly Asn Arg Ser Ser
    50                  55                  60
Lys Gln Ala His Ala Lys Trp Arg Leu Cys Ala Ala Ser Ala Ile Cys
65                  70                  75                  80
Phe Ile Phe Met Val Ala Glu Val Val Gly Gly His Val Ala Gly Ser
                85                  90                  95
Leu Ala Ile Leu Thr Asp Ala Ala His Leu Leu Ile Asp Leu Thr Ser
            100                 105                 110
Phe Leu Leu Ser Leu Phe Ser Leu Trp Leu Ser Ser Arg Pro Pro Ser
        115                 120                 125
Lys Arg Leu Thr Phe Gly Trp Tyr Arg Ala Glu Ile Leu Gly Ala Leu
    130                 135                 140
Leu Ser Val Leu Cys Ile Trp Val Val Thr Gly Val Leu Leu Tyr Leu
145                 150                 155                 160
Ala Cys Glu Arg Leu Leu Tyr Pro Asp Tyr Gln Ile Gln Ala Gly Ile
                165                 170                 175
Met Ile Thr Val Ser Gly Cys Ala Val Ala Ala Asn Ile Val Leu Thr
            180                 185                 190
Met Ile Leu His Gln Arg Asn Phe Gly Tyr Asn His Lys Asp Val Gln
        195                 200                 205
Ala Asn Ala Ser Val Arg Ala Ala Phe Val His Ala Leu Gly Asp Val
    210                 215                 220
Phe Gln Ser Ile Ser Val Leu Ile Ser Ala Leu Ile Ile Tyr Phe Lys
225                 230                 235                 240
Pro Asp Tyr Lys Ile Ala Asp Pro Val Cys Thr Phe Ile Phe Ser Ile
                245                 250                 255
Leu Val Leu Ala Ser Thr Val Met Ile Leu Lys Asp Phe Ser Ile Leu
            260                 265                 270
Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Gly Leu Ser Tyr Asn Ser Val Lys Glu
        275                 280                 285
Ile Ile Leu Ala Val Asp Gly Val Ile Ser Val His Ser Leu His Ile
    290                 295                 300
Trp Ser Leu Thr Val Asn Gln Val Ile Leu Ser Val His Val Ala Thr
305                 310                 315                 320
Ala Ala Ser Gln Asp Ser Gln Ser Val Arg Thr Gly Ile Ala Gln Ala
                325                 330                 335
Leu Ser Ser Phe Asp Leu His Ser Leu Thr Ile Gln Ile Glu Ser Ala
            340                 345                 350
Ala Asp Gln Asp Pro Ser Cys Leu Leu Cys Glu Asp Pro Gln Asp
        355                 360                 365
<210>5
<211>320
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>5
Met Tyr His Cys His Ser Gly Ser Lys Pro Thr Glu Lys Gly Ala Asn
1               5                   10                  15
Glu Tyr Ala Tyr Ala Lys Trp Lys Leu Cys Ser Ala Ser Ala Ile Cys
            20                  25                  30
Phe Ile Phe Met Ile Ala Glu Val Val Gly Gly His Ile Ala Gly Ser
        35                  40                  45
Leu Ala Val Val Thr Asp Ala Ala His Leu Leu Ile Asp Leu Thr Ser
    50                  55                  60
Phe Leu Leu Ser Leu Phe Ser Leu Trp Leu Ser Ser Lys Pro Pro Ser
65                  70                  75                  80
Lys Arg Leu Thr Phe Gly Trp His Arg Ala Glu Ile Leu Gly Ala Leu
                85                  90                  95
Leu Ser Ile Leu Cys Ile Trp Val Val Thr Gly Val Leu Val Tyr Leu
            100                 105                 110
Ala Cys Glu Arg Leu Leu Tyr Pro Asp Tyr Gln Ile Gln Ala Thr Val
        115                 120                 125
Met Ile Ile Val Ser Ser Cys Ala Val Ala Ala Asn Ile Val Leu Thr
    130                 135                 140
Val Val Leu His Gln Arg Cys Leu Gly His Asn His Lys Glu Val Gln
145                 150                 155                 160
Ala Asn Ala Ser Val Arg Ala Ala Phe Val His Ala Leu Gly Asp Leu
                165                 170                 175
Phe Gln Ser Ile Ser Val Leu Ile Ser Ala Leu Ile Ile Tyr Phe Lys
            180                 185                 190
Pro Glu Tyr Lys Ile Ala Asp Pro Ile Cys Thr Phe Ile Phe Ser Ile
        195                 200                 205
Leu Val Leu Ala Ser Thr Ile Thr Ile Leu Lys Asp Phe Ser Ile Leu
    210                 215                 220
Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Ser Leu Asn Tyr Ser Gly Val Lys Glu
225                 230                 235                 240
Leu Ile Leu Ala Val Asp Gly Val Leu Ser Val His Ser Leu His Ile
                245                 250                 255
Trp Ser Leu Thr Met Asn Gln Val Ile Leu Ser Ala His Val Ala Thr
            260                 265                 270
Ala Ala Ser Arg Asp Ser Gln Val Val Arg Arg Glu Ile Ala Lys Ala
        275                 280                 285
Leu Ser Lys Ser Phe Thr Met His Ser Leu Thr Ile Gln Met Glu Ser
    290                 295                 300
Pro Val Asp Gln Asp Pro Asp Cys Leu Phe Cys Glu Asp Pro Cys Asp
305                 310                 315                 320
<210>6
<211>28
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>6
Met Glu Phe Leu Glu Arg Ala Tyr Leu Val Asn Asp Lys Ala Ala Lys
1               5                   10                  15
Met Tyr Ala Phe Thr Leu Glu Arg Arg Ser Cys Lys
            20                  25
<210>7
<211>28
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>7
Met Glu Phe Leu Glu Arg Thr Tyr Leu Val Asn Asp Lys Ala Ala Lys
1               5                   10                  15
Met Tyr Ala Phe Thr Leu Glu Arg Arg Ser Arg Lys
            20                  25
<210>8
<211>74
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>8
Met Glu Phe Leu Glu Arg Thr Tyr Leu Val Asn Asp Lys Ala Ala Lys
1               5                   10                  15
Met Tyr Ala Phe Thr Leu Glu Ser Val Glu Leu Gln Gln Lys Pro Val
            20                  25                  30
Asn Lys Asp Gln Cys Pro Arg Glu Arg Pro Glu Glu Leu Glu Ser Gly
        35                  40                  45
Gly Met Tyr His Cys His Ser Gly Ser Lys Pro Thr Glu Lys Gly Ala
    50                  55                  60
Asn Glu Tyr Ala Tyr Ala Lys Trp Lys Leu
65                  70
<210>9
<211>103
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>9
Met Lys Asp Phe Ser Ile Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Ser Leu
1               5                   10                  15
Asn Tyr Ser Gly Val Lys Glu Leu Ile Leu Ala Val Asp Gly Val Leu
            20                  25                  30
Ser Val His Ser Leu His Ile Trp Ser Leu Thr Met Asn Gln Val Ile
        35                  40                  45
Leu Ser Ala His Val Ala Thr Ala Ala Ser Arg Asp Ser Gln Val Val
    50                  55                  60
Arg Arg Glu Ile Ala Lys Ala Leu Ser Lys Ser Phe Thr Met His Ser
65                  70                  75                  80
Leu Thr Ile Gln Met Glu Ser Pro Val Asp Gln Asp Pro Asp Cys Leu
                85                  90                  95
Phe Cys Glu Asp Pro Cys Asp
            100
<210>10
<211>87
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>10
Met Lys Asp Phe Ser Ile Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Ser Leu
1               5                   10                  15
Asn Tyr Ser Gly Val Lys Glu Leu Ile Leu Ala Val Asp Gly Val Leu
            20                  25                  30
Ser Val His Ser Leu His Ile Trp Ser Leu Thr Met Asn Gln Val Ile
        35                  40                  45
Leu Ser Ala His Val Ala Thr Ala Ala Ser Arg Asp Ser Gln Val Val
    50                  55                  60
Arg Arg Glu Ile Ala Lys Ala Leu Ser Lys Ser Phe Thr Met His Ser
65                  70                  75                  80
Leu Thr Ile Gln Met Glu Ser
                85
<210>11
<211>78
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>11
Met Lys Asp Phe Ser Ile Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Ser Leu
1               5                   10                  15
Asn Tyr Ser Gly Val Lys Glu Leu Ile Leu Ala Val Asp Gly Val Leu
            20                  25                  30
Ser Val His Ser Leu His Ile Trp Ser Leu Thr Met Asn Gln Val Ile
        35                  40                  45
Leu Ser Ala His Val Ala Thr Ala Ala Ser Arg Asp Ser Gln Val Val
    50                  55                  60
Arg Arg Glu Ile Ala Lys Ala Leu Ser Lys Ser Phe Thr Met
65                  70                  75
<210>12
<211>103
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>12
Met Lys Asp Phe Ser Ile Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Ser Leu
1               5                   10                  15
Asn Tyr Ser Gly Val Lys Glu Leu Ile Leu Ala Val Asp Gly Val Leu
            20                  25                  30
Ser Val His Ser Leu His Ile Trp Ser Leu Thr Met Asn Gln Val Ile
        35                  40                  45
Leu Ser Ala His Val Ala Thr Ala Ala Ser Arg Asp Ser Gln Val Val
    50                  55                  60
Arg Arg Glu Ile Ala Lys Ala Leu Ser Ala Ser Phe Thr Met Ala Ser
65                  70                  75                  80
Leu Thr Ile Gln Met Ala Ala Pro Val Asp Gln Asp Pro Asp Cys Leu
                85                  90                  95
Phe Cys Glu Asp Pro Cys Asp
            100
<210>13
<211>26
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>13
Val Leu Thr Val Val Leu His Gln Arg Cys Leu Gly His Asn His Lys
1               5                   10                  15
Glu Val Gln Ala Asn Ala Ser Val Arg Ala
            20                  25
<210>14
<211>95
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>14
Met Glu Gly Val Pro Lys Ser Leu Asn Tyr Ser Gly Val Lys Glu Leu
1               5                   10                  15
Ile Leu Ala Val Asp Gly Val Leu Ser Val His Ser Leu His Ile Trp
            20                  25                  30
Ser Leu Thr Met Asn Gln Val Ile Leu Ser Ala His Val Ala Thr Ala
        35                  40                  45
Ala Ser Arg Asp Ser Gln Val Val Arg Arg Glu Ile Ala Lys Ala Leu
    50                  55                  60
Ser Lys Ser Phe Thr Met His Ser Leu Thr Ile Gln Met Glu Ser Pro
65                  70                  75                  80
Val Asp Gln Asp Pro Asp Cys Leu Phe Cys Glu Asp Pro Cys Asp
                85                  90                  95
<210>15
<211>88
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>15
Met Asn Tyr Ser Gly Val Lys Glu Leu Ile Leu Ala Val Asp Gly Val
1               5                   10                  15
Leu Ser Val His Ser Leu His Ile Trp Ser Leu Thr Met Asn Gln Val
            20                  25                  30
Ile Leu Ser Ala His Val Ala Thr Ala Ala Ser Arg Asp Ser Gln Val
        35                  40                  45
Val Arg Arg Glu Ile Ala Lys Ala Leu Ser Lys Ser Phe Thr Met His
    50                  55                  60
Ser Leu Thr Ile Gln Met Glu Ser Pro Val Asp Gln Asp Pro Asp Cys
65                  70                  75                  80
Leu Phe Cys Glu Asp Pro Cys Asp
                85
<210>16
<211>80
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>16
Met Ile Leu Ala Val Asp Gly Val Leu Ser Val His Ser Leu His Ile
1               5                   10                  15
Trp Ser Leu Thr Met Asn Gln Val Ile Leu Ser Ala His Val Ala Thr
            20                  25                  30
Ala Ala Ser Arg Asp Ser Gln Val Val Arg Arg Glu Ile Ala Lys Ala
        35                  40                  45
Leu Ser Lys Ser Phe Thr Met His Ser Leu Thr Ile Gln Met Glu Ser
    50                  55                  60
Pro Val Asp Gln Asp Pro Asp Cys Leu Phe Cys Glu Asp Pro Cys Asp
65                  70                  75                  80
<210>17
<211>70
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>17
Met His Ser Leu His Ile Trp Ser Leu Thr Met Asn Gln Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Ala His Val Ala Thr Ala Ala Ser Arg Asp Ser Gln Val Val Arg
            20                  25                  30
Arg Glu Ile Ala Lys Ala Leu Ser Lys Ser Phe Thr Met His Ser Leu
        35                  40                  45
Thr Ile Gln Met Glu Ser Pro Val Asp Gln Asp Pro Asp Cys Leu Phe
    50                  55                  60
Cys Glu Asp Pro Cys Asp
65                  70
<210>18
<211>65
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>18
Met Trp Ser Leu Thr Met Asn Gln Val Ile Leu Ser Ala His Val Ala
1               5                   10                  15
Thr Ala Ala Ser Arg Asp Ser Gln Val Val Arg Arg Glu Ile Ala Lys
            20                  25                  30
Ala Leu Ser Lys Ser Phe Thr Met His Ser Leu Thr Ile Gln Met Glu
        35                  40                  45
Ser Pro Val Asp Gln Asp Pro Asp Cys Leu Phe Cys Glu Asp Pro Cys
    50                  55                  60
Asp
65
<210>19
<211>26
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>19
Met Asp Phe Ser Ile Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Ser Leu Asn
1               5                   10                  15
Tyr Ser Gly Val Lys Glu Leu Ile Leu Ala
            20                  25
<210>20
<211>57
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>20
Met Asp Phe Ser Ile Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Ser Leu Asn
1               5                   10                  15
Tyr Ser Gly Val Lys Glu Leu Ile Leu Ala Val Asp Gly Val Leu Ser
            20                  25                  30
Val His Ser Leu His Ile Trp Ser Leu Thr Met Asn Gln Val Ile Leu
        35                  40                  45
Ser Ala His Val Ala Thr Ala Ala Ser
    50                  55
<210>21
<211>76
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>21
Met Asp Phe Ser Ile Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Ser Leu Asn
1               5                   10                  15
Tyr Ser Gly Val Lys Glu Leu Ile Leu Ala Val Asp Gly Val Leu Ser
            20                  25                  30
Val His Ser Leu His Ile Trp Ser Leu Thr Met Asn Gln Val Ile Leu
        35                  40                  45
Ser Ala His Val Ala Thr Ala Ala Ser Arg Asp Ser Gln Val Val Arg
    50                  55                  60
Arg Glu Ile Ala Lys Ala Leu Ser Lys Ser Phe Thr
65                  70                  75
<210>22
<211>102
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>22
Met Asp Phe Ser Ile Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Ser Leu Asn
1               5                   10                  15
Tyr Ser Gly Val Lys Glu Leu Ile Leu Ala Val Asp Gly Val Leu Ser
            20                  25                  30
Val His Ser Leu His Ile Trp Ser Leu Thr Met Asn Gln Val Ile Leu
        35                  40                  45
Ser Ala His Val Ala Thr Ala Ala Ser Arg Asp Ser Gln Val Val Arg
    50                  55                  60
Arg Glu Ile Ala Lys Ala Leu Ser Lys Ser Phe Thr Met His Ser Leu
65                  70                  75                  80
Thr Ile Gln Met Glu Ser Pro Val Asp Gln Asp Pro Asp Cys Leu Phe
                85                  90                  95
Cys Glu Asp Pro Cys Asp
            100
<210>23
<211>89
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>23
Met Asp Phe Ser Ile Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Ser Leu Asn
1               5                   10                  15
Tyr Ser Gly Val Lys Glu Leu Ile Leu Ala Val Asp Gly Val Leu Ser
            20                  25                  30
Val His Ser Leu His Ile Trp Ser Leu Thr Met Asn Gln Val Ile Leu
        35                  40                  45
Ser Ala His Val Ala Thr Ala Ala Ser Arg Asp Ser Gln Val Val Arg
    50                  55                  60
Arg Glu Ile Ala Lys Ala Leu Ser Lys Ser Phe Thr Met His Ser Leu
65                  70                  75                  80
Thr Ile Gln Met Glu Ser Pro Val Asp
                85
<210>24
<211>102
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>24
Met Asp Phe Ser Ile Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Ser Leu Asn
1               5                   10                  15
Tyr Ser Gly Val Lys Glu Leu Ile Leu Ala Val Asp Gly Val Leu Ser
            20                  25                  30
Val His Ser Leu His Ile Trp Ser Leu Thr Met Asn Gln Val Ile Leu
        35                  40                  45
Ser Ala His Val Ala Thr Ala Ala Ser Arg Asp Ser Gln Val Val Arg
    50                  55                  60
Arg Glu Ile Ala Lys Ala Leu Ser Lys Ser Phe Thr Met His Ser Leu
65                  70                  75                  80
Thr Ile Gln Met Glu Ser Pro Val Asp Gln Asp Pro Asp Cys Leu Phe
                85                  90                  95
Cys Glu Asp Pro Cys Asp
            100
<210>25
<211>103
<212>PRT
<213>鼠(Mus musculus)
<400>25
Arg Asp Val Leu Leu Val Leu Met Glu Gly Ala Pro Arg Ser Val Glu
1               5                   10                  15
Phe Glu Pro Val Arg Asp Thr Leu Leu Ser Val Pro Gly Val Arg Ala
            20                  25                  30
Thr His Asp Leu His Leu Trp Ala Leu Thr Leu Thr Tyr His Val Ala
        35                  40                  45
Ser Ala His Leu Ala Ile Asp Ser Thr Ala Asp Pro Glu Ala Val Leu
    50                  55                  60
Ala Glu Ala Ser Ser Arg Leu Tyr Ser Arg Phe Gly Phe Ser Ser Cys
65                  70                  75                  80
Thr Leu Gln Val Glu Gln Tyr Gln Pro Glu Met Ala Gln Cys Leu Arg
                85                  90                  95
Cys Gln Glu Pro Ser Gln Ala
            100
<210>26
<211>17
<212>PRT
<213>猕猴(Macaca mulatta)
<400>26
Phe Thr Val Tyr Ser Leu Thr Ile Gln Met Glu Ser Pro Val Asp Gln
1               5                   10                  15
Asp
<210>27
<211>17
<212>PRT
<213>犬(Canis familiaris)
<400>27
Tyr Thr Val His Ser Leu Thr Ile Gln Met Glu Ser Pro Ala Asp Gln
1               5                   10                  15
Asp
<210>28
<211>17
<212>PRT
<213>黑家鼠(Rattus rattus)
<400>28
Phe Asp Leu His Ser Leu Thr Ile Gln Ile Glu Ser Ala Ala Asp Gln
1               5                   10                  15
Asp
<210>29
<211>17
<212>PRT
<213>原牛(Bos taurus)
<400>29
Phe Pro Val His Ser Leu Thr Ile Gln Met Ser Cys Ser Pro Thr Arg
1               5                   10                  15
Ile
<210>30
<211>17
<212>PRT
<213>爪蟾(Xenopus sp.)
<400>30
Phe Pro Phe His Ser Val Thr Ile Gln Val Glu Pro Ile Glu Asp Gln
1               5                   10                  15
Ser
<210>31
<211>17
<212>PRT
<213>原鸡(Gallus gallus)
<400>31
Tyr Ser Phe His Ser Ile Thr Ile Gln Ile Glu Ser Gly Gly Asp Gln
1               5                   10                  15
Glu
<210>32
<211>17
<212>PRT
<213>斑马鱼(Danio rerio)
<400>32
Tyr Ser Phe His Ser Val Thr Ile Gln Leu Glu Pro Gln Ala Asp Gln
1               5                   10                  15
Arg
<210>33
<211>17
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>33
Phe His Phe His Thr Val Thr Ile Gln Ile Glu Asp Tyr Ser Glu Asp
1               5                   10                  15
Met
<210>34
<211>17
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>34
Phe Gly Phe Ser Ser Cys Thr Leu Gln Val Glu Gln Tyr Gln Pro Glu
1               5                   10                  15
Met
<210>35
<211>17
<212>PRT
<213>热球菌(Pyrococcus sp.)
<400>35
Phe Gly Ile Thr His ValThr Ile Gln Leu Glu Thr Gly Arg Cys Lys
1               5                  10                  15
Glu
<210>36
<211>17
<212>PRT
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>36
Val Asp Gly Asn Gln Ile Thr Ile Gln Met Glu Ser Lys Ile Asp Val
1               5                   10                  15
Gln
<210>37
<211>17
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>37
Ser Met His Asp Leu Thr Thr Ile Gln Gly Asp Glu Pro Val Gly Gln
1               5                   10                  15
Arg
<210>38
<211>69
<212>PRT
<213>爪蟾(Xenopus sp.)
<400>38
Met Lys Gly Ser Glu Glu Ala Tyr Leu Val Ser Asp Lys Ala Thr Lys
1               5                   10                  15
Met Tyr Ser Leu Thr Lys Asp Ser Glu Lys Asn His Pro Ser Lys Pro
            20                  25                  30
Pro Leu Gln Asp Glu Glu Asn Pro Gln Ser Lys Tyr His Cys His Asn
        35                  40                  45
Asn Asn Lys Lys Ala Tyr Asp Ala Arg Gln Arg Glu Gln Thr Phe Ala
    50                  55                  60
Lys Lys Lys Leu Cys
65
<210>39
<211>102
<212>PRT
<213>爪蟾(Xenopus sp.)
<400>39
Arg Asp Leu Leu Thr Val Leu Met Glu Gly Thr Arg Pro Gly Ile His
1               5                   10                  15
Tyr Ser Asp Val Lys Gln Ser Ile Leu Ala Val Asp Gly Val Lys Ser
            20                  25                  30
Val His Ser Leu His Leu Trp Ala Leu Thr Met Asn Gln Val Ile Leu
        35                  40                  45
Ser Ala His Ile Ala Thr Asp Ile Val Gly Glu Ser Lys Arg Ile Leu
    50                  55                  60
Lys Asp Val Thr Gln Asn Val Phe Ala Arg Phe Pro Phe His Ser Val
65                  70                  75                  80
Thr Ile Gln Val Glu Pro Ile Glu Asp Gln Ser Pro Glu Cys Met Phe
                85                  90                  95
Cys Tyr Glu Pro Thr Gln
            100
<210>40
<211>102
<212>PRT
<213>鼠(Mus musculus)
<400>40
Met Lys Asp Phe Ser Ile Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Gly Leu
1               5                   10                  15
Ser Tyr Asn Ser Val Lys Glu Ile Ile Leu Ala Val Asp Gly Val Ile
            20                  25                  30
Ser Val His Ser Leu His Ile Trp Ser Leu Thr Val Asn Gln Val Ile
        35                  40                  45
Leu Ser Val His Val Ala Thr Ala Ala Ser Gln Asp Ser Gln Ser Val
    50                  55                  60
Arg Thr Gly Ile Ala Gln Ala Leu Ser Ser Phe Asp Leu His Ser Leu
65                  70                  75                  80
Thr Ile Gln Ile Glu Ser Ala Ala Asp Gln Asp Pro Ser Cys Leu Leu
                85                  90                  95
Cys Glu Asp Pro Gln Asp
            100
<210>41
<211>102
<212>PRT
<213>鼠(Mus musculus)
<400>41
Met Lys Asp Phe Ser Ile Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Gly Leu
1               5                   10                  15
Ser Tyr Asn Ser Val Lys Glu Ile Ile Leu Ala Val Asp Gly Val Ile
            20                  25                  30
Ser Val His Ser Leu His Ile Trp Ser Leu Thr Val Asn Gln Val Ile
        35                  40                  45
Leu Ser Val His Val Ala Thr Ala Ala Ser Arg Asp Ser Gln Ser Val
    50                  55                  60
Arg Thr Gly Ile Ala Gln Ala Leu Ser Ser Phe Asp Leu His Ser Leu
65                  70                  75                  80
Thr Ile Gln Ile Glu Ser Ala Ala Asp Gln Asp Pro Ser Cys Leu Leu
                85                  90                  95
Cys Glu Asp Pro Gln Asp
            100
<210>42
<211>102
<212>PRT
<213>鼠(Mus musculus)
<400>42
Met Lys Asp Phe Ser Ile Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Gly Leu
1               5                   10                  15
Ser Tyr Asn Ser Val Lys Glu Ile Ile Leu Ala Val Asp Gly Val Ile
            20                  25                  30
Ser Val His Ser Leu His Ile Trp Ser Leu Thr Val Asn Gln Val Ile
        35                  40                  45
Leu Ser Val His Val Ala Thr Ala Ala Ser Trp Asp Ser Gln Ser Val
    50                  55                  60
Arg Thr Gly Ile Ala Gln Ala Leu Ser Ser Phe Asp Leu His Ser Leu
65                  70                  75                  80
Thr Ile Gln Ile Glu Ser Ala Ala Asp Gln Asp Pro Ser Cys Leu Leu
                85                  90                  95
Cys Glu Asp Pro Gln Asp
            100
<210>43
<211>103
<212>PRT
<213>鼠(Mus musculus)
<400>43
Met Lys Asp Phe Ser Ile Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Gly Leu
1               5                   10                  15
Ser Tyr Asn Ser Val Lys Glu Ile Ile Leu Ala Val Asp Gly Val Ile
            20                  25                  30
Ser Val His Ser Leu His Ile Trp Ser Leu Thr Val Asn Gln Val Ile
        35                  40                  45
Leu Ser Val His Val Ala Thr Ala Ala Ser Gln Asp Ser Gln Ser Val
    50                  55                  60
Arg Thr Gly Ile Ala Gln Ala Leu Ser Lys Ser Phe Asp Leu His Ser
65                  70                  75                  80
Leu Thr Ile Gln Ile Glu Ser Ala Ala Asp Gln Asp Pro Ser Cys Leu
                85                  90                  95
Leu Cys Glu Asp Pro Gln Asp
            100
<210>44
<211>103
<212>PRT
<213>鼠(Mus musculus)
<400>44
Met Lys Asp Phe Ser Ile Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Gly Leu
1               5                   10                  15
Ser Tyr Asn Ser Val Lys Glu Ile Ile Leu Ala Val Asp Gly Val Ile
            20                  25                  30
Ser Val His Ser Leu His Ile Trp Ser Leu Thr Val Asn Gln Val Ile
        35                  40                  45
Leu Ser Val His Val Ala Thr Ala Ala Ser Arg Asp Ser Gln Ser Val
    50                  55                  60
Arg Thr Gly Ile Ala Gln Ala Leu Ser Lys Ser Phe Asp Leu His Ser
65                  70                  75                  80
Leu Thr Ile Gln Ile Glu Ser Ala Ala Asp Gln Asp Pro Ser Cys Leu
                85                  90                  95
Leu Cys Glu Asp Pro Gln Asp
            100
<210>45
<211>103
<212>PRT
<213>鼠(Mus musculus)
<400>45
Met Lys Asp Phe Ser Ile Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Gly Leu
1               5                   10                  15
Ser Tyr Asn Ser Val Lys Glu Ile Ile Leu Ala Val Asp Gly Val Ile
            20                  25                  30
Ser Val His Ser Leu His Ile Trp Ser Leu Thr Val Asn Gln Val Ile
        35                  40                  45
Leu Ser Val His Val Ala Thr Ala Ala Ser Trp Asp Ser Gln Ser Val
    50                  55                  60
Arg Thr Gly Ile Ala Gln Ala Leu Ser Lys Ser Phe Asp Leu His Ser
65                  70                  75                  80
Leu Thr Ile Gln Ile Glu Ser Ala Ala Asp Gln Asp Pro Ser Cys Leu
                85                  90                  95
Leu Cys Glu Asp Pro Gln Asp
            100
<210>46
<211>103
<212>PRT
<213>鼠(Mus musculus)
<400>46
Met Lys Asp Phe Ser Ile Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Gly Leu
1               5                   10                  15
Ser Tyr Asn Ser Val Lys Glu Ile Ile Leu Ala Val Asp Gly Val Ile
            20                  25                  30
Ser Val His Ser Leu His Ile Trp Ser Leu Thr Val Asn Gln Val Ile
        35                  40                  45
Leu Ser Val His Val Ala Thr Ala Ala Ser Gln Asp Ser Gln Ser Val
    50                  55                  60
Arg Arg Glu Ile Ala Lys Ala Leu Ser Lys Ser Phe Asp Leu His Ser
65                  70                  75                  80
Leu Thr Ile Gln Ile Glu Ser Ala Ala Asp Gln Asp Pro Ser Cys Leu
                85                  90                  95
Leu Cys Glu Asp Pro Gln Asp
            100
<210>47
<211>103
<212>PRT
<213>鼠(Mus musculus)
<400>47
Met Lys Asp Phe Ser Ile Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Gly Leu
1               5                   10                  15
Ser Tyr Asn Ser Val Lys Glu Ile Ile Leu Ala Val Asp Gly Val Ile
            20                  25                  30
Ser Val His Ser Leu His Ile Trp Ser Leu Thr Val Asn Gln Val Ile
        35                  40                  45
Leu Ser Val His Val Ala Thr Ala Ala Ser Arg Asp Ser Gln Ser Val
    50                  55                  60
Arg Arg Glu Ile Ala Lys Ala Leu Ser Lys Ser Phe Asp Leu His Ser
65                  70                  75                  80
Leu Thr Ile Gln Ile Glu Ser Ala Ala Asp Gln Asp Pro Ser Cys Leu
                85                  90                  95
Leu Cys Glu Asp Pro Gln Asp
            100
<210>48
<211>103
<212>PRT
<213>鼠(Mus musculus)
<400>48
Met Lys Asp Phe Ser Ile Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Gly Leu
1               5                   10                  15
Ser Tyr Asn Ser Val Lys Glu Ile Ile Leu Ala Val Asp Gly Val Ile
            20                  25                  30
Ser Val His Ser Leu His Ile Trp Ser Leu Thr Val Asn Gln Val Ile
        35                  40                  45
Leu Ser Val His Val Ala Thr Ala Ala Ser Trp Asp Ser Gln Ser Val
    50                  55                  60
Arg Arg Glu Ile Ala Lys Ala Leu Ser Lys Ser Phe Asp Leu His Ser
65                  70                  75                  80
Leu Thr Ile Gln Ile Glu Ser Ala Ala Asp Gln Asp Pro Ser Cys Leu
                85                  90                  95
Leu Cys Glu Asp Pro Gln Asp
            100
<210>49
<211>103
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>49
Met Lys Asp Phe Ser Ile Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Ser Leu
1               5                   10                  15
Asn Tyr Ser Gly Val Lys Glu Leu Ile Leu Ala Val Asp Gly Val Leu
            20                  25                  30
Ser Val His Ser Leu His Ile Trp Ser Leu Thr Met Asn Gln Val Ile
        35                  40                  45
Leu Ser Ala His Val Ala Thr Ala Ala Ser Arg Asp Ser Gln Val Val
    50                  55                  60
Arg Arg Glu Ile Ala Lys Ala Leu Ser Lys Ser Phe Thr Met His Ser
65                  70                  75                  80
Leu Thr Ile Gln Met Glu Ser Pro Val Asp Gln Asp Pro Asp Cys Leu
                85                  90                  95
Phe Cys Glu Asp Pro Cys Asp
            100
<210>50
<211>103
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>50
Met Lys Asp Phe Ser Ile Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Ser Leu
1               5                   10                  15
Asn Tyr Ser Gly Val Lys Glu Leu Ile Leu Ala Val Asp Gly Val Leu
            20                  25                  30
Ser Val His Ser Leu His Ile Trp Ser Leu Thr Met Asn Gln Val Ile
        35                  40                  45
Leu Ser Ala His Val Ala Thr Ala Ala Ser Gln Asp Ser Gln Val Val
    50                  55                  60
Arg Arg Glu Ile Ala Lys Ala Leu Ser Lys Ser Phe Thr Met His Ser
65                  70                  75                  80
Leu Thr Ile Gln Met Glu Ser Pro Val Asp Gln Asp Pro Asp Cys Leu
                85                  90                  95
Phe Cys Glu Asp Pro Cys Asp
            100
<210>51
<211>103
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>51
Met Lys Asp Phe Ser Ile Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Ser Leu
1               5                   10                  15
Asn Tyr Ser Gly Val Lys Glu Leu Ile Leu Ala Val Asp Gly Val Leu
            20                  25                  30
Ser Val His Ser Leu His Ile Trp Ser Leu Thr Met Asn Gln Val Ile
        35                  40                  45
Leu Ser Ala His Val Ala Thr Ala Ala Ser Trp Asp Ser Gln Val Val
    50                  55                  60
Arg Arg Glu Ile Ala Lys Ala Leu Ser Lys Ser Phe Thr Met His Ser
65                  70                  75                  80
Leu Thr Ile Gln Met Glu Ser Pro Val Asp Gln Asp Pro Asp Cys Leu
                85                  90                  95
Phe Cys Glu Asp Pro Cys Asp
            100
<210>52
<211>11
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>合成肽
<400>52
Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Gly
1               5                   10
<210>53
<211>216
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>53
Met Lys Asp Phe Ser Ile Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Ser Leu
1               5                   10                  15
Asn Tyr Ser Gly Val Lys Glu Leu Ile Leu Ala Val Asp Gly Val Leu
            20                  25                  30
Ser Val His Ser Leu His Ile Trp Ser Leu Thr Met Asn Gln Val Ile
        35                  40                  45
Leu Ser Ala His Val Ala Thr Ala Ala Ser Arg Asp Ser Gln Val Val
    50                  55                  60
Arg Arg Glu Ile Ala Lys Ala Leu Ser Lys Ser Phe Thr Met His Ser
65                  70                  75                  80
Leu Thr Ile Gln Met Glu Ser Pro Val Asp Gln Asp Pro Asp Cys Leu
                85                  90                  95
Phe Cys Glu Asp Pro Cys Asp Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly
            100                 105                 110
Gly Gly Lys Asp Phe Ser Ile Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Ser
        115                 120                 125
Leu Asn Tyr Ser Gly Val Lys Glu Leu Ile Leu Ala Val Asp Gly Val
    130                 135                 140
Leu Ser Val His Ser Leu His Ile Trp Ser Leu Thr Met Asn Gln Val
145                 150                 155                 160
Ile Leu Ser Ala His Val Ala Thr Ala Ala Ser Arg Asp Ser Gln Val
                165                 170                 175
Val Arg Arg Glu Ile Ala Lys Ala Leu Ser Lys Ser Phe Thr Met His
            180                 185                 190
Ser Leu Thr Ile Gln Met Glu Ser Pro Val Asp Gln Asp Pro Asp Cys
        195                 200                 205
Leu Phe Cys Glu Asp Pro Cys Asp
    210                 215
<210>54
<211>216
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>54
Met Lys Asp Phe Ser Ile Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Ser Leu
1               5                   10                  15
Asn Tyr Ser Gly Val Lys Glu Leu Ile Leu Ala Val Asp Gly Val Leu
            20                  25                  30
Ser Val His Ser Leu His Ile Trp Ser Leu Thr Met Asn Gln Val Ile
        35                  40                  45
Leu Ser Ala His Val Ala Thr Ala Ala Ser Arg Asp Ser Gln Val Val
    50                  55                  60
Arg Arg Glu Ile Ala Lys Ala Leu Ser Lys Ser Phe Thr Met His Ser
65                  70                  75                  80
Leu Thr Ile Gln Met Glu Ser Pro Val Asp Gln Asp Pro Asp Cys Leu
                85                  90                  95
Phe Cys Glu Asp Pro Cys Asp Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly
            100                 105                 110
Gly Gly Lys Asp Phe Ser Ile Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Ser
        115                 120                 125
Leu Asn Tyr Ser Gly Val Lys Glu Leu Ile Leu Ala Val Asp Gly Val
    130                 135                 140
Leu Ser Val His Ser Leu His Ile Trp Ser Leu Thr Met Asn Gln Val
145                 150                 155                 160
Ile Leu Ser Ala His Val Ala Thr Ala Ala Ser Gln Asp Ser Gln Val
                165                 170                 175
Val Arg Arg Glu Ile Ala Lys Ala Leu Ser Lys Ser Phe Thr Met His
            180                 185                 190
Ser Leu Thr Ile Gln Met Glu Ser Pro Val Asp Gln Asp Pro Asp Cys
        195                 200                 205
Leu Phe Cys Glu Asp Pro Cys Asp
    210                 215
<210>55
<211>216
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>55
Met Lys Asp Phe Ser Ile Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Ser Leu
1               5                   10                  15
Asn Tyr Ser Gly Val Lys Glu Leu Ile Leu Ala Val Asp Gly Val Leu
            20                  25                  30
Ser Val His Ser Leu His Ile Trp Ser Leu Thr Met Asn Gln Val Ile
        35                  40                  45
Leu Ser Ala His Val Ala Thr Ala Ala Ser Arg Asp Ser Gln Val Val
    50                  55                  60
Arg Arg Glu Ile Ala Lys Ala Leu Ser Lys Ser Phe Thr Met His Ser
65                  70                  75                  80
Leu Thr Ile Gln Met Glu Ser Pro Val Asp Gln Asp Pro Asp Cys Leu
                85                  90                  95
Phe Cys Glu Asp Pro Cys Asp Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly
            100                 105                 110
Gly Gly Lys Asp Phe Ser Ile Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Ser
        115                 120                 125
Leu Asn Tyr Ser Gly Val Lys Glu Leu Ile Leu Ala Val Asp Gly Val
    130                 135                 140
Leu Ser Val His Ser Leu His Ile Trp Ser Leu Thr Met Asn Gln Val
145                 150                 155                 160
Ile Leu Ser Ala His Val Ala Thr Ala Ala Ser Trp Asp Ser Gln Val
                165                 170                 175
Val Arg Arg Glu Ile Ala Lys Ala Leu Ser Lys Ser Phe Thr Met His
            180                 185                 190
Ser Leu Thr Ile Gln Met Glu Ser Pro Val Asp Gln Asp Pro Asp Cys
        195                 200                 205
Leu Phe Cys Glu Asp Pro Cys Asp
    210                 215
<210>56
<211>216
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>56
Met Lys Asp Phe Ser Ile Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Ser Leu
1               5                   10                  15
Asn Tyr Ser Gly Val Lys Glu Leu Ile Leu Ala Val Asp Gly Val Leu
            20                  25                  30
Ser Val His Ser Leu His Ile Trp Ser Leu Thr Met Asn Gln Val Ile
        35                  40                  45
Leu Ser Ala His Val Ala Thr Ala Ala Ser Gln Asp Ser Gln Val Val
    50                  55                  60
Arg Arg Glu Ile Ala Lys Ala Leu Ser Lys Ser Phe Thr Met His Ser
65                  70                  75                  80
Leu Thr Ile Gln Met Glu Ser Pro Val Asp Gln Asp Pro Asp Cys Leu
                85                  90                  95
Phe Cys Glu Asp Pro Cys Asp Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly
            100                 105                 110
Gly Gly Lys Asp Phe Ser Ile Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Ser
        115                 120                 125
Leu Asn Tyr Ser Gly Val Lys Glu Leu Ile Leu Ala Val Asp Gly Val
    130                 135                 140
Leu Ser Val His Ser Leu His Ile Trp Ser Leu Thr Met Asn Gln Val
145                 150                 155                 160
Ile Leu Ser Ala His Val Ala Thr Ala Ala Ser Gln Asp Ser Gln Val
                165                 170                 175
Val Arg Arg Glu Ile Ala Lys Ala Leu Ser Lys Ser Phe Thr Met His
            180                 185                 190
Ser Leu Thr Ile Gln Met Glu Ser Pro Val Asp Gln Asp Pro Asp Cys
        195                 200                 205
Leu Phe Cys Glu Asp Pro Cys Asp
    210                 215
<210>57
<211>216
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>57
Met Lys Asp Phe Ser Ile Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Ser Leu
1               5                   10                  15
Asn Tyr Ser Gly Val Lys Glu Leu Ile Leu Ala Val Asp Gly Val Leu
            20                  25                  30
Ser Val His Ser Leu His Ile Trp Ser Leu Thr Met Asn Gln Val Ile
        35                  40                  45
Leu Ser Ala His Val Ala Thr Ala Ala Ser Gln Asp Ser Gln Val Val
    50                  55                  60
Arg Arg Glu Ile Ala Lys Ala Leu Ser Lys Ser Phe Thr Met His Ser
65                  70                  75                  80
Leu Thr Ile Gln Met Glu Ser Pro Val Asp Gln Asp Pro Asp Cys Leu
                85                  90                  95
Phe Cys Glu Asp Pro Cys Asp Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly
            100                 105                 110
Gly Gly Lys Asp Phe Ser Ile Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Ser
        115                 120                 125
Leu Asn Tyr Ser Gly Val Lys Glu Leu Ile Leu Ala Val Asp Gly Val
    130                 135                 140
Leu Ser Val His Ser Leu His Ile Trp Ser Leu Thr Met Asn Gln Val
145                 150                 155                 160
Ile Leu Ser Ala His Val Ala Thr Ala Ala Ser Arg Asp Ser Gln Val
                165                 170                 175
Val Arg Arg Glu Ile Ala Lys Ala Leu Ser Lys Ser Phe Thr Met His
            180                 185                 190
Ser Leu Thr Ile Gln Met Glu Ser Pro Val Asp Gln Asp Pro Asp Cys
        195                 200                 205
Leu Phe Cys Glu Asp Pro Cys Asp
    210                 215
<210>58
<211>216
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>58
Met Lys Asp Phe Ser Ile Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Ser Leu
1               5                   10                  15
Asn Tyr Ser Gly Val Lys Glu Leu Ile Leu Ala Val Asp Gly Val Leu
            20                  25                  30
Ser Val His Ser Leu His Ile Trp Ser Leu Thr Met Asn Gln Val Ile
        35                  40                  45
Leu Ser Ala His Val Ala Thr Ala Ala Ser Gln Asp Ser Gln Val Val
    50                  55                  60
Arg Arg Glu Ile Ala Lys Ala Leu Ser Lys Ser Phe Thr Met His Ser
65                  70                  75                  80
Leu Thr Ile Gln Met Glu Ser Pro Val Asp Gln Asp Pro Asp Cys Leu
                85                  90                  95
Phe Cys Glu Asp Pro Cys Asp Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly
            100                 105                 110
Gly Gly Lys Asp Phe Ser Ile Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Ser
        115                 120                 125
Leu Asn Tyr Ser Gly Val Lys Glu Leu Ile Leu Ala Val Asp Gly Val
    130                 135                 140
Leu Ser Val His Ser Leu His Ile Trp Ser Leu Thr Met Asn Gln Val
145                 150                 155                 160
Ile Leu Ser Ala His Val Ala Thr Ala Ala Ser Gln Asp Ser Trp Val
                165                 170                 175
Val Arg Arg Glu Ile Ala Lys Ala Leu Ser Lys Ser Phe Thr Met His
            180                 185                 190
Ser Leu Thr Ile Gln Met Glu Ser Pro Val Asp Gln Asp Pro Asp Cys
        195                 200                 205
Leu Phe Cys Glu Asp Pro Cys Asp
    210                 215
<210>59
<211>216
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>59
Met Lys Asp Phe Ser Ile Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Ser Leu
1               5                   10                  15
Asn Tyr Ser Gly Val Lys Glu Leu Ile Leu Ala Val Asp Gly Val Leu
            20                  25                  30
Ser Val His Ser Leu His Ile Trp Ser Leu Thr Met Asn Gln Val Ile
        35                  40                  45
Leu Ser Ala His Val Ala Thr Ala Ala Ser Trp Asp Ser Gln Val Val
    50                  55                  60
Arg Arg Glu Ile Ala Lys Ala Leu Ser Lys Ser Phe Thr Met His Ser
65                  70                  75                  80
Leu Thr Ile Gln Met Glu Ser Pro Val Asp Gln Asp Pro Asp Cys Leu
                85                  90                  95
Phe Gys Glu Asp Pro Cys Asp Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly
            100                 105                 110
Gly Gly Lys Asp Phe Ser Ile Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Ser
        115                 120                 125
Leu Asn Tyr Ser Gly Val Lys Glu Leu Ile Leu Ala Val Asp Gly Val
    130                 135                 140
Leu Ser Val His Ser Leu His Ile Trp Ser Leu Thr Met Asn Gln Val
145                 150                 155                 160
Ile Leu Ser Ala His Val Ala Thr Ala Ala Ser Trp Asp Ser Gln Val
                165                 170                 175
Val Arg Arg Glu Ile Ala Lys Ala Leu Ser Lys Ser Phe Thr Met His
            180                 185                 190
Ser Leu Thr Ile Gln Met Glu Ser Pro Val Asp Gln Asp Pro Asp Cys
        195                 200                 205
Leu Phe Cys Glu Asp Pro Cys Asp
    210                 215
<210>60
<211>216
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>60
Met Lys Asp Phe Ser Ile Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Ser Leu
1               5                   10                  15
Asn Tyr Ser Gly Val Lys Glu Leu Ile Leu Ala Val Asp Gly Val Leu
            20                  253                  0
Ser Val His Ser Leu His Ile Trp Ser Leu Thr Met Asn Gln Val Ile
        35                  40                  45
Leu Ser Ala His Val Ala Thr Ala Ala Ser Trp Asp Ser Gln Val Val
    50                  55                  60
Arg Arg Glu Ile Ala Lys Ala Leu Ser Lys Ser Phe Thr Met His Ser
65                  70                  75                  80
Leu Thr Ile Gln Met Glu Ser Pro Val Asp Gln Asp Pro Asp Cys Leu
                85                  90                  95
Phe Cys Glu Asp Pro Cys Asp Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly
            100                 105                 110
Gly Gly Lys Asp Phe Ser Ile Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Ser
        115                 120                 125
Leu Asn Tyr Ser Gly Val Lys Glu Leu Ile Leu Ala Val Asp Gly Val
    130                 135                 140
Leu Ser Val His Ser Leu His Ile Trp Ser Leu Thr Met Asn Gln Val
145                 150                 155                 160
Ile Leu Ser Ala His Val Ala Thr Ala Ala Ser Arg Asp Ser Gln Val
                165                 170                 175
Val Arg Arg Glu Ile Ala Lys Ala Leu Ser Lys Ser Phe Thr Met His
            180                 185                 190
Ser Leu Thr Ile Gln Met Glu Ser Pro Val Asp Gln Asp Pro Asp Cys
        195                 200                 205
Leu Phe Cys Glu Asp Pro Cys Asp
    210                 215
<210>61
<211>216
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>61
Met Lys Asp Phe Ser Ile Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Ser Leu
1               5                   10                  15
Asn Tyr Ser Gly Val Lys Glu Leu Ile Leu Ala Val Asp Gly Val Leu
            20                  25                  30
Ser Val His Ser Leu His Ile Trp Ser Leu Thr Met Asn Gln Val Ile
        35                  40                  45
Leu Ser Ala His Val Ala Thr Ala Ala Ser Trp Asp Ser Gln Val Val
    50                  55                  60
Arg Arg Glu Ile Ala Lys Ala Leu Ser Lys Ser Phe Thr Met His Ser
65                  70                  75                  80
Leu Thr Ile Gln Met Glu Ser Pro Val Asp Gln Asp Pro Asp Cys Leu
                85                  90                  95
Phe Cys Glu Asp Pro Cys Asp Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly
            100                 105                 110
Gly Gly Lys Asp Phe Ser Ile Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Ser
        115                 120                 125
Leu Asn Tyr Ser Gly Val Lys Glu Leu Ile Leu Ala Val Asp Gly Val
    130                 135                 140
Leu Ser Val His Ser Leu His Ile Trp Ser Leu Thr Met Asn Gln Val
145                 150                 155                 160
Ile Leu Ser Ala His Val Ala Thr Ala Ala Ser Gln Asp Ser Gln Val
                165                 170                 175
Val Arg Arg Glu Ile Ala Lys Ala Leu Ser Lys Ser Phe Thr Met His
            180                 185                 190
Ser Leu Thr Ile Gln Met Glu Ser Pro Val Asp Gln Asp Pro Asp Cys
        195                 200                 205
Leu Phe Cys Glu Asp Pro Cys Asp
    210                 215
<210>62
<211>181
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>62
Met Glu Phe Leu Glu Arg Thr Tyr Leu Val Asn Asp Lys Ala Ala Lys
1               5                   10                  15
Met Tyr Ala Phe Thr Leu Glu Ser Val Glu Leu Gln Gln Lys Pro Val
            20                  25                  30
Asn Lys Asp Gln Cys Pro Arg Glu Arg Pro Glu Glu Leu Glu Ser Gly
        35                  40                  45
Gly Met Tyr His Cys His Ser Gly Ser Lys Pro Thr Glu Lys Gly Ala
    50                  55                  60
Asn Glu Tyr Ala Tyr Ala Lys Trp Lys Leu Cys Ser Gly Gly Gly Lys
65                  70                  75                  80
Asp Phe Ser Ile Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Ser Leu Asn Tyr
                85                  90                  95
Ser Gly Val Lys Glu Leu Ile Leu Ala Val Asp Gly Val Leu Ser Val
            100                 105                 110
His Ser Leu His Ile Trp Ser Leu Thr Met Asn Gln Val Ile Leu Ser
        115                 120                 125
Ala His Val Ala Thr Ala Ala Ser Trp Asp Ser Gln Val Val Arg Arg
    130                 135                 140
Glu Ile Ala Lys Ala Leu Ser Lys Ser Phe Thr Met His Ser Leu Thr
145                 150                 155                 160
Ile Gln Met Glu Ser Pro Val Asp Gln Asp Pro Asp Cys Leu Phe Cys
                165                 170                 175
Glu Asp Pro Cys Asp
            180
<210>63
<211>181
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>63
Met Glu Phe Leu Glu Arg Thr Tyr Leu Val Asn Asp Lys Ala Ala Lys
1               5                   10                  15
Met Tyr Ala Phe Thr Leu Glu Ser Val Glu Leu Gln Gln Lys Pro Val
            20                  25                  30
Asn Lys Asp Gln Cys Pro Arg Glu Arg Pro Glu Glu Leu Glu Ser Gly
        35                  40                  45
Gly Met Tyr His Cys His Ser Gly Ser Lys Pro Thr Glu Lys Gly Ala
    50                  55                  60
Asn Glu Tyr Ala Tyr Ala Lys Trp Lys Leu Cys Ser Gly Gly Gly Lys
65                  70                  75                  80
Asp Phe Ser Ile Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Ser Leu Asn Tyr
                85                  90                  95
Ser Gly Val Lys Glu Leu Ile Leu Ala Val Asp Gly Val Leu Ser Val
            100                 105                 110
His Ser Leu His Ile Trp Ser Leu Thr Met Asn Gln Val Ile Leu Ser
        115                 120                 125
Ala His Val Ala Thr Ala Ala Ser Arg Asp Ser Gln Val Val Arg Arg
    130                 135                 140
Glu Ile Ala Lys Ala Leu Ser Lys Ser Phe Thr Met His Ser Leu Thr
145                 150                 155                 160
Ile Gln Met Glu Ser Pro Val Asp Gln Asp Pro Asp Cys Leu Phe Cys
                165                 170                 175
Glu Asp Pro Cys Asp
            180
<210>64
<211>132
<212>PRT
<213>人(Homo sa piens)
<400>64
Met Tyr His Cys His Ser Gly Ser Lys Pro Thr Glu Lys Gly Ala Asn
1               5                   10                  15
Glu Tyr Ala Tyr Ala Lys Trp Lys Leu Cys Ser Gly Gly Gly Lys Asp
            20                  25                  30
Phe Ser Ile Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Ser Leu Asn Tyr Ser
        35                  40                  45
Gly Val Lys Glu Leu Ile Leu Ala Val Asp Gly Val Leu Ser Val His
    50                  55                  60
Ser Leu His Ile Trp Ser Leu Thr Met Asn Gln Val Ile Leu Ser Ala
65                  70                  75                  80
His Val Ala Thr Ala Ala Ser Trp Asp Ser Gln Val Val Arg Arg Glu
                85                  90                  95
Ile Ala Lys Ala Leu Ser Lys Ser Phe Thr Met His Ser Leu Thr Ile
            100                 105                 110
Gln Met Glu Ser Pro Val Asp Gln Asp Pro Asp Cys Leu Phe Cys Glu
        115                 120                 125
Asp Pro Cys Asp
    130
<210>65
<211>132
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>65
Met Tyr His Cys His Ser Gly Ser Lys Pro Thr Glu Lys Gly Ala Asn
1               5                   10                  15
Glu Tyr Ala Tyr Ala Lys Trp Lys Leu Cys Ser Gly Gly Gly Lys Asp
            20                  25                  30
Phe Ser Ile Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Ser Leu Asn Tyr Ser
        35                  40                  45
Gly Val Lys Glu Leu Ile Leu Ala Val Asp Gly Val Leu Ser Val His
    50                  55                  60
Ser Leu His Ile Trp Ser Leu Thr Met Asn Gln Val Ile Leu Ser Ala
65                  70                  75                  80
His Val Ala Thr Ala Ala Ser Arg Asp Ser Gln Val Val Arg Arg Glu
                85                  90                  95
Ile Ala Lys Ala Leu Ser Lys Ser Phe Thr Met His Ser Leu Thr Ile
            100                 105                 110
Gln Met Glu Ser Pro Val Asp Gln Asp Pro Asp Cys Leu Phe Cys Glu
        115                 120                 125
Asp Pro Cys Asp
    130
<210>66
<211>182
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>66
Met Lys Asp Phe Ser Ile Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Ser Leu
1               5                   10                  15
Asn Tyr Ser Gly Val Lys Glu Leu Ile Leu Ala Val Asp Gly Val Leu
            20                  25                  30
Ser Val His Ser Leu His Ile Trp Ser Leu Thr Met Asn Gln Val Ile
        35                  40                  45
Leu Ser Ala His Val Ala Thr Ala Ala Ser Arg Asp Ser Gln Val Val
    50                  55                  60
Arg Arg Glu Ile Ala Lys Ala Leu Ser Lys Ser Phe Thr Met His Ser
65                  70                  75                  80
Leu Thr Ile Gln Met Glu Ser Pro Val Asp Gln Asp Pro Asp Cys Leu
                85                  90                  95
Phe Cys Glu Asp Pro Cys Asp Gly Gly Gly Met Glu Phe Leu Glu Arg
            100                 105                 110
Thr Tyr Leu Val Asn Asp Lys Ala Ala Lys Met Tyr Ala Phe Thr Leu
        115                 120                 125
Glu Ser Val Glu Leu Gln Gln Lys Pro Val Asn Lys Asp Gln Cys Pro
    130                 135                 140
Arg Glu Arg Pro Glu Glu Leu Glu Ser Gly Gly Met Tyr His Cys His
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ser Lys Pro Thr Glu Lys Gly Ala Asn Glu Tyr Ala Tyr Ala
                165                 170                 175
Lys Trp Lys Leu Cys Ser
            180
<210>67
<211>244
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>67
Met Glu Phe Leu Glu Arg Thr Tyr Leu Val Asn Asp Lys Ala Ala Lys
1               5                   10                  15
Met Tyr Ala Phe Thr Leu Glu Ser Val Glu Leu Gln Gln Lys Pro Val
            20                  25                  30
Asn Lys Asp Gln Cys Pro Arg Glu Arg Pro Glu Glu Leu Glu Ser Gly
        35                  40                  45
Gly Met Tyr His Cys His Ser Gly Ser Lys Pro Thr Glu Lys Gly Ala
    50                  55                  60
Asn Glu Tyr Ala Tyr Ala Lys Trp Lys Leu Cys Ser Ala Ser Asp Ala
65                  70                  75                  80
Ala His Leu Leu Ile Asp Ser Ser Lys Pro Pro Ser Lys Arg Leu Thr
                85                  90                  95
Phe Gly Trp His Arg Ala Glu Cys Glu Arg Leu Leu Tyr Pro Asp Tyr
            100                 105                 110
Gln Ile Gln Ala Thr Leu His Gln Arg Cys Leu Gly His Asn His Lys
        115                 120                 125
Glu Val Gln Ala Asn Ala Ser Val Arg Lys Pro Glu Tyr Lys Lys Asp
    130                 135                 140
Phe Ser Ile Leu Leu Met Glu Gly Val Pro Lys Ser Leu Asn Tyr Ser
145                 150                 155                 160
Gly Val Lys Glu Leu Ile Leu Ala Val Asp Gly Val Leu Ser Val His
                165                 170                 175
Ser Leu His Ile Trp Ser Leu Thr Met Asn Gln Val Ile Leu Ser Ala
            180                 185                 190
His Val Ala Thr Ala Ala Ser Trp Asp Ser Gln Val Val Arg Arg Glu
        195                 200                 205
Ile Ala Lys Ala Leu Ser Lys Ser Phe Thr Met His Ser Leu Thr Ile
    210                 215                 220
Gln Met Glu Ser Pro Val Asp Gln Asp Pro Asp Cys Leu Phe Cys Glu
225                 230                 235                 240
Asp Pro Cys Asp

Claims (95)

1.ZnT8的片段，包括ZnT8的至少10个C端氨基酸，基本上由ZnT8的至少10个C端氨基酸组成，或由ZnT8的至少10个C端氨基酸组成。
2.ZnT8的片段，包括ZnT8的至少25个C端氨基酸，基本上由ZnT8的至少25个C端氨基酸组成，或由ZnT8的至少25个C端氨基酸组成。
3.ZnT8的片段，包括ZnT8的至少50个C端氨基酸，基本上由ZnT8的至少50个C端氨基酸组成，或由ZnT8的至少50个C端氨基酸组成。
4.ZnT8的片段，包括ZnT8的至少75个C端氨基酸，基本上由ZnT8的至少75个C端氨基酸组成，或由ZnT8的至少75个C端氨基酸组成。
5.ZnT8的片段，包括ZnT8的至少100个C端氨基酸，基本上由ZnT8的至少100个C端氨基酸组成，或由ZnT8的至少100个C端氨基酸组成。
6.ZnT8的片段，包括ZnT8的至少101个C端氨基酸，基本上由ZnT8的至少101个C端氨基酸组成，或由ZnT8的至少101个C端氨基酸组成。
7.ZnT8的片段，包括ZnT8的至少102个C端氨基酸，基本上由ZnT8的至少102个C端氨基酸组成，或由ZnT8的至少102个C端氨基酸组成。
8.ZnT8的片段，包括ZnT8的至少104个C端氨基酸，基本上由ZnT8的至少104个C端氨基酸组成，或由ZnT8的至少104个C端氨基酸组成。
9.ZnT8的片段，包括ZnT8的至少350个C端氨基酸，基本上由ZnT8的至少350个C端氨基酸组成，或由ZnT8的至少350个C端氨基酸组成。
10.ZnT8的片段，包括至少氨基酸序列SLTIQMES(SEQ ID NO：2的346-353位)，基本上由至少氨基酸序列SLTIQMES(SEQ ID NO：2的346-353位)组成，或由至少氨基酸序列SLTIQMES(SEQ ID NO：2的346-353位)组成。
11.权利要求1-9中任意一项的片段，其中相对于SEQ ID NO：2，所述片段包括选自E352和S353的氨基酸位置。
12.权利要求1-9中任意一项的片段，其中所述ZnT8是人ZnT8(SEQ IDNO：2)。
13.权利要求12的片段，其中所述片段包括SEQ ID NO：2的位置325。
14.权利要求1-9中任意一项的片段，其中所述ZnT8是SEQ ID NO：2的多态性变体。
15.权利要求14的片段，其中所述片段包括SEQ ID NO：2的位置325。
16.权利要求15的片段，其中325位的氨基酸是色氨酸。
17.权利要求15的片段，其中325位的氨基酸是谷氨酰胺。
18.ZnT8的片段，包括ZnT8的至少10个N端氨基酸，基本上由ZnT8的至少10个N端氨基酸组成，或由ZnT8的至少10个N端氨基酸组成。
19.ZnT8的片段，包括ZnT8的至少25个N端氨基酸，基本上由ZnT8的至少25个N端氨基酸组成，或由ZnT8的至少25个N端氨基酸组成。
20.ZnT8的片段，包括ZnT8的至少50个N端氨基酸，基本上由ZnT8的至少50个N端氨基酸组成，或由ZnT8的至少50个N端氨基酸组成。
21.ZnT8的片段，包括ZnT8的至少74个N端氨基酸，基本上由ZnT8的至少74个N端氨基酸组成，或由ZnT8的至少74个N端氨基酸组成。
22.ZnT8的片段，包括SEQ ID NOs：8-24或40-65中任一所示片段，基本上由SEQ ID NOs：8-24或40-65中任一所示片段组成，或由SEQ IDNOs：8-24或40-65中任一所示片段组成。
23.一种嵌合蛋白，包括前述权利要求中任意一项所述的任意两个或更多个片段，基本上由前述权利要求中任意一项所述的任意两个或更多个片段组成，或由前述权利要求中任意一项所述的任意两个或更多个片段组成。
24.权利要求23的嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白包括ZnT8的N端片段和ZnT8的C端片段。
25.权利要求23的嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白包括ZnT8的两个C末端片段，其中每一片段包括氨基酸325位，并且其中每一片段在325位包括不同的氨基酸。
26.权利要求25的嵌合蛋白，其中一个片段包括在325位的精氨酸，第二片段包括在325位的色氨酸。
27.ZnT8的片段或同系物，包括被抗ZnT8抗体选择性结合的至少一个ZnT8表位。
28.权利要求27的ZnT8的片段或同系物，其中所述抗ZnT8抗体是获自个体的抗体。
29.权利要求27的ZnT8的片段或同系物，其中所述个体患有或被怀疑患有I型糖尿病。
30.ZnT8的片段或同系物，包括被ZnT8特异性T细胞受体特异性识别的至少一个ZnT8表位。
31.权利要求30的ZnT8的片段或同系物，其中所述个体患有或被怀疑患有I型糖尿病。
32.权利要求1-31中任意一项的片段或嵌合蛋白，其中所述片段或嵌合蛋白与至少一个靶向基团复合，以将该片段或嵌合蛋白靶向到组织或机体的细胞或部位。
33.权利要求32的片段或同系物，其中所述靶向基团靶向于T细胞。
34.权利要求32的片段或同系物，其中所述靶向基团靶向于ZnT8特异性的自体反应T细胞。
35.权利要求1-31中任意一项的片段或嵌合蛋白，其中所述片段或嵌合蛋白与毒素复合，所述毒素在T细胞或B细胞中诱导凋亡或另外对T细胞或B细胞是有毒的。
36.权利要求1-31中任意一项的片段或嵌合蛋白，其中所述片段或嵌合蛋白与可检测的标记物连接。
37.ZnT8的同系物，包括与天然存在的ZnT8蛋白具有低于99％的同一性，并且与SEQ ID NO：2具有至少90％同一性的蛋白。
38.权利要求37的同系物，其中所述蛋白与SEQ ID NO：2具有至少95％的同一性。
39.权利要求37或权利要求38的同系物，其中所述蛋白包括SEQ IDNO：2的位置325，并且325位的氨基酸是精氨酸、色氨酸或谷氨酰胺。
40.一种包括ZnT8或其变体或片段的疫苗，其中所述疫苗引发抑制或消除个体中ZnT8特异性自体反应T细胞的免疫应答。
41.一种抗体或其抗原结合片段，它们选择性结合ZnT8或其片段或变体，并抑制或降低个体中ZnT8特异性自身免疫应答。
42.权利要求41的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
43.一种诊断易患或正患有自身免疫病的个体的方法，包括检测个体试样中选择性结合ZnT8的抗体，其中与阴性对照相比，如果检测到个体中抗体的增加表明个体易患或正患有自身免疫病。
44.权利要求43的方法，其中所述方法包括检测选择性结合人ZnT8的抗体，所述人ZnT8的325位的氨基酸是精氨酸。
45.权利要求43的方法，其中所述方法包括检测选择性结合人ZnT8的抗体，所述人ZnT8的325位的氨基酸是色氨酸。
46.权利要求43的方法，其中所述方法包括检测选择性结合人ZnT8的抗体，所述人ZnT8的325位的氨基酸是谷氨酰胺。
47.权利要求43的方法，其中所述方法包括检测选择性结合人ZnT8的抗体，所述人ZnT8的325位的氨基酸是精氨酸或色氨酸。
48.一种诊断易患或正患有自身免疫病的个体的方法，包括检测个体试样中ZnT8特异性的T细胞应答，其中与阴性对照相比，如果检测到个体中ZnT8特异性T细胞应答的增加表明个体易患或正患有自身免疫病。
49.权利要求48的方法，其中所述方法包括检测对包含325位精氨酸的人ZnT8特异性的T细胞应答。
50.权利要求48的方法，其中所述方法包括检测对包含325位色氨酸的人ZnT8特异性的T细胞应答。
51.权利要求48的方法，其中所述方法包括检测对包含325位谷氨酰胺的人ZnT8特异性的T细胞应答。
52.权利要求48的方法，其中所述方法包括检测对包含325位精氨酸或色氨酸的人ZnT8特异性的T细胞应答。
53.权利要求43-52中任意一项的方法，其中当所述个体易患或正患有自身免疫病时，所述方法还包括给该个体施用治疗剂，所述治疗剂靶向于该个体中包括325位氨基酸的ZnT8表位。
54.权利要求53的方法，其中所述治疗剂是该个体中ZnT8的蛋白、肽或激动剂，它们使该个体的免疫应答耐受ZnT8蛋白。
55.权利要求53的方法，其中所述治疗剂刺激抗ZnT8蛋白的免疫应答。
56.权利要求43-55中任意一项的方法，其中所述自身免疫病是I型糖尿病。
57.一种监测个体的I型糖尿病自身免疫从最初的良性自身反应性到破坏性胰岛炎的进展的方法，包括检测个体试样中选择性结合ZnT8的抗体，其中与相同个体中抗体的先前测量值相比，检测到个体中抗体的增加表明该个体正向破坏性胰岛炎发展。
58.权利要求57的方法，其中所述方法包括检测选择性结合人ZnT8的抗体，所述人ZnT8的325位的氨基酸是精氨酸。
59.权利要求57的方法，其中所述方法包括检测选择性结合人ZnT8的抗体，所述人ZnT8的325位的氨基酸是色氨酸。
60.权利要求57的方法，其中所述方法包括检测选择性结合人ZnT8的抗体，所述人ZnT8的325位的氨基酸是谷氨酰胺。
61.权利要求57的方法，其中所述方法包括检测选择性结合人ZnT8的抗体，所述人ZnT8的325位的氨基酸是精氨酸或色氨酸。
62.一种监测个体的I型糖尿病自身免疫从最初的良性自身反应性到破坏性胰岛炎的进展的方法，包括检测个体试样中ZnT8特异性T细胞应答，其中与相同个体中ZnT8特异性T细胞应答的先前测量值相比，检测到个体中ZnT8特异性T细胞应答的增加表明该个体正向破坏性胰岛炎发展。
63.权利要求62的方法，其中所述方法包括检测对包含325位精氨酸的人ZnT8特异性的T细胞应答。
64.权利要求62的方法，其中所述方法包括检测对包含325位色氨酸的人ZnT8特异性的T细胞应答。
65.权利要求62的方法，其中所述方法包括检测对包含325位谷氨酰胺的人ZnT8特异性的T细胞应答。
66.权利要求62的方法，其中所述方法包括检测对包含325位精氨酸或色氨酸的人ZnT8特异性的T细胞应答。
67.一种监测用于预防I型糖尿病、延缓I型糖尿病发病或改善前驱糖尿病个体的自身免疫的治疗效果的方法，包括检测个体试样中选择性结合ZnT8的抗体，其中与相同个体中抗体的先前测量值相比，检测到个体中抗体水平降低或基本上相同表明所述治疗是有效的，其中与同个体中抗体的先前测量值相比，检测到个体中抗体增加表明所述治疗是无效的。
68.权利要求67的方法，其中所述方法包括检测选择性结合人ZnT8的抗体，所述人ZnT8的325位的氨基酸是精氨酸。
69.权利要求62的方法，其中所述方法包括检测选择性结合人ZnT8的抗体，所述人ZnT8的325位的氨基酸是色氨酸。
70.权利要求67的方法，其中所述方法包括检测选择性结合人ZnT8的抗体，所述人ZnT8的325位的氨基酸是谷氨酰胺。
71.权利要求67的方法，其中所述方法包括检测选择性结合人ZnT8的抗体，所述人ZnT8的325位的氨基酸是精氨酸或色氨酸。
72.一种监测用于预防I型糖尿病、延缓I型糖尿病发病或改善前驱糖尿病个体的自身免疫的治疗效果的方法，包括检测个体试样中ZnT8特异性的T细胞应答，其中与相同个体中ZnT8特异性T细胞应答的先前测量值相比，检测到个体中ZnT8特异性T细胞应答水平降低或基本上相同表明所述治疗是有效的，其中与同个体中ZnT8特异性T细胞应答的先前测量值相比，检测到个体中ZnT8特异性T细胞应答增加表明所述治疗是无效的。
73.权利要求72的方法，其中所述方法包括检测对包含325位精氨酸的人ZnT8特异性的T细胞应答。
74.权利要求72的方法，其中所述方法包括检测对包含325位色氨酸的人ZnT8特异性的T细胞应答。
75.权利要求72的方法，其中所述方法包括检测对包含325位谷氨酰胺的人ZnT8特异性的T细胞应答。
76.权利要求67的方法，其中所述方法包括检测对包含325位精氨酸或色氨酸的人ZnT8特异性的T细胞应答。
77.权利要求43-47、53-61或67-71中任意一项的方法，其中所述方法包括使用选自以下组的分析法：放射免疫沉淀分析，ELISA，时间分辨荧光分析和化学发光分析。
78.权利要求43-47、53-61或67-71中任意一项的方法，其中所述方法包括使用竞争性铕分析。
79.权利要求48-56、62-66或72-76中任意一项的方法，其中所述方法包括使用选自以下组的分析法：T细胞增殖分析，利用可溶性MHC四聚体进行的结合分析，利用可溶性T细胞受体进行的结合分析，和ELISPOT分析。
80.权利要求43-79中任意一项的方法，其中所述方法包括使用ZnT8或其片段或变体。
81.用于进行权利要求43-47、53-61或67-71中任意一项方法的分析试剂盒，包括：
a)ZnT8蛋白或其变体或片段；
b)用于检测选择性结合ZnT8的抗体的试剂。
82.用于进行权利要求48-56、62-66或72-76中任意一项方法的分析试剂盒，包括：
a)ZnT8蛋白或其同系物或片段；
b)用于检测ZnT8特异性T细胞应答的试剂。
83.一种预防自身免疫病、延缓自身免疫病发病或改善患有自身免疫病的个体的自身免疫的方法，包括给需要其的个体施用引发ZnT8特异性免疫应答的药剂，所述ZnT8特异性免疫应答保护患者被自身免疫病靶向的细胞或组织。
84.权利要求83的方法，其中所述自身免疫病是I型糖尿病，所述药剂保护胰岛的β细胞。
85.一种预防自身免疫病、延缓自身免疫病发病或改善患有自身免疫病的个体的自身免疫的方法，包括给需要其的个体施用药剂，所述药剂靶向于个体的ZnT8特异性T细胞，并诱导ZnT8特异性T细胞的坏死或凋亡。
86.权利要求85的方法，其中所述自身免疫病是I型糖尿病，所述药剂诱导ZnT8特异性T细胞的坏死或凋亡。
87.一种预防自身免疫病、延缓自身免疫病发病或改善患有自身免疫病的个体的自身免疫的方法，包括给需要其的个体施用药剂，所述药剂诱导个体中ZnT8特异性T细胞的耐受性。
88.权利要求87的方法，其中所述自身免疫病是I型糖尿病，所述药剂诱导个体中ZnT8特异性T细胞的耐受性。
89.权利要求83-88中任意一项的方法，其中所述药剂是ZnT8、其同系物、其片段或其合成模拟物。
90.权利要求89的方法，其中所述药剂是权利要求1-38中任意一项的片段或嵌合蛋白、同系物或其片段。
91.权利要求83-88中任意一项的方法，其中所述药剂是个体中与天然的自身抗体竞争结合该个体的ZnT8的抗体。
92.权利要求83-91中任意一项的方法，其中所述药剂对包括325位精氨酸的人ZnT8的多态性变体具有特异性。
93.权利要求83-91中任意一项的方法，其中所述药剂对包括325位色氨酸的人ZnT8的多态性变体具有特异性。
94.权利要求83-91中任意一项的方法，其中所述药剂对包括325位谷氨酰胺的人ZnT8的多态性变体具有特异性。
95.ZnT8、其变体、其片段、其合成模拟物或结合所述ZnT8的抗体、其同系物或其片段在基本上如本文所述的诊断、预后或治疗方法中的用途。
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